Tóm tắt: Nghiên cứu thu nhận chế phẩm phytoestrogen từ phôi đậu tương

Nghiên cứu thu nhận chế phẩm phytoestrogen từ phôi đậu tương.Nghiên cứu thu nhận chế phẩm phytoestrogen từ phôi đậu tương.Nghiên cứu thu nhận chế phẩm phytoestrogen từ phôi đậu tương.Nghiên cứu thu nhận chế phẩm phytoestrogen từ phôi đậu tương.Nghiên cứu thu nhận chế phẩm phytoestrogen từ phôi đậu tương.Nghiên cứu thu nhận chế phẩm phytoestrogen từ phôi đậu tương.Nghiên cứu thu nhận chế phẩm phytoestrogen từ phôi đậu tương.Nghiên cứu thu nhận chế phẩm phytoestrogen từ phôi đậu tương.Nghiên cứu thu nhận chế phẩm phytoestrogen từ phôi đậu tương.Nghiên cứu thu nhận chế phẩm phytoestrogen từ phôi đậu tương.Nghiên cứu thu nhận chế phẩm phytoestrogen từ phôi đậu tương.Nghiên cứu thu nhận chế phẩm phytoestrogen từ phôi đậu tương.Nghiên cứu thu nhận chế phẩm phytoestrogen từ phôi đậu tương.Nghiên cứu thu nhận chế phẩm phytoestrogen từ phôi đậu tương.Nghiên cứu thu nhận chế phẩm phytoestrogen từ phôi đậu tương.Nghiên cứu thu nhận chế phẩm phytoestrogen từ phôi đậu tương.Nghiên cứu thu nhận chế phẩm phytoestrogen từ phôi đậu tương.Nghiên cứu thu nhận chế phẩm phytoestrogen từ phôi đậu tương.Nghiên cứu thu nhận chế phẩm phytoestrogen từ phôi đậu tương.Nghiên cứu thu nhận chế phẩm phytoestrogen từ phôi đậu tương.Nghiên cứu thu nhận chế phẩm phytoestrogen từ phôi đậu tương.Nghiên cứu thu nhận chế phẩm phytoestrogen từ phôi đậu tương.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

Lê Minh Châu

NGHIÊN CỨU THU NHẬN CHẾ PHẨM PHYTOESTROGEN

TỪ PHÔI ĐẬU TƯƠNG

Ngành: Công nghệ sinh học

Mã số: 9420201

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Hà Nội – 2023

Công trình được hoàn thành tại:

Đại học Bách khoa Hà Nội

Người hướng dẫn khoa học:

PGS.TS Đỗ Thị Hoa Viên PGS.TS Hồ Phú Hà

Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện:

1 Thư viện Tạ Quang Bửu - ĐHBK Hà Nội

2 Thư viện Quốc gia Việt Nam

1

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Phytoestrogen có nhiều lợi ích với sức khỏe con người, đặc biệt là phụ nữ và phụ nữ mãn kinh: phòng chống ung thư, làm giảm cholesterol và các bệnh tim mạch, phòng chống các triệu chứng bất lợi

ở tuổi mãn kinh, tăng cường khả năng nhận thức Các phytoestrogen

có mặt trong các bộ phận khác nhau của cây đậu tương như hạt, lá mầm, thân, rễ Theo các nghiên cứu gần đây đã công bố, so sánh giữa các thành phần cấu tạo hạt đậu tương gồm vỏ hạt, phôi hạt và phần nội nhũ thì phôi hạt có hàm lượng phytoestrogen cao nhất

Các nghiên cứu về nhóm hợp chất phytoestrogen trong phôi đậu tương công bố trên thế giới chủ yếu tập trung vào 6 hợp chất gồm nhóm aglycone và β-glucoside trong khi các tài liệu đã công bố về đủ

12 thành phần phytoestrogen trong phôi hạt chưa nhiều Kết quả khảo sát 12 thành phần phytoestrogen các bộ phận hạt đậu tương trên các giống đậu tương Hàn Quốc, Pháp cho thấy phôi hạt đậu tương có hàm lượng phytoestrogen cao nhất, gấp 5-6 lần so với toàn hạt và cao hơn nhiều lần so với vỏ hạt và lá mầm Tại Việt Nam chưa có báo cáo nào

về 12 thành phần phytoestrogen trong phôi hạt, do vậy chưa có cái nhìn tổng quát về nhóm hợp chất này

Do đó, chúng tôi đã tiến hành với đề tài: “Nghiên cứu thu nhận chế phẩm phytoestrogen từ phôi đậu tương” Đề tài này được định

hướng sẽ nghiên cứu, phân tích đầy đủ 3 thành phần hoạt chất chính

và 9 dẫn chất ở dạng glucoside từ đó định lượng chính xác hàm lượng phytoestrogen tổng số, xây dựng phương án chiết xuất tối ưu, nâng cao hiệu suất thu nhận phytoestrogen dạng aglycone, thử nghiệm một

số hoạt tính sinh học của phytoestrogen chiết xuất từ phôi đậu tương

2 Mục tiêu và nội dung nghiên cứu

2.1 Mục tiêu nghiên cứu

- Xây dựng chế độ chiết xuất phyoestrogen từ bột phôi đậu tương và làm giàu các phytoestrogen dạng aglycone

- Chứng minh bằng thực nghiệm hoạt tính chống oxy hóa của phytoestrogen

- Thử nghiệm hoạt tính phytoestrogen in vivo

2.2 Nội dung nghiên cứu

- Đánh giá và xử lý nguyên liệu: Đánh giá hàm lượng tạp trong phôi đậu tương ban đầu, xác định các đặc tính của bột phôi đậu tương và bột phôi đậu tương đã loại lipid

- Xây dựng chế độ chiết xuất phytoestrogen: Khảo sát các yếu

tố ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất phytoestrogen tổng; Tối

ưu hóa chế độ chiết xuất phytoestrogen tổng

- Thu nhận phytoestrogen aglycone: Khảo sát chế độ thủy phân phytoestrogen glucoside thành aglycone bằng enzyme β-glucosidase, cellulase; Tinh sạch phytoestrogen aglycone

- Đánh giá khả năng chống oxy hóa của các cao chiết phytoestrogen gồm cao phytoestrogen tổng, cao phytoestrogen aglycone thô và cao phytoestrogen aglycone tinh sạch

- Đánh giá hoạt tính phytoestrogen in vivo của cao

phytoestrogen tổng và cao phytoestrogen aglycone thô

3 Ý nghĩa khoa học của đề tài

3.1 Ý nghĩa khoa học

Luận án là một trong số ít các công trình công bố đầy đủ về 12 thành phần phytoestrogen trong phôi hạt – một phụ phẩm của quá trình sản xuất bột đậu tương nhưng là bộ phận có hàm lượng phytoestrogen cao nhất so với các bộ phận khác của hạt đậu Kết quả các nghiên cứu của luận án sẽ đóng góp vào cơ sở dữ liệu khoa học về các phytoestrogen từ nguồn nguyên liệu này

Khẳng định bằng thực nghiệm các dạng phytoestrogen gồm glucoside, acetyl-glucoside, malonyl-glucoside đều bị thủy phân bởi enzyme β-glucosidase và enzyme cellulase – đây là cơ sở cho việc nghiên cứu làm giàu phytoestrogen dạng aglycone thông qua việc nâng cao hiệu suất thủy phân các dạng acetyl-glucoside và malonyl-glucoside Các nghiên cứu đã công bố cho thấy các dạng acetyl-glucoside, malonyl-glucoside khó bị thủy phân trong hệ tiêu hóa của người do vậy hướng đề xuất nâng cao hàm lượng phytoestrogen aglycone bằng con đường thủy phân các dạng glucoside này bởi

3.2 Ý nghĩa thực tiễn

Dựa vào kết quả đánh giá hàm lượng phytoestrogen trong bột phôi đậu tương, khẳng định các tiềm năng sử dụng phôi đậu tương – một phụ phẩm của quá trình sản xuất đậu tương mảnh, hiện chủ yếu làm thức ăn gia súc và chưa phát huy được hết các hoạt tính sinh học quý Kết quả đánh giá hoạt tính chống oxy hóa và hoạt tính sinh học của các dịch chiết phytoestrogen cho thấy các phytoestrogen có khả năng chống oxy hóa và có hiệu quả tương tự như estradiol có giá trị trong việc ứng dụng sản xuất các chế phẩm bổ sung dinh dưỡng hay thực phẩm thuốc, mỹ phẩm để chăm sóc sức khỏe con người, đặc biệt là phụ nữ tiền mãn kinh và mãn kinh

4 Tính mới của đề tài

Luận án là công trình nghiên cứu có hệ thống đầu tiên tại Việt Nam nghiên cứu, khảo sát đầy đủ các phytoestrogen và các dạng dẫn xuất của chúng từ phôi đậu tương giống Đ8 Việt Nam, một nguồn phụ phẩm rất giàu phytoestrogen, hiện chưa được sử dụng rộng rãi cho người mà chủ yếu đang làm thức ăn trong chăn nuôi

Luận án cũng đánh giá được khả năng chống oxy hóa, độc tính và

hoạt tính estrogen in vivo của của các cao chiết giàu phytoestrogen từ

phôi hạt

Đề xuất chế độ làm giàu phytoestrogen aglycone từ phôi đậu tương

sử dụng enzyme β-glucosidase từ hạnh nhân và enzyme cellulase từ

Trichoderma reesei Kết quả cho thấy sử dụng enzyme cellulase để

thủy phân hiệu quả hơn so với việc sử dụng enzyme β-glucosidase từ hạnh nhân, là cơ sở khoa học cho việc nghiên cứu phát triển các sản phẩm có chứa phytoestrogen aglycone nâng cao được giá trị của các hợp chất này, làm phong phú thêm tính ứng dụng của chúng trong lĩnh

vực công nghệ thực phẩm, mỹ phẩm và dược phẩm

Chương 1: TỔNG QUAN 1.1 Cây đậu tương và phôi đậu tương

1.1.1 Tình hình sản xuất tiêu thụ đậu tương tại Việt Nam 1.1.2 Thành phần hóa học phôi đậu tương

1.1.3 Thành phần các chất có hoạt tính sinh học trong phôi đậu tương

1.2 Phytoestrogen

1.2.1 Tổng quan về phytoestrogen

1.2.2 Phytoestrogen trong phôi đậu tương

1.2.3 Khả dụng sinh học của phytoestrogen đậu tương

1.2.4 Lợi ích của phytoestrogen aglycone đậu tương và các chất chuyển hóa của chúng với sức khỏe con người

1.2.5 Tính an toàn của phytoestrogen đậu tương

1.3 Các phương pháp chiết xuất phytoestrogen

1.3.1 Các phương pháp truyền thống

1.3.2 Các phương pháp hiện đại

1.3.3 Phương pháp chiết xuất phytoestrogen phôi đậu tương 1.4 Sự chuyển hóa phytoestrogen glucoside đậu tương thành aglycone

1.4.1 Sự chuyển hóa phytoestrogen glucoside bằng enzyme 1.4.2 Sự chuyển hóa phytoestrogen glucoside bằng vi sinh vật 1.5 Phương pháp tinh sạch phytoestrogen aglycone

1.6 Các sản phẩm có chứa phytoestrogen từ đậu tương

Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu

2.1.1 Phôi đậu tương

2.1.2 Hóa chất

2.1.3 Động vật thực nghiệm

2.1.4 Thiết bị thí nghiệm

2.2 Bố trí thí nghiệm và phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp đánh giá và xử lý nguyên liệu

2.2.2 Xây dựng chế độ chiết xuất phytoestrogen

2.2.3 Phương pháp thu nhận phytoestrogen aglycone

2.2.4 Đánh giá khả năng chống oxy hóa của các cao chiết phytoestrogen

2.2.5 Đánh giá hoạt tính phytoestrogen in vivo

5

Bột phôi đậu tương

Bột phôi đậu tương loại lipid Loại lipid bằng n-hexane

Chiết xuất

Dịch chiết phytoestrogen tổng

Cô quay chân không

Cao phytoestrogen tổng

Cao phytoestrogen trước thủy phân

Cao phytoestrogen aglycone thô

Thủy phân bằng enzyme

Cao phytoestrogen aglycone tinh sạch

Tinh sạch bằng dung môi Loại protein, saccharide

Thu hồi n-hexane

Thu hồi ethanol

Đánh giá khả năng chống oxy hóa

Đánh giá hoạt tính phytoestrogen

in vivo

Đánh giá

và xử lý nguyên liệu

Xây dựng chế độ chiết xuất phytoestrogen

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1 Đánh giá và xử lý nguyên liệu

3.1.1 Đánh giá hàm lượng tạp chất phôi đậu tương

Hình 3.1 Phôi đậu tương chưa loại tạp (A) và phôi đậu tương loại

tạp (B)

Bảng 3.1 Kết quả đánh giá lượng tạp trong phôi đậu tương

Kết quả (%)

Hàm lượng tạp chất lt 18,96 ± 0,61

3.1.2 Đặc tính bột phôi đậu tương

Bảng 3.2 Đặc tính bột phôi đậu tương

3.1.3 Đặc tính bột phôi đậu tương đã loại lipid

7

Hình 3.2 Bột phôi đậu tương (A) và bột phôi đậu tương loại lipid (B)

Bảng 3.5 Đặc tính bột phôi đậu tương đã loại lipid

Độ ẩm W 2 (%) Hàm lượng lipid L 2 (%)

5,79 ± 0,09 0,43 ± 0,06

‒ Hiệu suất loại lipid của bột phôi đậu tương là 95,92%

‒ Hiệu suất thu hồi bột phôi loại lipid là 97,21%

‒ Hiệu suất thu hồi dung môi n-hexane là 66,67%

Bảng 3.6 Hàm lượng các phytoestrogen trong bột phôi đậu tương

đã loại lipid

STT Thành phần Hàm lượng

(mg/100g)

Hàm lượng (µmol/g)

3.2 Xây dựng chế độ chiết xuất phytoestrogen

3.2.1 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất phytoestrogen

Hình 3.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khối

lượng dịch chiết phytoestrogen tổng

Hình 3.4 Ảnh hưởng của tỉ lệ nguyên liệu/ dung môi đến khối lượng dịch chiết phytoestrogen tổng

Hình 3.5 Ảnh hưởng của pH đến khối lượng

dịch chiết phytoestrogen tổng

Hình 3.6 Ảnh hưởng của nồng độ ethanol đến khối lượng dịch chiết phytoestrogen tổng

Hình 3.7 Ảnh hưởng của thời gian đến khối

lượng dịch chiết phytoestrogen tổng

tb 233,57 239,39 240,26 241,71 243,49

a

200 210 220 230 240 250

3.2.2 Tối ưu hóa bằng phương pháp đáp ứng bề mặt

Bảng 3.9 Bảng giá trị mã hóa và thực nghiệm của các yếu tố

ý nghĩa về mặt thống kê khi thỏa mãn các điều kiện sau:

1 Giá trị P > F của các mô hình < 0,0001

2 Độ chính xác thích hợp AP (adequate precision) được sử dụng

để định hướng cho không gian thiết kế lớn hơn 4,0

3 Giá trị LOF phản ánh độ rời rạc của dữ liệu phải không có ý nghĩa về mặt thống kê

Ngoài ra, một số yếu tố khác cũng được sử dụng để đánh giá mô hình hoàn toàn tương thích tốt với kết quả thực nghiệm và dự đoán (predicted and actual value plots) và các biểu đồ phân bố ngẫu nhiên của các lần thí nghiệm (residuals versus runs models) Các dữ liệu ở các hình cũng chỉ ra rằng mô hình có sự tương quan tốt khi các điểm tập trung theo dạng đường thẳng và phân bố của các điểm thí nghiệm

là ngẫu nhiên

11

Hình 3.8 Biểu đồ so sánh giá trị thực nghiệm – dự đoán (A) và

Phân bố ngẫu nhiên 29 thí nghiệm (B)

Phương trình hồi quy lượng dịch chiết phytoestrogen tổng (Y) có dạng mô hình bậc 2 được biểu diễn theo biến coded

Y = 264,13 + 2,66X1 + 16,6X2 – 0,58X3 – 1,66X4 + 3,91X1X2 – 1,97X1X 3 – 3,50X1 X 4 – 3,56X2X 3 + 2,64X2X4 + 3,87X3X 4 –

4,21X12 – 3,08X2 – 3,08X3 – 4,17X42

Phương trình hồi quy hàm lượng dịch chiết phytoestrogen tổng (Y) có dạng mô hình bậc 2 được biểu diễn theo biến thực như sau:

Y = - 255,97728 + 1,57066X1 + 25,94183X2 + 55,35413X3 + 1,08964X4 + 0,065233X1 X 2 – 0,065650X1 X 3 – 0,011682X1 X 4 – 1,77938X2 X 3 + 0,13184X2 X4 + 0,38715X3X4 – 4,67993E-0,03X12 – 0,77051X2 – 3,08093X3 – 0,041721X42

Do giá trị a3 >0,05 nên phương trình hồi quy khối lượng dịch chiết phytoestrogen tổng (Y) theo biến thực suy biến như sau

Y = - 255,97728 + 1,57066X1 + 25,94183X2 + 1,08964X4 + 0,065233X1 X 2 – 0,065650X1 X 3 – 0,011682X1 X 4 – 1,77938X2 X 3 + 0,13184X2 X4 + 0,38715X3X4 – 4,67993E-0,03X12 – 0,77051X2 – 3,08093X3 – 0,041721X42

(A) Ảnh hưởng của thời gian chiết xuất và

nồng độ ethanol đến khối lượng dịch chiết

phytoestrogen tổng

(B) Ảnh hưởng của tỉ lệ dung môi: nguyên liệu và nồng độ ethanol đến khối lượng dịch chiết phytoestrogen tổng

(C )Ảnh hưởng của pH và nồng độ ethanol

đến khối lượng dịch chiết phytoestrogen tổng (D) Ảnh hưởng của tỉ lệ dung môi: nguyên

liệu và pH đến khối lượng dịch chiết phytoestrogen tổng

(E) Ảnh hưởng của thời gian chiết xuất và tỉ

lệ dung môi: nguyên liệu đến khối lượng dịch

chiết phytoestrogen tổng

(F) Ảnh hưởng của thời gian chiết xuất và

pH đến khối lượng dịch chiết phytoestrogen tổng

Hình 3.10 Biểu diễn 3D ảnh hưởng các yếu tố thực nghiệm đến

khối lượng dịch chiết phytoestrogen tổng

Như vậy các điều kiện chiết xuất được lựa chọn sau khi tối ưu hóa theo phương pháp bề mặt là:

- Thời gian chiết xuất là 90 phút

- Tỉ lệ dung môi / nguyên liệu là 1/12

±10,23 (mg/100 g CK) tăng lên khi chiết xuất theo phương pháp đáp ứng bề mặt là 39,02 ± 0,16 (µmol/g CK) tương đương 1671,54 ± 6,86 (mg/100g CK)

3.3 Thu nhận phytoestrogen aglycone

3.3.1 Thu nhận cao phytoestrogen tổng

Từ bột phôi đậu tương đã loại lipid tiến hành chiết xuất, cô quay thu cao phytoestrogen tổng Hiệu suất thu hồi dung môi ethanol là 70,21% Cao phytoestrogen tổng được điều chỉnh pH và xác định hàm lượng phytoestrogen thành phần bằng HPLC Kết quả của cao chiết trước khi thủy phân được trình bày trong bảng sau

Bảng 3.13 Hàm lượng các phytoestrogen trong cao chiết trước

Hình 3.12 Hiệu suất thủy phân

các dạng glucoside theo nồng

độ enzyme β-glucosidase

Hình 3.14 Hiệu suất thủy phân các dạng glucoside bằng enzyme β-glucosidase theo thời gian

phytoestrogen tổng số Điều kiện thủy phân các phytoestrogen

glucoside của enzyme là:

‒ pH 5

‒ Nhiệt độ 37 oC

‒ Nồng độ enzyme: 4 U/g bột đậu tương khử lipid

‒ Thời gian 5,5 giờ

3.3.3 Chuyển hóa phytoestrogen glucoside thành aglycone bằng enzyme cellulase

Enzyme cellulase từ Trichoderma reesei C2730 (Sigma) hoạt lực

β-glucosidase 28 U/ml Điều kiện phản ứng thủy phân cơ sở được xác định theo khuyến cáo của Sigma và Wang [78]: pH = 4,8; Nhiệt độ 40

oC; Nồng độ enzyme 0,5 U/g; Thời gian: 4,0 giờ

Hình 3.16 Hiệu suất thủy phân

các dạng glucoside bằng enzyme

cellulase theo nhiệt độ

Bảng 3.18 Hiệu suất thủy phân các dạng glucoside bằng enzyme

17

Hình 3.23 Ảnh hưởng của thời gian thủy phân bằng enzyme

cellulase đến hàm lượng aglycone

Vậy có thể sử dụng enzyme Cellulase từ Trichoderma reesei

(Sigma-Aldrich) để làm giàu aglycone trong cao chiết phytoestrogen

tổng Điều kiện thủy phân của enzyme là:

‒ pH 5

‒ Nhiệt độ 50 oC

‒ Nồng độ enzyme: 1,5 U/g bột đậu tương khử lipid

‒ Thời gian 5,0 giờ

3.3.4 So sánh hiệu quả quá trình thủy phân glucoside bằng enzyme β-glucosidase và cellulase

Dựa vào kết quả làm giàu aglycone bằng hai enzyme β-glucosidase

hạnh nhân và cellulase Trichoderma reesei cho thấy khi sử dụng với nồng độ enzyme thấp hơn, cellulase Trichoderma reesei cho hiệu suất

thủy phân các dạng glucoside tương đương với việc sử dụng glucosidase hạnh nhân, ngoài ra còn rất hiệu quả trong việc thủy phân dạng acetyl-glucoside do đó làm tổng hiệu suất thủy phân các dạng glucoside được nâng lên hơn 10% dẫn đến hàm lượng aglycone tổng

β-số thu được cũng cao hơn

Bảng 3.17 Độ tinh sạch của các cao chiết phytoestrogen theo các

giai đoạn thu nhận

Cao phytoestrogen tổng

Cao phytoestrogen aglycone thô

Cao phytoestrogen aglycone tinh sạch

Khối lượng cao chiết

1201,35 ± 1,20

1333,68 ± 3,63 Hàm lượng aglycone

aglycone so với khối

lượng cao chiết (%)

3.4 Đánh giá khả năng chống oxy hóa của các cao chiết phytoestrogen

Mẫu 1: cao phytoestrogen tổng (mẫu CE)

Mẫu 2: cao phytoestrogen alycone thô (mẫu TPCa)

Mẫu 3: cao phytoestrogen aglycone tinh sạch (mẫu TSC)

3.4.1 Đánh giá khả năng quét gốc tự do DPPH

Khả năng quét gốc tự do DPPH của các cao chiết phytoestrogen được trình bày trong các hình sau

Hình 3.25 Khả năng quét gốc tự do của acid

67,18

0 20 40 60 80