Định danh nấm vân chi đỏ thu thập tại núi cấm an giang

Từ các các dữ liệu trên, chúng ta có thể thấy số lượng các loài nấm dược liệu được tìm thấy, phân lập, định danh và có thể sử dụng được còn rất ít nhưng giá trị của chúng thì không hề nh

TRƯỜNG ĐẠI HỌC AN GIANG KHOA NÔNG NGHIỆP - TÀI NGUYÊN THIÊN NHIÊN

CHUYÊN ĐỀ TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

ĐỊNH DANH NẤM VÂN CHI ĐỎ THU

THẬP TẠI NÚI CẤM

AN GIANG

TRẦN THỊ PHƯỢNG MAI

An Giang, Tháng 06 Năm 2021

TRƯỜNG ĐẠI HỌC AN GIANG KHOA NÔNG NGHIỆP - TÀI NGUYÊN THIÊN NHIÊN

CHUYÊN ĐỀ TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

ĐỊNH DANH NẤM VÂN CHI ĐỎ THU

CHẤP THUẬN CỦA HỘI ĐỒNG

Chuyên đề “Định danh nấm Vân Chi đỏ thu thập tại núi Cấm An Giang” do

sinh viên Trần Thị Phượng Mai thực hiện dưới sự hướng dẫn của

TS Hồ Thị Thu Ba

Ts Nguyễn Thị Mỹ Duyên Ths Bằng Hồng Lam

Giảng viên hướng dẫn

Ts Hồ Thị Thu Ba

MỤC LỤC

CHẤP THUẬN CỦA HỘI ĐỒNG……….i

MỤC LỤC ii

DANH SÁCH HÌNH v

DANH SÁCH BẢNG vi

DANH MỤC VIẾT TẮT vii

CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU 1

1.1 TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI 1

1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU 1

1.3 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 1

1.4 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 2

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 KHÁI QUÁT VỀ NẤM LỚN 3

2.1.1 Định nghĩa nấm lớn……….………3

2.1.2 Đặc điểm sinh học 3

2.1.2.1 Hình thái 3

2.1.2.2 Đặc trưng về sinh sản 4

2.1.3 Giá trị dinh dưỡng 5

2.1.4 Định danh nấm lớn 5

2.2 NẤM VÂN CHI 5

2.2.1 Mô tả 6

2.2.2 Thành phần nấm Vân Chi 6

2.2.3 Tác dụng dược lý 6

2.3 PHƯƠNG PHÁP LY TRÍCH DNA 7

2.3.1 Nguyên tắc 7

2.3.2 Chuẩn bị mẫu 7

2.3.3 Cách thực hiện 7

2.4 GIỚI THIỆU PHƯƠNG PHÁP PCR 8

2.4.1 Định nghĩa 8

2.4.2 Nguyên tắc của kỹ thuật PCR 8

2.4.3 Các ứng dụng chủ yếu của PCR 11

2.5 PHƯƠNG PHÁP ĐIỆN DI 11

2.5.1 Nguyên lý chung 11

2.5.2 Các kỹ thuật điện di chủ yếu 11

2.6 GIỚI THIỆU VÙNG ITS 13

2.7 CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH DANH LOÀI 14

2.7.1 Khái niệm định danh loài 14

2.7.2 Phương pháp định danh loài 14

2.7.2.1 Hình thái 14

2.7.2.2 Sinh học phân tử 15

2.8 CƠ SỞ DỮ LIỆU NCBI 16

2.9 CÁC NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC 18

2.9.1 Các nghiên cứu ngoài nước 18

2.9.2 Các nghiên cứu trong nước 19

CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

3.1 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM 20

3.2 PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU 20

3.2.1 Đối tượng nghiên cứu 20

3.2.2 Công cụ nghiên cứu 20

3.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21

3.3.1 Thí nghiệm 1: Định danh sơ bộ bằng hình thái 21

3.3.2 Thí nghiệm 2: Định danh Nấm Vân Chi đỏ hoang dại bằng sinh học phân tử……….24

3.2.2.1 Ly trích DNA 24

3.2.2.2 Cách tiến hành kiểm tra chất lượng DNA 26

3.2.2.3 Mẫu giải trình tự DNA 28

3.2.2.4 Kết quả giải trình tự 29

3.3.3 Định danh nghiên cứu bằng hình thái kết hợp giải trình tự DNA 30

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31

4.1 THÍ NGHIỆM 1: ĐỊNH DANH BẰNG HÌNH THÁI 31

4.1.1 Quan sát hình thái nấm 31

4.1.2 Quan sát bào tử nấm 32

4.1.3 Quan sát hệ sợi tơ nấm 33

4.2 THÍ NGHIỆM 2: ĐỊNH DANH BẰNG PHƯƠNG PHÁP SINH HỌC PHÂN TỬ 34

4.2.1 Kết quả phân lập 34

4.2.2 Định danh mẫu nấm 35

4.2.3 Kết quả định danh 35

CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 42

5.1 KẾT LUẬN 42

5.2 KIẾN NGHỊ 42

TÀI LIỆU THAM KHẢO 44

DANH SÁCH HÌNH

Hình 1: Cách lấy bào tử nấm 23

Hình 2: Thao tác lấy mẫu tơ nấm 24

Hình 3: Cách lấy tơ nấm và nghiền nấm 24

Hình 4: Vortex mẫu và ủ mẫu 25

Hình 5: Cho hỗn hợp vào mẫu 25

Hình 6: Rửa tủa bằng Ethanol 70 26

Hình 7: Bảo quản mẫu bằng dung dịch TAE 0.5X 26

Hình 8: Agarose và dung dịch nhuộm Safeview 27

Hình 9: Đổ TAE 1X cho ngập gel 27

Hình 10: Đưa DNA vào các giếng 28

Hình 11: Chạy điện di 28

Hình 12: Giao diện chính của cơ sở dữ liệu NCBI 29

Hình 13: Công cụ tìm kiếm trình tự DNA bằng phần mềm BLAST 29

Hình 14: Giao diện của Nucleotide BLAST 29

Hình 15: Nấm Vân Chi đỏ (mặt trên) 31

Hình 16: Nấm Vân Chi đỏ (mặt dưới) 31

Hình 17: Bào tử Nấm Vân Chi đỏ dưới kính hiển vi 100X 32

Hình 18: Bào tử xem dưới kính hiển vi của Kuo (2018) 32

Hình 19: Hình dạng hệ sợi tơ nấm dưới kính hiển vi 10X, 40X, 100X 33

Hình 20: Hệ sợi tơ nấm phóng to ở vật kính 100X 33

Hình 21: Tơ nấm xem trên0 kính hiển vi của Kuo (2018 33

Hình 22: Tơ nấm phát triển ở ngày 7 và ngày 9 34

Hình 23: Sản phẩm PCR vùng ITS của nấm (M: thang DNA 1kb; 1 -2: mẫu nấm) 35

Hình 24: Kết quả chạy BLAST trên NCBI 37

Hình 25: Kết quả xếp giống cột với bestmatch thông qua Blast 38

Hình 26: Kết quả trình tự trên Genbank của Trametes coccinea 39

DANH SÁCH BẢNG

Bảng 1: Thành phần hóa chất cho một phản ứng PCR 10 Bảng 2: Trình tự đoạn mồi ITS1 và ITS4 14 Bảng 3: Thành phần môi trường PDA 22

DANH MỤC VIẾT TẮT

CTAB: Cetyl trimethyl ammonium bromide

DNA: deoxyribonucleic acid

EDTA: Ethylene Diamin Tetracetic Acid

EtBr: Ethidium Bromide

ETS: external transcribel spacer

HIV: Human-Immuno-Deficiency-Virus

IGS: intergenic spacer

ITS: Internal Transcribed Spacer

NCBI: National Center for Biotechnology Information PCR: Polymerase Chain Reaction

PDA: Potato Dextro Agar

PSK: Polysaccharide K

PSP: Polysaccharide-Peptide

rDNA: ribosomal DNAA

RNA: Ribonucleic Acid

SDS: Sodium Dodecyl Sulfate

SSU: Small subunit

TAE: Tricacetic ethylene diamine tetra acetate

TE: Tris ethylene diamine tetra acetate

Tm: Melting Tempereture

VAST: vecter Alignment search tool

VAST: Vector Alignment Search Tool

CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU 1.1 TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI

Giới nấm có nhiều loài theo ước tính của các nhà khoa học có khoảng 600.000 loài nấm trong đó 45.000 loài nấm được mô tả trong tự nhiên Trong đó khoảng 10% là các loài nấm ăn được và nấm dược liệu (4.500 loài) Tuy nhiên các loài nấm ăn và nấm dược liệu được nuôi trồng nhân tạo chỉ có khoảng 100 loài, trong đó có 20 loài được coi là quý hiếm và được nuôi trồng có sản lượng lớn

và phổ biến trên thế giới Không những vậy,nấm dược liệu còn có giá trị kinh

tế cao vì phục vụ cho nhu cầu nuôi trồng sản xuất và nghiên cứu của con người (Trịnh Tam Kiệt., 2011)

Trên thế giới, từ những năm 1960 đến nay nghề trồng nấm dược liệu đã phát

triển mạnh và nhanh một cách toàn diện về nhiều mặt Ở Việt Nam, trồng nấm

cũng được phát triển liên tục từ những năm 1980 với nhiều loài nấm trồng mới được du nhập (Nguyễn Hữu Đống và cs., 2002)

Vân Chi là một trong những giống nấm dược liệu được nghiên cứu rộng rãi nhất nhờ những tác động lên việc tăng cường các chức năng miễn dịch cơ bản

và thứ cấp Vân Chi đỏ chứa hai phân tử polysaccharide cụ thể là Polysaccharide K (PSK) và Polysaccharide-peptide (PSP), đã được chứng minh

là giúp ức chế sự phát triển của các tế bào ung thư (Nguyễn Hữu Đống và cs., 2002)

Từ các các dữ liệu trên, chúng ta có thể thấy số lượng các loài nấm dược liệu được tìm thấy, phân lập, định danh và có thể sử dụng được còn rất ít nhưng giá trị của chúng thì không hề nhỏ Vì vậy, việc định danh các loài nấm dược liệu

để phục vụ nhu cầu sử dụng và nghiên cứu ngày càng cao của con người là hết sức cần thiết Đồng thời, nó cũng góp phần vào việc làm tăng thêm số lượng các loài nấm trong danh sách các loài nấm dược liệu được tìm ra hiện nay Chính vì thế, việc định danh nấm Vân Chi đỏ nhằm phục vụ cho nhu cầu tiêu

dùng và nghiên cứu là rất cần thiết Đề tài “Định danh nấm Vân Chi đỏ thu thập tại núi Cấm An Giang” được thực hiện

1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

Khảo sát môi trường nhân giống Vân Chi đỏ hoang dại từ đó sử dụng mẫu tơ nấm để giãi mã được trình tự gene nấm Vân Chi đỏ hoang dại thu thập tự nhiên

1.3 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

Nấm Vân Chi hoang dại thu thập được ở chân núi Cấm, Tịnh Biên, An Giang

1.4 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

Định danh dựa trên kiểu hình bằng phương pháp nghiên cứu hình thái bên ngoài,

phương pháp nghiên cứu hình dạng bào tử và sợi tơ nấm tại khu thí nghiệm Trường Đại Học An Giang

Định danh mẫu nấm nghiên cứu bằng phương pháp sinh học phân tử, tiến hành

ly trích và diện di trên gel agarose tại khu thí nghiệm trường Đại học An Giang Gửi mẫu định danh ở Công ty Macrogen Hàn Quốc thông qua trung tâm Công nghệ Sinh học TP Hồ Chí Minh

Phân tích độ tương đồng của mẫu nấm nghiên cứu với ngân hàng gene trên NCBI

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 KHÁI QUÁT VỀ NẤM LỚN

Nấm được hiểu theo hai nghĩa khác nhau:

Theo nghĩa rộng (thuật ngữ khoa học), mà tiếng Anh là Fungi, là nhóm sinh vật nằm trong giới Myceteae (Chang & Miles., 2004)

Nấm lớn theo nghĩa hẹp, mà mọi người dễ nhận thấy ngoài thiên nhiên hay

được nuôi trồng, tiếng anh là Mushroom Nấm lớn là loại nấm lớn với quả thể

phân biệt rõ, mà nó có thể mọc trên mặt đất hay dưới mặt đất và đủ to để thấy được bằng mắt thường hay thu hái bằng tay Nấm lớn thuộc về giới nấm và những đặc điểm của giới nấm Các nấm ăn thuộc ngành phụ của Nấm túi hay

nấm nang (Ascomycotina) và ngành phụ Nấm đảm (Basidiomycotina) (Chang

& Miles., 2004)

2.1.2 Đặc điểm sinh học

2.1.2.1 Hình thái

Nấm lớn có cấu tạo gồm hai phần: hệ sợi tơ nấm và quả thể

Hầu hết quả thể nấm lớn rất đa dạng: hình dù với mũ nấm và cuống nấm (nấm hương), có bao ngoài (nấm rơm), giống vỏ sò (nấm sò), hình cáp uống nhăn, dạng cầu, dùi cui nhỏ (nấm rơm bạc lụa), dạng giống lỗ tai như nấm mèo (Nguyễn Thị Chính và cs., 2005)

Màu sắc của nấm phần lớn cũng khác nhau: trắng, xám, nâu đỏ, đen, tím, Cấu trúc mà người bình thường gọi nấm, thực chất là quả thể hay tại nấm của loài nấm Phần sinh dưỡng của loài nấm, được gọi là hệ sợi tơ nấm, bao gồm một

hệ các sợi mãnh nhỏ dài như các sợi chỉ mọc lan ra đất, compost, khúc gỗ hay

cơ chất trồng nấm Sau một thời gian tăng trưởng và dưới những điều kiện thuận lợi, hệ sợi tơ nấm trưởng thành có thể sản sinh ra quả thể là tai nấm (Nguyễn Thị Chính và cs., 2005)

2.1.2.2 Đặc trưng về sinh sản

Đa số nấm trồng đều sinh sản bằng bào tử Số lượng bào tử sinh ra là rất lớn Nhờ vậy, nấm phát triển rất nhanh và phân bố rất rộng Bào tử của nấm phổ biến ở 2 dạng: hữu tính và vô tính Ở nấm ăn bào tử sinh ra ở phía dưới cấu trúc đặt biệt gọi là mũ nấm hay tai nấm Mũ nấm thường có cuống nâng lên cao để

có thể nhờ gió đưa bào tử bay xa Bào tử này lại nẩy mầm lại cho hệ sợi mới (Phương Thị Hương., 2018)

Người ta chia đời sống nấm trồng ra 2 giai đoạn: Giai đoạn tăng trưởng (hay sinh trưởng) là tản dinh dưỡng, và giai đoạn thể quả (hay cơ quan sinh bào tử hữu tính của nấm, gia đoạn sinh thực) là tản nấm sinh sản (Phương Thị Hương., 2018)

Sinh sản vô tính bằng đính bào tử, sinh sản hữu tính bằng bào tử đảm mọc bên ngoài đảm Đảm có thể hình thành trực tiếp trên thể sợ hoặc trong những cơ quan đặc biệt gọi là thể quả (thường gọi là cây nấm) (Phương Thị Hương., 2018)

2.1.2.3 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa

Nhóm nấm lớn đặc biệt này đòi hỏi các nguồn dinh dưỡng dồi dào hơn và các điều kiện môi trường (nhiệt độ, ẩm độ, thông khí, pH, ánh sáng ) phức tạp hơn

để hình thành quả thể, so với việc tạo các bào tử vô tính ở vị nấm Nguồn dinh dưỡng chủ yếu cho nấm lớn là các chất xơ lignocellulose của thực vật Điều đặc biệt là các nấm lớn, giống các loài nấm khác nói chung, có thể tiết ra các enzyme mạnh (như cellulose, ligninase, ), phân rã các vật liệu lignocellulosic thành các chất dinh dưỡng dễ hấp thu Nguồn carbon và nitrogen trong cơ chất có ý nghĩa quan trọng thường đánh giá qua tỷ lệ C/N (Nguyễn Thị Chính và cs., 2005)

2.1.2.4 Sinh thái

Nấm thường xuất hiện ở các chỗ ẩm ướt, như các lớp lá cây mục và các vùng rừng mưa, độ ẩm cao làm nấm lớn mọc ra và có thể thu hái chúng quanh năm Nhưng ở các vùng khô các nấm lớn chỉ có thể xuất hiện sau cơn mưa (Phạm Thành Hổ., 2009)

Theo môi sinh thì có thể chia nấm lớn thành 3 loại (Phạm Thành Hổ., 2009):

 Nấm hoại sinh: thu nhận dinh dưỡng từ vật liệu hữu cơ chết

 Nấm ký sinh: sinh vật ký sinh lấy chất dinh dưỡng từ thực vật và động vật sống, gây bất lợi cho vật chủ Một số nấm trồng như nấm mèo, linh chi có thể mọc trên cây còn tươi sống hay đã khô mục, có thể gọi là bán ký sinh

 Nấm cộng sinh thường gọi là rễ nấm hay khuẩn căn (Mycorrhiza): rễ nấm

có quan hệ sinh lý chặt chẻ hai bên đều có lợi với rễ thực vật sống chủ: nấm thu nhận dinh dưỡng từ thực vật đồng thời làm cây tăng trưởng tốt hơn Một số nấm cộng sinh thường mọc thành vòng tròn quanh gốc cây

2.1.3 Giá trị dinh dưỡng

Nấm là một món ăn quý không chỉ vì thơm ngon mà còn vì có giá trị dinh dưỡng cao Độ ẩm cố định của nấm tươi dao động trong khoảng 70–95%, còn nấm khô thì ở mức 10 –13% Hàm lượng protein của nấm trồng ở mức từ 1,75 đến 5,9% trọng lượng tươi, có thể lấy giá trị trung bình đại diện khoảng 3.5–4.0 %; nói chung gấp 2 lần củ hành (1.4%) và cải bắp (1.4%) So sánh với hàm lượng protein thịt nói chung như sau: thịt heo 9–16%; thịt bò 12–20%; thịt gà 18 –20%; cá 18–20%; và sữa 2.9–3.3% Xét về trọng lượng khô, nấm ăn thường chứa 19-35% protein, so với 7.3% ở gạo, 12.7% ở lúa mì, 38.1% trong đậu nành

và 9.4% ở ngô Như vậy, tỷ lệ protein thô ở nấm ăn thấp hơn các thịt động vật, nhưng cao hơn phần lớn thực phẩm khác, kể cả sữa Hơn nữa, protein của nấm

ăn chứa đủ 9 loại acid amin không thay thế (Chang & Miles., 2004)

Thêm vào protein có giá trị cao, các nấm còn chứa các chất dinh dưỡng khác tốt cho sức khỏe như: lipid tốt cho sức khỏe, phosphorous, sắt và hàng loạt vitamin như B1, B2,… Nấm chứa ít năng lượng, carbohydrat và calcium Tổng hàm lượng lipid dao động giữa 0.6 – 3,1% trọng lượng khô nói chung ở nấm trồng Ít nhất 72% tổng lượng acid béo tìm thấy là không no Ở Nhật bản khi phân tích 140 loài nấm ăn có tới 118 có chứa bình quân 0.126 mg vitamin B2/100 g nấm, 47 loài chứa bình quân 1,229 mg vitamin B2 trên 100 gam nấm, vitamin B12 vốn không có nhiều trong thực vật nhưng có nhiều trong nấm

Agaricus bisporus, A.campestris, Morchella spp…(Chang & Miles., 2004)

2.1.4 Định danh nấm lớn

Để định danh nấm lớn cần dựa vào hình thái và giải trình tự vùng ITS Sự lựa chọn trình tự DNA dùng cho việc nhận diện các loài nấm đòi hỏi sự khác biệt của các trình tự sao cho ta có thể phân biệt được dòng phân lập ở cấp độ loài hay giống của chúng Gene mã hóa vùng ribosomal RNA đảm bảo được yêu cầu này Gene là một phần thiết yếu của sự sống tế bào và các vùng gene có sự khác biệt về trình tự giữa các loài Mặt khác, các gene tồn tại với một số lượng lớn trong genome giúp tăng độ nhạy của các kiểm tra chẩn đoán (Mau và cs., 2002)

2.2 NẤM VÂN CHI

Nấm Vân Chi bao gồm các chi Trametes, Pycnoporus,… là một loại nấm rừng phát triển mạnh mẽ trên các loại thân gỗ cứng khác nhau ở hầu như khắp trái

đất Nó đã được sử dụng trong nhiều thế kỷ, ở nhiều nơi trên thế giới, như một

loại thuốc tự nhiên cung cấp các đặc tính chống vi khuẩn, chống virus và chống

khối u mạnh mẽ (Nguyễn Thị Bích Thùy, Trịnh Tam Kiệt., 2016)

Vân Chi đỏ là một trong những giống nấm dược liệu được nghiên cứu rộng rãi

nhất nhờ những tác động lên việc tăng cường các chức năng miễn dịch cơ bản

và thứ cấp (Nguyễn Thị Bích Thùy, Trịnh Tam Kiệt., 2016)

2.2.1 Mô tả

Quả thể nấm là chất da, không cuống, phủ lông, rất biết đổi về màu sắc Đảm

quả khi non dạng u lồi tròn, sau phân hóa thành dạng bán cầu, già bán cầu đến

dạng thận, dạng quạt, thót dần lại ở phần gốc hay cũng có khi trải sát giá thể

hay trải cuộn lại thành dạng vành Nấm thường mọc thành đám dạng ngói lợp

Mặt mũ rất thay đổi về màu sắc, đặc trưng bỏi những vòng tròn đồng tâm với

màu sắc khác nhau từ cam nhạt đến cam đỏ; phủ lông tạo thành từng vòng xen

kẽ với vùng vỏ mũ còn nhẵn Mép mũ nhẵn, màu sáng hơn, lượn sóng ít hay

nhiều Mũ nấm không có cuống, dai, phẳng hoặc chỉ hơi quăn, hình gần như

bán nguyệt Mũ nấm thường mọc thành cụm, đường kính từ 1-8 cm, dầy khoảng

0,1-0,3 cm (Trịnh Tam Kiệt., 2011)

Thịt nấm mỏng, có màu cam đỏ, chất bì dai, dày 0,5 – 1 mm, ống nấm dài 0,5

– 2(3) mm Miệng ống nấm hoàn chỉnh hình tròn hay nhiều gốc, có khi vách

thành răng (Trịnh Tam Kiệt., 2011)

Đảm có kích thước 10 – 15 x 4 – 5 µm

Bào tử đảm không màu, nhẵn, hình trụ hơi thoát một đầu và cong; kích thước

1 – 2(2,5) x 4 – 6(7) µm

Hệ thống sợi gồm 2 loại sợi, gồm sợi cứng và sợi bện, có đường kính sợi 2 – 6

µm Nấm mọc trên gỗ mục thành từng đám lớn, gặp khắp nơi Là loại mọc

khắp thế giới nhưng thường gặp ở vùng có khí hậu ôn hòa (Trịnh Tam Kiệt.,

2011)

2.2.2 Thành phần nấm Vân Chi

Trong thành phần nấm Vân Chi có acid hữu cơ, alcaloid, chất khử, triterpeniod,

coumarin, saponin, polyphenol, hợp chất unonic, acid amin và polysaccharide

(Nguyễn Thị Bích Thùy, Trịnh Tam Kiệt., 2016)

2.2.3 Tác dụng dược lý

Tác dụng dược lý của nấm Vân Chi chủ yếu dựa trên nền tảng là khả năng làm

tăng cường chức năng miễn dịch của cơ thể, nhờ hoạt tính của các hợp chất

chứa trong nấm Trên thế giới đã có rất nhiều công trình nghiên cứu về ảnh

hưởng của nấm Vân Chi lên khả năng miễn dịch của cơ thể người và tất cả các công trình đều có kết quả khẳng định tác dụng tăng cường miễn dịch của nấm này Theo các kết quả nghiên cứu, trong nấm có chứa các hợp chất polysaccharid liên kết với protein với rất nhiều ưu điểm dược lý và chính các polysaccharid này quyết định tác dụng tăng cường miễn dịch của nấm Các hợp chất này gồm hai loại chính: PSP (polysaccharide peptide) và PSK (polysaccharide krestin) PSK và PSP có cấu trúc hoá học cũng như các tính chất khá tương đồng Chúng đều là những hỗn hợp của các chuỗi đường liên kết với một số protein (Yang & Snyder., 1992)

2.3 PHƯƠNG PHÁP LY TRÍCH DNA

2.3.1 Nguyên tắc

Để tiến hành tách DNA từ tế bào thì phải tiến hành phá bỏ màng tế bào và màng nhân, sau đó biến tính protein để loại bỏ protein chứa trong dịch tách, loại bỏ RNA và sau cùng là kết tủa DNA bằng cồn Hòa tan lại kết tủa sau khi thu được trong dung dịch đệm TE hoặc nước cất vô trùng tùy theo mục đích nghiên cứu (Hồ Huỳnh Thùy Dương., 2003)

2.3.2 Chuẩn bị mẫu

Đối với thực vật thường thu lấy mẫu lá, động vật thu lấy mô trên cơ thể, vi khuẩn: nuôi vi khuẩn trong môi trường nuôi cấy từ 15 - 16 giờ để tăng sinh, thường nuôi trong 16 giờ cho kết quả tốt nhất (Hồ Huỳnh Thùy Dương., 2003)

2.3.3 Cách thực hiện

Dùng phương pháp ly tâm để phá vỡ màng tế bào và phóng thích DNA trong nhân Riêng mẫu lá thực vật, do còn có lớp vỏ cellulose bên ngoài, nên phải được nghiền trong nitơ lỏng, giúp làm cho vách cellulose trở nên giòn hơn, dễ

vỡ hơn, đồng thời bảo vệ DNA phóng thích từ nhân không bị tiêu hủy bởi các protease trong tế bào Ngoài ra, màng tế bào và màng nhân còn được phá vở bằng hỗn hợp chất tẩy (SDS – sodium dodecyl sulfate, sarcosyl) và proteinase Các DNA sẽ được giải phóng ra môi trường Các protein liên kết với DNA cũng

tự bị phân hủy (Hồ Huỳnh Thùy Dương., 2003)

 Hòa tan DNA

 Hòa tan DNA trong dung dịch đệm buffer TE (pH 8) giúp DNA không

bị biến tính

 Loại bỏ các thành phần không phải là DNA:

 Proteinase K: Loại bỏ thành phần protein

 CTAB: Loại bỏ polysaccharide và lipid

 Chloroform: Phân tách và kéo các thành phần không phải là DNA xuống mặt dưới dung dịch

 Tủa DNA

Sử dụng ethanol 96% hoặc Isoproanol ủ ở –20 °C để tủa DNA trong dung dịch Mục đích là thu nhận nucleic acid dưới dạng cô đặc và bảo vệ chúng khỏi sự phân hủy của các enzyme

 Kiểm tra chất lượng DNA

Đo quang phổ

Chạy điện di

2.4 GIỚI THIỆU PHƯƠNG PHÁP PCR

2.4.1 Định nghĩa

PCR là một kỹ thuật được sử dụng phổ biến trong công nghệ sinh học hiện đại

và đã đóng góp rất lớn cho những tiến bộ về sinh học phân tử, đánh dấu một bước tiến vô cùng quan trọng tương đương với việc khám phá ra các enzyme hạn chế và kỹ thuật Southem blot (Hồ Huỳnh Thùy Dương., 2008)

Theo Kary Mullis (1985) Phương pháp PCR tạo bước nhảy vọt của sinh học phân tử và kỹ thuật gene Phương pháp PCR cho phép khuếch đại, tạo một số lượng rất lớn bản sao của gene (hay một đoạn DNA) trong một thời gian ngắn Nguyên tắc PCR dựa trên cơ sở tính chất biến tình, hồi tính của DNA và nguyên

lý tổng hợp DNA Trên cơ sở trình tự của đoạn DNA khuôn (DNA khuôn, DNA đích-target sequence), đoạn mồi (primer), các nucleotide tự do (dNTP) và enzyme polymerase có thể tổng hợp được đoạn DNA giới hạn bởi các đoạn mồi Lặp lại nhiều lần các chu kì nhân gene, trong một thời gian ngắn số lượng bản sao DNA tạo thành theo cấp số nhân (Khuất Hữu Thanh., 2003)

2.4.2 Nguyên tắc của kỹ thuật PCR

Kỹ thuật PCR (theo Kary Mulis) là một phương pháp tổng hợp DNA dựa trên mạch khuôn là một trình tự đích DNA ban đầu, khuếch đại, nhân số lượng bản

sao của khuôn này thành hàng triệu bản sao nhờ hoạt động của enzyme polymerase và một cặp mồi (primer) đặc hiệu cho đoạn DNA này

Primer là những đoạn DNA ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một mạch của đoạn DNA và nhờ hoạt động của đoạn DNA polymerase đoạn primer này được kéo dài để hình thành mạch mới Kỹ thuật PCR được hình thành dựa trên đặc tính này của DNA polymerase, đoạn DNA nằm giữa hai primer sẽ được khuếch đại thành số lượng lớn bản sao đến mức có thể thấy được sau khi nhuộm bằng ethidium bromide và có thể thu nhận đoạn DNA này cho các mục đích khác nhau bằng các thao tác trên gel Như vậy, để khuếch đại một trình tự DNA xác định, cần phải có những thông tin tối thiểu về trình tự của DNA, đặc biệt là trình tự base ở hai đầu đoạn DNA đủ để tạo các primer bổ sung chuyên biệt (Hồ Huỳnh Thùy Dương., 2003)

Phản ứng PCR gồm nhiều chu kỳ lặp lại nối tiếp nhau Mỗi chu kỳ gồm 3 bước như sau (Khuất Hữu Thanh., 2003):

Bước 1: Biến tính (denaturation): Ở nhiệt độ cao 90 - 95 °C (cao hơn Tm của DNA khuôn), làm đứt các liên kết hydro của phân tử DNA, hai mạch phân tử DNA tách rời nhau Đoạn khuôn DNA có các đoạn dài gồm nhiều nucleotide giống nhau, hoặc tỉ lệ G - C càng cao, có nhiệt độ biến tính (Tm) cao hơn Do vậy cần căn cứ đặc điểm của DNA khuôn để lựa nhiệt độ biến tính phù hợp Giai đoạn này kéo dài 1 phút đến 2 phút

Bước 2: Gắn mồi (annealing): Ở nhiệt độ khoảng 55 - 65 °C để các mồi bắt cặp với các mạch đơn DNA khuôn ở các đầu 3” theo nguyên lý Chargaff Giai đoạn này khoàng 30-60 giây

Bước 3: Tổng hợp (elongation): Nhiệt độ 70-720C giúp cho DNA polymerase hoạt động tốt nhất Enzyme DNA polymerase xúc tác hoạt động tổng hợp gắn thêm các nucleotide vào cuối đoạn mồi, các mối được kéo dài trên cơ sở bắt cặp với mạch khuôn theo nguyên lý Chargaff, tạo nên các mạch đơn DNA mới, giai đoạn này còn gọi là giai đoạn polymer hóa Thời gian của giai đoạn này từ

30 giây đến vài chục phút, tùy thuộc vào kích thước của đoạn DNA Thông thường, với thời gian 2 phút, tổng hợp được những đoạn DNA kích thước dưới

tự do giảm, enzyme DNA polymerase hoạt động yếu dần Do đó, cần tính toán

hàm lượng mồi dNTP, enzyme để đảm bảo phản ứng PCR có kết quả tốt nhất (Khuất Hữu Thanh, 2003)

DNA khuôn được thu nhận qua quá trình ly trích DNA và pha loãng kiểm tra nồng độ DNA thích hơp phản ứng PCR

1 U

5 ng/𝜇𝐿

(Nguồn White và cs., 1990)

 Đánh giá kết quả PCR (White và cs., 1990)

Sản phẩm PCR được điện di trên agarose gel 0,8%, dịch đệm TAE 0,5X Chạy điện di: 100 V, 250 mA, 25 phút

Nhuộm gel bằng dung dịch Ethidium Bromide trong vòng 15 phút

Kết quả được ghi lại nhờ máy chụp hình gel

 Tinh sạch sản phẩm PCR

Nguồn DNA dùng làm khuôn để đọc trình tự là sản phẩm PCR: Thực hiện khuếch đại bằng 2 cặp primer ITS1, ITS4 Thực hiện bước tinh sạch sản phẩm PCR bằng cột GFX Phương pháp này cho phép tinh sạch trực tiếp từ dung dịch DNA hay tinh sạch DNA từ gel Lượng DNA thu lại sau khi tinh sạch từ dung dịch khoảng 80% và từ gel là 60% so với lượng DNA ban đầu Đối với sản phẩm PCR những thành phần còn dư như primer hay dNTP có thể được loại bỏ hoàn toàn sau khi tinh sạch (White và cs., 1990)

Biến tính protein: Capture buffer có tác dụng biến tính protein và tăng cường khả năng liên kết chuỗi DNA với cột GFX

Thu giữ DNA: Cột GFX giữ DNA bám dính vào cột

Rửa: DNA được rửa bằng dung dịch wash buffer để loại bỏ muối và các thành phần khác

Hoà tan DNA: DNA tinh sạch được hoà tan trong TE (Elution Buffer)

2.4.3 Các ứng dụng chủ yếu của PCR

PCR ngày càng có nhiều ứng dụng rộng rãi trong công nghệ sinh học phân tử

và kỹ thuật gene (Khuất Hữu Thanh., 2003) Một số ứng dụng cơ bản của PCR gồm:

 Sử dụng PCR trong tách dòng gene, xây dựng ngân hàng gene, lập các loại bản đồ gene và giải trình tự gene, bộ gene

 PCR được ứng dụng trong nghiên cứu chuẩn đoán sớm các bệnh nhiễm virus, vi khuẩn và các đột biến gây rối loạn di truyền

 PCR được ứng dụng trong tạo đột biến in vitro, và trong một số kỹ thuật chuyển gene nhằm tạo các giống vật nuôi, cây trồng và vi sinh vật mới

 PCR có vai trò quan trọng trong nghiên cứu nguồn gốc các loài sinh vật

và trong phân loại phân tử,

2.5 PHƯƠNG PHÁP ĐIỆN DI

2.5.1 Nguyên lý chung

Phương pháp điện di là kỹ thuật thí nghiệm được sử dụng phổ biến trong nghiên cứu cấu trúc và đặc điểm sinh học của các phân tử mang điện tích (DNA, protein, enzyme ) DNA là đại phân tử sinh học mang điện tích âm, do đó trong môi trường có điện trường, các phân tử DNA có kích thước khác nhau di chuyển từ cực âm sang cực dương với tốc độ khác nhau Thiết bị điện di gồm nguồn điện, buồng điện di, hệ đệm thích hợp và các loại bản gel khác nhau (agarose, polycrylamid, tinh bột ) được sử dụng nhiều trong nghiên cứu độ tinh sạch DNA, kích thước các đoạn DNA cắt bởi enzyme giới hạn hoặc kiểm tra kết quả tách dòng gene (Khuất Hữu Thanh, 2003)

2.5.2 Các kỹ thuật điện di chủ yếu

Tùy theo mục đích nghiên cứu và loại bản gel sử dụng, người ta chia thành các phương pháp diện di khác nhau, thường được gọi theo tên loại bản gel sử dụng (Theo Khuất Hữu Thanh., 2003) Các kỹ thuật điện di chủ yếu gồm:

 Điện di trên gel agarose: Là kỹ thuật điện di để kiểm tra DNA sử dụng agarose từ 0,3% - 2,0% làm bản gel, tùy theo kích thước của DNA Nếu kích thước đoạn DNA nhỏ dưới 1 kb, nồng độ agarose sử dụng khoảng 1

- 2%, trong các phòng thí nghiệm thường sử dụng nồng độ agarose khoảng 0,7-0,8%

 Điện di trên gel polyacrylamid: là kỹ thuật điện di để kiểm tra DNA hoặc protein, sử dụng bản polyacrylamid với nồng độ khoảng 3,5 - 20% làm bản gel, tùy theo kích thước đoạn DNA hoặc trọng lượng phân tử protein Đoạn gene có kích thước càng nhỏ, protein có khối lượng phân tử nhỏ thì nồng độ polyacrylamid sử dụng càng lớn và ngược lại

 Điện di trên giấy: là kỹ thuật điện di sử dụng giấy thấm whatman 3MM làm cầu nối giữa 2 điện cực của buồng điện di, các đại phân tử tích điện dịch chuyển trên giấy với tốc độ khác nhau tùy theo kích thước và trọng lượng phân tử

 Điện di trên gel tinh bột: tinh bột biến tính được sử dụng làm bạn gel dùng trong điện di trong các nghiên cứu protein, enzyme và izoenzyme

 Các bước thực hiện kỹ thuật điện di

Theo khuất hữu thanh., 2003

Bước 1: Chuẩn bị dung dịch đệm và bản gel

Dung dịch đệm thường sử dụng trong điện di agarose và polyacrylamid là TBE

và TAE

Bản gel được chuẩn bị bằng dung dịch đệm lx TBE (1xTAE) hòa tan với hàm lượng agarose (polyacrylamid) với hàm lượng cần thiết, đặt trong lò vi sóng hoặc đun nóng đến khi hòa tan hoàn toàn, đổ vào khuôn có các lược cài sẵn để tạo bản gel với số giếng nạp mẫu cần thiết

Khi bản gel đã đông cứng, đặt bản gel vào buồng điện di và đổ dung dịch đệm ngập bản gel khoảng 1-2 mm

Bước 2: Nạp mẫu

Mẫu DNA đã tách chiết và xử lí enzym giới hạn cắt thành các đoạn kích thước nhỏ, được trộn đều vào đệm nạp mẩu có thêm chất màu (loading butter) tạo thành hỗn hợp có màu xanh, giúp dễ quan sát vị trí di chuyền của các vật mẫu trong quá trình điện đi.Để kiểm tra kích thước các đoạn DNA, thường chạy đồng thời cùng với mẫu DNA chuẩn (thang DNA)

Bước 3: Chạy điện di

Nguồn điện trong điện di thường sử dụng điện thế khoảng 100 V, cường độ 100mA Thời gian chạy điện di trong khoảng 40 phút đến 1 – 2 giờ tùy theo chiều dài bản gel và mức độ yêu cầu tách các phân tử (có thể dựa vào vị trí các vạch màu, khi các vạch màu chạy được khoảng 1 chiều dài bản gel có thể kết thúc điện di)

Bước 4: Nhuộm bản gel và soi gel

Kết thúc điện di, bản gel được lấy ra nhuộm ethyldium bromid (EtBr), hoặc các phương pháp nhuộm khác(nhuộm bạc, nhuộm SYBR green )

Bản gel sau khi nhuộm EtBI được đặt vào thiết bị hiện hình có tia UV, để quan sát kết quả điện di Vị trí các đoạn trích di theo kích thước khác nhau quan sát được những vệt sáng màu da cam trên bản gel, hoặc đặt bản gel vào các thiết bị chụp ảnh chuyên dụng để chụp ảnh , trường hợp nhuộm bạc hoặc nhuộm SYBR green có thể xác định kết quả bằng mắt thường

2.6 GIỚI THIỆU VÙNG ITS

rDNA được quan tâm nghiên cứu rất sớm Bằng cách tách gene, nhân dòng và đọc trình tự, người ta đã đọc được rất nhiều trình tự rDNA Đặc biệt, phương pháp đọc trình tự trực tiếp sản phẩm PCR ra đời tạo rất nhiều thuật lợi cho các nghiên cứu liên quan đến rDNA (White, Bruns, Lee and Tailor., 1989)

rDNA là nhóm gene mã hoá rRNA của ribosome và đóng vai trò quan trọng trong các nghiên cứu quan hệ phát sinh loài rDNA được nghiên cứu vì nó là gene có nhiều bản sao và đặt biệt không mã hoá cho bất kỳ protein nào Các bản sao của gene nằm liên tiếp trên một locus và liên quan mật thiết tới quá trình tiến hoá Ribosome hầu như tồn tại trong mọi sinh vật và có cùng nguồn gốc (Van de Peer, Chapelle S and De Wachter., 1996)

Vùng ITS là vùng có rất nhiều biến đổi, mặc dù vùng ITS thường được sử dụng trong nghiên cứu tiến hoá của sinh vật tuy nhiên phần lớn các so sánh trên vùng này chỉ thường sử dụng ở mức độ xác định các biệt hoá trong cùng loài (Guarro

Các primer vùng ITS được thiết kế dựa trên vùng bảo tồn giữa các gene 18 S, 5,8 S, 28 S ITS1 là trình tự bổ sung của NS8 Primer ITS2, ITS3 được thiết kế

và sàn lọc dựa trên vùng bảo tồn thuộc 5,8 S của N crassa, Schizosaccharomyces pombe và S cerevisiae, Vicia faba và chuột Vùng bảo tồn trên rDNA 28 S của S prome, S cerevisiae và lúa Oryza sativa được so

sánh để thiết kế ITS4 Primer ITS4 có trình tự giống với rDNA 18 S của N crassa, có đầu 5’ chỉ cách primer ITS1 25 bp (White, Bruns, Lee, and Tailor, 1989)

Bảng 2: Trình tự đoạn mồi ITS1 và ITS4

(Nguồn: White., 1990)

 Chu kỳ nhiệt phản ứng PCR

Cho primer ITS1 và ITS4 (White., 1990)

 Giai đoạn 1: 94 0C trong 3 phút

 Giai đoạn 2: 30 chu kỳ

o Bước 1: 94 0C trong 1 phút

o Bước 2: 58 0C trong 45 giây

o Bước 3: 72 0C trong 1 phút

 Giai đoạn 3: 72 0C trong 5 phút

2.7 CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH DANH LOÀI

2.7.1 Khái niệm định danh loài

Định danh chính xác các loài sinh vật ý nghĩa quan trọng đối với các nghiên cứu trong lĩnh vực đa dạng sinh học, bảo tồn, khai thác và nuôi trồng Đây là khâu đầu tiên làm tiền đề cho các nghiên cứu tiếp theo về đặc điểm sinh học, nuôi trồng, khai thác, quản lý… Việc định danh loài sai có thể dẫn đến những sai lầm trong đánh giá trữ lượng, mức độ đe dọa… Các nhầm lẫn trong định danh loài thường xảy ra ở những loài có đặc điểm hình thái gần giống nhau, hệ thống phân loại còn chưa thống nhất (Võ Điều và cs., 2017)

2.7.2 Phương pháp định danh loài

2.7.2.1 Hình thái

Là phương pháp truyền thống và thông dụng trong định danh loài dựa vào đặc điểm bên ngoài của cơ quan dinh dưỡng và sinh sản của thực vật Trong phân loại, nghiên cứu cơ quan sinh sản là không thể thiếu vì đặc điểm của nó liên quan chặt chẽ với bộ mã di truyền và ít biến đổi theo điều kiện môi trường sống Việc so sánh các đặc điểm, hình thái trong phân loại gọi là so sánh hình thái Đơn vị cơ bản của định tên sinh vật là loài, bao gồm nhóm có mức độ tương đồng cao về các đặc điểm hình thái (Hồ Huỳnh Thùy Dương., 2008)

Theo Chang and Miles (2004) số lượng nấm lớn được định danh căn cứ theo giá trị sử dụng có thể chia nấm lớn thành 4 loại :

 Nấm ăn ( nấm hương L.edodes , nấm rơm V.volvacea)

 Nấm dược lược liệu ( nấm linh chi Ganderma lucidum)

 Nhóm nấm hỗn hợp hay “các nấm khác”

Theo Phạm Thành Hổ (2004) để định danh nấm lớn, cần dựa vào các khóa phân loại Tuy nhiên không phải loài nấm hoang nào cũng có trong khóa phân loại Mẫu nấm tươi vừa thu hái là tốt nhất cho định danh và dựa vào khóa phân loại

mà xác định theo các đặc tính chủ yếu sau :

 Kích thước, màu sắc và độ chắc của mũ và cuống nấm

 Cách gắn các phiến vào cuống

 Màu bào tử có số lượng lớn

Sinh học phân tử là khoa học nghiên cứu các hiện tượng sống ở mức độ phân

tử Lĩnh vực khoa học này là điểm gặp nhau của các khoa học kinh điển như di truyền học, hóa sinh học, tế bào học, vật lý học, hóa học hữu cơ và hóa lý Theo cách hiểu phổ biến hiện nay, sinh học phân tử là khoa học nghiên cứu các gene

và hoạt động của chúng ở mức độ phân tử (Hồ Huỳnh Thùy Dương., 2008) Quy trình sử dụng các đặt trưng loài để định danh, phân loại gồm 4 bước: Bước 1: Chọn lựa những đoạn gene mong muốn

Bước 2: Tách chiếc DNA từ mẫu thu thập và thực hiện PCR

Bước 3: Giải trình tự đoạn gene và đem đi so sánh

Bước 4: So sánh trình tự thu được với các trình tự khác trên ngân hàng gene đã được công bố trước đây để định danh cá thể mẫu thuộc loài nào

và nhóm thứ hai là phương pháp Dideoxy dùng làm dùng một cách đặc hiệu nucleotide sự tổng hợp DNA bằng DNA-polymerase nhờ sử dụng các dideoxynucleotide Do thao tác đơn giản và các nguyên liệu được thương mại hóa dưới dạng các bộ chế sẳn (kit) nên gần đây hầu như để xác định trình tự nucleotide người ta chỉ sử dụng phương pháp dideoxy Còn phương pháp Maxam-Gibert như là phương pháp kiểm chứng sự nối dài primer, S1 mapping

và xác định trình tự nucleotide đoạn đặc hiệu tương đối ngắn Trong cả hai phương pháp, người ta đều cần cắt ngắn đoạn DNA vừa phải để giải trình dần (Phạm Hồng Sơn., 2006)

Từ những năm 1977 một số phương pháp giải trình tự gene đã được phát minh như:

 Phương pháp giải trình tự gene theo phương pháp hóa học (Alan Maxam và Walter Gilbert)

 Phương pháp giải trình tự gene bằng enzyme hay phương pháp Dideoxy (Frederick Sanger)

Cả hai phương pháp này đã đánh dấu bước ngoặt lớn trong lịch sử phát triển của

bộ môn sinh học hiện đại Ngày nay, rất nhiều máy giải trình tự gene tự động đều dựa trên nguyên tắc chính là phương pháp giải trình tự gene của Sanger (Phạm Hồng Sơn., 2006)

Ngoài ra, phương pháp xác định trình tự nucleotide nằm kề đoạn AND đã biết được biết đến là phương pháp vận dụng sáng tạo phản ứng PCR, clone hóa DNA

là sản phẩm của DNA có trình tự đã biết (Phạm Hồng Sơn., 2006)

2.8 CƠ SỞ DỮ LIỆU NCBI

Trung tâm Quốc gia về Thông tin Công nghệ sinh học (National Center for Biotechnology Information) được viết tắt NCBI NCBI đặt tại Bethesda,

Maryland và được thành lập vào tháng 11 năm 1988, tại Thư viện Y khoa Quốc gia (NLM) ở Hoa Kỳ, thông qua luật do Thượng nghị sĩ Claude Pepper bảo trợ

NCBI chứa một loạt cơ sở dữ liệu liên quan đến công nghệ sinh học và y sinh học và là một nguồn tài nguyên quan trọng cho các công cụ và dịch vụ tin sinh học Các cơ sở dữ liệu chính bao gồm GenBank cho trình tự DNA và PubMed, một cơ sở dữ liệu thư mục cho tài liệu y sinh Các cơ sở dữ liệu khác bao gồm

cơ sở dữ liệu NCBI Epigenomics Tất cả các cơ sở dữ liệu này đều có sẵn trực tuyến thông qua công cụ tìm kiếm Entrez NCBI được chỉ đạo bởi David Lipman, một trong những tác giả ban đầu của chương trình căn chỉnh trình

tự BLAST và là một nhân vật được kính trọng rộng rãi trong lĩnh vực tin sinh học

Trang web NCBI, truy cập: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/

Các dịch vụ mà NCBI cung cấp:

GenBank là cơ sở dữ liệu công khai toàn diện về trình tự nucleotide, hỗ trợ chú

thích sinh học và thư mục GenBank được xây dựng và phân phối bởi Trung tâm Thông tin Công nghệ Sinh học Quốc gia (NCBI), một bộ phận của Thư viện Y khoa Quốc gia (NLM) Tất cả các mồi PCR có nguồn gốc từ phòng thí nghiệm được sử dụng được thiết kế và thử nghiệm bằng cách sử dụng dữ liệu trình tự GenBank

PubMed là một công cụ tìm kiếm miễn phí truy cập chủ yếu vào cơ sở dữ

liệu MEDLINE gồm các tài liệu tham khảo và tóm tắt về các chủ đề khoa học đời sống và y sinh PubMed có hơn 30 triệu trích dẫn cho tài liệu y sinh từ MEDLINE, tạp chí khoa học đời sống và sách trực tuyến, PubMed chứa các liên kết đến các bài báo toàn văn, một số trong số đó được cung cấp miễn phí, thường ở PubMed Central

VAST (Vector Alignment Search Tool), là một thuật toán máy tính được phát

triển tại NCBI và được sử dụng để xác định các cấu trúc 3 chiều tương tự của protein ("cấu trúc tương tự") theo tiêu chí hình học thuần túy và để xác định các tương đồng ở xa không thể nhận dạng bằng cách so sánh trình tự

BLAST (công cụ tìm kiếm liên kết cục bộ cơ bản) là một thuật toán và chương

trình để so sánh thông tin trình tự sinh học sơ cấp, chẳng hạn như trình tự axit amin của protein hoặc nucleotit của trình tự DNA hoặc RNA Tìm kiếm BLAST cho phép nhà nghiên cứu so sánh protein chủ đề hoặc trình tự nucleotide (được gọi là truy vấn) với thư viện hoặc cơ sở dữ liệu của chuỗi và xác định chuỗi cơ sở dữ liệu giống với chuỗi truy vấn trên một ngưỡng nhất định

Entrez là một hệ thống cơ sở dữ liệu sinh học phân tử cung cấp khả năng truy

cập tích hợp vào dữ liệu trình tự nucleotide và protein, thông tin lập bản đồ

gene và hệ gene, dữ liệu cấu trúc 3D, PubMed MEDLINE, v.v Hệ thống được sản xuất bởi Trung tâm Thông tin Công nghệ Sinh học Quốc gia (NCBI) và có sẵn trên Internet Entrez bao gồm hơn 20 cơ sở dữ liệu bao gồm dữ liệu trình tự protein hoàn chỉnh từ PIR-International, PRF, Swiss-Prot và PDB và dữ liệu trình tự nucleotide từ GenBank bao gồm thông tin từ EMBL và DDBJ

2.9 CÁC NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC

2.9.1 Các nghiên cứu ngoài nước

Năm 2012, Ivan đã chọn “Species of genus Trametes Fr.” nghiên cứu phân tích,

mô tả hình thái hiển vi và đưa ra khóa định loại được 63 loài nấm thuộc chi

Trametes: Trametes apiaria (Pers.) Zmitr., Wasser & Ezhov; T flavida (Lév.) Zmitr., Wasser & Ezhov; T glabrorigens (Lloyd) Zmitr., Wasser & Ezhov; T hirta (P Beauv.) Zmitr., Wasser & Ezhov; T hostmannii (Berk.) Zmitr., Wasser & Ezhov; T niam-niamensis(P Henn.) Zmitr., Wasser & Ezhov; T quarrei (Beeli) Zmitr., Wasser & Ezhov; T speciosa (Fr.) Zmitr., Wasser & Ezhov; T strumosa (Fr.) Zmitr., Wasser & Ezhov; T variegate(Berk.) Zmitr., Wasser & Ezhov; T vernicipes (Berk.) Zmitr., Wasser & Ezhov; T vespacea (Pers.) Zmitr., Wasser & Ezhov; và T warnieri (Durieu & Mont.)

Zmitr., Wasser & Ezhov (Ivan, Oleg, Solomon., 2012)

Năm 2015, nghiên cứu Samuel và Victor về việc định danh loài nấm Trametes elegans được thu thập hoang dại ở Osengere, Ibadan, Nigeria bằng phương

pháp giải trình tự vùng ITS với cặp mồi ITS4 và ITS5 Nghiên cứu cũng cho thấy khả năng kháng khuẩn của Trametes elegans tạo sự tin cậy cho việc sử dụng nấm trong y học dân gian (Samuel, Awala and Victor, Oyetayo., 2015)

Năm 2018, Kuo Micchael xác định loài nấm hoang dại Trametes elegans thông

qua mô tả hình thái ngoài: nấm không cuống, phát triển một bên, quả thể hình nan quạt, có nhiều vân đồng tâm, chồng chất, xen kẽ nhau như ngói lợp Mũ nấm phẳng, mỏng, mọc thành cụm Hình dạng bào tử: bào tử của nấm Vân Chi

có hình trụ hơi thót một đầu và cong, không màu, nhẵn, vách mỏng Cấu trúc dạng sợi: sợi nguyên thủy có vách ngăn, có khóa, sợi có vách dày, phân nhánh (Kuo, 2018)

Năm 2018, Aleksandar Knežević và cs đã nghiên cứu “Hoạt động chống oxy hóa, kháng nấm, độc tế bào và chống thoái hóa thần kinh của

các loài Trametes được chọn từ Serbia” với thành tựu Trametes versicolor , T.hirsuta và T.gibbosa là những loài được thử nghiệm cho các hoạt

động sinh học Khả năng kháng nấm của các chất chiết xuất được đánh giá đối

với các chủng Candida và Aspergillus được chọn lọc trên lâm sàng loài Các xét

nghiệm ABTS và FRAP được sử dụng để đánh giá khả năng chống oxy hóa của các chất chiết xuất được nghiên cứu Hoạt tính gây độc tế bào được xác định