ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM NÔNG THỊ HƯƠNG Tên đề tài: ĐỊNH DANH MỘT SỐ LOÀI CÁ CHÉP TẠI TỈNH HÀ GIANG BẰNG PHÂN LOẠI HÌNH THÁI VÀ CHỈ THỊ PHÂN TỬ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆ
ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Đối tượng nghiên cứu và phạm vi nghiên cứu
3.1.1 Đối tượng nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu là cá chép thu thập tại một số địa phương của tỉnh Hà Giang
Nghiên cứu đặc điểm hình thái và di truyền trên các mẫu cá chép thu thập Các nghiên cứu được tiến hành trong phạm vi phòng thí nghiệm
3.1.3 Dụng cụ, nguyên vật liệu nghiên cứu
Các dụng cụ, thiết bị nghiên cứu chính của đề tài được tổng hợp trong bảng 3.1
Bảng 3.1 Các dụng cụ, thiết bị nghiên cứu chính của đề tài
STT Dụng cụ, thiết bị Hãng sản xuất, nước sản xuất
1 Máy đồng hóa mẫu Benchmark, Trung Quốc
2 Cân điện tử Startorius, Đức
3 Nồi khử trùng Hirayama - Japan
4 Lò vi sóng Trung Quốc
5 Bể ổn nhiệt JSR, Hàn Quốc
6 Máy ly tâm lạnh Eppendorf, Đức
7 Máy Vortex Mixer IAK, Đức
9 Máy PCR Master cycler X50s Eppendorf, Đức
10 Hệ thống điện di DNA Scie - Plas Ltd, Anh
11 Máy soi và chụp ảnh gel Kodak, Nhật Bản
12 Micropipette các loại Eppendorf, Đức
Các hóa chất sinh học phân tử cho phản ứng PCR của hãng Promega bao gồm các thành phần cần thiết để thực hiện quy trình này Hóa chất điện di như agarose, Tris-HCl, axit acetic băng, EDTA, ethidium bromide và DNA loading dye được cung cấp bởi hãng Merck Ngoài ra, bộ KIT tách chiết DNA tổng số và bộ KIT tinh sạch DNA cũng đến từ hãng Promega, hỗ trợ hiệu quả trong việc xử lý và phân tích DNA.
Cặp mồi CarpF/CarpR được thiết kế để khuếch đại vùng gen COI mã hóa Cytochrome c oxidase subunit I của cá chép, dựa trên nghiên cứu của Ward và cộng sự năm 2005 Thông tin chi tiết về cặp mồi này được trình bày trong bảng 3.2.
Bảng 3.2 Cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu
Ký hiệu mồi Trình tự nucleotide (5’→3’)
Nhiệt độ biến tính (Tm, o C)
Kích thước sản phẩm PCR (bp)
Trình tự mồi được đặt sản xuất tại công ty Phusa Biochem Ltd., Quận Ninh Kiều, thành phố Cần Thơ.
Nội dung nghiên cứu
Chúng tôi đã thu thập các mẫu cá chép từ một số địa phương của tỉnh Hà Giang và tiến hành mô tả đặc điểm hình thái của những mẫu cá chép này.
Nội dung 3: Định danh mẫu một số mẫu cá chép thu thập bằng chỉ thị phân tử
- Tách chiết DNA của các mẫu giống cá chép thu thập
- Khuếch đại vùng gen mục tiêu bằng kỹ thuật PCR
- Giải trình tự gen, định danh loài một số mẫu cá chép thu thập.
Phương pháp nghiên cứu
3.3.1 Phương pháp mô tả đặc điểm hình thái các mẫu cá chép thu thập
Các đặc điểm hình thái của các mẫu cá chép thu thập được mô tả theo hướng dẫn của Rainboth, W.J năm 1996 [26]
- Đo một số thông số hình thái ngoài: Đo đếm một số hình thái ngoài của cá chép được thực hiện theo sơ đồ hình 3.1
Hình 3.1 Sơ đồ đo, đếm các chỉ tiêu hình thái cá (theo Rainboth W.J., 1996) [26]
Hình 3.2 Sơ đồ đo, đếm các chỉ tiêu hình thái cá chép
Chiều dài toàn thân (Lt) là tổng chiều dài của cá, trong khi chiều dài thân chuẩn (Ls) được sử dụng để đo kích thước cơ thể một cách chính xác hơn Chiều dài vây bụng (Lv) và chiều dài đầu (Lh) cũng là những thông số quan trọng trong việc xác định hình dạng và kích thước của cá Đường kính mắt (Ed) và khoảng cách trước của mắt (SL) giúp đánh giá đặc điểm của cá, trong khi chiều dài mõm (Lm) và chiều cao thân (Hb) cung cấp thông tin về cấu trúc cơ thể Cuối cùng, chiều dài cán đuôi (Cpl) và chiều cao cán đuôi (Cpw) là những yếu tố cần thiết để phân tích hình thái và sự phát triển của cá.
Xác định một số chỉ tiêu sinh chắc (Biometric index):
+ Chiều dài mõm/chiều dài đầu (Lm/Lh)
+ Đường kính mắt/chiều dài đầu (Ed/Lh)
+ Chiều dài mõm/chiều dài thân chuẩn (Lm/Ls)
+ Đường kính mắt/chiều dài thân chuẩn (Ed/Ls)
+ Khoảng cách hai mắt/chiều dài thân chuẩn (De/Ls)
+ Chiều dài đầu/chiều dài thân chuẩn (Lh/Ls)
+ Chiều cao thân/chiều dài thân chuẩn (Hb/Ls)
+ Chiều dài vây bụng/chiều dài thân chuẩn (Lv/Ls)
- Đếm một số thông số của vây:
Các loại vây bao gồm việc đếm số lượng tia vây của vây lưng, vây ngực, vây bụng, vây hậu môn và vây đuôi Ngoài ra, hình dạng của vây mỡ và vây đuôi cũng là những yếu tố quan trọng cần xem xét.
1 Vây lưng (D - Dorsal) 4 Vây ngực (P - Pectoral)
2 Vây bụng (V - Ventral) 5 Vây đuôi (C - Caudal)
Các vây có hai loại tia chính: tia đơn và tia phân nhánh Tia đơn được chia thành tia cứng (ghi bằng số La Mã) và tia mềm (ghi bằng số Ả Rập) Tia phân nhánh cũng được ghi bằng số Ả Rập Giữa các tia đơn và tia phân nhánh được phân cách bằng dấu phẩy (,), trong khi các loại tia khác nhau được phân biệt bằng gạch nối (-).
Hình 3.3 Chỉ dẫn đếm gai, tia không phân nhánh, tia phân nhánh của vây cá xương (theo Rainboth W.J., 1996) [26]
+ Đếm số vẩy đường bên, số đường vẩy trên, số đường vẩy dưới
Các thông số đo đếm được thực hiện bằng thước kẹp panme, đơn vị đo: mm
3.3.2 Định danh một số mẫu cá chép thu thập bằng chỉ thị phân tử
3.3.2.1 Tách chiết DNA tổng số của các mẫu cá chép thu thập
DNA của các mẫu cá chép được tách chiết bằng bộ KIT của hãng Promega, thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất với một số điều chỉnh nhỏ cho phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm Các bước tiến hành cụ thể được thực hiện như sau:
- Cõn chớnh xỏc 20 mg mẫu cỏ vào ống effendorf 2 ml và bổ sung 600 àl dung dịch Nuclei Lysis solution
- Nghiền mẫu trong máy đồng hóa mẫu 4 lần, mỗi lần 30 giây cho tới khi mô cá được phá hủy
- Ủ mẫu ở 65 o C trong 30 phút, cứ 10 phút đảo trộn một lần bằng máy vortex
- Bổ sung 3 àl dung dịch Rnase Solution đảo trộn nhẹ bằng tay, ủ mẫu ở
37 o C trong 30 phút sau đó để ở nhiệt độ phòng 5 phút
- Bổ sung 200 àl dung dịch Protein Precipitation Solution, đảo trộn bằng mỏy votex Để mẫu trong tủ -20 o C trong 5 phút
- Ly tâm 12.000 vòng/phút trong trong 4 phút Chuyển dung dịch pha trên sang ống effendof 1,5 ml mới, vô trùng
- Bổ sung 600 àl dung dịch isopropanol, đảo trộn nhẹ bằng tay cho tới khi thấy tủa DNA dạng sợi
- Ly tâm 12.000 vòng/phút trong 1 phút, loại bỏ dịch, thu cặn Bổ sung 600 àl dung dịch ethanol 70%, sau đú đảo trộn nhẹ
- Ly tâm 12.000 vòng/phút trong 1 phút, loại bỏ dung dịch ethanol
Rửa cồn lần 2 bằng cách bổ sung 600 àl dung dịch ethanol 70%, sau đó đảo trộn nhẹ và ly tâm ở 12.000 vòng/phút trong 1 phút Tiếp theo, loại bỏ dung dịch ethanol và tiếp tục ly tâm ở cùng tốc độ trong 1 phút nữa để hút bỏ toàn bộ dung dịch Cuối cùng, để mẫu khô tự nhiên trong 10-15 phút cho đến khi hết mùi ethanol.
- Bổ sung 50 àl dung dịch Rehydration Solution để hũa tan DNA
- Kiểm tra sản phẩm tách chiết bằng điện di trên gel agarose 1,0%
3.3.2.2 Khuếch đại vùng gen mục tiêu bằng kỹ thuật PCR
Vùng gen COI nằm trong ty thể của cá chép mã hóa Cytochrome c oxidase subunit I được khuếch đại sử dụng cặp mồi CarpF/CarpR Thành phần phản ứng gồm:
- Deion H2O: 16,0 àl Điều kiện chu trình nhiệt của phản ứng PCR gồm các bước như sau:
- Giai đoạn biến tính ban đầu: 94 o C trong 5 phút
- 25 chu kỳ khuếch đại gồm 3 bước:
+ Kéo dài mồi: 72 o C trong 60 giây
- Giai đoạn kéo dài cuối cùng: 72 o C trong 5 phút
- Ủ bảo quản mẫu: 10 o C cho đến khi lấy sản phẩm
Sản phẩm PCR được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1,5%
3.3.2.3 Tinh sạch sản phẩm PCR
Sản phẩm PCR được tinh sạch theo quy trình của hãng Promega, tuân thủ hướng dẫn của nhà sản xuất Quy trình này bao gồm các bước cụ thể để đảm bảo chất lượng sản phẩm.
Chuyển sản phẩm PCR vào ống Eppendorf 2 ml và bổ sung dung dịch Membrame Binding với tỷ lệ 10 µl Membrame Binding cho 10 mg mẫu Sau đó, đảo trộn mạnh bằng máy vortex và ly tâm nhẹ bằng máy spindown Cuối cùng, ủ mẫu ở nhiệt độ 65 °C.
10 phút (2 phút đảo trộn 1 lần)
- Ly tâm nhẹ bằng máy Spindown, chuyển toàn bộ mẫu vào cột, để ở nhiệt độ phòng 1 phút
- Ly tâm 14.000 vòng/phút trong 1 phút, loại bỏ dung dịch dưới cột
- Bổ sung vào cột 700 àl dung dịch Membrame Washing, ly tõm 14000 vòng/phút trong 1 phút
- Bổ sung vào cột 500 àl dung dịch Membrame Washing, ly tõm 14000 vòng/phút trong 5 phút Lấy cột cẩn thận ra khỏi ống tránh không làm ướt phía đáy cột
- Loại bỏ dung dịch dưới cột, ly tâm 14.000 vòng/phút trong 1 phút, để ở nhiệt độ phòng cho bay hết ethanol
- Chuyển cột vào ống eppendorf 2,0 ml mới, vụ trựng Bổ sung 50 àl H2O, ủ
- Ly tâm 14.000 vòng/phút trong 1 phút, bỏ cột, thu dịch DNA
- Bảo quản dung dịch DNA tinh sạch ở -20 o C
3.3.2.4 Giải trình tự gen COI
Sản phẩm PCR đã được tinh sạch và giải trình tự 2 chiều bởi Công ty 1st BASE, Selangor, Malaysia, sử dụng phương pháp giải trình tự tự động dựa trên nguyên lý Sanger Trình tự gen thu được được kiểm tra bằng phần mềm SnapGene®Viewer 5.3.1, sau đó đổi chiều từ mồi ngược, loại bỏ tín hiệu nhiễu và tinh chỉnh để có được trình tự chuẩn thông qua phần mềm Clustal Omega.
3.3.2.5 Định danh và dựng cây đa dạng di truyền của các mẫu cá chép thu thập dựa trên chỉ thị gen COI
Trình tự gen COI của các mẫu cá chép đã được thu thập và so sánh với trình tự gen tương ứng trong cơ sở dữ liệu của NCBI bằng phần mềm BLAST.
3.3.3 Phương pháp xử lý số liệu
Các số liệu được tổng hợp và xử lý bằng phần mềm Microsorf Excel.
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
Kết quả thu thập mẫu cá chép tại một số địa phương của tỉnh Hà Giang
Nhóm nghiên cứu đã tiến hành thu thập được 06 mẫu cá chép tại các địa phương của tỉnh Hà Giang Danh sách các mẫu được tổng hợp trong bảng 4.1
Bảng 4.1 Danh sách các mẫu cá chép thu thập tại các địa phương tỉnh Hà Giang
STT Mẫu giống Ký hiệu Địa điểm thu thập Số lượng cá thể (con)
Hoàng Su Phì, Xí Mần, Bắc Quang, Quang Bình, Vị Xuyên
Ký hiệu của các mẫu cá dựa trên màu sắc bên ngoài của cá chép nuôi ruộng
Hà Giang thu thập được Ký hiệu CR-HĐ là mẫu cá có màu hung đỏ, ký hiệu CR-
Mẫu cá chép được phân loại thành 6 loại với các màu sắc khác nhau: màu nâu vàng (ký hiệu CR-T), màu tím (ký hiệu CR-TB), màu trắng bạc (ký hiệu CR-TXVT), màu trắng xanh vảy thưa (ký hiệu CR-XT), và màu xanh trắng Những mẫu cá này đã được thu thập từ các huyện Hoàng Su Phì, Xí Mần, Bắc Quang, Quang Bình và Vị Xuyên thuộc tỉnh Hà Giang, với mỗi loại gồm 5 cá thể Các mẫu cá được nuôi và lưu giữ tại Trung tâm Đào tạo, nghiên cứu và phát triển thủy sản, trường Đại học Nông Lâm, Đại học Thái Nguyên, nhằm phục vụ cho các nghiên cứu về đặc điểm hình thái và sinh học phân tử Hình ảnh đại diện của 6 mẫu cá chép được trình bày trong hình 4.1.
Hình 4.1 Các mẫu cá chép thu thập tại Hà Giang
Kết quả đánh giá đặc điểm hình thái các mẫu giống cá chép thu thập
Kết quả đánh giá một số chỉ tiêu hình thái phân loại của 6 mẫu cá chép thu thập tại Hà Giang được tổng hợp trong bảng 4.2
Bảng 4.2 Một số chỉ tiêu hình thái phân loại của các mẫu cá chép thu thập tại
Hà Giang (n=5) Mẫu Chỉ tiêu
Vây hậu môn II 5-6 Vây hậu môn II 5-6
Vây lưng II 20-21 CR-T Vây lưng I 18-19
Vây hậu môn II 6 Vây hậu môn II 5-6
Vây hậu môn II 5-6 Vây hậu môn II 5-6
Từ kết quả tổng hợp tại bảng 4.2, công thức vây của 6 mẫu cá chép thu thập tại
Hà Giang được xác định như sau:
+ Mẫu CR-XT: DI, 19 - 20; AII, 5 – 6
+ Mẫu CR-HĐ: DII, 20 - 21: AII - 6
+ Mẫu CR-TB: DI, 19; AII, 5 – 6
+ Mẫu CR-NV: DI, 19: AII, 5 – 6
+ Mẫu CR-TXVT: DI, 20 – 21; AII, 5 – 6
Kết quả đánh giá hình thái vây cá chép tại tỉnh Hà Giang cho thấy tất cả mẫu đều có đặc điểm chung: vây ngực và vây bụng có 1 tia cứng, vây đuôi không có tia cứng, và vây hậu môn có 2 tia cứng Đặc biệt, mẫu CR-HĐ có 2 tia cứng ở vây lưng, khác với các mẫu còn lại chỉ có 1 tia cứng.
Số lượng tia phân nhánh ở các mẫu cá chép thu thập cho thấy sự đa dạng, với vây lưng có từ 10 đến 21 tia, vây ngực từ 13 đến 17 tia mềm, vây bụng từ 7 đến 9 tia, vây hậu môn từ 5 đến 6 tia, và vây đuôi từ 18 đến 19 tia phân nhánh.
Bảng 4.3 tổng hợp kích thước một số hình thái của 6 mẫu cá chép thu thập tại tỉnh
Bảng 4.3 Kích thước một số chỉ tiêu hình thái cá chép (n0)
Mẫu Kích thước trung bình một số chỉ tiêu hình thái (cm)
Lv Lh Ed Lm Hb Lt Ls De
Ghi chú các ký hiệu: Lv là chiều dài vây bụng, Lh là chiều dài đầu, Ed là đường kính mắt, Lm là chiều dài mõm, Hb là chiều cao thân, Lt là chiều dài toàn thân, Ls là chiều dài thân chuẩn, và De là khoảng cách giữa 2 mắt.
Dựa trên số liệu về kích thước các chỉ tiêu hình thái của mẫu cá chép, tỷ lệ phần trăm các chỉ tiêu này được tính toán so với chiều dài đầu (Lh) và chiều dài thân chuẩn (Ls) Kết quả tỷ lệ phần trăm của các chỉ tiêu hình thái trên 6 mẫu cá chép thu thập tại Hà Giang được trình bày trong bảng 4.4.
Bảng 4.4 Tỷ lệ % các chỉ tiêu hình thái so với chiều dài đầu (Lh) và chiều dài thân chuẩn (Ls) của cá chép Mẫu
Tỷ lệ phần trăm các chỉ tiêu hình thái của cá chép so với chiều dài đầu và chiều dài thân chuẩn được thể hiện qua các chỉ số như Lm/lh (25,14%), Ed/Lh (26,52%), Lm/Ls (7,55%), Ed/Ls (7,97%), De/Ls (10,62%), Lh/ls (30,04%), Hb/Ls (29,21%) và Lv/Ls (22,24%).
Ghi chú các ký hiệu trong bài viết: Lv đại diện cho chiều dài vây bụng, Lh là chiều dài đầu, Ed là đường kính mắt, Lm là chiều dài mõm, Hb là chiều cao thân, Lt là chiều dài toàn thân, Ls là chiều dài thân chuẩn, và De là khoảng cách giữa 2 mắt.
Kết quả phân tích các chỉ tiêu hình thái của 6 mẫu cá chép tại Hà Giang cho thấy tỷ lệ chiều cao thân/chiều dài thân chuẩn (Lh/Ls) tương đối ổn định, dao động từ 29,21% đến 30,73% Tuy nhiên, các tỷ lệ hình thái khác có sự biến động rõ rệt, cụ thể: tỷ lệ chiều dài mõm/chiều dài đầu (Lm/Lh) dao động từ 25,14% đến 32,64%, tỷ lệ khoảng cách giữa mắt/chiều dài mõm (De/Lm) dao động từ 18,45% đến 26,52%, tỷ lệ chiều dài mõm/chiều dài thân chuẩn (Lm/Ls) dao động từ 7,55% đến 10,47%, và tỷ lệ đường kính mắt/chiều dài thân chuẩn (Ed/Ls) cũng có sự biến động tương tự.
7,43%-14,10%, tỷ lệ chiều dài đầu/chiều dài thân chuẩn (Lh/Ls) dao động từ 29,78% - 32,54%, tỷ lệ chiều dài vây bụng/chiều dài thân chuẩn (Lv/Ls) dao động từ 19,02% - 23,23%
Về đặc điểm hình thái vảy của các mẫu cá chép thu thập tại Hà Giang được tổng hợp trong bảng 4.4 dưới đây:
Bảng 4.5 Đặc điểm hình thái vảy của các mẫu cá chép thu thập tại Hà Giang
Số vảy trên đường bên
Số hàng vảy trên đường bên
Số hàng vảy dưới đường bên
Số vảy trên đường bên
Số hàng vảy trên đường bên
Số hàng vảy dưới đường bên
Từ kết quả mô tả đặc điểm vảy của 6 mẫu cá chép thu thập tại Hà Giang xác định được công thức vảy của các mẫu như sau
5−635 + Mẫu CR-TXVT: Không xác định, do số vảy biến động rất lớn
Trong nghiên cứu về 6 mẫu cá chép tại Hà Giang, 5 mẫu cho thấy công thức vây ổn định Mẫu CR-XT có 30-33 vảy trên đường bên, 4-5 hàng vảy trên đường bên và 4-6 hàng vảy dưới đường bên Mẫu RR-HĐ có 32-35 vảy trên đường bên, 4-5 hàng vảy trên đường bên và 5-6 hàng vảy dưới đường bên Mẫu CR-TB có 33-35 vảy trên đường bên, 4-5 hàng vảy trên đường bên và 5-6 hàng vảy dưới đường bên Mẫu CR-NV có 30-32 vảy trên đường bên, 4-5 hàng vảy trên đường bên và 5-6 hàng vảy dưới đường bên Mẫu CR-T có 33-35 vảy trên đường bên, 4-5 hàng vảy trên đường bên và 5-6 hàng vảy dưới đường bên Đặc biệt, mẫu CR-TXVT có số vảy trên đường bên dao động lớn (20-26 vảy) và số hàng vảy không ổn định (3-4 hàng), do đó không xác định được công thức vẩy Từ các kết quả này, có thể xác định công thức vây và vẩy của 6 mẫu cá chép thu thập tại Hà Giang.
+ Mẫu CR-XT: Công thức vây: DI, 19 - 20; AII, 5 – 6
+ Mẫu CR-HĐ: Công thức vây: DII, 20 - 21: AII, 6
5−635 + Mẫu CR-TB: Công thức vây: DI, 19; AII, 5 – 6
5−635 + Mẫu CR-NV: Công thức vây: DI, 19: AII, 5 – 6
5−632 + Mẫu CR-T: Công thức vây: DI, 18 -19; AII, 5 – 6
5−635 + Mẫu CR-TXVT: Công thức vây: DI, 20 – 21; AII, 5 – 6
Công thức vảy: Không xác định
Theo các nghiên cứu các đã công bố, công thức vây của cá chép là DIII, 18-
22; AIII, 5-6; Công thức vảy của cá chép là 30 6−8
Mẫu cá chép thu thập tại tỉnh Hà Giang cho thấy một số khác biệt so với công thức chung về hình thái của cá chép Cụ thể, số lượng vây cứng tại vây lưng ít hơn, chỉ có 1-2 vây cứng so với 3 vây cứng của cá chép nói chung Ngoài ra, số lượng vây cứng của vây hậu môn cũng có sự khác biệt đáng chú ý.
Cá chép Hà Giang có đặc điểm nổi bật với chỉ 2 vây cứng, ít hơn so với 3 vây của cá chép thông thường Về công thức vảy, cá chép Hà Giang sở hữu 4-6 hàng vảy trên đường bên và 5-6 hàng vảy dưới đường bên, thấp hơn so với cá chép chung với 6-8 hàng vảy trên và 6-7 hàng vảy dưới Đặc biệt, mẫu cá chép CR-TXVT không thể xác định công thức vẩy do sự biến động lớn về số lượng vẩy giữa các cá thể phân tích.
Kết quả định danh một số mẫu cá chép thu thập bằng chỉ thị phân tử
4.2.1 Kết quả tách chiết DNA tổng số của các mẫu cá chép thu thập Để tách chiết DNA tổng số của các mẫu cá chép thu thập từ Hà Giang phục vụ cho các nghiên cứu định danh bằng chỉ thị phân tử Trước tiên, chúng tôi tiến hành thử nghiệm khả năng tách chiết DNA bằng 2 phương pháp gồm tách chiết theo phương pháp sử dụng hóa chất đệm CTAB ( Cetyl trimethyl ammonium bromide) của Saghai Maroof et al, 1984 và phương pháp tách chiết theo bộ KIT của hãng Promega(Wizard Genomic DNA Purification Kit) Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm tách chiết DNA tổng số của cá chép từ 2 phương pháp này được thể hiện trong hình 4.2
Hình 4.2 Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm tách chiết DNA tổng số
1 và 2: Tách chiết DNA tổng số dựa trên phương pháp sử dụng hóa chất đệm CTAB ; 3 và 4: Tách chiết DNA tổng số bằng bộ KIT của hãng
Pomega(Wizard Genomic DNA Purification Kit)
Kết quả tách chiết DNA tổng số từ mẫu cá chép cho thấy, đường chạy số 1, 3 và 4 xuất hiện băng DNA tổng số, trong khi đường chạy số 2 không có băng DNA rõ ràng do mẫu chứa nhiều tạp chất So sánh giữa hai phương pháp tách chiết cho thấy, trong hai mẫu tách chiết bằng hóa chất, chỉ có một mẫu thành công, còn một mẫu không đạt yêu cầu Ngược lại, phương pháp tách chiết bằng bộ KIT của hãng Promega cho kết quả rõ ràng với cả hai mẫu, không bị đứt gãy và không có tạp chất Kết quả này chứng minh rằng phương pháp sử dụng bộ KIT hiệu quả hơn so với phương pháp hóa chất CTAB Do đó, để đảm bảo tách chiết thành công DNA tổng số từ các mẫu cá chép cho nghiên cứu sinh học phân tử, phương pháp tách chiết theo bộ KIT của Promega được khuyến nghị Kết quả tách chiết DNA tổng số của 6 mẫu cá chép từ Hà Giang được tổng hợp trong bảng 4.6, và kết quả điện di kiểm tra sản phẩm tách chiết được thể hiện trong hình 4.3.
Bảng 4.6 Kết quả kiểm tra sản phẩm tách chiết DNA tổng số từ các mẫu cá chép thu thập tại Hà Giang
STT Ký hiệu mẫu Hàm lượng DNA tổng số
(ng/àl) Tỷ số OD 260 /OD 280
Hình 4.3 Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm tách chiết DNA tổng số sử dụng bộ kit của hãng Promega
Mẫu 1: CR-XT, mẫu 2: CR-HĐ, mẫu 3: CR-TB, mẫu 4: CR-NV, mẫu 5:
Kết quả tách chiết DNA tổng số từ vây của 6 mẫu cá chép thu thập từ Hà Giang cho thấy cả 6 mẫu đều có băng DNA rõ ràng với cường độ lớn Nồng độ DNA tổng số dao động từ 128,2 đến 177,5 ng/µl, với tỷ số OD260/OD280 từ 1,85 đến 1,99, chứng tỏ dung dịch DNA tách chiết có hàm lượng lớn và tinh sạch, đủ điều kiện cho các nghiên cứu sinh học phân tử.
4.2.2 Kết quả khuếch đại vùng gen COI bằng kỹ thuật PCR
4.2.2.1 Thử nghiệm nhiệt độ gắn mồi khuếch đại vùng gen COI Để thực hiện phản ứng PCR khuếch đại hiệu quả vùng gen COI của cá chép phục vụ giải trình tự gen, chúng tôi đã thử nghiệm phản ứng PCR với các nhiệt độ gắn mồi khác nhau từ 55 o C đến 63 o C, kết quả điện di kiểm tra sản phẩm của phản ứng PCR được thể hiện trong hình 4.4 dưới đây
Hình 4.4 trình bày kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR ở các nhiệt độ khác nhau Các đường chạy 1, 2, 3, 4, 5 tương ứng với sản phẩm PCR được thực hiện ở nhiệt độ gắn mồi lần lượt là 55 o C, 57 o C, 59 o C, 61 o C và 63 o C Các mẫu được kiểm tra bao gồm: mẫu 1 (CR-XT), mẫu 2 (CR-HĐ), mẫu 3 (CR-TB), mẫu 4 (CR-NV).
Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR cho thấy, ở tất cả các nhiệt độ gắn mồi từ 55 o C đến 63 o C, sản phẩm PCR chỉ xuất hiện 1 băng duy nhất, chứng tỏ phản ứng PCR khuếch đại đặc hiệu vùng gen COI của cá chép Khi nhiệt độ gắn mồi tăng từ 55 o C đến 61 o C, cường độ băng DNA không giảm và không xuất hiện sản phẩm phụ, cho thấy nhiệt độ này đảm bảo khuếch đại đặc hiệu và hiệu quả Tuy nhiên, khi nhiệt độ gắn mồi lên 63 o C, cường độ băng sản phẩm PCR giảm, chứng tỏ hiệu quả phản ứng giảm Do đó, nhiệt độ gắn mồi tối ưu cho phản ứng PCR được chọn là 61 o C để đảm bảo khuếch đại vùng gen COI hiệu quả.
4.2.2.2 Khuếch đại vùng gen COI của các mẫu cá chép Hà Giang bằng phản ứng PCR
Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR khuếch đại vùng gen COI từ 6 mẫu cá chép thu thập tại Hà Giang được thể hiện trong hình 4.5
Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR cho thấy tất cả 6 mẫu cá chép đều cho một băng sản phẩm PCR duy nhất với cường độ băng sáng rõ, kích thước khoảng
Sản phẩm PCR gen COI có kích thước 638 bp, phù hợp với kích thước lý thuyết khi sử dụng cặp mồi CarpF/CarpR Điều này xác nhận rằng vùng gen COI từ 6 mẫu cá chép Hà Giang đã được khuếch đại thành công, tạo ra sản phẩm PCR đặc hiệu.
Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR khuếch đại vùng gen COI của các mẫu cá chép Hà Giang cho thấy đường chạy M là Ladder 100-1000 bp (Promega), với mẫu kiểm chứng âm tính ở đường chạy 1 và 6 mẫu cá chép Hà Giang ở các đường chạy 2-7, trong đó mẫu 2 là CR-.
XT, mẫu 3: CR-HĐ, mẫu 4: CR-TB, mẫu 5: CR-NV, mẫu 6: CR-T, mẫu 7:
Sản phẩm PCR đã khuếch đại vùng gen COI từ 6 mẫu cá chép Hà Giang và được tinh sạch bằng kit tinh sạch của hãng Promega Kết quả kiểm tra sản phẩm tinh sạch qua điện di được trình bày trong hình 4.6.
Kết quả điện di cho thấy cả 6 mẫu sản phẩm PCR tinh sạch đều chỉ xuất hiện 1 băng DNA duy nhất với kích thước khoảng 638 bp, không có sản phẩm phụ hay tạp chất Điều này chứng tỏ rằng sản phẩm PCR khuếch đại gen COI của 6 mẫu cá chép Hà Giang đã được tinh sạch thành công, đủ điều kiện để thực hiện giải trình tự gen.
Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR sau khi tinh sạch cho thấy đường chạy M là thang chuẩn 100-1000 bp (Promega) Các mẫu cá chép Hà Giang được phân tích từ mẫu 1 đến mẫu 6, trong đó mẫu 1 là CR-XT, mẫu 2 là CR-HĐ, và mẫu 3 là CR-TB.
CR-NV, mẫu 5: CR-T, mẫu 6: CR-TXVT
4.2.3 Kết quả giải trình tự vùng gen COI của các mẫu cá chép Hà Giang thu thập
Sản phẩm PCR đã khuếch đại vùng gen COI từ 6 mẫu cá chép Hà Giang và được tinh sạch trước khi gửi đi giải trình tự gen 2 chiều bởi Công ty 1st BASE (Malaysia) theo phương pháp Sanger Sau khi xác định trình tự 2 chiều, các trình tự được so sánh bằng phần mềm Clustal Omega để thu được trình tự chuẩn Kết quả là 6 trình tự chuẩn của các mẫu cá chép Hà Giang.
Trình tự gen COI của mẫu CR-XT:
TCAACCAACCACAAAGACATTGGCACCCTTTATCTTGTATTTGGTGCCTGAGCCGGAATAGTAGGAACCGCCTTAAGCCTCCTCATTCGGGCCGAACTTAGCCAACCCGGGTCGCTTCTAGGTGATGACCAAATTTATAACGTTATCGTCACTGCCCACGCCTTTGTAATAATTTTCTTTATAGTAATGCCTATCCTTATTGGAGGATTTGGAAACTGACTTGTACCACTAATAATCGGAGCCCCAGACATAGCATTCCCACGAATAAATAACATAAGCTTCTGACTACTGCCCCCATCATTCCTTCTACTCCTAGCTTCTTCTGGTGTTGAAGCTGGAGCCGGAAC
AGGATGAACCGTATACCCACCTCTTGCAGGGAACTTAGCCCACGCAGGA GCATCAGTAGACCTAACAATTTTCTCACTTCACCTAGCAGGTGTTTCATC AATTCTAGGGGCAATCAACTTTATTACTACAACCATCAACATGAAACCC CCAGCCATCTCCCAATACCAAACACCCCTGTTCGTCTGATCCGTGCTTGT AACCGCCGTATTGCTCCTTCTATCATTACCTGTCTTAGCCGCAGGAATTA CAATGCTCCTAACAGACCGAAACCTTAATACCACATTCTTGACCCGGCA GGAGGAGGAGACCCAATCCTTACAACCCACTTATTCTGATTCTTTGGCC ACCCAGAAGTCTA
Hình 4.7 Sơ đồ giải trình tự của mẫu CR-XT trên phần mêm BioEdit
A: Trình tự gen chiều từ 5’- 3’
B: Trình tự gen chiều từ 3’- 5’
Trình tự gen COI của mẫu CR-HĐ:
ATTGGAGGATTTGGAAACTGACTTGTACCACTAATAATCGGAGCCCCAG ACATAGCATTCCCACGAATAAATAACATAAGCTTCTGACTACTGCCCCC ATCATTCCTTCTACTCCTAGCTTCTTCTGGTGTTGAAGCTGGAGCTGGAA CAGGATGAACCGTATACCCACCTCTTGCAGGGAACTTAGCCCACGCAGG AGCATCAGTAGACCTAACAATCTTCTCACTTCACCTAGCAGGTGTTTCAT CAATTCTAGGGGCAATCAACTTTATTACTACAACCATCAACATGAAACC CCCAGCCATCTCCCAATACCAAACACCCCTGTTCGTCTGATCCGTGCTTG TAACCGCCGTATTGCTCCTTCTATCATTACCTGTTTTAGCCGCAGGAATT ACAATGCTCCTAACAGACCGAAACCTTAATACCACATTCTTGACCCGGC AGGAGGAGGAGACCCATCCTTACACCTTATCTTATTCTGATTCTTTGGCC ACCCAGAAGTCTA
Hình 4.8 Sơ đồ giải trình tự của mẫu CR-HD trên phần mêm BioEdit
A: Trình tự gen chiều từ 5’- 3’
B: Trình tự gen chiều từ 3’- 5’
Trình tự gen COI của mẫu CR-TB:
TCAACCAACCACAAAGACATTGGCACCCTTTATCTTGTATTTGGTGCCTG AGCCGGAATAGTAGGAACCGCCTTAAGCCTCCTCATTCGGGCCGAACTT AGCCAACCCGGGTCGCTTCTAGGTGATGACCAAATTTATAACGTTATCG TCACTGCCCACGCCTTTGTAATAATCTTCTTTATAGTAATGCCTATCCTT ATTGGAGGATTTGGAAACTGACTTGTACCACTAATAATCGGAGCCCCAG ACATAGCATTCCCACGAATAAATAACATAAGCTTCTGACTACTGCCCCC ATCATTCCTTCTACTCCTAGCTTCTTCTGGTGTTGAAGCTGGAGCTGGAA CAGGATGAACCGTATACCCACCTCTTGCAGGGAACTTAGCCCACGCAGG AGCATCAGTAGACCTAACAATTTTCTCACTTCATCTAGCAGGTGTTTCAT CAATTCTAGGGGCAATCAACTTTATTACTACAACCATCAACATGAAACC CCCAGCCATCTCCCAATACCAAACACCCCTGTTCGTCTGATCCGTGCTTG TAACCGCCGTATTGCTCCTTCTATCATTACCTGTTTTAGCCGCAGGAATT ACAATGCTCCTAACAGACCGAAACCTTAATACCACATTCTTGACCCGGC AGGAGGAGGAGACCCAATCCTTTATCAACACTTATTCTGATTCTTTGGCC ACCCAGAAGTCTA
Hình 4.9 Sơ đồ giải trình tự của mẫu CR-TB trên phần mêm BioEdit A: Trình tự gen chiều từ 5’- 3’
B: Trình tự gen chiều từ 3’- 5’
Trình tự gen COI của mẫu CR-NV:
TCAACCAAACCACAAAGACATTGGCACCCTTTATCTTGTATTTGGTGCCT GAGCCGGAATAGTAGGAACCGCCTTAAGCCTCCTCATTCGGGCCGAACT TAGCCAACCCGGGTCGCTTCTAGGTGATGACCAAATTTATAACGTTATC GTCACTGCCCACGCCTTTGTAATAATTTTCTTTATAGTAATGCCTATCCTT ATTGGAGGATTTGGAAACTGACTTGTACCACTAATAATCGGAGCCCCAG ACATAGCATTCCCACGAATAAATAACATAAGCTTCTGACTACTGCCCCC ATCATTCCTTCTACTCCTAGCTTCTTCTGGTGTTGAAGCTGGAGCCGGAA CAGGATGAACCGTATACCCACCTCTTGCAGGGAACTTAGCCCACGCAGG AGCATCAGTAGACCTAACAATTTTCTCACTTCACCTAGCAGGTGTTTCAT CAATTCTAGGGGCAATCAACTTTATTACTACAACCATCAACATGAAACC CCCAGCCATCTCCCAATACCAAACACCCCTGTTCGTCTGATCCGTGCTTG TAACCGCCGTATTGCTCCTTCTATCATTACCTGTCTTAGCCGCAGGAATT ACAATGCTCCTAACAGACCGAAACCTTAATACCACATTCTTTGACCCGG CAGGAGGAGGAGACCCAATCCTTTATCAACACTTATTCTGATTCTTTGGC CACCAGAAAGTCTA
Hình 4.10 Sơ đồ giải trình tự của mẫu CR-NV trên phần mêm BioEdit A: Trình tự gen chiều từ 5’- 3’
B: Trình tự gen chiều từ 3’- 5’
Trình tự gen COI của mẫu CR-T
TCAACCAAACCACAAAGACATTGGCACCCTTTATCTTGTATTTGGTGCCTGAGCCGGAATAGTAGGAACCGCCTTAAGCCTCCTCATTCGGGCCGAACTTAGCCAACCCGGGTCGCTTCTAGGTGATGACCAAATTTATAACGTTATCGTCACTGCCCACGCCTTTGTAATAATTTTCTTTATAGTAATGCCTATCCTTATTGGAGGATTTGGAAACTGACTTGTACCACTAATAATCGGAGCCCCAGACATAGCATTCCCACGAATAAATAACATAAGCTTCTGACTACTGCCCCCATCATTCCTTCTACTCCTAGCTTCTTCTGGTGTTGAAGCTGGAGCCGGAACAGGATGAACCGTATACCCACCTCTTGCAGGGAACTTAGCCCACGCAGGAGCATCAGTAGACCTAACAATTTTCTCACTTCACCTAGCAGGTGTTTCATCAATTCTAGGGGCAATCAACTTTATTACTACAACCATCAACATGAAACCCCCAGCCATCTCCCAATACCAAACACCCCTGTTCGTCTGATCCGTGCTTGTAACCGCCGTATTGCTCCTTCTATCATTACCTGTCTTAGCCGCAGGAATTACAATGCTCCTAACAGACCGAAACCTTAATACCACATTCTTGACCCGGCAGGAGGAGGAGACCCAATCCTTTATCAACCTTCTGTCTGATTCTTTGGCCACCCAGAAGTCTA
Hình 4.11 Sơ đồ giải trình tự của mẫu CR-T trên phần mêm BioEdit
A: Trình tự gen chiều từ 5’- 3’
B: Trình tự gen chiều từ 3’- 5’
Trình tự gen COI của mẫu CR-TXVT:
TCAACCAACCACAAAGACATTGGCACCCTTTATCTTGTATTTGGTGCCTGAGCCGGAATAGTAGGAACCGCCTTAAGCCTCCTCATTCGGGCCGAACTTAGCCAACCCGGGTCGCTTCTAGGTGATGACCAAATTTATAACGTTATCGTCACTGCCCACGCCTTTGTAATAATTTTCTTTATAGTAATGCCTATCCTTATTGGAGGATTTGGAAACTGACTTGTACCACTAATAATCGGAGCCCCAGACATAGCATTCCCACGAATAAATAACATAAGCTTCTGACTACTGCCCCCATCATTCCTTCTACTCCTAGCTTCTTCTGGTGTTGAAGCTGGAGCCGGAACAGGATGAACCGTATACCCACCTCTTGCAGGGAACTTAGCCCACGCAGGAGCATCAGTAGACCTAACAATTTTCTCACTTCACCTAGCAGGTGTTTCATCAATTCTAGGGGCAATCAACTTTATTACTACAACCATCAACATGAAACCC
CCAGCCATCTCCCAATACCAAACACCCCTGTTCGTCTGATCCGTGCTTGT AACCGCCGTATTGCTCCTTCTATCATTACCTGTCTTAGCCGCAGGAATTA CAATGCTCCTAACAGACCGAAACCTTAATACCACATTCTTGACCCGGCA GGAGGAGGAGACCCAATCCTTATCAACCTTTTGTTCTGATTCTTTGGCCA CCCAGAAGTCTA
Hình 4.12 Sơ đồ giải trình tự của mẫu CR-TXVT trên phần mêm BioEdit
A: Trình tự gen chiều từ 5’- 3’
B: Trình tự gen chiều từ 3’- 5’
4.2.4 Kết quả định danh các mẫu cá chép Hà Giang dựa trên chỉ thị gen COI
Từ trình tự gen thu thập, chúng tôi đã so sánh với trình tự gen COI trên ngân hàng Genebank NCBI bằng phần mềm BLAST Kết quả cho thấy gen COI của 6 mẫu cá chép Hà Giang có mức tương đồng cao nhất với các chủng khác, được trình bày trong bảng 4.7.
Kết quả thể hiện trên bảng 4.7 cho thấy cả 6 mẫu cá chép thu thập đều thuộc loài cá chép Cyprinus carpio với mức tương đồng 99%
Bảng 4.7 Danh sách 6 mẫu nghiên cứu và các loài có quan hệ gần gũi nhất đã công bố trên ngân hàng gen NCBI
Mẫu Mã số Ngân hàng gen
Loài có tính tương đồng cao nhất
Tỷ lệ nucleotide tương đồng (%)
Số nucleotide khác biệt (gaps)
CR-XT KX254108.1 Cyprinus carpio 700/707(99%)** 5 CR-HĐ KX254108.1 Cyprinus carpio 689/708(97%)* 7 CR-TB KX254108.1 Cyprinus carpio 702/705(99%)** 1 CR-NV AP011238.1 Cyprinus carpio 699/703(99%)** 2 CR-T KX254108.1 Cyprinus carpio 700/707(99%)** 4 CR-TXVT KX254108.1 Cyprinus carpio 698/706(99%)** 3
Các mẫu cá thu thập được cho thấy sự tương đồng với gen cá chép lên đến 99% tại mức ý nghĩa 1%, với sự sai khác có ý nghĩa cao (đánh dấu **) Đối với mẫu CR-HĐ, sự tương đồng với gen cá chép đạt 97% tại mức ý nghĩa 3%, với sự sai khác tương đối cao (đánh dấu *) Đơn vị gaps được sử dụng để chỉ khoảng trống nơi số nucleotide không xuất hiện trên trình tự gen.