đề tài sản xuất chế phẩm trichoderma, bacillus dùng kiểm soát sinh học fusarium sp. và pythium sp. và kích thích sinh trưởng ở cây đậu

Thử ảnh hưởng độc tố trên cây trồng:Tẩm hạt và phun lên cây, khi thấy không có ảnh hưởng xấu với cây mới, thực hiện các thí nghiệm tiếp theo như định danh, xác định khả năng ức chế phát

ĐỀ TÀI:

Sản xuất chế phẩm Trichoderma,

Bacillus dùng kiểm soát sinh học

Fusarium sp và Pythium sp và kích thích sinh trưởng ở cây đậu.

NHÓM 7

BÀI BÁO CÁO VI SINH ỨNG DỤNG

Tổng Quan

Bacillus.

Là vi khuẩn hình que, Gram dương, có khả năng chuyển động.

Phần lớn có lợi cho con người.

Hiếu khí hoặc kị khí tùy nghi

Tạo điều kiện tốt cho vi sinh vật cố định đạm.

kích thích tăng trưởng và phục hồi bộ rễ cây trồng

Phân giải tốt các chất xơ , chitin, lignin giúp cho cây hấp thụ dễ dàng

Pythium sp.

Là một vsv giống với nấm.

Phổ ký chủ rộng.

Sinh sản vô tính bằng bào tử động.

Gây tàn lụi và chết rạp ở cây con( do ẩm

ướt).

Gây thối củ ( khoai tây, cà rốt ).

Gây thối củ và quả : là một bệnh chủ yếu ở

Lạc.

Nguyên tắc phân lập:

- Gieo cấy vi khuẩn đã pha loãng trên môi trường

dinh dưỡng đặc trưng (2% thạch hay còn gọi là agar).

- Nuôi dưỡng trong điều kiện thích hợp cho mọc các khuẩn lạc tách biệt nhau.

- Cấy tách từ khuẩn lạc mọc tách biệt sang ống môi trường dinh dưỡng thạch nghiêng để thu nhận chủng

vi khuẩn thuần khiết (do Robert Koch đề ra).

PHÂN LẬP

PHÂN LẬP BACILLUS

1 Mẫu:

Nốt sần đậu phộng có kích thước lớn, có màu đỏ hống.

Rửa sạch, ngâm cồn 5 phút, rửa nước, nghiền nát bằng kim mũi mác, bổ sung thêm 3ml nước cất ta thu được dung dịch chứa vi khuẩn trên.

Đất: lấy đất gần tầng mặt, không lấy ở phần đất sâu.

2 Pha loãng mẫu:

Cân 10g đất nghiền trong cối sứ (đã sấy tiệt trùng) hòa với 90ml nước muối sinh lý chứa sẵn trong bình tam giác 200ml

vô trùng.

Lắc đều trên máy lắc tốc độ 150v/p trong 30 phút.

Đun sôi cách thủy 15 phút thu được huyền dịch 10 -1, Lắc đều huyền dịch rồi dùng micropipet hút vô trùng 1ml huyền dịch vào ống nghiệm chứa sẵn 90ml nước muối sinh lý đã tiệt

trùng để được độ pha loãng 10 -2 , tương tự thu được các nồng

độ 10 -3 , 10 -4 ,…

Nếu thấy có đặc điểm của Bacillus thì cấy truyền

khuẩn lạc nghi ngờ vào môi trường thạch nghiêng NA

để giữ giống thử test sinh hóa tiếp theo.

Giám định đặc tính sinh hóa: catalaza (+), nitrate (+),

VP (+), citrate (+), methyred (+), maltose (-).

PHÂN LẬP TRICHODERMA

1 Mẫu:

Đất: lấy từ các ruộng trồng đậu.

Làm mịn đất qua rây 1mm.

2 Pha loãng mẫu:

Cân 1g đất mịn hòa vào 100ml nước sinh lý

4 Thử ảnh hưởng độc tố trên cây trồng:

Tẩm hạt và phun lên cây, khi thấy không có ảnh hưởng xấu với cây mới, thực hiện các thí nghiệm tiếp theo như định danh, xác định khả năng ức chế phát triển các vi sinh vật gây bệnh cây.

ĐỊNH TÍNH

 Các bước thực hiện:

Chuẩn bị dịch khuẩn: Vi khuẩn được hòa vào nước muối sinh lý nồng độ 0,85% để có mật độ khoảng: 1-2.108 CFU/ml)

Chuẩn bị dịch nấm (Fusarium sp, Pythium sp,

Trichoderma): Nấm mốc được pha trong nước

muối sinh lý 0,85% để có mật độ 1 - 2.106 tb/ml (đếm bằng buồng đếm hồng cầu)

Môi trường thử định tính: NA 37oC/24h.

Nấm gây bệnh được hoạt hóa trên môi trường PDA (Potato dextrose agra)

37oC/3 ngày (ống thạch nghiêng).

1 Thử khả năng đối kháng nấm gây bệnh của

các chủng Bacillus.

Nhằmchọn ra chủng có hoạt tính mạnh nhất

 Tiến hành thử nghiệm đối kháng:

Hút 10µl dịch nấm (Fusarium sp và Pythium sp)

và dịch khuẩn (Bacillus) cấy đối xứng nhau qua

đường kính đĩa môi trường PGA

Khoảng cách giữa chúng là 3cm

Tiến hành lập lại thí nghiệm nhiều lần để cho kết quả chính xác

Sau khi cấy: Ủ ở 37oC trong 3 ngày.

Đánh giá kết quả: xem chủng Bacillus

nào kháng nấm mạnh nhất, chọn chủng

Bacillus đó.

2 Thử khả năng kháng nấm của Trichoderma.

Môi trường thử đối kháng: SA( Sabouraud agar).

Nấm gây bệnh cũng được nuôi trên môi

trường thích hợp để chúng phát triển tốt.

Tiến hành thử nghiệm đối kháng:

Hút 10µl dịch nấm Trichoderma và 10µl dịch nấm gây bệnh (Fusarium sp và Pythium sp.) cấy

đối xứng nhau qua đường kính đĩa, cách mép đĩa petri 1-1.5cm

Tiến hành lập lại thí nghiệm nhiều lần

Thí nghiệm được quan sát 2 ngày 1 lần, sau 3 ngày tiến hành chọn lọc các chủng kháng bệnh mạnh nhất

Trichoderma kháng Fusaryum sp.

a Đánh giá khả năng kháng nấm:

•Phần nấm Trichoderma phát triển bao phủ

qua phần nấm gây hại.

•Phần nấm gây hại bị bào mòn dần ở mép

khuẩn lạc.

•Phần nấm Trichoderma phát triển và khống

chế làm cho nấm gây hại không phát triển

được.

b Đánh giá mức đối kháng của nấm:

•Kháng mạnh: Nấm Trichoderma tấn công và phá hủy

hoàn toàn nấm gây hại, kí hiệu: +++

•Kháng trung bình: Nấm Trichoderma tấn công và phá

hủy một phần nấm gây hại, kí hiệu: ++

•Kháng yếu: Nấm Trichoderma ngăn chặn sự phát triển

của nấm gây hại, kí hiệu: +

•Không kháng: nấm gây hại gần như phát triển bình

thường, xâm nhập vào vùng phát triển của nấm, kí

hiệu: Chọn chủng Trichoderma kháng nấm mạnh nhất.

3 Thử khả năng kết hợp của nấm Trichoderma với chủng

Bacillus đã được chọn qua định tính.

•Từ chủng nấm Trichoderma và chủng Bacillus đã được

chọn ra sau khi định tính ta tiến hành thử khả năng kết hợp giữa chúng.

•Chuẩn bị môi trường nuôi cấy: PGA.

•Trichoderma và Bacillus được cấy đối xứng nhau qua

đường kính đĩa petri, khoảng cách giữa chúng là 3cm

•Quan sát khả năng kết hợp giữa chúng:

Trichoderma và Bacillus cùng mọc được trên cùng môi

trường: không ức chế lẫn nhau.

Trichoderma mọc lấn ác Bacillus hoặc ngược lại.

Ức chế lẫn nhau.

•Chọn ra chủng nấm Trichoderma và chủng Bacillus có

khả năng kết hợp nhau tốt nhất.

ĐỊNH LƯỢNG

Khảo sát phần trăm ức chế:

Công thức tính phần trăm ức chế:

Đường kính đĩa đối chứng - Đường kính đĩa cấy x 100%

Đường kính đĩa đối chứng

Nếu % ức chế càng lớn thì khả năng

ức chế của Trichoderma và Bacillus

càng mạnh Người ta sẽ chọn những nấm có % ức chế lớn nhất đem thử nghiệm Invivo.

III THỬ NGHIỆM INVIVO

 Nấm tăng sinh trong môi trường cám, mạt

cưa, sau đó đem pha với nước muối sinh lý 0,85%

để đạt mật độ 1 - 2.106 tb/ml

 Đất đã khử trùng

Bước 2: Thử nghiệm.

Phương pháp thực hiện thử nghiệm

Invivo.

Số nghiệm thức: Thực hiện 15 nghiệm

thức, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần (tổng cộng có 45 nghiệm thức).

Pythium sp Fusarium sp Pythium sp +

Fusarium sp

Cấy cùng lúc

Ttrichoderma và Bacillus

Cấy Trichoderma

trước, Bacillus

sau.

Cấy Trichoderma trước, Bacillus sau. Cấy Trichoderma trước, Bacillus sau.

Bảng: Các lô thí nghiệm

• Đánh giá kết quả thử nghiệm: đánh giá mức

độ kháng Fusaium sp và Pythium sp dựa vào

số hạt tỉ lệ hạt nảy mầm và số nốt sần trên rễ

cây.

LÊN MEN

CÁC BƯỚC LÊN MEN

Bước 1: Thiết lập môi trường dùng trong tăng sinh

giống sản xuất

Sử dụng phương pháp lên men bề mặt( lên men nổi)

MÔI TRƯỜNG LÊN MEN TỐI ƯU HÓA CHO

TRICHODESMA

Tạo môi trường hiếu khí.

Tạo môi trường có pH 2-6( pH thích hợp cho nấm Trichoderma tiết ra Enzyme).

Môi trường có độ ẩm cao.

pH thích hợp để hình thành bào tử là 5-5,8 tùy từng mức pH mà cho các loại bào tử khác nhau

Nhiệt độ tối ưu là 25-30 0 C

Nhiệt độ thích hợp tiết Chitinase là 40 0 C, Glucanase

ở 35 0 C.

Nguồn cacbon chủ yếu là glucose, galatose, mantose, D-fructose.

D-MÔI TRƯỜNG TỐI ƯU HÓA BACILLUS

Sử dụng phương pháp lêm men chìm( Lên men bề sâu)

Nhiệt độ tối ưu : 550C

PH tối ưu: 7-8.

Môi trường hiếu khí hoặc kị khí tùy nghi.

Bước 2: Thanh trùng môi trường, nồi lên

men và các thiết bị kèm theo.

Bước 3: Nhân sinh khối đủ lớn, mạnh và

thuần để cung cấp cho các bồn lên men

trong quá trình sản xuất.

Bước 4: Cung cấp các điều kiện tối ưu cho

sự phát triển của giống để giống sản sinh sản phẩm.

QUÁ TRÌNH XỬ LÍ SAU LÊN MEN

• Bao gồm: Tách chiết và tinh chế sản phẩm

thành dạng thích hợp cho mục đích nhất định.

• Các loại sản phẩm: Toàn bộ tế bào, Vaccine, Protein trị liệu, Kháng thể đơn dòng Các sản phẩm khác nhau đáng kể về kích thước phân

tử, thành phần hóa học, yêu cầu về độ tinh

sạch

• Cần các phương pháp khác nhau để thu hồi

và tinh sạch.

• Bước 7: Sấy cả 2 sản phẩm ở: 180oC/30 phút, sau đó phối trộn 2 sản phẩm

Trichoderma Và Bacillus lại với nhau.

• Bước 8: Xử lý những chất thải tạo ra

trong qui trình.

Điều kiện bảo quản chế phẩm

Khảo sát thời gian bảo quản chế phẩm( thường

là 6 tháng đối với 2 chủng trên)

thoáng mát)

phẩm được bào chế dưới dạng bào tử tinh khiết 100% (>99,99%)

 Sản phẩm chứa bào tử có thể bảo quản vô thời hạn ở nhiệt độ phòng trong điều kiện đóng gói kín hoàn toàn

• Điều này không thể có được ở sản phẩm probiotic của sinh vật không có khả năng

tạo bào tử, ví dụ như các Lactobacillus

đang sử dụng khá phổ biến hiện nay.

• Tìm hiểu trên thị trường xem đã có sản

phẩm nào tương tự không nếu chưa có sản phẩm nào tương tự thì ta đăng ký bản

quyền cho sản phẩm.

• Nếu Sản phẩm sản xuất ra được chứng nhận bản quyền thì chúng ta sẽ đưa vào sản xuất công nghiệp với quy mô lớn

để bán trên thị trường.