BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM ------ LÊ MINH HẢI NGHIÊN CỨU ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA VI KHUẨN Photobacterium damselae GÂY BỆNH TR
TỔNG QUAN TÀI LIỆ U
Tình hình nuôi cá biển trên thế gi ới và ở Vi ệ t Nam
1.1 1 Tình hình nuôi cá biển trên thế giới
Theo FAO (2016), tổng sản lượng nuôi trồng thủy sản toàn cầu năm 2014 đạt 73,8 triệu tấn, trong đó có 26,7 triệu tấn từ nuôi biển Trung Quốc dẫn đầu về sản xuất thủy sản biển, tiếp theo là Ấn Độ và Việt Nam.
Bảng 1.1 Sản lượng đánh bắt và nuôi trồng thủy hải sản trên thế giới Đơn vị: Triệu tấn
Tổng sản lượng đánh bắt 90,2 89,1 93,7 91,3 92,7 93,4 Nuôi trồng
Tổng sản lượng nuôi trồng 55,7 59,0 61,8 66,5 70,3 73,6
Nguồn: FAO 2016 Tại Trung Quốc, nuôi lồng bắt đầu từ cuối những năm 1970, khởi đầu với nuôi trồng thủy sản nội địa và sau đó mở rộng sang nuôi biển.
Từ năm 1970, tỉnh Quảng Đông đã thành công trong việc nuôi cá biển như cá mú và cá chẽm trong lồng Đến năm 1984, số lượng lồng cá biển ở ba tỉnh Quảng Đông, Phúc Kiến và Chiết Giang đã vượt qua 57,000 Đến năm 2005, tổng số lồng biển đạt một triệu, với sản lượng nuôi khoảng 200,000 tấn/năm và hơn 40 loài cá Trong 5 năm gần đây, nghề nuôi cá biển tại Trung Quốc đã phát triển đều đặn, với tổng sản lượng cá biển nuôi từ năm 2010 đến 2015 tăng từ 0,8082 triệu tấn lên 1,3076 triệu tấn.
Bảng 1.2 Các loài cá biển nuôi chủ yếu ở Trung Quốc
Cá đù vàng (Larmichthys crocea)
Cá đù đỏ (Sciaenops ocellatus)
Cá tráp đỏ (Pagrus major)
Cá tráp đen (Acanthopagrus schlegelii schelgelii)
Cá chim vây ngắn (Trachinotus ovatus)
Cá nóc hố (Takifugu rubripes)
Cá lưỡi trâu (Cynoglossus semilaevis) đã được Ấn Độ triển khai nuôi từ năm 1950, bao gồm nhiều loài cá biển như cá da trơn, cá mú, cá chẽm và cá điểm ngọc trai Trong giai đoạn đầu, các trang trại nuôi cá chủ yếu hoạt động ở quy mô nhỏ và bán tập trung Theo thống kê của Cục Chăn nuôi và Nghề cá, sản lượng nuôi cá biển của Ấn Độ đã tăng đều đặn từ 534.000 tấn năm 1950 lên 3.440.000 tấn vào năm 2014 Mặc dù tốc độ tăng trưởng không cao, nhưng nuôi cá biển đã tối ưu hóa việc sử dụng tài nguyên biển và đóng góp đáng kể cho nền kinh tế.
1.1 2 Tình hình nuôi cá biể n ở Vi ệ t Nam
Trong giai đoạn 2005 - 2010, nuôi trồng hải sản trên biển và hải đảo đã phát triển mạnh mẽ, với diện tích và sản lượng không ngừng gia tăng Sản lượng nuôi trồng hải sản trong giai đoạn này cho thấy sự tăng trưởng đáng kể.
Từ năm 2005 đến 2010, sản lượng nuôi trồng hải sản tại Việt Nam đã đạt tốc độ tăng trưởng bình quân 5,1% mỗi năm, trong đó cá biển tăng trưởng ấn tượng với 38,1% mỗi năm Diện tích nuôi trồng hải sản trên biển và hải đảo đã tăng từ 34.174 ha năm 2005 lên 38.800 ha vào năm 2010.
Tốc độ tăng trưởng nuôi trồng thủy sản ở vùng biển hở đạt 15,4% mỗi năm, trong khi diện tích nuôi tại các vịnh, đảo và eo ngách tăng trung bình 4,86% hàng năm Bên cạnh đó, diện tích nuôi bãi triều ven biển cũng ghi nhận mức tăng 1,8% mỗi năm.
Các loài cá biển hiện nay được nuôi phổ biến bao gồm cá song, cá giò, cá vược, chép biển, tráp đỏ, hồng mỹ, đối mục, cá dìa, và cá chim vây vàng Trong đó, cá song, cá giò và cá vược là những loài được nuôi nhiều nhất Tại khu vực Quần đảo Trường Sa, chủ yếu nuôi cá chim trắng, cá hồng và cá vược mõn nhọn.
Trong giai đoạn 2005 - 2010, số lượng lồng nuôi cá tăng mạnh, từ 13.172 ô lồng năm 2005 lên 30.031 ô lồng năm 2010, với tỷ lệ tăng trưởng bình quân 17,92%/năm Số bè nuôi cũng tăng từ 1.461 bè lên 2.142 bè, đạt tốc độ tăng trưởng 7,96%/năm Năm 2010, có 1.019 bè cá ở vịnh Bắc bộ, 630 bè ở miền Trung, 140 bè ở Đông Nam Bộ và 353 bè ở Tây Nam Bộ Đặc biệt, khu vực đảo Đá Tây - quần đảo Trường Sa-Khánh Hóa đã nuôi 8 lồng công nghiệp kiểu Nauy cải tiến với thể tích 218 m³ mỗi lồng.
Sản lượng nuôi cá biển đã có sự tăng trưởng đáng kể từ 3.141 tấn vào năm 2005 lên 15.751 tấn vào năm 2010, với tốc độ tăng trưởng bình quân 38,1% mỗi năm Trong năm 2010, cá song chiếm 49% tổng sản lượng với 7.786 tấn, tiếp theo là cá giò 4.734 tấn (30%), cá vược 1.096 tấn (7%) và các loại cá biển khác 2.135 tấn (14%) Tại khu vực nuôi cá biển ở Úc, cụ thể là vịnh Nha Trang, sản lượng đạt gần 3.000 tấn, chủ yếu là cá giò và cá song Tuy nhiên, đến năm 2014, sản lượng nuôi cá biển chỉ đạt 63.460 tấn, cho thấy sự chậm lại trong tốc độ phát triển sau ba năm Quy hoạch cá biển được phê duyệt vào năm 2011.
Sản lượng nuôi cá biển trong lồng bè dự kiến đạt 44.000 tấn vào năm 2015, nhưng sản lượng nuôi ao đầm nước mặn chỉ đạt 50% so với quy hoạch, trong khi nuôi công nghiệp gần như không thể đạt chỉ tiêu Đối tượng nuôi cá biển đa dạng, chủ yếu là cá vược, cá song, cá bớp và cá hồng Mỹ Diện tích nuôi cá biển đã được mở rộng tại các tỉnh như Quảng Ninh, Phú Yên, Bà Rịa-Vũng Tàu và Kiên Giang, với nuôi lồng bè nhỏ rải rác ở các tỉnh ven biển Tuy nhiên, nuôi cá biển quy mô công nghiệp với lồng bè lớn trên 1.000m³ ở các vùng eo vịnh và biển mở vẫn chưa thu hút được sự đầu tư từ các thành phần kinh tế.
Bảng 1.3 Báo cáo quy hoạch nuôi cá biển ở Việt Nam
TT Danh mục QH 2015 2013 QH 2014
- Nuôi trong ao nước mặn lợ, ao nuôi tôm chuyển đổi (tấn)
- Nuôi trong hệ thống lồng nhỏ (tấn) 44000 31895 33171
- Nuôi công nghiệp tập trung (tấn) 55000
4 Diện tích nuôi trong ao (ha) 18367 29781
Theo quy hoạch phát triển nuôi cá biển đến năm 2015 và định hướng đến năm 2020 ban hành kèm theo Quyết định số 1523/QĐ-BNN-TCTS ngày
08 tháng 07 năm 2011của Bộ trưởng Bộ NN và PTNT [16]:
Phát triển nuôi trồng thủy sản cần được mở rộng ở tất cả các loại hình mặt nước biển, bao gồm khu vực bãi triều ven biển, eo vịnh, và quanh các đảo có dân cư sinh sống Đồng thời, cần chú trọng đến vùng biển mở và biển khơi tại các khu vực Vịnh Bắc Bộ, đặc biệt là tỉnh Quảng.
Ninh - Quảng Trị, biển miền Trung (Thừa Thiên Huế - Khánh Hòa), biển Đông Nam bộ (Ninh Thuận - Cà Mau) và biển Tây Nam bộ (Cà Mau - Kiên Giang) đều nằm giữa Biển Đông.
Để tối ưu hóa sản xuất thủy sản, cần đa dạng hóa đối tượng nuôi và phương thức nuôi phù hợp với từng vùng kinh tế, sinh thái, phát huy lợi thế so sánh của từng sản phẩm Nên tập trung phát triển các loài có lợi thế cạnh tranh và thị trường tiêu thụ lớn như cá song, cá giò, cá chim vây vàng, cá hồng mỹ, cá vược, cá ngừ, cá măng biển, cùng với nhuyễn thể như ngao, hàu, tu hài, rong biển như rong câu, rong sụn, rong mứt, giáp xác như tôm hùm, ghẹ xanh, và các loài bản địa có giá trị kinh tế cao như hải sâm, bào ngư.
Phát triển nuôi cá biển trên các khu vực quy hoạch, tăng dần mật độ lồng bè và nâng cao năng suất, sản lượng theo từng khu vực, đảm bảo đáp ứng yêu cầu về con giống, thức ăn và nhu cầu thị trường.
M ộ t s ố b ệ nh thườ ng g ặp trên cá biển nuôi lồ ng
* B ệ nh do k ý sinh tr ù ng
Bệnh do ký sinh trùng rất phổ biến ở cá biển nuôi, đặc biệt là cá nuôi lồng, với hơn 80% nông hộ báo cáo cá có triệu chứng nhiễm ký sinh trùng Các loài ký sinh trùng thường gặp bao gồm sán lá đơn chủ, giáp xác chân chèo và động vật đơn bào, chủ yếu là ngoại ký sinh trên da và trong miệng Chúng gây tổn thương mang, làm cá khó thở, bỏ ăn, chậm lớn và thường dẫn đến chết ở giai đoạn cá nhỏ.
* B ệ nh do vi rút ở cá biển nuôi
Bệnh do vi rút nguy hiểm nhất ở cá biển nuôi lồng là bệnh do Nervous
Bệnh hoại tử thần kinh (NNV) là một bệnh cấp tính ảnh hưởng đến nhiều loài cá biển, đặc biệt phổ biến trong giai đoạn cá giống Tỷ lệ nhiễm bệnh có thể lên tới 82,8% với 53/64 mẫu thu thập dương tính Tỷ lệ cá chết do NNV dao động từ 90-100% Các nghiên cứu về NNV chủ yếu tập trung vào mô đích của virus này.
VNN là hệ thần kinh trung ương bao gồm não, tuỷ sống và võng mạc Virus này gây hoại tử nơron thần kinh, dẫn đến các biểu hiện bất thường như bơi không định hướng, thường theo hình trôn ốc hoặc lao thẳng nhanh về phía trước Nhiều tác giả đã nghiên cứu tác nhân gây bệnh do virus trên cá biển và đề xuất các biện pháp khắc phục thiệt hại, chủ yếu tập trung vào phòng bệnh.
Bệnh do vi khuẩn ở cá biển chủ yếu do vi khuẩn gram (-) gây ra, đặc biệt là các loài thuộc họ Vibrionaceae như Vibrio alginolyticus, V vulnificus, V cholerae, V parahaemolyticus, V anguillarum, V ordalii, V carchariae và V harveyi Ngoài ra, còn có một số loài khác như Photobacterium damselae, Edwardsiella tarda và Pseudomonas sp.
Nhiều nghiên cứu tại Việt Nam đã chỉ ra rằng vi khuẩn như V parahaemolyticus, Vibrio alginolyticus, V carchriae và V vulnificus là nguyên nhân gây bệnh xuất huyết lở loét cho cá biển, đặc biệt là cá mú, ở cả ba miền Bắc, Trung, Nam Bệnh lý này đặc trưng bởi các vết xuất huyết lở loét trên thân cá, lây lan nhanh chóng và có thể dẫn đến tỷ lệ chết lên đến 30% trong đàn cá nuôi.
Bệnh xuất huyết do vi khuẩn P damselae là một trong những bệnh thường gặp ở cá biển nuôi, có khả năng tấn công và gây bệnh ở tất cả các giai đoạn phát triển của cá, từ ấu trùng, cá giống đến cá nuôi thương phẩm Khi mắc bệnh, cá có thể biểu hiện triệu chứng ở dạng mãn tính.
Bệnh 10 tính và cấp tính gây ra các triệu chứng như loét da, nốt trắng hoặc u hạt màu trắng ở một số cơ quan nội tạng, và hoại tử nội tạng, chủ yếu ở thận và lách Tỷ lệ chết của cá bệnh có thể lên tới 80-100% trong vòng 5-10 ngày, gây thiệt hại kinh tế nghiêm trọng tại nhiều quốc gia như Nhật Bản, Mỹ, Pháp, Tây Ban Nha, Hy Lạp, và Thổ Nhĩ Kỳ Tại Việt Nam, bệnh này đã lan rộng ở hầu hết các vùng nuôi cá, gây thiệt hại lớn cho người nuôi cá biển.
Vi khu ẩ n Photobacterium damselae và bệ nh do vi khu ẩ n P damsela e gây
Tình hình phân loại của P damselae đã trải qua nhiều thay đổi, ban đầu được xác định là Vibrio damselae, một tác nhân gây bệnh cơ hội ở cá và động vật có vú McDonell và Colwell (1985) đã phân loại lại thành viên này vào chi Listonella dựa trên phân tích chuỗi 5S rRNA Các nghiên cứu di truyền và kiểu hình sau đó cho thấy V damselae có mối quan hệ gần gũi với các loài thuộc họ Photobacterium, dẫn đến việc đề xuất tên P damselae Smith et al (1991) đã chuyển các loài này vào chi Photobacterium dựa trên đặc điểm kiểu hình, trong khi nghiên cứu của Gauthier et al (1995) đã chỉ ra tác nhân gây bệnh Photobacteriosis ở một số loài cá.
11 chứng minh và xác định chủng vi khuẩn này là P damselae bằng phương pháp phân tích trình tự 16S rDNA và DNA [73]
Theo nghiên cứu của Austin et al (1997), vi khuẩn P damselae là trực khuẩn Gram âm, có kích thước khoảng 0.5 – 0.8 µm x 0.7 – 2.6 µm Vi khuẩn này có hình dạng lưỡng cực, với màu sắc sẫm ở hai đầu và nhạt hơn ở giữa do hiện tượng nguyên sinh chất bị dung giải P damselae không có roi và không di động.
Hình 1.1 Hìnhthái của vi khuẩn P damselae (Nguồn: Austin et al., 1997)[33]
1.3.1.3 Đặc điểm sinh lý, sinh hoá
P damselae là vi khuẩn hiếu khí, kỵkhí tùy tiện Vi khuẩn P damselae phản ứng tích cực với Metyl đỏ (1%NaCl), Arginene (1%NaCl), khử Nitrat thành Nitrit, sinh acid nhưng không sinh khí gas từ các loại đường glucose, mannose, maltose, fructose, và galactose, sinh khí từ D-glucose, lipase, esculin Vi khuẩn P damselae dương tính với oxidase, catalase, methyl red và âm tính với indol, nitrate, citrate, H2S [33], [67]
Vi khuẩn P damselae phát triển tốt trên môi trường có nồng độ NaCl từ 0,5% - 4% Vi khuẩn P damselae phát triển tốt nhất ở nồng độ NaCl từ 1,0% -
Vi khuẩn P damselae phát triển tốt nhất trong môi trường BHI và có khả năng sinh trưởng ở nhiệt độ từ 15ºC đến 32,5ºC Tuy nhiên, vi khuẩn này không thể phát triển trong môi trường có nồng độ NaCl 0%, 8% - 12% và cần có ion Na+ để tồn tại.
Agar, TCBS, Marine Agar và môi trường thạch máu (2% máu cừu) được bổ sung thêm muối Khuẩn lạc trên môi trường thạch máu có màu xám, đục, đường kính khoảng 1mm, viền trơn, gây dung huyết β và có thể quan sát rõ ràng sau 48 giờ ở 28ºC.
1.3.1.5 Khảnăng kháng kháng sinh của vi khuẩn P damselae
Nghiên cứu của Pasqualina et al (2011) cho thấy các chủng P damselae từ trang trại nuôi trồng thủy sản ở Ý có khả năng kháng một số kháng sinh như ampicillin, carbenicillin, kanamycin và cefalothin, nhưng lại mẫn cảm với chloramphenicol, nitrofurantoin và tobramycin.
Theo nghiên cứu của Toranzo et al., (1991); Bakopoulos et al., (1995);
According to Sano (1998), the most commonly used antibiotics for treating infectious hemorrhages include amoxicillin, chloramphenicol, erythromycin, florfenicol, flumequine, oxolinic acid, oxytetracycline, nitrofurazone, trimethoprim-sulfadiazine, and tetracycline.
Nghiên cứu của Thyssen et al (2000) cho thấy vi khuẩn P damselae từ các khu vực khác nhau có độ nhạy cảm khác nhau với kháng sinh Cụ thể, 93% các chủng vi khuẩn kháng erythromycin, trong khi tỷ lệ kháng với amoxicillin, ampicillin, florfenicol và trimethoprim-sulfamethoxazole dưới 10% Ngược lại, các chủng này rất nhạy cảm với kanamycin, florfenicol và trimethoprim-sulfamethoxazole.
Nghiên cứu khả năng kháng kháng sinh của vi khuẩn gây bệnh là rất quan trọng để phát triển các biện pháp phòng ngừa và điều trị bệnh cho cá biển nuôi Đến nay, chưa có nghiên cứu nào trong nước công bố về khả năng kháng kháng sinh của vi khuẩn P damselae được phân lập tại Việt Nam.
1.3.1.6 Gen độc tố và các yếu tố gây bệnh
P damselae subsp damselae là một vi khuẩn biển, gây ra các bệnh trên cá biển với độc lực cao Các chủng gây dung huyết cao, sản xuất damselysin một cytolysin được mã hoá bởi gen dly Nghiên cứu của Amable et al., (2011) đã xác định được gen này nằm trên plasmid được ký hiệu là pPHDD1 có kích thước là 153.429bp Bên cạnh đó, các tác giả này đã chỉ ra rằng, trên plasmid pPHDD1 còn chứa gen hlyA mã hóa độc tố gây thủng tế bào vật chủ Bằng phương pháp gây đột biến, các tác giả đã phát hiện có mối tương quan chặt chẽ giữa 2 gen độc tố dly và hlyA, các dòng vi khuẩn bị gây đột biến cả hai gen dly và hlyA đều không gây dung huyết hồng cầu cừu và hồng cầu người, tuy nhiên ở các dòng vi khuẩn đột biến đơn lẻ 1 trong 2 gen này đều không bị giảm khả năng gây dung huyết [28]
Amable et al., (2011) đã xác định được khả năng gâydung huyết của vi khuẩn P damselae subsp Damselae được quyết định bởi sự phối hợp của 2 gen dly và hlyA [28]
Các nghiên cứu khác cho rằng thành phần chính trong các sản phẩm ngoại bào có liên quan đến độc lực bao gồm các protease, hemolysins [128],
Các cơ chế gây phá hủy mô tế bào và xuất huyết đóng vai trò quan trọng trong việc xâm nhập của vi khuẩn gây bệnh vào cơ thể cá Mặc dù Osorio et al (2000) đã chỉ ra rằng sự hiện diện của các sản phẩm ngoại bào không phải là điều kiện quyết định cho khả năng gây độc của vi khuẩn, nhưng một số protease trong các sản phẩm này vẫn được xem là yếu tố độc lực quan trọng ở nhiều vi khuẩn gây bệnh Protease có khả năng hạn chế hoạt động của các yếu tố khác trong quá trình gây bệnh.
14 enzym đã được phát hiện ở P damselae bao gồm cả phosphatases, esteraza, amylase và glycosidases
Rất ít thông tin về độc lực của P damselae trong việc gây xuất huyết nhiễm trùng ở động vật thủy sản và con người Một nghiên cứu ban đầu cho thấy mối liên hệ giữa khả năng gây bệnh của P damselae ở chuột và sản lượng lớn độc tố tiêu tế bào Mẫu gen dly từ môi trường nuôi cấy cho thấy khả năng chống lại hồng cầu của 16 loài động vật homeotherm, trong đó chuột là loài nhạy cảm nhất Ngoài ra, các nghiên cứu khác đã chỉ ra rằng sản phẩm ngoại bào của vi khuẩn này có hoạt tính gây dung huyết trên hồng cầu cá bơn.
Phân tích gen dly cho thấy nó có khả năng hoạt động D-phospholipase đối với sphingomyelin, phosphatidylcholine và phosphatidylethanolamine Các gen độc tố dly đã được nhân bản và xác định trình tự Tuy nhiên, bộ gen của gevf n dly vẫn còn khó nắm bắt Quan sát ban đầu cho thấy chủng gây dung huyết cao có đột biến tự phát và giảm đáng kể hoạt động gây dung huyết khi mất gen dly.
Nghiên cứu ban đầu đã chỉ ra rằng khả năng dung huyết của P damselae có ảnh hưởng lớn đến sự nguy hiểm đối với chuột Các nghiên cứu trước đây cho thấy liều gây tử vong cho người và cá gần như tương đương với 50% liều gây tử vong cho chuột Hơn nữa, các chủng thiếu gen dly vẫn thể hiện độc tính đối với chuột và cá, cho thấy gen dly không phải là điều kiện tiên quyết cho độc lực của vi khuẩn này Các sản phẩm ngoại bào từ chủng độc lực không có gen dly cũng gây chết cho cá và chuột, cũng như độc hại cho con người, cho thấy rằng các yếu tố độc lực khác ngoài gen dly có thể đóng vai trò quan trọng.
Các nghiên cứu chủ yếu tập trung vào việc xác định các gen quy định độc lực của vi khuẩn và các sản phẩm ngoại bào liên quan.
T ổ ng quan v ề t ạ o ch ủ ng vi khu ẩn nhược độ c
- Các phương pháp làm giảm độc vi khuẩn :
Vi sinh vật giảm độc lực là những vi sinh vật đã được điều chỉnh để không còn khả năng gây bệnh, nhưng vẫn có khả năng kích thích một đáp ứng miễn dịch mạnh mẽ và duy trì lâu dài.
- Giảm độc lực bằng nhiệt độ
Vi sinh vật gây bệnh rất nhạy cảm với nhiệt độ Khi được nuôi cấy ở nhiệt độ không phù hợp, chúng sẽ giảm độc lực nhưng vẫn duy trì tính kháng nguyên.
Vắc xin nhiệt thán: Nuôi vi khuẩn nhiệt thán ở nhiệt độ 42,5- 43ºC từ
15-20 ngày, vi khuẩn mất khả năng hình thành giáp mô, độc lực giảm, sử dụng làm giống gốc sản xuất vắc xin
Vắc xin Sabin dạng uống chống bại liệt được sản xuất từ các chủng virus bại liệt đã đột biến, được nhân lên nhiều lần trong tế bào thận khỉ và nuôi cấy ở nhiệt độ thấp Virus này có khả năng nhân lên trong tuyến nước bọt và đường tiêu hóa, nhưng không xâm nhập vào mô thần kinh, do đó không gây ra chứng bại liệt.
Tia cực tím có khả năng khử khuẩn mạnh mẽ, có thể làm biến dạng hoặc tiêu diệt vi khuẩn Hiệu quả diệt khuẩn của tia này phụ thuộc vào mật độ, thời gian chiếu, điều kiện môi trường và sức chịu đựng của vi khuẩn Bên cạnh đó, tia cực tím còn tạo ra Ozon trong không khí, cũng có khả năng tiêu diệt vi khuẩn.
Trong tế bào, purin và pyrimidin là các chất hữu cơ có mạch vòng hấp thu tia cực tím, với DNA hấp thu mạnh nhất ở bước sóng 254nm, làm tăng tần số đột biến Tia UV gây ra biến đổi quang oxy hóa các gốc purin và pyrimidin, trong đó adenine (A) bị chuyển thành hypoxantin, dẫn đến thay đổi hóa học của DNA Tia UV cũng làm đứt liên kết C = C giữa các base thymin gần nhau, tạo ra dimer thymin, làm giảm khả năng tái bản của DNA.
Hình 1.2 Tác động của tia tử ngoại tạo các dimer thymine.
Nghiên cứu của Ston et al cho thấy tần số đột biến của Staphylococcus aureus tăng lên khi chúng được chiếu tia UV trong thời gian ngắn trước khi nuôi cấy Mức độ sống sót của các tế bào vi sinh vật phụ thuộc vào liều lượng tia UV mà chúng hấp thụ Đặc biệt, độ đậm đặc của dịch huyền phù khi chiếu tia UV có ảnh hưởng rõ rệt đến tần số đột biến, với dịch huyền phù quá đậm đặc (lớn hơn).
Tia UV có hiệu quả hấp thụ thấp khi mật độ tế bào đạt 1.10^8 tế bào/ml do các tế bào che lấp lẫn nhau Ngược lại, dịch huyền phù quá loãng có thể dẫn đến cái chết của các tế bào khi chiếu tia UV Tác động gây chết tế bào và đột biến của tia UV còn phụ thuộc vào trạng thái sinh lý, tuổi giống và loài sinh vật.
1.4.2 Các phương pháp vi sinh vật học Đây là phương pháp giảm độc vi sinh vật cổ điển, phần lớn vắc xin virus sử dụng cho người, động vật được sản xuất theo phương pháp này Vi sinh vật gây bệnh được cấy chuyển nhiều đời qua môi trường ít mẫn cảm (động vật thí nghiệm hoặc môi trường nuôi tế bào hoặc phôi gia cầm) Vi sinh vật không đủ điều kiện để thực hiện đầy đủ chu kỳ sống nên thay đổi bộ gen để thích nghi với điều kiện sống mới, do đó vi sinh vật thay đổi về độc lực và khả năng gây bệnh [2]
- Vắc xin BCG (Bacillus Calmette Guerin) là chủng trực khuẩn lao bò
Mycobacterium tuberculosis bovis có độc lực cao, nhưng sau 13 năm nuôi cấy trong môi trường có mật bò và 231 lần cấy chuyển, vi khuẩn đã mất độc lực Vi khuẩn này được sử dụng để sản xuất vắc xin BCG, giúp phòng bệnh lao cho con người.
Vắc xin nhiệt thán nhược độc giáp mô được sản xuất từ vi khuẩn nhiệt thán được nuôi cấy trong môi trường CO₂, trong đó vi khuẩn không có khả năng hình thành giáp mô Khi vi khuẩn này được nuôi cấy trong môi trường có đủ O₂, chúng sẽ hình thành giáp mô nhưng với độc lực yếu, không gây bệnh, và được sử dụng làm vắc xin.
1.4.3 Đột biến bằng kháng sinh r ifampicin
Rifampicin (Rif) được phát hiện lần đầu vào năm 1957 từ quá trình lên men của Streptomyces mediterranei tại phòng thí nghiệm của Gruppo Lepetit SpA ở Milan Đây là một loại kháng sinh có phổ kháng khuẩn rộng, được sử dụng để điều trị bệnh lao và có khả năng rút ngắn thời gian điều trị bệnh lao bằng liệu pháp hóa học.
Rif được sử dụng khá phổ biến trong việc gây nhược độc vi khuẩn Escherichia coli, Flavobacterium psychrophilum, E ictaluri,… [43],
Vi khuẩn Edwardsiella ictaluri kháng Rif (RE–33) đã được cấp bằng sáng chế (US patent No 6019981) và được sử dụng để sản xuất vắc xin sống nhược độc thương mại mang tên AQUAVAC – ESC™ Ngoài ra, nghiên cứu của nhóm tác giả Benjamin et al (2008) về việc phân lập chủng Flavobacterium psychrophilum kháng Rifampicin đã chứng minh hiệu lực của vắc xin sống nhược độc này.
259-93B.17 kháng Rifampicin có thể đáp ứng như một vắc xin sống nhược độc cho việc ngăn chặn nhiễm Flavobacterium psychrophilum gây bệnh ở họ cá hồi [43]
Từ các kết quả nghiên cứu trên các nhà khoa học đã đưa ra giả thuyết: Rif tác động gây đột biến RNA polymerase (RNAP) củachủng vi khuẩn
Đột biến ảnh hưởng đến hoạt tính của RNAP có tác động đến biểu hiện gen và khả năng nhược độc của vi khuẩn Các đột biến kháng Rif chỉ xảy ra ở đoạn gen rpoB, mã hóa cho tiểu đơn vị β của phân tử RNAP, dẫn đến sự phát sinh đột biến kháng rifampicin.
4 vùng của gen rpoB: vùng N, vùng I, vùng II, vùng III, tuy nhiên những vị trí độtbiến chính, xảy ra ở vùng I [96]
Hình 1.3 Vùng kháng Rif của tiểu đơn vịβ RNAP [56]
Hình 1.4 Đột biến kháng Rif ởvùng I của gen rpoB [56]
Các vị trí thay thế amino acid được ghi nhận ở B anthracis (màu đỏ), B cereus (màu xanh), B subtilis (màu xanh lá cây), E coli (màu tím) và M tuberculosis (màu xanh lợt) Những vị trí mất amino acid được thể hiện bằng các khung.
Trong nghiên cứu này, 24 vị trí amino acid đã được xác định, trong đó amino acid V được thay thế cho các vị trí amino acid bị mất ở E coli Đồng thời, mũi tên chỉ ra sự chèn thêm amino acid DQ vào E coli.
12 vị trí amino acid phản ứng trực tiếp với Rif là phần bôi đậm màu xám [96]
