đề tài ảnh hưởng đối kháng và ức chế của b.subtilis đối với nấm gây bệnh trên thực vật

Kháng sinh Tính chất Tác độngSURFACTIN, nhóm chất có hoạt tính sinh học, bản chất là lipopeptid -Kết hợp với iturin thì trở thành hợp chất diệt nấm.. SUBLANCIN - bacteriocin rất bền, -

Bài thuyết trình

Môn: Kỹ thuật gen Khoa Công nghệ Sinh học Viện Đại học Mở Hà Nội

GVHD: TS.Nguyễn Huy Hoàng

Nguyễn Anh Tiến

Nhóm 9 Lớp 10.01

Trần Thủy Tiên Trịnh Công Sơn

Nguyễn Thị Lương

Trần Thị Hạnh

Nguyễn Hà Nhung Trần Thị Hằng

Đề tài

ẢNH HƯỞNG ĐỐI KHÁNG VÀ ỨC CHẾ CỦA B.SUBTILIS ĐỐI VỚI NẤM

GÂY BỆNH TRÊN THỰC VẬT

B CẤU TẠO VI KHUẨN

A Khái quát vi khuẩn B.subtilis

C TÍNH ĐỐIKHÁNG CỦA CHÚNG

D NGUYÊN LiỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

E KẾT QuẢ

F THẢO LUẬN Mục lục

A/ Khái quát về vi khuẩn Bacillus

subtilis

 LỊCH SỬ :

• 1872 Bacillus subtilis được Ferdinand Cohn- một cộng sự của Robert Koch

mô tả và đặt tên

• 1949 – 1957: Henrry, Albot và các cộng sự tách được các chủng thuần

khiết của Bacillus subtilis.

• 1959 : Công trình nghiên cứu của Work cho thấy B subtilis có hệ thống men

tương đối hoàn chỉnh có khả năng thủy phân glucid, lipid, protid

 PHÂN BỐ:

+ Phần lớn chúng tồn tại trong đất, thảm mùn thực vật Thông thường đất trồng trọt chứa khoảng 10 - 100 triệu CFU/g

+ Tồn tại trong dạ dày, ruột, do chúng chịu được pH thấp.

 PHÂN LOẠI: B subtilis thuộc :

Ngành (phylum): Firmicutes

Lớp (class): Bacilli

Bộ (order) Eubacteriales

Họ family) Bacillaceae

Giống (genus):  Bacillus

Loài Bacillus subtilis

B/ Đặc điểm của B.subtilis

1.Vi khuẩn gram (+), không sinh bệnh

2 Hình que và là vi khuẩn sinh nội bào

Là đối tượng được nghiên cứu nhiều nhất về hình thái khuẩn lạc của VK Gram (+) Trên môi trường thạch đĩa khuẩn lạc phát triển theo dạng tròn, hoặc vết nhăn màu nâu rìa răng cưa không đều, có tâm sẫm màu, màu vàng xám, đường kính 3 – 5 mm

Sau 1 - 4 ngày bề mặt nhăn nheo, màu hơi nâu.

Khuẩn lạc B.subtilis

trên điã thạch Kl sau 48h Kl sau 96h

bệnh bằng cách

•   Cạnh tranh với mầm gây bệnh (nơi ở, dinh dưỡng)

•   Thay đổi chuyển hóa, tiết ra enzyme thủy phân ngoại

bào

•   Kích thích miễn dịch của cơ thể vật chủ.

• Trung hòa độc tố nấm.

– B.subtilis sản sinh kháng sinh có bản chất lipopeptide

– Khối lượng phân tử nhỏ hơn 2000 Dalton.

– Tổng hợp không ribosome.( non-ribosome)

Kháng sinh Tính chất Tác động

SURFACTIN, nhóm chất có hoạt

tính sinh học, bản chất là lipopeptid

-Kết hợp với iturin thì trở thành hợp chất diệt nấm

- Làm thủng vách tế bào của các tác nhân gây bệnh và bào tử của chúng.

ITURIN - Bản chất là

lipopeptit dk chiết từ môi trường nuôi cấy B.subtillis

- Tác động lên màng tb chất, làm tan màng và tạo những lỗ thủng trên đó để làm mất tính thẩm thấu chọn lọc của màng.

AGASTATIN Bản chất lipopeptide - Có khả năng diệt nấm như surfactin và iturin

SUBTILIN - Chịu nhiệt rất cao,

không mất hoạt tính khi hấp autoclave ở

pH 2

-cách gắn với màng nguyên sinh chất làm ảnh hưởng đến hệ thống vận chuyển các chất có trọng lượng phân tử nhỏ và  hệ thống trao đổi proton.

SUBLANCIN - bacteriocin rất bền, - Đối kháng mạnh với vi khuẩn gram dương kể cả

tế bào sinh dưỡng lẫn bào tử

C/ KHÁNG SINH DO B.SUBTILIS TỔNG HỢP

TÁC ĐỘNG CỦA CÁC CHỦNG B.SUBTILIS

• B.subtilis RB14 kháng nấm Rihzotomia, là tác nhân gây úng thối trên cây cà chua con Phần trăm cây bị bệnh khi thiếu B.subtilis RB14 là 85.2% Khi có

RB14 tỉ lệ cây bệnh giảm lần lượt 16.7%, 27.8%, 11.1%.

• Trên canh trường NB và TSB, B.subtilis cho thấy ảnh hưởng kháng lại nhất với Peronophythora litchi.

• B.subtilis YM 10-20 ngăn ngừa sự nảy mầm của bào tử Penicillin roqueforti Hiệu suất nảy mầm của Penicillin roqueforti sau 8h ủ không có mặt

B.subtilis YM10-20 là 84% Ở các tỷ lệ dịch 10, 25, 50% YM10-20, làm giảm

tỷ lệ lần lượt từ 7%, 1% và 0%

• B.subtilis 6051 bảo vệ rễ cây Arabidopsis khỏi sự nhiễm vi khuẩn

Pseudomonas syringae tomato DC 3000 trong điều kiện ống nghiệm và

trong đất màu.

• Đáng chú ý hơn cả là Bacillus spp.3 và B.subtilis CEI sản sinh ra dịch ngoại bào có hoạt tính kháng nấm cao nhất, lần lượt là 78 và 60% B.subtilis CEI cho thấy khả năng ngăn cản sự phát trển của F.verticillioides và sản phẩm

fumonisin trong điều kiện in vitro.

• Bacillus dòng PY-1 đc phát hiện tính chất hóa sinh, t/c vật lý nhờ phân tích trình tự 16S rDNA biểu hiện khả năng kháng nhiều loại nấm bệnh thông

thường trong đk invitro.

Vi khuẩn B.subtilis

R.Sonali from Cotton,

strawberry, potato

Alternaria from potato

Helmithosporum from tomato

F.oxysporum from tomamto

D/ NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

In total 14 isolates were identified :

7 B.subtilis (B3, B4, B5, B9, B11, B12):3 different subspecies

2 B.pumilus(B6, B10): 2 different different subspecies

1 Brevibacillus Bortelensis (B14)

4 B cereus (B1, B2, B8, B13,)

1/ Antagonistic effect of B.subtilis isolates (invitro)

(Phương pháp)

 Cấy trong bình rung:

- Môi trường nước thịt : ( peptone 5g/L , nước chiết thịt bò,3gL -1 )

- Bình Erlenmeyer 500ml, chứa 10g peptone; 10g glucose; 1g KH2PO4,, 0,5g MgSO4.7H2O trong nước cất.

- Hai giếng (đường kính 5mm) được tạo ra ở mỗi đĩa (PDA).

- Các giếng này được đổ 200l dịch ngoại bào Các nấm được thí nghiệm

đều được đặt tại vị trí trung tâm ở mỗi đĩa Các đĩa được nuôi trong vòng 3-7 ngày ở 30C Đo vùng ức chế

- Lấy kết quả : đo mật độ quang học ở 550nm, thu số lượng, khối lượng các chất kháng nấm Phân tích số liệu dựa hệ thống SAS

Nấm chuẩn bị là F.oxysporum và R.solani Bình nuôi để không rung trong Bóng tối ở 30C trong 1 tuần.Thể sợi nấm trên bề mặt được tách ra khoảng 894g trong vòng 2’

Cấy nấm vào đất theo tỉ lệ 1 lọ nấm tinh sạch ~20ml, 5 ngày trướckhi trồng cà chua

B.subtilis B7 được nuôi trong môi trường nước thịt và nuôi quađêm ở 30C, lắc liên

tục ở 200rpm.

1ml môi trường này sẽ được chuyển sang 500 ml bình Erlenmeyer, để qua đêm

ở 30C và lắc liên tục ở 200rpm Dịch lỏng được đem ly tâm ở 894g trong 10’ ở 4C , các viên tế bào được rửa sạch trong dung dịch muối (0,85%NaCl, pH 7),

sau đó được đem ly tâm lần nữa ở cùng điều kiện

Thực hiện đo khối lượng tươi và khối lượng khô của các mầm và rễ cây

ở cùng thời gian Dữ liệu thu được đem phân tích theo hệ thống SAS

2/ Antagonistic effect of B.subtilis isolate B7 (in vivo)

• Dịch ngoại bào được lọc vô trùng (0.22μm)

• Điều chỉnh pH=HCl Phần kết tủa được thu lại, đem hòa tan trong hỗn hợp methanol:

nước(50:50v/v) pH 8, lọc qua màng (0.22μm) Giữ

ở -20oC đến khi phân tích xong

Phương pháp phân tích HPLC

( Nhận biết các hợp chất kháng nấm)

• Tiêm 50μl dịch ngoại bào

của B.subtilis vào zorbax

eclipse cột XDB- C18, 4,6x150mm,5μm( Agilent technologies,USA) và đo ở 214nm

• Tốc độ rửa trôi 0,9cm³/min

• Hỗn hợp methanol:

nước(50:50 v/v) trong thời gian từ 0-20 phút, (80:20 v/v) từ 20-60 phút, (100:0 v/v) từ 60-65 phút và lặp lại(50:50 v/v) trong 65-75 phút

H Phân tích HPLC vs B.subtilis B7 phát hiện Iturin

( xhien 5 peaks )

 Antagonistic effect (ảnh hưởng đối kháng)

 Chủng B1 có ảnh hưởng lớn tới R.solani trên dâu tây (R2), khoai tây(R3)

và Helminthosporum , nhưng ít tác động đến F.oxysporum

 Chủng B8, B7,B11 có tác dụng đối kháng không mấy khác biệt, và là các chủng ảnh hưởng nhiều nhất, tiếp theo là B1 và B4 trong ức chế nấm

F.oxysporum phát triển

E/ Kết quả

• Khi nuôi trong bình lắc có chứa một môi trường với chủng thuần khiết của mỗi B subtilis phân lập, bình được ủ ở 30 độ celcius trong 16h

• Đường cong tăng trưởng điển hình được theo dõi trong bình lắc bằng cách đo mật độ quang học là một hàm của thời gian Tất cả các

đường cong bắt đầu với một pha kéo dài

khoảng 2 giờ Pha này được theo sau bởi các pha theo cấp số nhân, trong đó mật độ quang học tăng lên đều đặn theo thời gian thể hiện một tốc độ tăng trưởng liên tục

• Pha cần bằng bắt đầu vào cuối pha sinh trưởng , sau đó môi trường bước vào giai đoạn suy

vong.

 Inhibitory effect

- Chủng B8, B10, B14, B7, B4, B1, B11 và B13 có hiệu lực đối kháng trên R.solani tách từ dâu tây(R2) B8, B7, B10, B14, B11, B4, B13 và B1

ức chế theo thứ tự giảm dần sự phát triển của nấm R.solanni thu được

từ khoai tây(R3).

- Dịch thu được từ B7, B14, B10, B4, B3 cho nhiều ảnh hưởng ức chế hơn trên Helminthosporium spp so với B1, B5, B8, B13

- Dịch thu được từ B7, B14, B10, B4, B3 cho nhiều hiệu quả hơn trên Helminthosporium spp so với B1, B5, B8, B13.

- Dịch ngoại bào các chủng B7, B10, B4, B14 không quá khác biệt và chúng đều là các chủng hiệu lực nhất sau đó đến B1,B3,B8,B13 trong ảnh hưởng ức chế Alternaria spp trên cây cà chua.

+Chủng B.subtilis B7 có hiệu quả làm giảm tỷ lệ và nguy cơ mắc các bệnh nghiêm trọng khi nhiễm nấm Fusarium và R.solani, và kích thích sự phát triển của cây cà chua

+Khối lượng tươi của thân và lá của cây cà chua ở lô thí nghiệm cao hơn so với đối chứng Chiều cao cây, số lượng lá/cây ở lô xử lí với dịch ngoại bào cao hơn so với đối chứng

Fig 4 Cà chua nhiễm Fusarium Fig 5 Cà chua nhiễm R.solani

 Sử dụng trong ngành công nghệ sinh học sản xuất các axit amin quan trọng như: lysine, valine, tyrozine, proline,

threonine, isoleusine, aspastic…

 1999, Marten cho rằng B.subtilis B2 có thể ngăn chặn các tác nhân gây bệnh truyền qua rễ của thực vật B B2

subtilis có thể được sử dụng để sản xuất một loại thực phẩm có nguồn gốc từ DNJ như là một thực phẩm chức năng cho bệnh nhân tiểu đường

Các nghiên cứu ứng dụng liên quan vi

khuẩn B.subtilis

 B.subtilis B2:

- Ức chế mạnh mẽ tới α-glucosidase Bản chất kháng sinh

1-deoxynojirimycin (DNJ) là một đường imino với trọng

lượng phân tử 163 Dalton.

 Phương pháp:

- HPLC (TSKgel amit-80, CH3CN: H2O)

phân tích các hợp chất B2 Bacillus subtilis

- Thẩm tách màng, than hoạt tính,

sắc ký CM-Sepharose, và chuẩn bị

sắc ký lớp mỏng (TLC), khối phổ (MS),

cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)

B.Subtilis RB14

• RB14 Bacillus subtilis, cho thấy hoạt động kháng sinh chống lại các

phytopathogens bằng cách sản xuất các kháng sinh iturin A và surfactin

Iturin A, một lipopeptide,có đặc tính kháng nấm mạnh mẽ và độc tính với động vật

Ngiên cứu chế phẩm sinh học từ vi

khuẩn có tác dụng diệt nấm

• Tế bào của các chủng vi khuẩn đối kháng Burkholderia,

Pseudomonas và Bacillus tác dụng tích cực đến sinh trưởng của rau diếp

và cà chua Ko ảnh hưởng tốc độ nảy mầm và sự phát triển của rễ, lá ( khi nuôi trong nhà lưới)

• Trong điều kiện in vitro trên môi trường thạch, dịch ngoại bào của chủng vi

khuẩn đối kháng này diệt 70-90% nấm F oxysporum, và diệt 75-81%

nấm R solani. 

A R.solani hại rau diếp 

B Rau diếp nhiễm nấm R solani được xử với dịch ngoại bòa chủng vi khuẩn đối kháng chọn lọc.

C Rau diếp nhiễm nấm R.solani được xử với tế bào chủng vi khuẩn đối kháng chọn lọc.

Tài liệu tham khảo:

• Asian Network for scientific Information

• http//:TextbookofBaterial.com/Genus

Bacillus

• The Korean Society of Biology.

• Việncôngnghệsinhhọc/tài liệu tham khảo.

for your

listening