Nghiên cứu nhân giống cây quýt vàng bắc sơn bằng kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật

Ảnh hưởng của Cytokinin BAP đến khả năng tái sinh chồi quýt vàng Bắc Sơn in vitro sau 30 ngày nuôi cấy.. Ảnh hưởng của của Cytokinin BAP đến khả năng nhân nhanh chồi quýt v

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

TRỊNH KHÁNH LÂM

Tên đề tài:

“NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG CÂY QUÝT VÀNG BẮC SƠN BẰNG KĨ THUẬT NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT”

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo: Chính quy

Thái Nguyên, năm 2022

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

TRỊNH KHÁNH LÂM

Tên đề tài:

“NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG CÂY QUÝT VÀNG BẮC SƠN BẰNG KĨ THUẬT NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT”

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo: Chính quy

Giảng viên hướng dẫn: TS Nguyễn Văn Hồng

Thái Nguyên, năm 2022

i

LỜI CẢM ƠN

Được sự đồng ý của Ban giám hiệu nhà trường, Ban Chủ nhiệm Khoa

Nông học, trong thời gian thực tập tốt nghiệp em đã thực hiện đề tài: “Nghiên

cứu nhân giống cây quýt vàng Bắc Sơn bằng kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật”

Trang đầu tiên của khoá luận này em xin gửi lời cảm ơn tới Ban Giám hiệu nhà trường, Ban Chủ nhiệm Khoa Nông học cùng các thầy cô giáo trong Khoa đã tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành đề tài nghiên cứu này Đặc biệt, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc, em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới thầy giáo TS Nguyễn Văn Hồng giảng viên Khoa Nông học và đã tận tình chỉ bảo, giúp đỡ và hướng dẫn em trong thời gian thực hiện đề tài Cuối cùng, em xin cảm ơn gia đình đã tạo điều kiện vật chất và luôn là chỗ dựa tinh thần cho em trong suốt thời gian thực tập, cảm ơn bạn bè đã hết lòng động viên, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian qua

Trong quá trình thực tập, cũng như là quá trình làm báo cáo thực tập thời gian có hạn, trình độ và kỹ năng bản thân còn nhiều hạn chế nên đề tài không thể tránh khỏi những sai sót Em rất mong nhận được những ý kiến đóng góp của thầy cô và các bạn để đề tài của em được hoàn thiện hơn

Lời cuối em xin kính chúc các thầy, cô giáo trong nhà trường, trong Khoa Nông học, cùng các bạn đồng nghiệp sức khoẻ, thành công trong cuộc sống

Em xin chân thành cảm ơn!

Thái Nguyên, ngày tháng năm 2022

Sinh viên thực tập

Trịnh Khánh Lâm

CV : Coefficient variance : Hệ số biến động

Đ/C : Đối chứng Đtg : Đồng tác giả

Kinetin : 6-Furfurylaminopurine

LSD0.05 : Least significant difference:

Giá trị sai khác nhỏ nhất ở mức độ tin cậy 95%

MS : Murashige & Skoog’s, 1962

MT : Môi trường NAA : α-Naphthalene acetic acid

TN : Thí nghiệm

TB : Trung bình

iii

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 4.1 Ảnh hưởng của thời gian khử trùng đến tỷ lệ nhiễm, tỷ lệ chết, tỷ lệ sạch-sống của mẫu hạt làm gốc ghép (sau 20 ngày) 28 Bảng 4.2 Ảnh hưởng của môi trường nền đến tỷ lệ nảy mầm và sinh trưởng của mẫu hạt gốc ghép (sau 30 ngày nuôi cấy) 31 Bảng 4.3 Ảnh hưởng của môi trường nền đến khả năng sinh trưởng của gốc ghép (sau 30 ngày nuôi cấy) 32 Bảng 4.4 Ảnh hưởng của thời gian khử trùng đến tỷ lệ nhiễm, tỷ lệ chết, tỷ lệ sạch-sống đoạn cành quýt vàng Bắc Sơn chứa đỉnh sinh trưởng (sau 20 ngày) 34 Bảng 4.5 Ảnh hưởng của Cytokinin (BAP) đến khả năng tái sinh chồi quýt

vàng Bắc Sơn in vitro (sau 30 ngày nuôi cấy) 35

Bảng 4.6 Ảnh hưởng phối hợp của Cytokinin (BAP 2,0 ppm) và Auxin

(NAA) đến khả năng tái sinh chồi quýt vàng Bắc Sơn in vitro (sau 30 ngày

nuôi cấy) 37 Bảng 4.7 Ảnh hưởng của của Cytokinin (BAP) đến khả năng nhân nhanh

chồi quýt vàng Bắc Sơn in vitro (sau 30 ngày nuôi cấy) 38

Bảng 4.8 Ảnh hưởng phối hợp của Cytokinin (BAP 2,0 ppm) và Auxin

(NAA) đến khả năng nhân nhanh chồi quýt vàng Bắc Sơn in vitro (sau 30

ngày nuôi cấy) 40

Bảng 4.9 Ảnh hưởng của loại gốc ghép đến hiệu quả vi ghép in vitro đỉnh

sinh trưởng quýt vàng Bắc Sơn (sau 20 ngày nuôi cấy) 41

iv

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

DANH MỤC CÁC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT ii

DANH MỤC CÁC BẢNG iii

MỤC LỤC iv

Phần 1 : MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu nghiên cứu 2

1.3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 3

1.3.1 Ý nghĩa khoa học 3

1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn 3

Phần 2 : TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

2.1 Một số đặc điểm thực vật học và thành phần dinh dưỡng của quả quýt 4

2.1.1 Một số đặc điểm thực vật học 4

2.1.2 Thành phần dinh dưỡng và giá trị sử dụng của quả quýt 5

2.2 Tình hình sản xuất cam, quýt trên thế giới và ở Việt Nam 6

2.2.1 Tình hình sản xuất cam, quýt trên thế giới 6

2.2.2 Tình hình sản xuất cam quýt ở Việt Nam 6

2.3 Kỹ thuật nhân giống in vitro trong công nghệ tế bào thực vật 7

2.3.1 Ưu thế và các phương thức nhân giống in vitro 7

2.3.2 Quy trình nhân giống in vitro 9

2.3.3 Chất điều hòa sinh trưởng thuộc nhóm auxin và cytokinin sử dụng trong nuôi cấy mô thực vật 11

2.3.4 Một số yếu tố ảnh hưởng đến nhân giống cây trồng trong ống nghiệm 15

2.4 Một số thành tựu nhân giống cây ăn quả có múi bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro 16

v

Phần 3 : VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18

3.1 Vật liệu, hoá chất, thiết bị và địa điểm nghiên cứu 18

3.1.1 Vật liệu thực vật 18

3.1.2 Hoá chất sử dụng 18

3.1.3 Thiết bị, dụng cụ nghiên cứu 18

3.1.4 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 19

3.2 Nội dung nghiên cứu 19

3.3 Phương pháp nghiên cứu 19

3.3.1 Nghiên cứu kỹ thuật sản xuất gốc ghép in vitro sạch bệnh 19

3.3.2 Nghiên cứu kỹ thuật sản xuất đỉnh sinh trưởng sạch bệnh in vitro 21

3.3.3 Nghiên cứu kỹ thuật vi ghép đỉnh sinh trưởng quýt vàng Bắc Sơn in vitro

24

3.4 Chỉ tiêu nghiên cứu và phương pháp theo dõi 25

3.5 Phương pháp xử lí số liệu 27

Phần 4 : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28

4.1 Kết quả nghiên cứu kỹ thuật sản xuất gốc ghép in vitro sạch bệnh 28

4.1.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian khử trùng đến hiệu quả khử trùng mẫu hạt gốc ghép 28

4.1.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nền đến tỷ lệ nảy mầm và sinh trưởng của mẫu hạt gốc ghép in vitro 31

4.2 Kết quả nghiên cứu kỹ thuật sản xuất đỉnh sinh trưởng sạch bệnh in vitro 34

4.2.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian khử trùng đến tỷ lệ nhiễm, tỷ lệ chết, tỷ lệ sạch-sống của đoạn cành quýt vàng Bắc Sơn chứa đỉnh sinh trưởng 34

4.2.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của Cytokinin (BAP) đến khả năng tái sinh chồi quýt vàng Bắc Sơn in vitro 35

4.2.3 Nghiên cứu ảnh hưởng phối hợp của Cytokinin (BAP 2,0 ppm) và Auxin (NAA) đến khả năng tái sinh chồi quýt vàng Bắc Sơn in vitro 37

vi

4.2.4 Nghiên cứu ảnh hưởng của Cytokinin (BAP) đến khả năng nhân nhanh chồi

quýt vàng Bắc Sơn in vitro 38

4.2.5 Nghiên cứu ảnh hưởng phối hợp của Cytokinin (BAP 2,0 ppm) và Auxin (NAA) đến khả năng nhân nhanh chồi quýt vàng Bắc Sơn in vitro 40

4.3 Kết quả nghiên cứu kỹ thuật vi ghép đỉnh sinh trưởng quýt vàng Bắc Sơn in vitro 41

Phần 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 43

5.1 Kết luận 43

5.2 Kiến nghị 43

TÀI LIỆU THAM KHẢO 44 PHẦN PHỤ LỤC

1

Phần 1

MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Cây quýt (Citrus recutilata Blanco) được nhiều người biết đến là loại

cây ăn quả có vị ngọt, mùi thơm riêng đặc trưng, ngoài ra còn chứa nhiều các chất dinh dưỡng Quýt không chỉ là nguồn cung cấp dưỡng chất mà còn đóng vai trò tích cực trong việc phát triển kinh tế nhiều địa phương Do có hương vị riêng, chất lượng tốt nên mức độ tiêu thụ trên thị trường đang dần tăng lên Với mức giá tốt, cây quýt mang lại nguồn lợi kinh tế đáng kể cho các nhà vườn Giúp nhiều hộ gia đình thoát nghèo, vươn lên làm giàu từ cây quýt Trồng quýt không những giúp phủ xanh những khoảng đất trống mà còn

có vai trò cải tạo cảnh quan và bảo vệ môi trường tự nhiên Phù hợp với khí hậu vùng trung du miền núi nên cây quýt dễ dàng thích nghi với điều kiện sống khô hạn, lá xanh bao phủ quanh năm Để chống xói mòn trên các vùng đồi núi, trồng quýt cũng là 1 giải pháp hiệu quả, khi vừa đem lại hiệu quả kinh tế vừa có thể bảo vệ môi trường sinh thái Không chỉ vậy, cây quýt cũng là 1 thú chơi với những người đam mê cây cảnh, khi cây quýt có tán lá rộng, xanh quanh năm, hoa quả màu sắc đẹp

Cây quýt Bắc Sơn được trồng chủ yếu ở huyện Bắc Sơn, tỉnh Lạng Sơn

Có vị ngọt đậm, hương thơm đặc trưng, là loại quả quý cần được bảo tồn Toàn tỉnh Lạng Sơn hiện có trên 1.400 ha sản xuất quýt, sản lượng thu hoạch hàng năm khoảng 3.000-3.500 tấn, giá trị mang lại cho người dân trên 100 tỷ đồng (Minh Thu, 2022) Với lợi thế của giống quýt bản địa, trong những năm qua, cây quýt vàng Bắc Sơn đã và đang được đẩy mạnh phát triển Tuy nhiên, cây quýt vàng Bắc Sơn hiện nay cũng đứng trước thực tế bị giảm cả về diện tích và phẩm cấp hàng hoá Giống quýt vàng Bắc Sơn được nhân dân trồng chủ yếu quảng canh nên tỷ lệ đồng đều thấp, có biểu hiện suy thoái mạnh về

Citri), ruồi vàng đục quả, bệnh vàng lá Greening và Tristeza…Đặc biệt là các

bệnh nguy hiểm như: bệnh Greening, bệnh Tristeza là nguyên nhân gây suy

giảm nghiêm trọng về diện tích trồng, năng suất và chất lượng của vùng trồng quýt Bắc Sơn (Nguyễn Hữu Đống, 2003)

Để giải quyết kho khăn trên, tăng năng suất, sản lượng và nâng cao chất lượng quả thì cần có biện pháp tạo được giống quýt vàng Bắc Sơn đúng giống, sạch bệnh và cải tạo các diện tích đất trồng bị thoái hóa, chứa mầm bệnh

Phương pháp nhân giống in vitro có thể tạo ra lượng lớn giống quýt vàng

Bắc Sơn đúng giống (cây nhân từ cây giống gốc), đồng đều và hoàn toàn sạch bệnh Thực hiện nhiệm vụ cấp nhà nước “Khai thác và phát triển nguồn gen quýt vàng Bắc Sơn, Lạng Sơn và cam Mường Pồn, Điện Biên”, mã số: NVQG- 2020/ĐT.10, nhóm nghiên cứu đã tiến hành tuyển chọn cây đầu dòng sử dụng làm vật liệu cho sản xuất bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào Để thực hiện

được điều này, nhóm nghiên cứu thực hiện đề tài “"Nghiên cứu nhân giống cây

quýt vàng Bắc Sơn bằng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật" Đề tài thành

công là cơ sở cho sản xuất cây quýt vàng Bắc Sơn đem trồng trong điều kiện nhà lưu giữ và cung cấp vật liệu cho sản xuất giống quýt vàng Bắc Sơn chất lượng cao (đồng đều, sạch bệnh) phục vụ phát triển vùng trồng nguồn gen này

1.2 Mục tiêu nghiên cứu

Nghiên cứu 1 số phương pháp nhân giống quýt vàng Bắc Sơn bằng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật tạo tiền đề sản xuất cây giống chất lượng cao đáp ứng nhu cầu phát triển nguồn quýt vàng Bắc Sơn

1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn

Đề xuất được quy trình công nghệ nhân nhanh giống quýt vàng Bắc Sơn bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào Tạo tiền đề sản xuất cây giống quýt vàng chất lượng cao: đồng đều, sạch bệnh và ở quy mô công nghiệp

Kết quả nghiên cứu cũng là cơ sở khoa học cho việc ứng dụng công

nghệ nuôi cấy in vitro phục vụ cho công tác bảo tồn, khai thác và phát triển

nguồn gen cây quýt vàng Bắc Sơn

4

Phần 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Một số đặc điểm thực vật học và thành phần dinh dưỡng của quả quýt

2.1.1 Một số đặc điểm thực vật học

Cây quýt thuộc bộ cam quýt (Rutales), họ cam quýt (Rutaceae), chi:

Citrus, (Nguyễn Hữu Đống, 2003)

Với bộ lá xanh quanh năm, cây quýt có lá đơn, mọc cách và có eo lá Lá thay nhau rụng trong lúc lá mới xuất hiện nên cây lúc nào cũng xanh lá Khi vò lá có mùi thơm vì trong lá có chứa nhiều túi tinh dầu

Quýt là cây thân gỗ với hình thiết diện tròn, có mầu nâu thẫm, chiều cao

từ 2-3m, ngoại hình của cây thông thường sẽ có hình chóp, có gai ở phần thân, phía bên trong vỏ cây có chứa nhiều túi tiết tinh dầu thơm Nếu cây được trồng bằng hạt thì thường có một gốc lớn, cây được trồng bằng cành chiết thì sẽ có nhiều cành gốc hơn

Quýt là cây thuộc họ rễ cọc, rễ của chúng lan rộng, phát triển ở nhiệt độ

đất 1% Cây trồng bằng hạt sẽ có rễ chính rõ ràng mà không có nhiều rễ cạnh

có thể phát triển to như trồng bằng giâm cành

Hoa thường hình thành ở nách lá, hoa mọc thành nhóm, lưỡng tính, lá đài và hình tứ bội Việc thụ phấn ở hoa thường do các loại côn trùng thụ phấn hộ Cánh hoa thường có số lượng ít gấp 3-4 lần số nhị hoa Quýt phía bắc sản xuất các chồi đầu tiên vào tháng 3 hoặc tháng 4 hàng năm, hầu hết chúng đều đậu quả, nở hoa đợt thứ hai vào tháng 6, đợt 3 vào tháng 7 và cho cành to khoẻ, lá to màu nhạt Những bông hoa tốt nhất của thời kỳ ra hoa là vào tháng hai và tháng ba (Nguyễn Hữu Đống, 2003)

5

Quả quýt bao gồm các phần là: vỏ, thịt và hạt Quả quýt có vỏ màu vàng

và mỏng, vỏ dễ bóc, múi dễ chia, tuỳ loại giống thì quả sẽ có trọng lượng trung bình đạt từ 35-145g Tùy giống có từ 18 đến 20 hạt trong mỗi quả Hạt quýt có 2 lá mầm, đa phôi hay đơn phôi, hạt quýt sẽ có 2 lớp màng vỏ, do thấm nhiều linhin màng bên ngoài cứng hơn màng trong Hạt thường chín cùng quả, nảy mầm ở nhiệt độ từ 10oC đến 30oC, tốt nhất là 25-30oC (Nguyễn Hữu Đống, 2003)

2.1.2 Thành phần dinh dưỡng và giá trị sử dụng của quả quýt

Trong các nghiên cứu gần đây, quýt chứa nhiều chất dinh dưỡng, vitamin, chất khoáng cần thiết, đặc biệt có chứa vitamin C giúp chống lại một số bệnh tật, tăng cường sức đề kháng Trong 100g múi quýt (phần ăn được) có thành phần dinh dưỡng gồm: nước 66,5%, protein 0,6%, lipit 0,7%, gluxit 6,4%, xelulozo 0,4%, năng lượng 32kcal, canxi 25,9mg, photpho 12,6mg, sắt 0,3mg, caroten 0,44mg, vitamin B1 0,06mg, vitamin B2 0,02mg, vitamin PP 0,2mg, vitamin C 41mg và một số axit hữu cơ Ngoài các chất dinh dưỡng nói trên, quả quýt còn mang đến 1 lượng chất xơ không nhỏ, giúp khả năng tiêu hoá được tốt hơn, không gây béo phì (Nguyễn Hữu Đống, 2003)

Qủa quýt có rất nhiều công dụng tốt khác nhau nên được mọi người rất

ưa chuộng như sử dụng để ăn tráng miệng, làm đồ uống, làm mứt Vỏ quýt còn được dùng để chữa cao huyết áp, đau tim và có tác dụng chữa đầy bụng, rối loạn tiêu hóa, chán ăn, ho nhiều đờm Hạt quýt có vị đắng, tính bình, vào hai kinh mạch và thận, có tác dụng kiện tỳ ích vị, hóa đàm Lá quýt có vị đắng, tính bình, quy kinh lạc, có tác dụng ích gan, ích khí, tiêu thủng, làm tan các cục u, chữa đau hạ sườn, đau tức vú, u vú

6

2.2 Tình hình sản xuất cam, quýt trên thế giới và ở Việt Nam

2.2.1 Tình hình sản xuất cam, quýt trên thế giới

Với các nước mạnh về xuất khẩu hoa quả mà cam, quýt đứng trên cả nho, chuối, táo thì ta hiểu được chúng quan trọng thế nào Cam, quýt được trồng tập trung chủ yếu ở các nước có khí hậu cận nhiệt đới như Mexico, Brazin, Mỹ, Trung Quốc, Ấn Độ và các nước ven Địa Trung Hải, các nước ở

vĩ tuyến 30- 35o

Hiện tại, các nước nhiệt đới đã sản xuất cam quýt gần bằng các nước cận nhiệt đới Với các công nghệ hiện đại, kĩ thuật tiên tiến đã nghiên cứu ra nhiều loại giống phù hợp với điều kiện tự nhiên của từng vùng Mặt khác, do dân số ở các nước nhiệt đới có xu hướng tăng nhanh nên nhu cầu tiêu thụ cam, quýt vì thế cũng tăng theo

Theo FAO (năm 2020) tổng sản lượng cam quýt trên thế giới đạt 114,59 triệu tấn Trong đó, năm quốc gia có sản lượng cao nhất là Trung Quốc 30,9 triệu tấn, Brazin 17,7 triệu tấn, Mỹ 5,6 triệu tấn, Ấn Độ 9,8 triệu tấn, Mehico 14,5 triệu tấn Về diện tích trồng của các nước này, đứng đầu là Ấn Độ với 737,00 nghìn ha; Trung Quốc với 577,89 nghìn ha; Brazin với 572,26 nghìn ha; Mexico với 402,78 nghìn ha

2.2.2 Tình hình sản xuất cam quýt ở Việt Nam

Việt Nam thích hợp trồng nhiều loại cây do nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa Vì thế, cây quýt được trồng trải dọc khắp đất nước từ Bắc vào Nam Nếu ở miền Bắc, quýt được trồng nhiều ở một số tỉnh Lạng Sơn, Hưng Yên, Bắc Giang, Bắc Kạn, Tuyên Quang, Hà Giang , thì ở miền Nam được trồng chủ yếu ở Bến Tre, Tiền Giang, Đồng Tháp,…Các nhà vườn trồng quýt ngày càng càng nhiều do nhu cầu tiêu thụ của người dân ngày một nhiều Theo FAO, tại năm 2019, tổng sản lượng cam, quýt của nước ta đạt 1017200 tấn, năm 2020 tăng lên và đạt 1149898 tấn Về năng suất bình quân năm 2019

7

đạt được 142,53 hg/ha thì vào năm 2020 chỉ số này tăng lên 155,77 hg/ha Tới năm 2020 diện tích trồng của Việt Nam đã tăng lên 73955 ha Tuy nhiên, sản lượng quýt trong nước chưa đáp ứng đủ nhu cầu trong nước nên hàng năm chúng ta vẫn phải nhập khẩu quýt từ các nước khác, chủ yếu từ Trung Quốc

2.3 Kỹ thuật nhân giống in vitro trong công nghệ tế bào thực vật

Là một trong những ứng dụng chính của công nghệ tế bào thực vật: nhân

giống in vitro (vi nhân giống) sử dụng sự sinh trưởng nhân tạo và nhân các

mô phân sinh và các đỉnh sinh trưởng trong cây Để làm nguyên liệu tốt cho nhân giống thì sử dụng đỉnh sinh trưởng của chồi, tiếp đến là đỉnh mô phân sinh đã làm sạch bệnh (Lê Trần Bình và cs, 1997)

Kỹ thuật nhân nhanh được ứng dụng nhằm phục vụ các mục đích sau: (1) Duy trì và sinh sản nhanh các kiểu gen quý hiếm làm nguyên liệu cho công tác chọn giống

(2) Duy trì và nhân nhanh các dòng vô tính ưu việt, và cung cấp hạt giống cho các loại cây trồng khác nhau như cây lương thực có củ, rau, cây cảnh và cây thuốc

(3) Nhân nhanh ở điều kiện vô trùng cách li tái nhiễm kết hợp với việc làm sạch bệnh vi-rút

(4) Rút ngắn thời gian sản xuất của cây lai và giống cây trồng tự nhiên có đặc tính ưu việt hoặc nhân nhanh các cặp bố mẹ lai trong sản xuất hạt lai (5) Các dòng cây lai được bảo quản tốt trong ngân hàng gen (Lê Trần Bình và cs, 1997)

2.3.1 Ưu thế và các phương thức nhân giống in vitro

Do nhu cầu tiêu thụ tăng cao, cần phát triển các loại giống cho năng suất,

chất lượng cao vì thế ngành công nghiệp nhân giống in vitro được mở ra nhằm phục vụ mục đích trên Nhân giống in vitro có các ưu điểm như sau:

8

Thứ nhất: Rút gọn được khâu đưa giống vào sản xuất đại trà với hệ số nhân giống cao, đảm bảo tốc độ nhân nhanh Phù hợp với việc bảo tồn các nguồn gen quý hiếm

Thứ hai: Trong 1 diện tích không lớn có thể nhân được 1 số lượng lớn cây giống

Thứ ba: Có thể đảm bảo các nguồn giống sạch bệnh vì được cách li khỏi nguồn bệnh và làm việc trong môi trường khử trùng

Thứ tư: Giảm chi phí và thuận lợi cho việc vận chuyển với số lượng cây lớn , cây giống có thể bảo quản trong hàng tháng ở nhiệt độ 40C

Thứ năm: Tại bất kỳ thời điểm nào trong ngày, bất kỳ thời điểm nào trong năm, quy trình sản xuất vẫn có thể hoạt động

Để có thể nhân giống cây trên diện rộng, ngay cả những cây khó nhân giống bằng phương pháp thông thường, cần phải áp dụng phương pháp nhân

giống in vitro là nuôi cấy mô phân sinh hoặc đỉnh sinh trưởng Tái sinh cây

hoàn chỉnh từ các bộ phận khác của cây và nhân giống sang giai đoạn mô sẹo Qua các phương thức đó sẽ được nguồn nguyên liệu sạch bệnh, có khả năng tái tạo, phục hồi lại các nguồn gen hiếm có nguy cơ tuyệt chủng

Nuôi cấy mô phân sinh hoặc đỉnh sinh trưởng

Theo (Lê Trần Bình và cs, 1997), các mẫu vật nuôi cấy tách đỉnh sinh trưởng có kích thước nhỏ hơn 0,1mm từ đỉnh của đỉnh sinh trưởng là mô phân sinh Tuy nhiên, rất khó để nuôi cấy thành công các mẫu vật trong thực tế Việc nuôi cấy cũng chỉ với mục đích không nhiễm vi rút Các loài thực vật như phong lan, dứa và mía là những đối tượng phổ biến nhất đối với đỉnh phát triển mô hoặc với đỉnh sinh trưởng từ 5 đến 10 mm Kích thước chồi, tỷ lệ sống và độ ổn định của chồi là các chỉ số quan trọng trong mô phân sinh hoặc nuôi cấy tăng trưởng, vì thông thường nếu tỷ lệ sống của chồi tăng tỷ lệ sống sót sẽ tăng và độ ổn định của chồi cũng sẽ giảm Nhưng nếu xét hiệu quả kinh

9

tế của cây trồng, kích thước chồi tăng lên thì ngược lại hiệu quả kinh tế giảm

Vì vậy, để tìm ra phương pháp chọn mẫu tối ưu, cần phải biết kết hợp các yếu tố Ngọn sinh dưỡng sẽ phát triển thành một hoặc nhiều chồi và chồi sẽ phát triển thành cây có rễ hoàn chỉnh nếu được trồng trong điều kiện phù hợp Xét nguồn gốc của mô phân sinh hay sự phát triển của cây trồng theo ngọn, có 3 khả năng: cây phát triển từ chồi ngọn, cây phát triển từ chồi ngọn, chồi nách phá vỡ trạng thái ngủ, cây phát triển từ chồi mới xuất hiện Tuy vậy, rất khó phân biệt được chồi phá ngủ và chồi mới phát sinh ở ngoài thực tế Gần đây, phương pháp nuôi cấy mô phân sinh cũng đã bắt đầu được áp dụng với kết quả trên cây ăn quả và cây rừng, bao gồm các cây có giá trị như

cà phê, cây lê, thông, bồ đề, cây cam, cây quýt…

Tái sinh cây hoàn chỉnh từ các bộ phận khác của cây

Vì tế bào thực vật là đa năng nên phần dễ phát triển thành công, ngoài

mô phân sinh và đỉnh sinh trưởng thì phần còn lại của cơ thể thực vật đều có thể được nhân giống trong ống nghiệm Các bộ phận này là: Các đoạn của thân cây trong các các loài như thuốc lá, cam, chanh

Nhân giống qua giai đoạn mô sẹo

Trong mục đích nhân giống vô tính, không chỉ thu được cây nhanh chóng mà còn khá đồng đều về mặt di truyền Tuy vậy, trong nhiều trường hợp mô nuôi cấy sẽ không tái sinh luôn mà có khả năng phát triển thành khối

mô sẹo Khi cấy chuyển nhiều lần thì tế bào mô sẹo sẽ không có tính ổn định

về mặt di truyền Các cây sạch vi-rút có thể thu được được từ giai đoạn mô sẹo này (Mai Xuân Lương, 2005)

2.3.2 Quy trình nhân giống in vitro

Theo Đỗ Năng Vịnh, (2005) quy trình nhân giống in vitro gồm các giai

đoạn sau:

Giai đoạn 1: Chuẩn bị lấy cây làm vật liệu nền

10

Cần chọn lọc kỹ càng ở giai đoạn này vì cây con sẽ mang các đặc tính và tính trạng của cây mẹ trước, do đó cây mẹ là cây mẹ ưu việt, khỏe và có giá trị kinh tế cao Sau khi chọn cây xong, tiếp tục chọn để lấy mẫu, các cơ quan là thường là thân non có chồi ngủ, lá non, hoa non, hạt Trong môi trường nuôi cấy, các mô được chọn để nuôi cấy sẽ được chọn lọc kĩ càng Mô ghép nói chung là mô có khả năng giữ được các đặc tính sinh học quý giá của cây mẹ, ít nguy cơ đột biến

Giai đoạn 2: Thiết lập với phương thức cấy vô trùng

Sẽ là giai đoạn chuyển mẫu vật từ ngoài vào môi trường nuôi cấy, giai đoạn này được tiến hành theo 2 bước:

(1) Bề mặt quanh mẫu vật sẽ được khử trùng, chuẩn bị các môi trường nuôi cấy phù hợp với đối tượng là cây trồng

(2) Cấy mẫu vô trùng vào bình nuôi cấy ống nghiệm với môi trường nhân tạo đã có sẵn từ trước Sau khi lọc các mẫu nuôi cấy bị nhiễm vi khuẩn, nấm và các mẫu cấy sạch không bị nhiễm sẽ được nuôi trong phòng nuôi cấy với điều kiện nhiệt độ và ánh sáng thích hợp Chỉ sau thời gian nhất định, từ mẫu nuôi cấy đó sẽ bắt đầu xuất hiện các cụm tế bào, các cơ quan hoặc các phôi vô tính

Giai đoạn 3: Nhân nhanh chồi

Với giai đoạn sản xuất này sẽ quyết định hiệu quả của quá trình nuôi cấy

mô, người nuôi cấy sẽ tùy thuộc mục đích mà quyết định cây được nhân nhạnh như nào Cây trồng sẽ bước vào giai đoạn sản xuất khi một cây sạch đã được tạo ra và từ đó sẽ thu được các cụm chồi và các dòng vô tính phát triển tốt Các thành phần và điều kiện môi trường sẽ được tùy chỉnh để tối ưu hóa nhất, để đạt được mục tiêu với tốc độ nhân nhanh nhất Không nên kéo dài quá lâu ở giai đoạn này

Giai đoạn 4: Tạo rễ

11

Ở môi trường nuôi cấy bình thường thì rễ của cây trồng sẽ có rễ tự sinh, nhưng để kích thích ra rễ thì thường phải chuyển chồi này qua môi trường kích thích tạo rễ Nhiều loài khi chuyển trực tiếp ra đất thì các chồi sẽ tự tạo

rễ Thông thường giai đoạn này cần 2 - 8 tuần

Giai đoạn 5: Chuyển cây ra đất trồng

Giai đoạn sẽ quyết định khả năng thành công khi ứng dụng quy trình

nhân giống in vitro sẽ chính là giai đoạn đưa cây từ điều kiện vô trùng của

phòng thí nghiệm ra môi trường bên ngoài Với đa số các loài cây trồng được chuyển ra ngoài vườn ươm chỉ khi cây đã ra rễ và đã tạo thành cây hoàn chỉnh, nhưng đối với 1 số loại khác đã có thể đưa ra đất khi chưa ra rễ Do đưa từ điều kiện vô trùng ra ngoài môi trường tự nhiên nên cây cần quá trình chăm sóc đặc biệt để có thể thích nghi với điều kiện môi trường bên ngoài Vì thế mà vườn ươm cần đáp ứng các yêu cầu: Dùng nilon bao phủ để che ánh nắng trực tiếp và có hệ thống cung cấp độ ẩm và làm mát cây bằng các hệ thống phun sương; đất mùn, hoặc các hỗn hợp nhân tạo không chứa đất, mùn cưa và bọt biển… để làm giá thể trồng cây Giai đoạn này thường đòi hỏi 4 -

16 tuần (Đỗ Năng Vịnh, 2005)

2.3.3 Chất điều hòa sinh trưởng thuộc nhóm auxin và cytokinin sử dụng trong nuôi cấy mô thực vật

Bổ sung một chất hoặc nhiều chất điều hòa sinh trưởng như cytokinin, auxin và gibberellin ngoài việc bổ sung các chất dinh dưỡng cho mô nuôi cấy

là việc làm rất cần thiết cho sự kích thích sinh trưởng đối với mô nuôi cấy, phát triển cũng như phân hóa các cơ quan Tuy nhiên, những chất này có chứa hàm lượng chất điều hòa sinh trưởng nội sinh của chúng và thay đổi tùy theo loài thực vật cũng như các loại mô Hai nhóm auxin và cytokinin là hai nhóm được sử dụng nhiều nhất trong quá trình nuôi cấy mô (Nguyễn Như Khanh và

cs, 2011)

12

* Auxin

Indol acetic acid (IAA) là dạng auxin đầu tiên trong tất cả các loại thực vật nó và cũng là bản chất hóa học của auxin tự nhiên bên trong tế bào thực vật, chủ yếu và vô cùng quan trọng Nó còn có thể tồn tại ở dạng liên kết không có hoạt tính sinh học như là IAA-glucan, IAA-myoinositol, IAA- glucozo…Những dẫn xuất khác của indol cũng được thể hiện sự hoạt tính của auxin là indol ethanol, indol tryptamine, indol acetaldehyd và indol pyruvate Auxin xuất hiện chủ yếu ở đỉnh của chồi và ngọn rồi sau đó thông qua di chuyển đi xuống các bộ phận của cơ thể thực vật có tính non như rễ, lá và một số mô dự trữ… sau đó được lấy từ những loại thực vật bậc cao bao gồm cả tảo, nấm và vi khuẩn Auxin có hai loại bao gồm auxin tự nhiên và auxin tổng hợp (NAA, IBA,2,4-D…) (Nguyễn Minh Chơn, 2004)

Các chất điều hòa sinh trưởng bên trong nhóm auxin gồm một số những hợp chất đã từng được sử dụng trong nông nghiệp từ rất lâu về trước IAA được tổng hợp và trở thành một hợp chất có giá trị cao chỉ sau khi nó được tìm thấy và phát triển trong tự nhiên Tuy nhiển IAA lại dễ dàng có thể phân hủy thành các hợp chất mất đi hoạt tính dưới sự ảnh hưởng khắc nghiệt của ánh sáng và cả những vi sinh vật nên IAA vẫn được xem là không có lợi để sử dụng rộng rãi trong nông nghiệp Một trong những tác dụng lớn của auxin là sự kích thích hình thành rễ của những lát cắt phần thân thực vật Những hợp chất tổng hợp được con người tạo ra có vai trò tương tự IAA, trong đó có cả IBA IBA là dạng hợp chất có hoạt tính auxin khá yếu nhưng bù lại là có khả năng ổn định tốt và sự vô hiệu hệ enzyme có tác dụng làm mất đi hoạt tính của auxin (Nguyễn Bá Lộc, 1997)

Hiện nay các auxin thường được sử dụng trong nuôi cấy mô và các tế bào nhằm kích thích quá trình phân bào và quá trình sinh trưởng của mô sẹo Trong số các auxin thì auxin IBA và auxin NAA lại chủ yếu dùng cho môi

13

trường tạo ra rễ và kết hợp với cytokinin sử dụng cho những môi trường ra chồi Auxin thường được hòa tan trong hợp chất ethanol hoặc NaOH dạng pha loãng (Nguyễn Bá Lộc, 1997)

Mức độ auxin thường được sử dụng trong khoảng từ 0,1-2,0mg/l, riêng đối với auxin IAA, do kém bền khi tiếp xúc với nhiệt độ và ánh sáng nên nồng độ được sử dụng ở mức cao hơn là (1,0-3,0mg/l) Chúng có hiệu quả sinh lý tốt nhất khi ở nồng độ thấp Tùy theo sự riêng biệt của các loại auxin mà hàm lượng sử dụng và đối tượng nuôi cấy để tác động sinh lý của auxin

là kích thích sự sinh trưởng của mô và hoạt hóa quá trình hình thành ra rễ hay

có thể nói là thúc đẩy sự phân chia mạnh mẽ của tế bào qua đó hình thành mô sẹo (Vũ Văn Vụ và cs, 2010)

* Cytokinin

Phần lớn cytokinin được dẫn xuất của purin Loại cytokinin được phát hiện đầu tiên và cũng là dạng phổ biến nhất chính là zeatin được tách từ mầm ngô Bên cạnh đó còn có rất nhiều cytokinin khác như kinetin, dihydrozeatin Trong đó loại kinetin không xuất hiện trong môi trường tự nhiên, mà lại được con người thu nhận bằng phương pháp xử lý nhiệt DNA (Nguyễn Bá Lộc, 1997)

Sự chứng minh về khả năng ngăn cản quá trình vàng lá của benzyladenin (BA) là một phát hiện được thu hút bởi rất nhiều nhà sinh lý học bắt đầu từ những năm 1950 Đến năm 1960, các nhà nghiên cứu kết luận rằng BA có thể được kích thích bởi nhiều quá trình, BA thường được sử dụng trong việc nuôi cấy mô nhằm kéo dài chồi cũng như phát sinh phôi với các nồng độ khác nhau tùy theo từng đối tượng thực vật được nuôi cấy và qua cả mục đích nuôi cấy (Nguyễn Bá Lộc, 1997) Cytokinin được phát hiện là có mặt trong mọi thực vật, với hàm lượng cao nhất được phát hiện trong phôi và trong quá trình quả đang tiến hành phát triển Hoạt tính của chúng cũng được được tăng

14

cường đáng kể khi chúng được tương tác với hợp chất myo-inositol, nhưng lại

có thể bị mất đi khi kết hợp bên trong thành phần của các glycoside (Nguyễn

Bá Lộc, 1997) Giống như auxin, cytokinin tham gia trong quá trình điều hòa các phản ứng trong cây, đồng thời cũng làm tăng thêm các quá trình trao đổi giữa axit nucleic và protein Cytokinin tự điều chỉnh sinh trưởng bằng rất nhiều cách ví dụ như điều chỉnh tốc độ tổng hợp của ADN khi phân chia các tế bào, qua đó làm chậm đi sự lão hóa của lá và góp phần phá vỡ tình trạng ngủ của hạt cũng như kích thích cho hạt được nảy mầm Ngoài ra còn kích thích mọc hoa và phát triển của quả, tạo nên sự hình thành chồi và mầm trong nhiều mô, làm tăng thêm diện tích phiến lá do quá trình kích thích sự lớn lên của tế bào (Nguyễn Bá Lộc, 1997)

Trong môi trường điều kiện nuôi cấy mô, cytokinin là rất cần thiết cho sự phân chia của các tế bào cũng như tạo và nhân mô sẹo, sự phân hóa chồi từ

mô sẹo hoặc từ những cơ quan, tạo ra phôi vô tính sau đó kích thích sự phát sinh chồi nách và kìm hãm quá trình ảnh hưởng ưu thế đối với chồi đỉnh, tăng cường khả năng phát sinh các chồi phụ Các loại cytokinin thường được dùng là: BAP, kinetin… Cytokinin được hòa tan trong dung dịch hợp chất HCl pha loãng (Nguyễn Bá Lộc, 1997)

Hàm lượng sử dụng phù hợp các loại cytokinin trong nuôi cấy mô dao động trong khoảng từ 0,1-2,0mg/l Đối với những nồng độ cao hơn, cytokinin

có tác dụng là kích thích rõ rệt đến quá trình hình thành chồi bất định, đồng thời cũng ức chế mạnh quá trình tạo rễ của chồi nuôi cấy Trong nuôi cấy thực vât, có những loại mẫu chỉ cần auxin hoặc là cytokinin, hoặc là không cần cả hai, nhưng đa số đối với các trường hợp khác phải sử dụng kết hợp cả auxin

và cytokinin với những tổ hợp tỷ lệ khác nhau (Vũ Văn Vụ và cs, 2010)

15

2.3.4 Một số yếu tố ảnh hưởng đến nhân giống cây trồng trong ống nghiệm

- Ánh sáng và nhiệt độ: Các mẫu nuôi cấy thường được đặt trong những phòng nuôi có sự ổn định về ánh sáng cũng như nhiệt độ Tất cả những mẫu nuôi cấy đều cần được đảm bảo ánh sáng, ngoại trừ một số những trường hợp nuôi cấy cấy tạo mô sẹo, nhưng trong quá trình tái sinh và nhân giống của chúng cũng đều đòi hỏi yêu cầu có ánh sáng, tỷ lệ chiếu sáng và pha tối phù hợp là 16/8 Nhiệt độ của phòng nuôi cấy được duy trì ở mức trong khoảng 25

- Nguồn Cacbon: Các mẫu nuôi cấy thực vật nói chung sẽ không thể nào được quang hợp, nếu như có quang hợp thì cũng sẽ xảy ra tình trạng cường độ rất yếu do thiếu chất chlorophil, cường độ CO2 và cả nhiều điều kiện khác Vì vậy, cần phải đưa thêm những hợp chất như hydratcacbon vào bên trong thành phần môi trường nuôi cấy kể cả khi mẫu cấy là chồi xanh có khả năng tự quang hợp Loại hydratcacbon được sử dụng phổ biến nhất hiện nay là đường sucrose với hàm lượng đo được từ 2%-6% (Vũ Văn Vụ và cs, 2010)

- Than hoạt tính: Được sử dụng để hấp thụ các chất mầu và các hợp chất phenol và các sản phẩm trao đổi chất thứ cấp trong trường hợp các chất đó phát sinh tác dụng gây ức chế đến sự sinh trưởng của mẫu nghiên cứu Than hoạt tính cũng sẽ tự động hút các chất hữu cơ như vitamin, phytohoocmon, sắt chelat, kẽm Hàm lượng sử dụng than hoạt tính trong khoảng từ 0,2%-0,3% Không chỉ vậy, than hoạt tính còn có tác dụng làm giảm hiệu quả của chất điều hòa sự sinh trưởng và làm thay đổi môi trường ánh sáng, cũng như có thể kích thích sự hình thành và phát triển mạnh mẽ hơn của rễ một số trường hợp khác than hoạt tính có thể thúc đẩy phát sinh phôi vô tính và kích thích quá trình sinh trưởng, phát sinh các cơ quan của những loài cây có thân gỗ (Vũ Văn Vụ và cs, 2010)

16

- Nước dừa: Nước dừa được công nhận và xác định là chứa rất nhiều các hợp chất hữu cơ, chất khoáng và cả chất kích thích sự sinh trưởng Nước dừa đã được sử dụng phổ biến để kích thích phân hóa cũng như nhân nhanh chồi ở rất nhiều loài cây Hiện nay nước dừa thường được sử dụng ở nồng độ lý

tưởng nhất là từ 5% đến 20% (Lê Văn Hoàng, 2007)

2.4 Một số thành tựu nhân giống cây ăn quả có múi bằng kỹ thuật nuôi

cấy in vitro

Những năm gần đây, phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật đang được ứng dụng rất rộng rãi, không những trong quá trình nghiên cứu mà còn được ứng dụng sử dụng trong thực tiễn Tuy nhiên hiện nay, phương pháp này lại đang được chủ yếu được thực hiện trên nhóm cây thân thảo, còn trên nhóm cây thân gỗ, đặc biệt là cây ăn quả vẫn còn đang bị hạn chế

Nghiên cứu tạo ra chồi in vitro ở cây chanh dây (Passiflora edulis Sims),

Lê Văn Trường Huân (2007) đã nhận xét là môi trường tạo ra đa chồi từ đoạn thân mang mắt chồi bên của cây chanh dây trồng ngoài tự nhiên thực chất là môi trường MS cơ bản được bổ sung đường sucrose 20g/l + agar 8g/l + BAP 0,5mg/l đã cho hệ số nhân chồi là 6,57± 0,74

Nghiên cứu nhân giống cây cam chua của (Citrus aurantium L.),

Mohammad và cs (2013) đã chỉ ra, đoạn phía trên trụ lá mầm phát sinh chồi cao nhất trong môi trường MS cơ bản và được bổ sung thêm BAP 2,5mg/l + α-NAA 0,05mg/l, với tỷ lệ phát sinh chồi đạt tỷ lệ là 90% cùng với đó số chồi/mẫu đạt được là 4,2 chồi

Nghiên cứu nhân giống cây chanh thô (Citrus jambhiri Lush) qua mô

sẹo, các tác giả Hawkat và cs thuộc Khoa Sinh học Đại học Quaid-i-Azam Islamabas thuộc Pakistan (2006) đã nhận định, môi trường MS cơ bản được

bổ sung BAP 3,0mg/l cho các mô sẹo có nguồn gốc từ đoạn thân trên trụ lá mầm có tỷ lệ phát sinh chồi ở mức cao nhất (70%) và các chồi phát sinh ra rễ

17

tốt nhất ở môi trường MS cơ bản được bổ sung thêm α-NAA 0,5mg/l với tỷ lệ chồi ra rễ cũng ở mức 70%

Nghiên cứu để nhân giống bưởi (Citrusn Grandis (L.) Osbeck), của tác

giả Ibrahim (2012) đã xác định, môi trường để tái sinh chồi trực tiếp từ đoạn thân và mang chồi nách là MS cơ bản bổ sung BAP 2,0mg/l + NAA 0,1mg/l với số chồi/mẫu là 9,33 và sau đó là môi trường MS cơ bản được bổ sung BAP 4,0mg/l +NAA 0,1mg/l cho số lượng chồi/mẫu là 6,66 Môi trường tái sinh chồi gián tiếp từ mô sẹo tối ưu nhất là MS cơ bản bổ sung BAP 1,0mg/l +NAA 0,1mg/l cho 6,33 chồi/mẫu, môi trường MS cơ bản bổ sung BAP 2,0mg/l + NAA 0,1mg/l cho 4,33 chồi/mẫu Kết luận nghiên cứu là chồi sẽ ra

rễ tốt nhất là MS cơ bản bổ sung NAA 0,2mg/l +BAP 0,1mg/l

Sarker và cs (2015), sau khi nghiên cứu nhân giống cây cam quýt

(Citrusaurantifollia) đã nhận định, môi trường điều kiện tối ưu nhất cho tái

sinh chồi trực tiếp từ phần gốc thân mang nách lá mầm là MS cơ bản và được

bổ sung BAP 1,5mg/l sau thời gian nuôi cấy 16 ngày cho ra tỷ lệ mẫu phát

sinh chồi đạt tỷ lệ lên tới 90% và đạt 5 chồi/mẫu

18

Phần 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Vật liệu, hoá chất, thiết bị và địa điểm nghiên cứu

3.1.1 Vật liệu thực vật

Hạt gốc ghép (hạt bưởi diễn, hạt bưởi chua, hạt chấp), cành quýt vàng Bắc Sơn mang mắt ngủ

3.1.2 Hoá chất sử dụng

- Môi trường MS (Murashige & Skoog’s, 1962)

- Các chất bổ sung vào môi trường nuôi cấy gồm: Đường sucrose, agar

- Một số chất kích thích sinh trưởng thực vật thuộc nhóm Auxin (NAA), nhóm Cytokinin (BAP)

3.1.3 Thiết bị, dụng cụ nghiên cứu

Bảng 3.1: Thiết bị, dụng cụ nghiên cứu

Nồi hấp vô trùng Cốc đong, ống đong

Hệ thống giàn đèn Đĩa (hạt đậu, peptri)

Cùng các trang thiết bị, dụng cụ khác phục vụ nghiên cứu của Phòng Công nghệ Tế bào, Viện Khoa học Sự sống

19

3.1.4 Địa điểm và thời gian nghiên cứu

Địa điểm nghiên cứu: Phòng Công nghệ tế bào thuộc Viện Khoa học sự sống, Trường Đại học Nông Lâm – Đại học Thái Nguyên

Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 2 năm 2022 đến tháng 6 năm 2022

3.2 Nội dung nghiên cứu

- Nội dung 1: Nghiên cứu kỹ thuật sản xuất gốc ghép in vitro sạch bệnh

- Nội dung 2: Nghiên cứu kỹ thuật sản xuất đỉnh sinh trưởng sạch bệnh

in vitro

- Nội dung 3: Nghiên cứu kỹ thuật vi ghép đỉnh sinh trưởng quýt vàng

Bắc Sơn in vitro

3.3 Phương pháp nghiên cứu

3.3.1 Nghiên cứu kỹ thuật sản xuất gốc ghép in vitro sạch bệnh

Thí nghiệm 1:Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian khử trùng đến hiệu quả khử trùng mẫu hạt gốc ghép

- Vật liệu nghiên cứu: Hạt bưởi diễn, bưởi chua, chấp (từ quả chín)

- Công thức thí nghiệm:

Công thức 1 (đối chứng): Nước cất vô trùng

- Phương pháp bố trí thí nghiệm: Các thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại 20 mẫu/công thức Bình nuôi cấy được đặt trong phòng thí nghiệm với cường độ ánh sáng 2000-

- Kỹ thuật khử trùng mẫu cấy: Mẫu cấy đem rửa sạch bằng nước sạch trong 10 phút, mẫu được ngâm trong xà phòng (0,01 %) 10 phút và rửa lại

20

bằng nước máy 5 lần Trước khi đưa mẫu vào phòng cấy, mẫu được rửa sạch bằng nước cất vô trùng và tiến hành thí nghiệm khử trùng Trong tủ cấy, mẫu được rửa với nước cất vô trùng 3 lần, mỗi lần 5 phút Tiếp theo, mẫu được khử trùng sơ bộ bằng cồn 70 % trong 30 giây, rồi rửa lại bằng nước cất vô

gian khác nhau tùy từng công thức thí nghiệm Kết thúc khử trùng, mẫu được rửa lại 5 lần bằng nước cất vô trùng trước khi cấy mẫu vào môi trường thích hợp để đánh giá hiệu quả khử trùng

Các chỉ tiêu theo dõi (sau 20 ngày nuôi cấy): Tỷ lệ nhiễm (%); Tỷ lệ mẫu sạch, chết (%); Tỷ lệ sạch, sống (%)

Thí nghiệm 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nền đến sinh trưởng của mẫu hạt gốc ghép in vitro

- Các công thức thí nghiệm gồm:

CT1: Môi trường MS (Murashige & Skoog’s, 1962) (Bảng 5, phụ lục 1) CT2: Môi trường CHU (N6) Medium Including Vitamins (Phụ lục 1)

CT3: Môi trường Gamborg (B5) Medium Including Vitamins (Bảng 6,

phụ lục 1)

- Phương pháp bố trí thí nghiệm: Sau khi khử trùng, hạt gốc ghép xác định sạch bệnh được cấy chuyển sang môi trường nuôi cấy khác nhau (MS, N6, B5) để đánh giá khả năng phù hợp của môi trường nền với sinh trưởng của hạt gốc ghép Các thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại 20 mẫu/công thức Bình nuôi cấy được đặt trong phòng thí nghiệm với cường độ ánh sáng 2000-2500 lux, nhiệt độ phòng

Các chỉ tiêu theo dõi: Thí nghiệm được theo dõi trong 30 ngày với các chỉ tiêu sau: Tỷ lệ nảy mầm (%); Đường kính thân(mm); chiều cao (cm); số

lá (lá)

21

3.3.2 Nghiên cứu kỹ thuật sản xuất đỉnh sinh trưởng sạch bệnh in vitro

Thí nghiệm 3 : Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian khử trùng đến hiệu quả khử trùng đoạn cành quýt vàng Bắc Sơn chứa đỉnh sinh trưởng

- Vật liệu nghiên cứu: Đoạn cành chứa đỉnh sinh trưởng của quýt vàng Bắc Sơn

- Công thức thí nghiệm:

Công thức 1 (đối chứng): Nước cất vô trùng

Công thức 2: HgCl2 0,1% trong 5 phút

Công thức 3: HgCl2 0,1% trong 10 phút

Công thức 4: HgCl2 0,1% trong 15 phút

Công thức 5: HgCl2 0,1% trong 20 phút

- Phương pháp bố trí thí nghiệm: Các thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại 20 mẫu/công thức Bình nuôi cấy được đặt trong phòng thí nghiệm với cường độ ánh sáng 2000-

- Khử trùng mẫu cấy: Mẫu cấy đem rửa sạch bằng nước sạch trong 10 phút, mẫu được ngâm trong xà phòng nồng độ 0,01 % trong 10 phút và rửa lại bằng nước máy 5 lần, cho sạch xà phòng Trước khi đưa mẫu vào phòng cấy, mẫu được rửa sạch bằng nước cất vô trùng và tiến hành thí nghiệm khử trùng Trong tủ cấy, mẫu được rửa với nước cất vô trùng 3 lần, mỗi lần 5 phút Tiếp theo, mẫu được khử trùng sơ bộ bằng cồn 70 % trong 30 giây, rồi rửa lại bằng

thời gian khác nhau tùy từng công thức thí nghiệm Cuối cùng, mẫu được rửa lại 5 lần bằng nước cất vô trùng trước khi cấy mẫu vào môi trường thích hợp để đánh giá hiệu quả khử trùng

Các chỉ tiêu theo dõi (sau 20 ngày nuôi cấy): Tỷ lệ nhiễm (%); Tỷ lệ mẫu sạch, chết (%); Tỷ lệ sạch, sống (%)

22

Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng của chất điều tiết Cytokinin (BAP) đến khả năng tái sinh chồi quýt vàng Bắc Sơn in vitro

- Vật liệu nghiên cứu: Đoạn cành chứa chồi nách đã được xác định vô trùng

- Thí nghiệm gồm các công thức:

Công thức 1(đ/c): BAP 0,0 ppm

Công thức 2: BAP 0,5 ppm

Công thức 3: BAP 1,0 ppm

Công thức 4: BAP 1,5 ppm

Công thức 5: BAP 2,0 ppm

Công thức 6: BAP 2,5 ppm

Công thức 7: BAP 3,0 ppm

- Phương pháp bố trí thí nghiệm: Chồi nách vô trùng, được cấy vào môi trường MS và bổ sung các chất điều tiết sinh trưởng BAP ở các nồng độ khác nhau tùy từng công thức thí nghiệm để xác đinh hiệu quả tái sinh chồi quýt

vàng Bắc Sơn in vitro Các thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu

nhiên với 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại 10 mẫu/công thức Bình nuôi cấy được đặt lên giá nuôi trong phòng thí nghiệm với cường độ ánh sáng 2000-

Thí nghiệm 5: Nghiên cứu ảnh hưởng phối hợp của Cytokinin (BAP 2,0 ppm) và Auxin (NAA) đến khả năng tái sinh chồi quýt vàng Bắc Sơn in vitro

- Vật liệu nghiên cứu: Đoạn cành chứa chồi nách đã được xác định vô trùng

- Thí nghiệm gồm các công thức:

Công thức 1(đ/c): BAP 2,0 ppm

Công thức 2: BAP 2,0 ppm+ NAA 0,1ppm

Công thức 3: BAP 2,0ppm + NAA 0,2ppm

Công thức 4: BAP 2,0ppm + NAA 0,3ppm

Công thức 5: BAP 2,0ppm + NAA 0,4ppm

23

Công thức 6: BAP 2,0ppm + NAA 0,5ppm

- Phương pháp bố trí thí nghiệm: Chồi nách vô trùng, được cấy vào môi trường MS + BAP* (nồng độ BAP tốt nhất xác định ở thí nghiệm 4) và bổ sung thêm các chất điều tiết sinh trưởng NAA ở các nồng độ khác nhau tùy từng công thức thí nghiệm Các thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại 10 mẫu/công thức Bình nuôi cấy được đặt lên giàn nuôi trong phòng thí nghiệm công nghệ tế bào với cường độ ánh sáng 2000-2500 lux, nhiệt độ phòng 25 ± 2oC, độ ẩm phòng 60±5%

Chỉ tiêu theo dõi của thí nghiệm 4 và 5 (sau 30 ngày nuôi cấy): Tỷ lệ tái sinh (%), hệ số tái sinh (lần), chất lượng chồi

Thí nghiệm 6:Nghiên cứu ảnh hưởng của Cytokinin (BAP) đến khả năng nhân nhanh chồi quýt vàng Bắc Sơn in vitro

- Vật liệu nghiên cứu: Chồi quýt vàng Bắc Sơn sau tái sinh in vitro

- Thí nghiệm gồm các công thức:

Công thức 1(đ/c): BAP 0,0 ppm

Công thức 2: BAP 0,5 ppm

Công thức 3: BAP 1,0 ppm

Công thức 4: BAP 1,5 ppm

Công thức 5: BAP 2,0 ppm

Công thức 6: BAP 2,5 ppm

Công thức 7: BAP 3,0 ppm

- Phương pháp bố trí thí nghiệm: Chồi sau tái sinh (có chiều cao 0,5 cm,

có 1-2 lá) được tách khỏi đoạn cành và cấy chuyển sang môi trường MS + đường glucose 30 gram/l+ Agar 6,2 gram/l, bổ sung BAP ở các nồng độ khác nhau (0-3,0 ppm) tùy từng công thức thí nghiệm Các thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại 10

24

mẫu/công thức Bình nuôi cấy được đặt trong phòng thí nghiệm với cường độ

Thí nghiệm 7: Nghiên cứu ảnh hưởng phối hợp của Cytokinin (BAP 2,0 ppm) và Auxin (NAA) đến khả năng nhân nhanh chồi quýt vàng Bắc Sơn in vitro

- Vật liệu nghiên cứu: Chồi quýt vàng Bắc Sơn sau tái sinh in vitro

- Thí nghiệm gồm các công thức:

Công thức 1 (Đ/C): BAP 2,0ppm

Công thức 2: BAP 2,0ppm + NAA 0,1ppm

Công thức 3: BAP 2,0ppm + NAA 0,2ppm

Công thức 4: BAP 2,0ppm + NAA 0,3ppm

Công thức 5: BAP 2,0ppm + NAA 0,4ppm

Công thức 6: BAP 2,0ppm + NAA 0,5ppm

- Phương pháp bố trí thí nghiệm: Chồi sau tái sinh (có chiều cao 0,5 cm,

có 1-2 lá) được tách khỏi đoạn cành và cấy chuyển sang môi MS + đường glucose 30 gram/l + Agar 6,2 gram/l, bổ sung BAP 2,0 ppm và NAA ở các nồng độ khác nhau (0-0,5 ppm) tùy từng công thức thí nghiệm Các thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại 10 mẫu/công thức Bình nuôi cấy được đặt trong phòng thí nghiệm

60±5%

Chỉ tiêu theo dõi của thí nghiệm 6 và 7 (sau 30 ngày nuôi cấy):Hệ số nhân (lần), chiều cao đỉnh chồi (cm), chất lượng chồi

3.3.3.Nghiên cứu kỹ thuật vi ghép đỉnh sinh trưởng quýt vàng Bắc Sơn in vitro

Thí nghiệm 8: Nghiên cứu ảnh hưởng của loại gốc ghép đến hiệu quả vi ghép in vitro đỉnh sinh trưởng quýt vàng Bắc Sơn

25

- Vật liệu thí nghiệm: Cây gốc ghép in vitro được gieo từ hạt bưởi diễn, bưởi chua, chấp và đỉnh sinh trưởng quýt vàng Bắc Sơn in vitro thu được từ

giai đoạn nhân nhanh chồi

- Công thức thí nghiệm:

Công thức 1: Gốc ghép bưởi diễn

Công thức 2: Gốc ghép bưởi chua

Công thức 3: Gốc ghép chấp

- Phương pháp bố trí thí nghiệm: Các thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại 10 mẫu/công thức

- Kỹ thuật vi ghép đỉnh sinh trưởng in vitro: Hạt bưởi diễn, bưởi chua và

chấp được gieo thành công trong môi trường MS, bắt đầu xòe 2 lá mầm được sử dụng làm gốc ghép trong thí nghiệm Sử dụng dao cấy cắt ngang thân gốc

ghép, dưới vị trí lá mầm 0,5 cm và đặt đỉnh sinh trưởng quýt vàng Bắc Sơn in

vitro (kích thước 2 mm) lên được chính giữa vị trí vị trí cắt ngọn của gốc ghép

Chỉ tiêu theo dõi (sau 20 ngày): Số ngày thành công (ngày),tỷ lệ ghép thành công (%), chiều cao đỉnh sinh trưởng (cm)

3.4 Chỉ tiêu nghiên cứu và phương pháp theo dõi

* Các chỉ tiêu theo dõi nghiên cứu khử trùng mẫu (hạt gốc ghép và đoạn cành quýt vàng Bắc Sơn):Theo dõi sau 20 ngày nuôi cấy Các chỉ tiêu theo dõi:

26

- Mẫu chết: Mẫu vật không nảy chồi/mầm hoặc có dấu hiệu bị khô, héo

- Mẫu sạch, sống: Mẫu sinh trưởng phát triển bình thường, không xuất hiện nấm

* Các chỉ tiêu theo dõi giai đoạn tái sinh mẫu nuôi cấy: Theo dõi sau 30

ngày nuôi cấy

+ Thí nghiệm gieo hạt gốc ghép: Được theo dõi trong 30 ngày với các chỉ tiêu sau:

x 100

∑ số hạt nuôi cấy

- Đường kính thân (mm): Sự dụng thước panme để đo đường kính thân của gốc ghép tại vị trí giữa cổ rễ và lá mầm Đơn vị tính mm

- Chiều cao cây (cm): sử dụng thước kỹ thuật đo chiều cao từ cổ rễ đến đỉnh ngọn Đơn vị tính cm

+ Thí nghiệm tái sinh chồi từ mắt ngủ quýt vàng Bắc Sơn: Được theo dõi trong 30 ngày với các chỉ tiêu sau:

x 100

∑ số mẫu cấy

∑số mẫu tái sinh chồi

- Chất lượng mẫu: quan sát bằng mắt thường và so sánh các mẫu với nhau, đánh giá cây theo tiêu chí:

Chồi tốt (+++): thân mập, lá màu xanh đậm

Chồi trung bình (++): thân bình thường, lá màu xanh non

Chồi kém (+): thân gầy, lá màu xanh nhạt hoặc vàng hoặc chồi dị dạng

* Các chỉ tiêu theo dõi giai đoạn nhân nhanh mẫu cấy:

Thực hiện theo dõi sau 30 ngày cấy chuyển Gồm các chỉ tiêu sau:

27

- Hệ số nhân chồi (lần) = ∑ số chồi thu được

∑ số chồi nuôi cấy

- Chiều cao chồi (cm) = Chiều cao trung bình của các chồi trong cụm – chiều cao ban đầu của chồi cấy chuyển

- Chất lượng chồi: tương tự giai đoạn tái sinh

* Các chỉ tiêu theo dõi hiệu quả vi ghép đỉnh sinh trưởng quýt vàng Bắc Sơn:

Thực hiện theo dõi trong 20 ngày sau vi ghép Các chỉ tiêu gồm:

- Số ngày thành công (ngày): tính từ khi ghép đến bắt đầu hình thành sẹo

∑ số chồi nuôi cấy

- Chiều cao đỉnh sinh trưởng (cm): Chiều cao đỉnh sinh trưởng tính từ vị

trí vi ghép

3.5 Phương pháp xử lí số liệu

- Các số liệu được tính toán bằng phần mềm Excel 2010

- Để xác định được sai khác giữa các công thức thí nghiệm quá trình xử

lý số liệu được thực hiện trên phần mềm SAS 9.1 và giá trị trung bình được so sánh theo phương pháp Duncan với P < 0,05

28

Phần 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1 Kết quả nghiên cứu kỹ thuật sản xuất gốc ghép in vitro sạch bệnh 4.1.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian khử trùng đến hiệu quả khử trùng mẫu hạt gốc ghép

Giai đoạn khử trùng là quan trọng trong quy trình nuôi cấy mô, mục đích của giai đoạn này là thu được nguyên liệu thực vật vô trùng đưa vào nuôi cấy

in vitro Có nhiều phương pháp cũng như hóa chất khử trùng khác nhau, nồng

độ, thời gian khử trùng thích hợp của mỗi giống là khác nhau Phương pháp khử trùng thích hợp phải đảm bảo được yêu cầu: tỷ lệ nhiễm thấp, tỷ lệ chết thấp và tỷ lệ sạch – sống cao Kết quả khử trùng hạt gốc ghép thử nghiệm

phút được trình bày ở bảng 4.1

Bảng 4.1 Ảnh hưởng của thời gian khử trùng đến tỷ lệ nhiễm, tỷ lệ chết, tỷ

lệ sạch-sống của mẫu hạt làm gốc ghép (sau 20 ngày)

diễn

Bưởi chua Chấp

Bưởi diễn

Bưởi chua Chấp

Bưởi diễn

Bưởi chua Chấp

29

Ghi chú: a, b, c… thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa ở mức độ tin cậy P< 0,05 theo

phương pháp so sánh Duncan

Từ kết quả thu được ở bảng 4.1 cho thấy:

Tỷ lệ nhiễm của các loại hạt gốc ghép (bưởi diễn, bưởi chua và chấp) bị

ảnh hưởng bởi thời gian khử trùng bằng HgCl2 0,1% (P<0,05) Với trường

hợp khử trùng hạt bưởi diễn ở thời gian khử trùng HgCl2 0,1% từ 0-20 phút,

tỷ lệ nhiễm dao động từ 5,0-100% Trong đó, CT5 (thời gian khử trung 20 phút) có tỷ lệ nhiễm thấp nhất (5%) Công thức đối chứng (khử trùng bằng nước cất vô trùng) có tỷ lệ nhiễm cao nhất là 100% Các công thức khác có tỷ lệ nhiễm ở mức trung gian là 40% (CT2- thời gian khử trùng 5 phút), 13,33% (CT3- thời gian khử trùng 10 phút), 8,0% (CT4- thời gian khử trùng 15 phút);

Tỷ lệ nhiễm của hạt bưởi chua trong khử trùng HgCl2 0,1% trong 0-20 phút cũng cho kết quả tương tự Tỷ lệ nhiễm đạt thấp nhất là 5% ở CT 5 (khử trùng

20 phút), tỷ lệ nhiễm cao nhất (100%) ở công thức đối chứng không sử dụng chất khử trùng HgCl2 0,1% Các CT2, CT3, CT 4 có tỷ lệ nhiễm thấp hơn công thức đối chứng, có giá trị tương ứng lần lượt là: 40%, 16,67% và 11,67% Trong khử trùng hạt chấp, tỷ lệ nhiễm dao động từ 13,33% -100% ở các mức thời gian khử trùng giảm dần từ 20 phút đến 0 phút (bước nhảy 5 phút) Tỷ lệ nhiễm đạt thấp nhất (13,33%) ở công thức khử trùng lâu nhất (20 phút) Tỷ lệ nhiễm giảm dần với thời gian khử trùng tăng dần ở các công thức CT2, CT3, CT4 Vậy, kết quả tỷ lệ nhiễm ở các mẫu hạt có xu hướng tỷ lệ nghịch với sự tăng của thời gian khử trùng bằng HgCl2

Về chỉ tiêu tỷ lệ chết, tỷ lệ chết của hạt bưởi diễn dao động từ 66,67% Trong đó, công thức sử dụng thời gian khử trùng là 20 phút cho tỷ lệ chết cao nhất đạt 66,67% ở mức “a”, công thức đối chứng (khử trùng bằng nước cất vô trùng) cho tỉ lệ chết thấp nhất 5% Các CT khác có tỷ lệ chết ở mức trung gian là 43,33% (CT4 -khử trùng 15 phút), 15% (CT2- khử trùng 5

5%-30

phút) và 15% (CT3-khử trùng 10 phút) (P<0,05,CV =12,49) Tỷ lệ chết của

hạt bưởi chua dao động từ 6,67% - 71,67%, trong đó công thức sử dụng thời gian khử trùng là 20 phút cho tỷ lệ chết cao nhất đạt 71,67% ở mức “a”, công thức đối chứng (khử trùng bằng nước cất vô trùng) cho tỉ lệ chết thấp nhất 6,67% Các CT khác có tỷ lệ chết ở mức trung gian là 41,67% (CT4 -khử trùng 15 phút), 16,67% (CT2- khử trùng 5 phút) và 16,67% (CT3-khử trùng

10 phút) (P<0,05,CV =10,31) Tỷ lệ chết của hạt chấp dao động từ 71,67% Trong đó, công thức sử dụng thời gian khử trùng là 20 phút cho tỷ lệ chết cao nhất đạt 71,67% ở mức “a”, tiếp đến với 15 phút đạt 46,67%, với thời gian là 10 phút thì cho tỷ lệ chết là 20%, công thức sử dụng thời gian khử trùng là 5 phút cho tỷ lệ chết thấp thứ 2 sau công thức đối chứng đạt 16,67% (P<0,05,CV =7,9)

8,33%-Về tỷ lệ sạch-sống Với hạt bưởi diễn, công thức có thời gian khử trùng

là 10 phút cho tỷ lệ sạch-sống cao nhất đạt 78,33% được đánh giá ở mức “a” Với 15 phút tỷ lệ sạch-sống đạt 50,00% được xếp ở mức “b”, 5 phút đạt 50,00% Tỷ lệ sạch sống thấp nhất là CT1(sử dụng nước cất vô trùng) là 0,00% Công thức dùng thời gian khử trùng 20 phút có tỷ lệ sạch-sống là 31,67% thấp thứ 2 sau công thức đối chứng xếp ở mức “c” (P<0,05,CV

=10,08) Với hạt bưởi chua, công thức có thời gian khử trùng là 10 phút cho

tỷ lệ sạch-sống cao nhất đạt 70% được đánh giá ở mức “a” Với 15 phút tỷ lệ sạch-sống đạt 48,33% được xếp ở mức “b”, 5 phút đạt 48,33% Công thức dùng thời gian khử trùng 20 phút có tỷ lệ sạch-sống là 26,67% thấp thứ 2 sau công thức đối chứng xếp ở mức “c” (P<0,05,CV =6,24) Với hạt chấp, công thức có thời gian khử trùng là 10 phút cho tỷ lệ sạch-sống cao nhất đạt 65% được đánh giá ở mức “a” Với 15 phút tỷ lệ sạch-sống đạt 45,00% được xếp ở mức “b”, 5 phút đạt 43,33% Công thức dùng thời gian khử trùng 20 phút có

Từ kết quả thu được có thể kết luận rằng: Thời gian khử trùng với HgCl20,1% trong 10 phút là phù hợp nhất để khử trùng hạt bưởi diễn, bưởi chua và chấp trong các ngưỡng thời gian thử nghiệm Ở công thức khử trùng này, Tỷ lệ sạch – sống của mẫu hạt đạt cao nhất ( bưởi diễn: 78,33%; bưởi chua: 70%; chấp: 65%)

4.1.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nền đến tỷ lệ nảy mầm và sinh trưởng của mẫu hạt gốc ghép in vitro

Bảng 4.2 Ảnh hưởng của môi trường nền đến tỷ lệ nảy mầm và sinh

trưởng của mẫu hạt gốc ghép (sau 30 ngày nuôi cấy)

CT

TN

Môi

trường

32

Ghi chú: a, b, c… thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa ở mức độ tin cậy P < 0,05 theo

phương pháp so sánh Duncan

Bảng 4.3 Ảnh hưởng của môi trường nền đến khả năng sinh trưởng của

gốc ghép (sau 30 ngày nuôi cấy)

Ghi chú: a, b, c… thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa ở mức độ tin cậy P < 0,05 theo

phương pháp so sánh Duncan

Trên môi trường MS (CT1) thì tỷ lệ nảy mầm hạt bưởi diễn đạt cao nhất 88,33% được đánh giá ở mức “a” trong so sánh duncan Môi trường N6 (CT2) đạt 76,67% xếp ở mức “b” Môi trường B5 (CT3) đạt 71,67% xếp ở mức “c” (P<0,05,CV =2,11) Trên môi trường MS (CT1) thì tỷ lệ nảy mầm hạt bưởi chua đạt tỷ lệ nảy mầm tốt nhất là 81,67% được đánh giá ở mức “a” trong so sánh duncan Môi trường N6 (CT2) đạt 68,33% xếp ở mức “b” Môi trường B5 (CT3) đạt 63,33% xếp ở mức “b” (P<0,05,CV =4,69) Trên môi trường

MS (CT1) thì tỷ lệ nảy mầm hạt chấp đạt tỷ lệ nảy mầm tốt nhất là 75% được đánh giá ở mức “a” trong so sánh duncan Môi trường N6 (CT2) đạt 71,67% xếp ở mức “a” Môi trường B5 (CT3) đạt 63,33% xếp ở mức “b” (P<0,05,CV

=4,12)

Với chỉ tiêu chiều cao TB, trên môi trường MS (CT1) đạt chiều cao trung bình tốt nhất là 8,03cm được đánh giá ở mức “a” trong so sánh duncan Môi trường N6 (CT2) đạt trung bình 7,57cm xếp ở mức “b” Môi trường B5