kiểm tra an toàn, hiệu lực và độ dài miễn dịch của vắc xin vô hoạt xuất huyết thỏ

Trong khi đó thỏ đối chứng chết sau khi công cường độc từ 24 - 48 giờ với những triệu chứng và bệnh tích của bệnh xuất huyết thỏ.. Một trong những bệnh gây thiệt hại lớn trên thỏ hiện na

TÓM TẮT KHOÁ LUẬN

Đề tài được thực hiện từ ngày 01/03/2008 đến 01/08/09 tại công ty thuốc thú y

Trung Ương Navetco với nội dung “Kiểm tra an toàn, hiệu lực và độ dài miễn dịch

của vắc xin vô hoạt xuất huyết thỏ”

Vắc xin xuất huyết thỏ dùng để kiểm tra được công ty Navetco cung cấp

Kiểm tra vô trùng 3 lô vắc xin trên các môi trường: thạch máu, thạch nấm, nước thịt dinh dưỡng, môi trường yếm khí Sau 7 ngày theo dõi không thấy vi sinh vật nào mọc trên các môi trường 3 lô vắc xin đạt tiêu chuẩn vô trùng

Kiểm tra an toàn 3 lô vắc xin trên thỏ: mỗi lô vắc xin dùng 3 thỏ khỏe mạnh, tiêm bắp với liều gấp đôi liều quy định (2 ml/con) Sau 7 ngày theo dõi, thỏ được tiêm vắc xin không có những biểu hiện bất thường nào 3 lô vắc xin đạt tiêu chuẩn an toàn

Kiểm tra hiệu lực 3 lô vắc xin: mỗi lô vắc xin dùng 8 thỏ, 5 thỏ được tiêm vắc xin với liều 1ml/con và 3 thỏ đối chứng không tiêm Sau 21 ngày, lấy máu kiểm tra HGKT và tiến hành công cường độc toàn bộ thỏ Kết quả tất cả thỏ được tiêm vắc xin sống khỏe mạnh HGKT dao động từ 1/20 - 1/160 Trong khi đó thỏ đối chứng chết sau khi công cường độc từ 24 - 48 giờ với những triệu chứng và bệnh tích của bệnh xuất huyết thỏ 3 lô vắc xin đạt tiêu chuẩn về hiệu lực

Kiểm tra độ dài miễn dịch 1 lô vắc xin trong 4 tháng: 20 thỏ được tiêm vắc xin tiêm bắp với liều 1 ml/con và 12 thỏ đối chứng không tiêm Cứ 1, 2, 3, 4 tháng sau khi tiêm, chọn 5 thỏ được tiêm vắc xin và 3 thỏ đối chứng tiến hành lấy máu kiểm tra HGKT và công cường độc Kết quả thỏ được bảo hộ 100%, độ dài miễn dịch kéo dài ít nhất 4 tháng Sau khi tiêm vắc xin, HGKT tăng dần và cao nhất ở tháng thứ 3

Kiểm tra hiệu lực 1 lô vắc xin sau khi bảo quản ở 2 - 8oC trong 3 và 6 tháng: kiểm tra vắc xin theo phương pháp kiểm tra hiệu lực Kết quả vắc xin để ở 2 - 8oC trong 3, 6 tháng vẫn còn hiệu lực bảo hộ trên thỏ từ 80 - 100%

Kiểm tra hiệu lực 1 lô vắc xin sau khi để ở nhiệt độ phòng (25 - 30oC) trong 1,

2 và 3 ngày: kiểm tra vắc xin theo phương pháp kiểm tra hiệu lực Kết quả vắc xin sau khi để ở nhiệt độ 25 - 30oC trong 1, 2, 3 ngày vẫn còn hiệu lực bảo hộ 100% thỏ

MỤC LỤC

Trang

Trang tựa i

Lời cảm tạ ii

Tóm tắt khóa luận iii

Mục lục iv

Danh sách các chữ viết tắt vii

Danh sách các bảng và biểu đồ viii

Danh sách các hình ix

Chương 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ 1

1.2 MỤC ĐÍCH VÀ YÊU CẦU 2

1.2.1 Mục đích 2

1.2.2 Yêu cầu 2

Chương 2 TỔNG QUAN 3

2.1 BỆNH XUẤT HUYẾT THỎ 3

2.1.1 Khái niệm 3

2.1.2 Lịch sử và phân bố địa lý 3

2.1.2.1 Lịch sử bệnh 3

2.1.2.2 Tình hình nhiễm bệnh trên thế giới 4

2.1.2.3 Tình hình nhiễm bệnh ở Việt Nam 5

2.1.3 Căn bệnh 5

2.1.3.1 Đặc điểm hình thái và cấu trúc 5

2.1.3.2 Đặc điểm nuôi cấy và phân lập 6

2.1.3.3 Sức đề kháng của virus 6

2.1.4 Truyền nhiễm học 6

2.1.4.1 Loài vật mắc bệnh 6

2.1.4.2 Chất chứa mầm bệnh 6

2.1.4.3 Đường xâm nhập 6

2.1.4.4 Cách sinh bệnh 6

2.1.4.5 Cách thức lan truyền 7

2.1.5 Triệu chứng học 7

2.1.5.1 Thể quá cấp 7

2.1.5.2 Thể cấp và bán cấp tính 7

2.1.5.3 Thể mãn tính 7

2.1.6 Bệnh tích 8

2.1.6.1 Bệnh tích đại thể 8

2.1.6.2 Bệnh tích vi thể 11

2.1.7 Các phương pháp chẩn đoán 13

2.1.7.1 Chẩn đoán lâm sàng 13

2.1.7.2 Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm 13

2.1.8 Các biện pháp phòng bệnh 14

2.1.8.1 Khi chưa có dịch xảy ra 14

2.1.8.2 Khi có dịch xảy ra 14

2.2 MIỄN DỊCH VÀ VẮC XIN PHÒNG BỆNH XUẤT HUYẾT THỎ 15

2.2.1 Miễn dịch trong bệnh xuất huyết thỏ 15

2.2.1.1 Miễn dịch dịch thể 15

2.2.1.2 Miễn dịch tế bào 15

2.2.2 Vắc xin phòng bệnh xuất huyết thỏ 16

2.2.2.1 Vắc xin và nguyên lý tác dụng 16

2.2.2.2 Phương pháp sản xuất vắc xin vô hoạt xuất huyết thỏ (theo OIE, 2000) 17

2.2.2.3 Những điều cần chú ý khi sử dụng vắc xin 18

2.2.2.4 Những công trình nghiên cứu về vắc xin xuất huyết thỏ 19

Chương 3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP TIẾN HÀNH 20

3.1 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM 20

3.2 NỘI DUNG THÍ NGHIỆM 20

3.3 VẬT LIỆU VÀ DỤNG CỤ THÍ NGHIỆM 20

3.3.1 Vật liệu thí nghiệm 20

3.3.2 Thiết bị và dụng cụ ……… 21

3.4 PHƯƠNG PHÁP TIẾN HÀNH 21

3.4.1 Kiểm tra vô trùng, an toàn và hiệu lực của vắc xin 21

3.4.1.2 Kiểm tra an toàn 21

3.4.1.3 Kiểm tra hiệu lực 22

3.4.1.4 Phương pháp kiểm tra kháng thể trên thỏ 23

(1) Phương pháp ngưng kết hồng cầu HA (theo OIE, 2000) 23

(2) Phương pháp ngăn trở ngưng kết hồng cầu HI (theo OIE, 2000) 25

3.4.2 Kiểm tra độ dài miễn dịch 1 lô vắc xin trong 4 tháng 26

3.4.3 Kiểm tra hiệu lực của 1 lô vắc xin sau khi bảo quản ở 2 - 8oC trong 3 và 6 tháng .27

3.4.4 Kiểm tra hiệu lực của vắc xin sau khi để ở nhiệt độ phòng (25 – 30oC) trong 1, 2, 3 ngày 28

3.5 PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU 29

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 30

4.1 KẾT QUẢ KIỂM TRA VÔ TRÙNG, AN TOÀN VÀ HIỆU LỰC CỦA 3 LÔ VẮC XIN XUẤT HUYẾT THỎ 30

4.1.1 Kết quả kiểm tra vô trùng 30

4.1.2 Kết quả kiểm tra an toàn 30

4.1.3 Kết quả kiểm tra hiệu lực 31

4.2 KẾT QUẢ KIỂM TRA ĐỘ DÀI MIỄN DỊCH 35

4.3 KẾT QUẢ KIỂM TRA HIỆU LỰC CỦA VẮC XIN SAU KHI BẢO QUẢN Ở 2 - 8oC TRONG 3 VÀ 6 THÁNG 37

4.4 KẾT QUẢ KIỂM TRA HIỆU LỰC CỦA VẮC XIN SAU KHI ĐỂ Ở NHIỆT ĐỘ PHÒNG (25 - 30oC) TRONG 1, 2 VÀ 3 NGÀY 38

Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 41

5.1 KẾT LUẬN 41

5.2 ĐỀ NGHỊ 41

TÀI LIỆU THAM KHẢO 42

PHỤ LỤC 44

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

RHD Rabbit Haemorrhagic Disease Bệnh xuất huyết trên thỏ

RHDV Rabbit Haemorrhagic Disease Virus Virus gây bệnh xuất huyết thỏ

HI Haemagglutination Inhibition Phản ứng ngăn trở ngưng kết

hồng cầu

OIE Organization International Tổ chức dịch tể thế giới

Epidemiology

Navetco National Veterinary Company Công ty thuốc thú y trung ương

TSB Tryptone Soya Broth

TSA Tryptone Soya Agar

PBS Phosphate Buffer Saline

DANH SÁCH CÁC BẢNG VÀ BIỂU ĐỒ

Trang

Bảng 3.1: Bố trí thí nghiệm kiểm tra an toàn 22

Bảng 3.2: Bố trí thí nghiệm kiểm tra hiệu lực……… 23

Bảng 3.3: Tóm tắt quá trình thực hiện phản ứng HA 24

Bảng 3.4: Tóm tắt quá trình thực hiện phản ứng HI 25

Bảng 3.5: Bố trí thí nghiệm kiểm tra độ dài miễn dịch 27

Bảng 3.6: Bố trí thí nghiệm kiểm tra hiệu lực của vắc xin sau khi bảo quản trong 3 và 6 tháng ở 2 - 8oC………28

Bảng 3.7: Bố trí thí nghiệm kiểm tra hiệu lực của vắc xin sau khi để ở nhiệt độ phòng (25 - 30oC) trong 1, 2, 3 ngày………29

Bảng 4.1: Kết quả kiểm tra an toàn 30

Bảng 4.2: Kết quả công cường độc sau khi tiêm vắc xin 21 ngày 31

Bảng 4.3: Hiệu giá kháng thể của thỏ sau khi tiêm vắc xin 21 ngày……….31

Bảng 4.4: Hiệu giá kháng thể của thỏ sau khi tiêm vắc xin 1, 2, 3, 4 tháng 35

Bảng 4.5: Kết quả công cường độc ở 1, 2, 3, và 4 tháng sau khi tiêm vắc xin 36

Bảng 4.6: Hiệu giá kháng thể của thỏ sau khi tiêm vắc xin 21 ngày với vắc xin bảo quản ở 2 – 8oC trong 3 và 6 tháng 37

Bảng 4.7: Tỷ lệ bảo hộ của vắc xin được bảo quản ở 2 - 8oC trong 3 và 6 tháng 38

Bảng 4.8: Hiệu giá kháng thể của thỏ sau khi tiêm vắc xin 21 ngày với vắc xin để ở 25 – 30oC trong 1, 2, 3 ngày 39

Bảng 4.9: Tỷ lệ bảo hộ của vắc xin để ở nhiệt độ 25 - 30oC trong 1, 2, 3 ngày 39

Biểu đồ 4.1: Biến động chỉ số MG qua 1, 2, 3, 4 tháng sau khi tiêm vắc xin ……… 36

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Trang

Hình 2.1: Bản đồ phân bố bệnh RHD trên thế giới (4/2000) 4

Hình 2.2: Hình thái của Calicivirus ở tế bào gan 5

Hình 2.3: Thỏ trào máu mũi 8

Hình 2.4: Các thùy gan sưng phồng, nhạt màu 9

Hình 2.5: Khí quản chứa đầy bọt khí, phổi có nhiều vết lốm đốm và phù thủng 9

Hình 2.6: Tim có đốm xuất huyết 10

Hình 2.7: Lách to và sung huyết 10

Hình 2.8: Thận có những điểm xuất huyết 11

Hình 2.9: Tế bào gan bị hoại tử 11

Hình 2.10: Tế bào gan bình thường 12

Hình 2.11: Cấu trúc tế bào gan bị thay đổi 12

Hình 2.12: Ống thận và quản cầu thận xuất huyết 13

Hình 2.13: Vắc xin xuất huyết thỏ của công ty Navetco 14

Hình 4.1: Thỏ chết với tư thế đầu ngửa về sau……… 32

Hình 4.2: Máu xuất huyết ra mũi……… 32

Hình 4.3: Khí quản xuất huyết lẫn bọt khí 33

Hình 4.4: Phổi sung huyết 34

Hình 4.5: Gan nhạt màu, hoại tử, xuất huyết 34

Hình 4.6: Dạ dày xuất huyết 34

trong đó có các bệnh gây ra trên thỏ như ghẻ, tụ huyết trùng, myxomatosis… Một

trong những bệnh gây thiệt hại lớn trên thỏ hiện nay là bệnh xuất huyết thỏ (Rabbit Haemorrhagic Disease, viết tắt là RHD) Đây là bệnh truyền nhiễm cấp tính cho thỏ nuôi cũng như thỏ hoang dại với đặc điểm lây lan nhanh, gây thiệt hại rất lớn, tỷ lệ nhiễm và tử vong cao từ 40 - 90% (Teifke.J.P và cs, 2002) Bệnh xuất hiện đầu tiên ở Trung Quốc vào năm 1984 (Cooke.B.D, 2002) và đã giết hàng triệu thỏ Ở nước ta, vào năm 2000 xuất hiện một bệnh lạ trên thỏ và được Trung tâm Chẩn Đoán Thú y

Trung ương xác định là bệnh xuất huyết do Calicivirus (Phạm Thành Long và Phương

Song Liên, 2004) Đặc biệt vào tháng 4/2003 bệnh xuất hiện trên thỏ nuôi tại Thành Phố Hồ Chí Minh, Bà Rịa - Vũng Tàu, Đồng Nai, Bình Dương, Long An, Tiền Giang… Do vậy, yêu cầu cần phải có một biện pháp phòng bệnh Một trong những biện pháp phòng bệnh đem lại hiệu quả là tiêm vắc xin

Xuất phát từ tình hình thực tế trên, được sự phân công của Bộ môn Vi Sinh - Truyền Nhiễm, khoa Chăn Nuôi Thú y, trường Đại Học Nông Lâm Tp.Hồ Chí Minh,

sự đồng ý của công ty Navetco và sự hướng dẫn của ThS Trần Thị Bích Liên, TS

Trần Xuân Hạnh, BSTY Tô Thị Phấn, chúng tôi thực hiện đề tài “KIỂM TRA AN

TOÀN, HIỆU LỰC VÀ ĐỘ DÀI MIỄN DỊCH CỦA VẮC XIN VÔ HOẠT XUẤT HUYẾT THỎ”

1.2 MỤC ĐÍCH VÀ YÊU CẦU

1.2.1 Mục đích

- Đánh giá chất lượng của vắc xin xuất huyết thỏ do công ty Navetco sản xuất

1.2.2 Yêu cầu

- Kiểm tra vô trùng, an toàn, hiệu lực của vắc xin xuất huyết thỏ

- Xác định độ dài miễn dịch của vắc xin xuất huyết thỏ

- Xác định độ dài bảo quản của vắc xin xuất huyết thỏ ở 2 - 8oC

- Kiểm tra hiệu lực của vắc xin xuất huyết thỏ sau khi để ở nhiệt độ phòng (25 -

30oC) trong 1, 2 và 3 ngày

Chương 2

TỔNG QUAN

2.1 BỆNH XUẤT HUYẾT THỎ

2.1.1 Khái niệm

Bệnh xuất huyết thỏ (Rabbit Haemorrhagic Disease - RHD) do Calicivirus gây

ra, là một bệnh truyền nhiễm cấp tính ở thỏ nuôi cũng như thỏ hoang dại Bệnh lây lan rất mạnh do truyền trực tiếp từ vật bệnh sang vật lành hoặc truyền gián tiếp qua dụng

cụ chăn nuôi, người chăn nuôi Bệnh có tỷ lệ nhiễm và tỷ lệ tử vong cao từ 40 - 90% (Teifke.J.P và cs, 2002) Thời gian nung bệnh từ 1 - 3 ngày, thời gian chết biến động

từ 24 - 72 giờ (OIE, 2000) sau khi có biểu hiện sốt cao, khó thở Triệu chứng lâm sàng

ở thể cấp tính là các dấu hiệu về thần kinh, hô hấp Bệnh tích biểu hiện ở gan, khí quản

và phổi Hầu hết các tổ chức đều xuất huyết và hiện tượng máu không đông

Trong phòng thí nghiệm virus này không thể nhân lên trên phôi trứng hay trên môi trường tế bào do vậy việc phân lập virus là không phù hợp Phản ứng đầu tiên để chẩn đoán bệnh RHD là phản ứng ngưng kết hồng cầu (HA) người nhóm máu O Ngoài ra cũng có những phương pháp chẩn đoán khác có độ nhạy cao như: reverse transcription polymerase chain reaction (RT - PCR), Western blotting, negative - staining immunoelectron microscopy, enzyme linked immunosorbent assay (ELISA)

2.1.2 Lịch sử và phân bố địa lý

2.1.2.1 Lịch sử bệnh

Bệnh xuất huyết thỏ được phát hiện đầu tiên ở Trung Quốc vào năm 1984 (Cooke.B.D, 2002) đã giết chết 140 triệu thỏ ở các nông trại, sau đó bệnh lan sang Hàn Quốc vào năm 1985 Chẳng bao lâu sau bệnh đã xuất hiện ở Châu Âu Tại Châu Âu, trường hợp bệnh được ghi nhận đầu tiên ở Italia vào năm 1986 đã giết chết 64 triệu thỏ

ở các trại (Patton, 1989; Cancellotti và Renzi, 1991) Ở Pháp, bệnh được phát hiện vào cuối năm 1987 (Morisse và cs, 1991), Tây Ban Nha và Thụy Sĩ năm 1988 (Parra và Prieto, 1990), Đức năm 1989 (Loliger và Eskens,1991), Đan Mạch năm 1990 (Rodak

và cs, 1991; Smid và cs, 1989,1991) Tháng 10 - 1988 bệnh xuất hiện ở Mexico do

nước này nhập sản phẩm có nguồn gốc từ thỏ nhiễm virus xuất huyết thỏ từ Trung Quốc (Gregg và House, 1989; Gutierrez, 1990) Bệnh cũng được công bố ở Ấn Độ (Sundaram và cs, 1991) và Trung Đông (Kuttin và cs, 1991) 1995, bệnh xuất hiện ở Australia gây chết 30 triệu thỏ chỉ trong vòng vài tuần (Mutze và cs, 1998) Đến nay bệnh có ở hầu hết các châu lục gây thiệt hại lớn cho nghề chăn nuôi thỏ Với những triệu chứng rất giống nhau, người ta cho rằng bệnh được lây lan qua con đường vận chuyển thỏ hay các sản phẩm của thỏ nhiễm RHDV có nguồn gốc từ Trung Quốc Năm 1989, tổ chức dịch tể thế giới công bố bệnh RHD được xếp vào danh mục các bệnh truyền nhiễm bảng B

Hình 2.1: Bản đồ phân bố bệnh RHD trên thế giới (4/2000) (http://www.aphis.usda.gov/vs/ceah/cei/taf/iw_2000_files/domestic/rabbitcal.htm) 2.1.2.2 Tình hình nhiễm bệnh trên thế giới

Theo tổ chức Lương Nông thế giới, hiện nay bệnh RHD xuất hiện trên 40 nước

ở hầu hết các châu lục đã gây thiệt hại rất lớn đến ngành chăn nuôi thỏ trên thế giới

2/1989, chính phủ Mêxicô đã triển khai chương trình kiểm soát và thanh toán bệnh này bao gồm cách ly kiểm dịch những nông trại đã bị nhiễm bệnh, ngăn chặn vận chuyển hay buôn bán thỏ, tiêu hủy thỏ bị bệnh, giám sát hoạt động dịch tễ, thông tin công cộng Chương trình đã đạt được sự thành công, ổ dịch cuối cùng ghi nhận được vào 4/1991 20/01/1993, Mêxicô công bố đã khống chế được bệnh RHD và là quốc gia

2.1.2.3 Tình hình nhiễm bệnh ở Việt Nam

Năm 2000 một bệnh lạ xuất hiện trên thỏ và đã được Trung tâm chẩn đoán quốc gia xác định là bệnh xuất huyết thỏ (Phạm Thành Long và Phương Song Liên, 2004) Đặc biệt 4/2003, hàng chục ngàn thỏ chết tại thành phố Hồ Chí Minh, Bà Rịa Vũng Tàu, Đồng Nai, Bình Dương, Long An, Tiền Giang Năm 2008, bệnh xuất hiện ở Thanh Hóa gây chết hàng ngàn con thỏ

Có thể phát hiện virus bằng nhiều kỹ thuật như phản ứng HA, ELISA (Berninger và House, 1995; OIE, 2000) Theo Mary Lou Berninger (1995), các chủng virus gây bệnh RHD từ các vùng khác nhau đều đồng nhất về tính kháng nguyên

Hình 2.2: Hình thái của Calicivirus ở tế bào gan, quan sát dưới kính hiển vi điện tử

(Nguồn: McIntosh và cs, 2001 Virology Journal, 2007)

2.1.3.2 Đặc điểm nuôi cấy và phân lập

RHDV không nhân lên trên phôi trứng hay môi trường tế bào vì vậy không thể nuôi cấy hay phân lập được trong phòng thí nghiệm Hiện nay sử dụng phủ tạng (gan, lách …) làm nguyên liệu để sản xuất vắc xin là biện pháp tốt nhất (Berninger, 1995; OIE, 2000)

Virus có khả năng gây ngưng kết hồng cầu người nhóm máu O

2.1.3.3 Sức đề kháng của virus

RHDV đề kháng cao với môi trường bên ngoài Chúng có thể sống 105 ngày ở

20oC, 2 ngày ở 60oC, 225 ngày trong huyễn dịch tổ chức ở 4oC Virus bị vô hoạt bởi NaOH 10%, formol 1 - 1,4% , β - propiolactone ở 4oC (OIE, 2000)

2.1.4 Truyền nhiễm học

2.1.4.1 Loài vật mắc bệnh

Loài mắc bệnh: thỏ nhà và thỏ rừng là vật chủ tự nhiên của RHDV

Lứa tuổi mắc bệnh: thỏ trên 50 ngày tuổi, thỏ nái và thỏ sinh sản đặc biệt mẫn cảm với virus (OIE, 2000) Những thỏ non dưới 50 ngày tuổi ít nhạy cảm với bệnh (Ruvoen Clouet, 1995; Boucher và Nouaille, 2002) Kh
năng đ
kháng c
a th
non đ
i v
i b
nh có th
liên quan đ
n s
t
n t
i kháng th
m
hay đ
n c
u t
o và ch
c năng sinh lý c
a t
bào
th
non so v
i th
tr

ng thành (Cooke B.D, 2002)

Mùa vụ mắc bệnh: bệnh xảy ra quanh năm

2.1.4.2 Chất chứa mầm bệnh

Các phủ tạng như phổi, khí quản, tim, thận, dạ dày, ruột, bàng quang, chất tiết

và thai sẩy đều có thể chứa virus Tuy nhiên, khi xét nghiệm bằng kỹ thuật HA thì gan, lách là bệnh phẩm cho hiệu giá virus cao (Trần Xuân Hạnh và cs, 2003)

2.1.4.5 Cách thức lan truyền

RHDV truyền trực tiếp hoặc gián tiếp do tiếp xúc giữa thỏ khỏe mạnh với thỏ

đã nhiễm bệnh, chất tiết, chất thải chứa virus, chuồng trại, người chăn nuôi, thức ăn, nước uống… Côn trùng, gặm nhấm có thể là véctơ mang virus (Nathtaz, 2007)

Trong môi trường không khí ẩm, virus phát tán và lây lan nhanh hơn, nguy cơ lan truyền virus sẽ cao hơn nếu nuôi thỏ với mật độ dầy

2.1.5 Triệu chứng học

Bệnh xảy ra rất nhanh, đôi khi thỏ không có biểu hiện gì trước khi chết Thời gian nung bệnh ngắn từ 1 - 3 ngày Tất cả thỏ chết đều có tư thế rất giống nhau, đầu hất về phía sau

Tùy độc lực, số lượng của RHDV và sức đề kháng của thỏ mà bệnh RHD có 4 thể: quá cấp tính, cấp tính, bán cấp tính và mãn tính Bệnh thường diễn biến ở thể cấp tính

2.1.5.1 Thể quá cấp

Bệnh xuất hiện đột ngột, thỏ chết nhanh trong vòng 6 - 24 giờ Một số thỏ có biểu hiện rối loạn vận động, chạy nhảy, kêu la trong chuồng trước khi chết Thể bệnh này thường xảy ra ở giai đoạn đầu của trận dịch (Xue và cs, 2001)

2.1.5.2 Thể cấp và bán cấp tính

Lúc đầu thỏ có biểu hiện sốt cao (>40o), khó thở Thỏ suy nhược, khát nước, bỏ

ăn chỉ 3 - 4 giờ trước khi chết, dạ dày luôn đầy thức ăn Biểu hiện rối loạn vận động ngay trước khi thỏ chết, thỏ co giật, kêu la, nhảy không định hướng, phân sệt đen kéo thành sợi và có dịch nhờn ở hậu môn, thời điểm này thường thấy máu lẫn bọt trào ra lỗ mũi Thể bệnh này thường xảy ra ở giai đoạn giữa của trận dịch (Xue và cs, 2001)

2.1.5.3 Thể mãn tính

Thỏ bị bệnh chậm lớn, suy nhược, vàng ở vùng tai và dưới da, trong máu xuất hiện kháng thể nhưng hiệu giá không cao (OIE, 2000) Ở thể này thỏ trở thành thể mang trùng và có thể phát tán virus Thể bệnh này xảy ra ở giai đoạn sau của trận dịch (Xue và cs, 2001)

Hình 2.3: Thỏ trào máu mũi (Nguồn: J.P.Teifke, 2002 Federal Research Institute for

Animal Health, Riems, Germany)

2.1.6 Bệnh tích

RHDV gây tổn thương ở nhiều cơ quan như: gan, khí quản, phổi, tim, lách, thận, dạ dày, ruột,…

2.1.6.1 Bệnh tích đại thể

Theo Xue và cs (2001) bệnh tích đại thể được quan sát ở nhiều cơ quan:

Khí quản: sung huyết chứa bọt khí có lẫn máu

Phổi: sung huyết nghiêm trọng, có những điểm xuất huyết bằng hạt kê

Tim: sung huyết, đốm xuất huyết ở màng trong tim

Tuyến giáp: phù, xuất huyết điểm

Túi mật: sưng, mỏng

Thận: sung huyết, xuất huyết

Lách: sưng to, sung huyết

Gan: sưng, xuất huyết, thoái hóa, hoại tử, mềm dễ vỡ

Màng treo ruột: xuất huyết

Dạ dày: xuất huyết

Tử cung: xuất huyết, chết phôi

Bàng quang: tích nước tiểu trong một vài trường hợp

Hình 2.4: Các thùy gan sưng phồng, nhạt màu (Nguồn: J.P.Teifke, 2002 Federal

Research Institute for Animal Health, Riems, Germany)

Hình 2.5: Khí quản chứa đầy bọt khí, phổi có nhiều vết lốm đốm và phù thủng

(Nguồn: J.P.Teifke, 2004 Federal Research Institute for Animal Health, Riems,

Germany)

Hình 2.6: Tim có đốm xuất huyết (Nguồn: J.P.Teifke, 2002 Federal Research

Institute for Animal Health, Riems, Germany)

Hình 2.7: Lách to và sung huyết (Nguồn: J.P.Teifke, 2002 Federal Research Institute

for Animal Health, Riems, Germany)

Hình 2.8: Thận có những điểm xuất huyết ở vùng vỏ và vùng tủy bị sung huyết nặng

(Nguồn: J.P.Teifke, 2002 Federal Research Institute for Animal Health, Riems,

Germany)

2.1.6.2 Bệnh tích vi thể

RHDV gây thoái hóa, hoại tử hầu hết tế bào gan Xuất hiện nhiều tế bào ưa axit, nhân tế bào gan bị vỡ hoặc tan biến Virus làm cho mạch máu bị xơ cứng đông đặc lại (Disseminated intravascular coagulation - DIC) ở nhiều cơ quan như lách, phổi, gan, thận

Hình 2.9: Tế bào gan bị phân tách, xuất hiện tế bào ưa axit (đầu mũi tên trắng), nhân

tế bào bị vỡ (mũi tên trắng), tế bào gan bị hoại tử (đầu mũi tên đen) (Nguồn:

McIntosh và cs, 2001 Virology Journal, 2007)

Hình 2.10: Tế bào gan bình thường

(Nguồn: McIntosh và cs, 2001 Virology Journal, 2007)

Hình 2.11: Cấu trúc tế bào gan bị thay đổi Chất nhiễm sắc (Ch) nằm ở rìa của nhân

(Nu), nếp màng trong của ty thể (Mt) bị vỡ, hệ thống lưới nội chất (ER) dày đặc

(Nguồn: McIntosh và cs, 2001 Virology Journal, 2007)

Hình 2.12: Ống thận và quản cầu thận xuất huyết (nhuộm HE x 100) (Nguồn: M.I

Abubakr - Revue Élev Méd Vét Pays trop, 2005)

2.1.7 Các phương pháp chẩn đoán

2.1.7.1 Chẩn đoán lâm sàng

Dựa vào lứa tuổi: bệnh RHD thường xảy ra trên thỏ lớn hơn 50 ngày tuổi Dựa vào triệu chứng: thời gian chết nhanh trong vòng 12 - 24 giờ Trước khi chết có dấu hiệu rối loạn vận động như mất thăng bằng, co giật, một số thỏ kêu, rên, la rồi chết và một biểu hiện đặc trưng là đầu hất về phía sau, 4 chân duỗi thẳng

Dựa vào bệnh tích: gan sưng, xuất huyết, mềm dễ vỡ, thoái hóa, hoại tử; khí quản xuất huyết nặng…

Chẩn đoán phân biệt với bệnh tụ huyết trùng thể cấp tính (Pasteurella

multocida ), myxomatosis, cầu trùng (Eimeria) , ngộ độc…

2.1.7.2 Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm

Một trong những trở ngại khi nghiên cứu bệnh của thỏ do Calicivirus là virus

không thể nhân lên trên phôi trứng hay môi trường tế bào do vậy việc phân lập virus là không phù hợp Vì hàm lượng virus có nhiều trong phủ tạng như gan, thận, lách, phổi

do vậy để xác định virus người ta dùng các phản ứng huyết thanh học như phản ứng ngưng kết hồng cầu, phản ứng miễn dịch huỳnh quang, phương pháp ELISA, phương pháp Western blotting, phương pháp RT - PCR, phương pháp nhuộm âm xem dưới kính hiển vi điện tử

2.1.8 Các biện pháp phòng bệnh

Đối với bệnh này về nguyên lý là không điều trị Tuy nhiên, để tăng sức đề kháng và chống nhiễm trùng kế phát cho thỏ, chúng ta dùng thuốc trợ sức như Vitamin

C, B - complex…, các kháng sinh như Enrofloxacin, Gentamycin…tiêm cho thỏ

2.1.8.1 Khi chưa có dịch xảy ra

Vệ sinh chăm sóc tốt Cung cấp thức ăn, nước uống đầy đủ thành phần dinh dưỡng, sạch sẽ, hợp lý Định kỳ tiêu độc, sát trùng chuồng trại, máng ăn, máng uống, dụng cụ chăn nuôi Bố trí chuồng trại, nuôi dưỡng thỏ phù hợp từng lứa tuổi

Thỏ mới nhập về phải cách ly ít nhất 1 tháng mới cho nhập vào đàn (Gregg và House, 1989)

Tiêm phòng bằng vắc xin Hiện nay, ở Việt Nam có 2 nơi sản xuất vắc xin phòng bệnh xuất huyết thỏ là:

- Vắc xin ở Hà Nội (Trung tâm chẩn đoán thú y Trung ương): vắc xin vô hoạt dạng keo phèn, tiêm cho thỏ trên 2 tháng tuổi, tiêm dưới da cổ 1 ml/con Miễn dịch 6 -

12 tháng

- Vắc xin của công ty thuốc thú y Trung ương Navetco Tp.Hồ Chí Minh: vắc xin vô hoạt dạng keo phèn, tiêm cho thỏ trên 2 tháng tuổi, tiêm dưới da cổ hoặc tiêm bắp 1 ml/con Miễn dịch 6 - 12 tháng

Hình 2.13: Vắc xin xuất huyết thỏ của công ty Navetco

Một số loại vắc xin thương mại phòng bệnh xuất huyết thỏ trên thế giới: Cunical®, Lapinject®, Haemorrvac®, Dercunimix®, Rabbit MEV®, Cunipravac - RHD®…

2.1.8.2 Khi có dịch xảy ra

Cách ly thỏ bệnh với thỏ khỏe mạnh

Quét dọn, vệ sinh chuồng trại sạch sẽ

Phun tiêu độc sát trùng chuồng trại, dụng cụ chăn nuôi, lối ra vào và chất thải…bằng các chất sát trùng

Công nhân chăn nuôi phải thay trang phục bảo hộ và tắm rửa sạch sẽ trước khi

ra khỏi trại

Những thỏ khỏe mạnh phải được tăng cường sức đề kháng

Báo cáo ngay cho cơ quan thú y

2.2 MIỄN DỊCH VÀ VẮC XIN PHÒNG BỆNH XUẤT HUYẾT THỎ

2.2.1 Miễn dịch trong bệnh xuất huyết thỏ

Khi có 1 yếu tố lạ xâm nhập vào cơ thể, hệ thống miễn dịch có nhiệm vụ nhận biết, sau đó có những hoạt động có hiệu quả tiếp theo để loại trừ nó nhằm mục đích bảo vệ tính toàn vẹn của cơ thể Đáp ứng miễn dịch dịch thể và đáp ứng miễn dịch tế bào là 2 phương thức mà hệ thống miễn dịch sử dụng Đối với đáp ứng miễn dịch dịch thể, các kháng thể hòa tan, chính xác hơn là các globulin miễn dịch đảm đương chức năng này, nó được sản xuất từ tế bào plasma (tương bào), biệt hóa từ tế bào lympho B (Trần Thị Chính, 2007)

Khi kháng nguyên xâm nhập vào cơ thể, sẽ kích thích sự hoạt động biệt hoá của dòng tế bào lympho T; các quần thể lympho T sau khi được biệt hoá sẽ tăng sinh nhanh chóng và tạo ra một số lượng lớn sẵn sàng làm nhiệm vụ tấn công kháng nguyên (Lê Văn Hùng, 2002)

2.2.1.2 Miễn dịch dịch thể

Đáp ứng miễn dịch dịch thể là đáp ứng miễn dịch được thực hiện bởi các kháng thể (còn gọi là các Immunglobulin - Ig) Kháng thể có trong các dịch thể của cơ thể như máu, dịch nhầy, nước mắt, nước bọt (Tô Long Thành, 2006)

Đáp ứng miễn dịch trên thỏ với RHDV thấy có sự liên hệ giữa quần thể tế bào lympho T và B cũng như kháng thể IgG Trên thỏ thí nghiệm với RHDV thấy gia tăng

số lượng lympho bào T (CD3, CD5), lympho bào Th (CD4), lympho bào Tc/Ts (CD8)

và lympho bào B (CD19), lympho bào T và B (CD25) hoạt hóa và nồng độ IgG trong huyết thanh Sự thay đổi chỉ số miễn dịch chính là nồng độ lympho bào, tăng lên thông thường 4 - 8 giờ sau khi nhiễm và tồn tại kéo dài sau 36 giờ, 48 giờ hoặc 60 giờ Tuy nhiên sự thay đổi phụ thuộc vào chủng virus và liều nhiễm virus (Beata Tokarz và cs, 2004)

Miễn dịch dịch thể đóng vai trò quan trọng chống lại virus gây bệnh RHD Sau khi tiêm vắc xin hoặc trong trường hợp nhiễm tự nhiên, kháng thể IgG tăng rất nhanh

và đáp ứng miễn dịch được xác định bằng các phương pháp huyết thanh học như HI, ELISA (Laurent Fischer và cs, 1997; Mary Lou Berninger và House, 1995; OIE, 2000) Ở những thỏ con từ mẹ được tiêm vắc xin hay nhiễm tự nhiên nhưng qua khỏi, kháng thể từ mẹ truyền qua con kéo dài đến 6 tuần, nhưng cá biệt có thể đến 12 tuần (COOKE, 2002) Tuy nhiên hiệu giá kháng thể có được và sự tồn tại của nó còn phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác, trong đó hàm lượng kháng thể trong máu của thỏ mẹ có ý nghĩa rất quan trọng Kháng thể có thể được xác định được sau khi tiêm vắc xin 5 ngày (Smid B và cs, 1997) hay 3 - 5 ngày (Song Bao - Yun và cs, 2004) Miễn dịch ở thỏ tiêm vắc xin có thể kéo dài 6 tháng (Song Bao - Yun và cs, 2004) thậm chí 1 năm (OIE, 2000)

2.2.2 Vắc xin phòng bệnh xuất huyết thỏ

2.2.2.1 Vắc xin và nguyên lý tác dụng

Vắc xin là một chế phẩm sinh học chứa vật chất của mầm bệnh được gọi là

“kháng nguyên” khi đưa vào cơ thể người hoặc động vật sẽ kích thích cơ thể tạo ra trạng thái miễn dịch giúp cơ thể chống lại mầm bệnh (Outteridge, 1985)

Kể từ khi Edward Jenner tìm ra cách dùng đậu bò chủng cho người để chống lại

“muốn phòng cho một bệnh phải gây cho thú trạng thái bệnh nhẹ” và ông đã dùng vi khuẩn chết hoặc giảm độc để chế vắc xin Cho đến nay nguyên lý phòng chống bệnh bằng vắc xin vẫn là gây ra trong cơ thể sống một đáp ứng chủ động của hệ thống miễn dịch nhằm tạo ra kháng thể dịch thể hay kháng thể tế bào chống lại những nhóm quyết định kháng nguyên của yếu tố có khả năng gây bệnh và làm mất khả năng gây bệnh này của chúng (Lê Văn Hùng, 2002)

Hiện nay trên thị trường có hai loại vắc xin chính: vắc xin sống nhược độc và vắc xin chết bất hoạt

Vắc xin sống là loại vắc xin được chế từ chủng vi sinh vật có độc lực thấp, hoặc

từ chủng gây bệnh có độc lực cao được làm yếu đi để chúng không còn khả năng gây bệnh nhưng vẫn giữ được tính kháng nguyên và vẫn sống Vắc xin sống kích thích hệ thống miễn dịch có thể tạo ra đồng thời miễn dịch dịch thể, miễn dịch tế bào cũng như miễn dịch tại chỗ, do vậy thường tạo được miễn dịch phòng hộ nhanh (7 - 14 ngày), hiệu lực miễn dịch cao và kéo dài Tuy vậy theo Egerton (2005) vắc xin sống có thể gây phản ứng ở động vật được tiêm phòng với tỷ lệ cao, thậm chí có thể gây nên những ổ dịch địa phương sau khi tiêm vắc xin do mầm bệnh trong vắc xin tăng cường độc lực hoặc làm trổi dậy các bệnh thể mãn tính, thể bệnh ẩn, thể mang trùng ở động vật được tiêm phòng (Lê Văn Tạo, 2006)

Vắc xin chết hay vô hoạt là vắc xin chứa kháng nguyên là mầm bệnh đã được làm vô hoạt bằng các yếu tố vật lý như: nhiệt độ, sóng siêu âm, tia tử ngoại; bằng hoá chất như: các loại thuốc nhuộm, các loại axit, phormol hoặc từng phần của mầm bệnh

đã được chiết, tách, tinh chế Vắc xin vô hoạt có ưu điểm là độ an toàn cao, nhưng tạo miễn dịch phòng hộ chậm (14 - 21 ngày), thời gian miễn dịch ngắn, liều tiêm vắc xin lớn Để khắc phục nhược điểm này người ta bổ sung vào vắc xin chất bổ trợ để làm giảm tỷ lệ phản ứng, nâng cao và kéo dài thời gian khả năng tạo miễn dịch phòng vệ của vắc xin (Lê Văn Tạo, 2006)

2.2.2.2 Phương pháp sản xuất vắc xin vô hoạt xuất huyết thỏ (theo OIE, 2000)

Mẫu gan, lách của thỏ bệnh chết do Calicivirus được nghiền nhỏ (dùng cối vô

trùng) hòa với dung dịch đệm PBS vô trùng, có chứa kháng sinh thành nồng độ 1/10 Dùng 2 thỏ khoẻ mạnh không có kháng thể RHD (HI âm tính <1/10) gây nhiễm với liều 1 ml/con Theo dõi thời gian bệnh và chết của thỏ Thỏ chết với triệu chứng điển

hình của bệnh RHD, mổ khám kiểm tra bệnh tích, thu hoạch gan, lách một cách vô trùng Kiểm tra mẫu gan, lách về mặt vi khuẩn học và xác định hiệu giá HA Quá trình tiếp đời thực hiện liên tục qua 4 đời và giống virus chứa trong gan, lách thỏ ở lần tiếp đời cuối cùng được giữ như giống gốc dùng nghiên cứu chế vắc xin phòng bệnh cho thỏ

Quy trình sản xuất vắc xin được tóm tắt như sau: gan, lách xay nhỏ hòa với đệm PBS → ly tâm lấy phần dịch trong phía trên → vô hoạt virus → xác định hiệu giá virus → pha thành nồng độ thích hợp → cho chất bổ trợ

Vắc xin sau khi sản xuất được kiểm tra vô trùng trên các môi trường kiểm tra như: thạch máu, thạch nấm, môi trường yếm khí và nước thịt 50 ml Vắc xin chỉ được dùng kiểm tra an toàn và hiệu lực khi đạt tiêu chuẩn về kiểm tra vô trùng

2.2.2.3 Những điều cần chú ý khi sử dụng vắc xin

Vắc xin là thuốc dùng phòng bệnh, chỉ nên dùng cho thú chưa mắc bệnh

Vắc xin phòng bệnh nào thì chỉ phòng được loại bệnh đó thôi

Hiệu quả của vắc xin phụ thuộc vào tình trạng sức khỏe của thú, vì rằng đáp ứng miễn dịch = tính kháng nguyên + phản ứng của cơ thể Cho nên chỉ dùng vắc xin cho những thú có phản ứng tốt, tức thú khỏe mạnh, được nuôi dưỡng tốt, không mắc bệnh truyền nhiễm khác, trưởng thành về hệ thống miễn dịch (Lê Văn Hùng, 2002)

Sau khi tiêm vắc xin một thời gian cơ thể động vật mới hình thành đáp ứng miễn dịch phòng bệnh Trong khoảng thời gian này thú vẫn có thể mắc bệnh và phát bệnh Do đó chúng ta dễ nhận định nhầm, cho là vắc xin gây ra bệnh hoặc vắc xin không có hiệu lực phòng bệnh

Một số vắc xin có thể gây phản ứng dị ứng sau khi tiêm Nếu phản ứng nhẹ thì sau một thời gian thú sẽ trở lại bình thường, nếu phản ứng nặng có thể làm thú chết Vì vậy sau khi tiêm vắc xin cần theo dõi kỹ trong vòng 2 giờ Khi thú dị ứng phải can thiệp sớm bằng các thuốc kháng histamine

Không dùng vắc xin cho thú còn quá nhỏ Ở những thú này hệ thống miễn dịch chưa hoàn chỉnh, đáp ứng miễn dịch với vắc xin còn rất yếu Hơn nữa những thú nhỏ này có kháng thể mẹ truyền, kháng thể này sẽ trung hòa với vắc xin nhược độc, và vắc xin sẽ làm giảm số kháng thể hiện có, làm cho thú dễ cảm thụ với bệnh hơn (Nguyễn

Tiêm phòng phải đúng liều và bảo đảm vô trùng Sử dụng dưới liều sẽ làm giảm miễn dịch, nhất là thú non Dùng quá liều có thể làm tê liệt miễn dịch Với vắc xin virus, phần lớn dùng liều giống nhau cho các loại tuổi Với vắc xin vi khuẩn, hiện nay vẫn phải dùng theo thể trọng hay tuổi

Hiệu lực vắc xin còn phụ thuộc vào phương pháp tiêm chủng Mỗi loại vắc xin

có cách sử dụng khác nhau, người sử dụng nên theo hướng dẫn cụ thể của nhà sản xuất

Bảo quản vắc xin có ý nghĩa quyết định đến chất lượng và hiệu lực của vắc xin Nếu bảo quản không tốt thì thời hạn sử dụng của vắc xin sẽ rút ngắn đi nhiều Không được để vắc xin ở chỗ nóng, chỗ có ánh sáng mặt trời chiếu vào, không được giữ vắc xin ở nhiệt độ âm Nhiệt độ tối ưu để bảo quản đối với mỗi loại vắc xin có quy định riêng, nhưng thông thường là 2oC - 8oC (Trần Hữu Ngọc, 2004)

2.2.2.4 Những công trình nghiên cứu về vắc xin xuất huyết thỏ

- Vắc xin vô hoạt (Smid B và cs, 1991, Mary Lou Berninger và House, 1995, OIE, 2000)

- Vắc xin subunit (Boga và cs, 1994)

- Vắc xin tái tổ hợp giữa Canarypox virus và Calicivirus được sản xuất trên tế bào

xơ phôi gà (Laurent Fischer và cs, 1997)

- Vắc xin tái tổ hợp phòng Myxomatosis và RHDV (Juan M.Torres, 2001)

- Vắc xin đa giá phòng Pasteurellosis và RHDV (Peshev R, 2003)

- Trần Xuân Hạnh và cs (2003) bước đầu nghiên cứu vắc xin vô hoạt phòng bệnh xuất huyết trên thỏ

- Trần Thị Liên và cs (2005) nghiên cứu sản xuất và thử nghiệm vắc xin vô hoạt phòng bệnh xuất huyết thỏ

Chương 3

NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP TIẾN HÀNH

3.1 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM

- Thời gian thực hiện thí nghiệm: từ 01/03/2008 đến 01/08/2008

- Địa điểm: bộ môn nghiên cứu vi trùng, phòng kiểm nghiệm, trại chăn nuôi Thạnh Lộc của công ty thuốc thú y Trung Ương Navetco

3.2 NỘI DUNG THÍ NGHIỆM

- Kiểm tra vô trùng, an toàn và hiệu lực của 3 lô vắc xin xuất huyết thỏ

- Kiểm tra độ dài miễn dịch của vắc xin xuất huyết thỏ trong 4 tháng

- Kiểm tra hiệu lực của vắc xin xuất huyết thỏ được bảo quản ở điều kiện 2 -

Hồng cầu người nhóm máu O

Kaolin 25%