nghiên cứu tối ưu hóa quá trình sản xuất chitin từ vỏ tôm thẻ chân trắng với sự kết hợp của alkalase – pepsinvà hcl

Quy trình sản xuất Chitosan từ vỏ tôm Sú bằng phương pháp hóa học với một công đoạn xử lý kiềm...18 Hình 1.9.. Theo điều tra ban đầu thì công nghệ sản xuất chitin – chitosan trong nước h

MỤC LỤC Trang MỤC LỤC i

LỜI MỞ ĐẦU 1

PHẦN 1: TỔNG QUAN 3

1.1 TỔNG QUAN VỀ CHITIN 3

1.1.1 Cấu trúc và tính chất của chitin 3

1.1.2 Ứng dụng của chitin – chitosan 4

1.2 TỔNG QUAN VỀ PHẾ LIỆU TÔM 6

1.2.1 Tỷ lệ thu hồi phế liệu tôm 6

1.2.2 Cấu tạo và thành phần sinh hóa của vỏ tôm 7

1.2.3.Thành phần sinh hoá của vỏ tôm 8

1.3 CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT CHITIN 9

1.3.1 Giới thiệu công nghệ sản xuất chitin 9

1.3.2 Tình hình nghiên cứu sản xuất chitin trên thế giới và ở Việt Nam 11

1.3.2.1 Sản xuất chitin, chitosan theo phương pháp hóa học 12

1.3.2.2 Sản xuất chitin, chitosan theo phương pháp hóa học cải tiến 15

1.3.2.3 Sản xuất chitin, chitosan theo phương pháp sử dụng enzyme 21

1.4 Tổng quan về enzyme protease 23

1.4.1 Phân loại protease 23

1.4.2 Nguồn thu nhận enzyme protease 24

1.4.3 Một số loại protese thường dùng 25

PHẦN 2: NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26

2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 26

2.1.1 Nguyên liệu vỏ tôm 26

2.1.2 Enzyme Protease 26

2.1.3 Hóa chất 26

2.2.PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26

2.2.1.Phương pháp thu nhận mẫu 26

2.2.2 Bố trí thí nghiệm 26

2.2.2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát 26

2.2.2.2 Bố trí thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của xử lý nhiệt nguyên liệu trước khi thủy phân .28

2.2.2.3 Thí nghiệm xác định chế độ khử protein tối ưu bằng enzyme Alcalase 28

2.2.2.4 Thí nghiệm xác định chế độ khử protein tối ưu bằng enzyme Pepsin 29

2.3 CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH HÓA HỌC 32

2.3.1 Xác định hàm lượng ẩm bằng phương pháp sấy ở nhiệt độ 105oC theo TCVN 3700-1990 32

2.3.2 Xác định hàm lượng khoáng bằng phương pháp nung ở 600oC 32

2.3.3 Xác định hàm lượng protein theo phương pháp của Hein và cộng sự năm 2004 32

2.3.4 Xác định hiệu quả khử protein 33

2.3.5 Phương pháp xử lý số liệu: 33

PHẦN 3: kẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 34

3.1 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của xử lý nhiệt nguyên liệu trước thủy phân 34

3.2.Kết quả nghiên cứu công đoạn khử protein bằng enzyme Alcalase 35

3.3 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của các nhân tố đến công đoạn khử protein bằng enzyme Pepsin 40

3.4.Kết quả nghiên cứu tối ưu công đoạn khử protein bằng enzyme Pepsin và HCl 44

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾn 51

Một số đề xuất cần tiếp tục nghiên cứu: 51

TÀI LIỆU THAM KHẢO 52

PHỤ LỤC 54

DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Cấu tạo của Chitin 4

Hình 1.2 Quy trình của Stevens (2002) Học Viện Công Nghệ Châu Á 12

Hình 1.3 Quy trình sản xuất chitosan từ vỏ tôm hùm của Hackman………

Hình 1.4 Quy trình nhiệt của Yamashaki và Nakamichi (Nhật Bản) 14

Hình 1.5 Quy trình sản xuất của Pháp 15

Hình 1.6 Quy trình của Đỗ Minh Phụng, trường Đại học Thủy Sản 16

Hình 1.7 Quy trình sản xuất Chitosan ở Trung tâm cao phân tử thuộc Viện khoa học Việt Nam 17

Hình 1.8 Quy trình sản xuất Chitosan từ vỏ tôm Sú bằng phương pháp hóa học với một công đoạn xử lý kiềm 18

Hình 1.9 Quy trình của Trung tâm Chế biến Đại học Thủy sản .20

Hình 1.10 Quy trình sản xuất chitin của Holanda và Netto (2006) .21

Hình 1.11 Quy trình sử dụng Enzyme papain để sản xuất chitosan 22

Hình 2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát 27

Hình 2.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của nhiệt lên nguyên liệu trước thủy phân 28

Hình 3.1: Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của xử lý nhiệt nguyên liệu trước thủy phân 34

Hình 3.2.a Mô hình biểu diễn phân phối chuẩn 48

Hình 3.2.b Mô hình biểu diễn phân phối chuẩn……… 49

Hình 3.3 Đồ thị 3D biểu diễn ảnh hưởng của nhiệt và thời gian tới hiệu quả khử protein 55

Hình 3.4: Đồ thị biểu diễn mức độ ảnh hưởng của các yếu tố 42

Hình 3.5: Đồ thị biểu diễn sự tương tác giữa nhiệt độ và nồng độ ảnh hưởng đến hiệu quả khử protein 43

Hình 3.6: Mô hình biểu diễn phân phối chuẩn 48 Hình 3.7: Đồ thị 3D biểu diễn ảnh hưởng của nhiệt và nồng độ tới hiệu quả khử protein 50

DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Một số chỉ tiêu chất lượng của chitosan từ vỏ tôm sú theo phương pháp xử lý kiềm một giai đoạn 19

Bảng 2.1: Ma trận thí nghiệm tối ưu quá trình khử protein lần 1 với Alcalase 29

Bảng 2.2 Ma trận thí nghiệm nghiên cứu các nhân tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân Pepsin 30

Bảng 2.3: Ma trận thí nghiệm dự kiến 32

Bảng 3.1 Kết quả hàm lượng protein còn lại ở các chế độ khử protein bằng enzyme Alcalase 35

Bảng 3.2 Lựa chọn hàm cho mô hình 36

Bảng 3.3 Kết quả phân tích ANOVA 36

Bảng 3.4 Kết quả phân tích các chỉ số thống kê 37

Bảng 3.5: Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của các nhân tố đến công đoạn khử protein bằng enzyme Pepsin 41

Bảng 3.6: Kết quả đánh giá mức độ ảnh hưởng của các yếu tố 42

Bảng 3.7: Kết quả hàm lượng protein còn lại ở các chế độ khử protein bằng enzyme Pepsin - HCl 44

Bảng 3.8 Lựa chọn hàm cho mô hình 45

Bảng 3.9: Kết quả phân tích Anova 45

Bảng 3.10: Kết quả phân tích các chỉ số thống kê mô hình 2FI 46

LỜI MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Giáp xác là nguồn nguyên liệu thủy sản dồi dào chiếm 1/3 tổng sản lượng nguyên liệu thủy sản ở Việt Nam Trong công nghiệp chế biến thủy sản xuất khẩu,

tỷ lệ cơ cấu các mặt hàng đông lạnh từ giáp xác chiếm từ 70 – 80% công suất chế biến Hàng năm các nhà máy chế biến đã thải bỏ một lượng phế liệu giáp xác khá lớn khoảng 70.000 tấn/năm [1]

Nguồn phế liệu này là nguyên liệu quan trọng cho công nghiệp sản xuất chitin, chitosan, glucosamine và các sản phẩm khác Do vậy việc nghiên cứu và phát triển sản xuất các sản phẩm từ vỏ tôm là rất cần thiết nhằm nâng cao giá trị sử dụng phế liệu này và làm sạch môi trường

Theo điều tra ban đầu thì công nghệ sản xuất chitin – chitosan trong nước hiện nay chủ yếu theo phương pháp hóa học với việc sử dụng hóa chất có nồng độ cao, thời gian xử lý dài, không những ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm, mà còn gây ô nhiễm môi trường, khó khăn cho quá trình xử lý nước thải, đồng thời tốn chi phí cao Vì vậy, là xu thế mới hiện nay ứng dụng công nghệ sinh học trong sản xuất chitin, thay thế hóa chất bằng enzyme để giảm tối đa lượng hoá chất sử dụng, giảm ô nhiễm môi trường và nâng cao chất lượng sản phẩm

Ở Việt Nam trong những năm qua đã có rất nhiều đề tài nghiên cứu sử dụng enzyme protease vào công đoạn khử protein của quy trình sản xuất chitin-chitosan Tuy nhiên, kết quả nghiên cứu cho thấy khi sử dụng đơn lẻ một loại enzyme protease thì hiệu quả khử protein không cao, lượng enzyme sử dụng nhiều và vẫn phải dùng kết hợp với hóa chất Nếu kết hợp hai enzyme protease để khử protein có thể sẽ mang lại tác dụng tích cực hơn

Xuất phát từ thực tế trên, được sự đồng ý của Bộ môn Công nghệ Chế Khoa Chế biến -Trường Đại học Nha Trang, dưới sự hướng dẫn của cô Thạc sĩ Ngô

biến-Thị Hoài Dương, đề tài: “Nghiên cứu tối ưu hóa quá trình sản xuất Chitin từ vỏ tôm

thẻ chân trắng với sự kết hợp của Alkalase – Pepsin và HCl”đã được thực hiện

2 Mục đích của đề tài

Đề xuất quy trình sản xuất chitin từ vỏ tôm thẻ chân trắng (Penaeus

vannamei) với sự kết hợp của enzyme Alkalnase, enzyme Pepsin và HCl

3 Tính khoa học và thực tiễn của đề tài

Thành công của đề tài sẽ được áp dụng tại các cở sở sản xuất chitin với mục đích tận dụng triệt để nguồn protein từ phế liệu tôm, hạn chế sử dụng hóa chất nhằm giảm ô nhiễm môi trường, tạo ra sản phẩm có chất lượng cao và ứng dụng rộng rãi…Đề tài cũng là nguồn tài liệu hữu ích phục vụ cho công tác nghiên cứu chuyên sâu về lĩnh vực này

4 Nội dung của đề tài

- Tổng quan về công nghệ sản xuất chitin – chitosan

- Nghiên cứu ảnh hưởng của việc xử lý nhiệt sơ bộ nguyên liệu đến khả năng khử protein của Enzyme Alcalase

- Nghiên cứu quy trình sản xuất sản xuất chitin với sự kết hợp của Alcalase – Pepsin và HCl

- Đề xuất quy trình

- Sơ bộ đánh giá chất lượng sản phẩm thu được

PHẦN 1: TỔNG QUAN

1.1 TỔNG QUAN VỀ CHITIN

1.1.1 Cấu trúc và tính chất của chitin

a Sự tồn tại của Chitin trong tự nhiên

Chitin là một polysacharit tồn tại trong tự nhiên với sản lượng rất lớn (đứng thứ hai sau xellulose) Trong tự nhiên chitin tồn tại trong cả động vật và thực vật

Trong động vật, chitin là một thành phần cấu trúc quan trọng của các vỏ một

số động vật không xương sống như: côn trùng, nhuyễn thể, giáp xác và giun tròn Trong động vật bậc cao monome của chitin là một thành phần chủ yếu trong mô da

nó giúp cho sự tái tạo và gắn liền các vết thương ở da Trong thực vật chitin có ở thành tế bào nấm họ zygenmyctes, các sinh khối nấm mốc, một số loại tảo [2]

Chitin là polysacharit có đạm không độc, có khối lượng phân tử lớn Cấu trúc của chitin là tập hợp các monosacharit (N-acetyl- β-D-glucosamine) liên kết với nhau bởi các cầu nối glucozit và hình thành một mạng lưới các sợi có tổ chức Hơn nữa chitin tồn tại rất hiếm ở trạng thái tự do và hầu như luôn luôn nối bởi các cầu nối dặng trị (coralente) với các protein, CaCO3 và các hợp chất hữu cơ khác.[3]

Trong các loài thủy sản đặc biệt là trong vỏ tôm, cua, ghẹ, hàm lượng chitin chiếm khá cao dao động từ 14 – 35% so với trọng lượng khô Vì vậy, tôm, cua, ghẹ

là nguồn nguyên liệu chính để sản xuất chitin – chitosan.[3]

b Cấu trúc của chitin

Chitin là một polysaccharide mạch thẳng, nó có cấu trúc tuyến tính gồm các đơn vị N-acetyl-glucosamine nối với nhau nhờ cầu β-1,4glucoside

Công thức phân tử: (C8H13O5N)n

Phân tử lượng : M = (203,19)n

Trong đó n phụ thuộc vào nguồn gốc nguyên liệu:

Đối với tôm hùm : n = 700÷800

Đối với cua : n = 500÷600

Đối với tôm thẻ: n = 400÷500

Công thức cấu tạo của chitin được trình bày ở hình 1.1

Hình 1.1 Cấu tạo của Chitin

c Tính chất của chitin

Chitin có màu trắng, không tan trong nước, trong kiềm, trong acid loãng và các dung môi hữu cơ khác như ete, rượu Chitin hòa tan được trong dung dịch đậm đặc, nóng của muối thyoxyanat liti (LiSCN) và muối thyoxyanat canxi (Ca(SCN)2) tạo thành dung dịch keo, tan được trong hệ dimetylacetamid - LiCl 8%[4],tan trong hexafluoro –isopropul alcohol (CF3CHOHCF3) và hexafluoracetone sesquihydrate (CF3COCF3.H2O)[15] Chitin ổn định với chất oxy hóa như KMnO4, nước javen,

NaClO,…người ta lợi dụng tính chất này để khử màu cho chitin [3]

Chitin có khả năng hấp thụ tia hồng ngoại ở bước sóng 884÷890 µm

Chitin là một polysaccharide nguồn gốc tự nhiên, có hoạt tính sinh học cao,

có tính hòa hợp sinh học và tự phân hủy trên da Chitin bị enzyme lysozyme, một loại enzyme chỉ có ở cơ thể người, phân giải thành mono N-acetyl-D-glucosamine

Khi đun nóng chitin trong dung dịch NaOH đặc (40-50%), ở nhiệt độ cao thì chitin sẽ bị mất gốc acetyl tạo thành chitosan

Khi đun nóng chitin trong acid HCl đặc thì chitin sẽ bị thủy phân tạo thành Glucosamine và acid acetic

1.1.2 Ứng dụng của chitin – chitosan

a Trong y học, mỹ phẩm[3][6]

Dùng làm phụ gia trong kỹ nghệ bào chế dược phẩm:

Tá dược độn, tá dược chính, viên nang mềm, nang cứng…làm chất mang sinh học để gắn thuốc, tạo ra thuốc polymer tác dụng kéo dài, làm hoạt chất chính

để chữa bệnh như: Thuốc điều trị liền vết thương, vết phỏng, vết mổ vô trùng, thuốc

bổ dưỡng cơ thể: Hạ lipid và cholesterol máu, thuốc chữa bệnh đau dạ dày, tiểu đường, xưng khớp, viêm khớp, chống đông tụ máu, kháng nấm, kháng khuẩn, điều trị suy giảm miễn dịch, có khả năng hạn chế sự phát triển của tế bào u, tế bào ung thư và chống HIV

Dùng làm vật liệu y sinh: Da nhân tạo, màng sinh học, chất nền cho da nhân tạo, chỉ khâu phẫu thuật, mô cấy ghép…

Trong mỹ phẩm chitosan được bổ sung vào kem chống khô da, kem lột mặt

để tăng độ bám dính, tăng độ hòa hợp sinh học với da, chống tia cực tím…

b Trong công nghiệp thực phẩm[7]

Chitosan được xem như một phụ gia tạo độ cứng, tạo keo, phân lớp và khử axit của trái cây và đồ uống, tăng cường mùi vị tự nhiên hoặc tạo màng để bao gói thực phẩm, hoa quả, rau tươi

c Trong nông nghiệp[5], [3]

Dùng bảo quản hạt giống, tăng cường khả năng nảy mầm của hạt, tác nhân chống nấm, chống vi khuẩn gây bệnh cho môi trường xung quanh

Ngoài ra, chitosan còn dùng làm chất kích thích sinh trưởng cây trồng, thuốc chống bệnh đạo ôn, khô vằn cho lúa

d Ứng dụng trong sinh học

Làm giá thể hoạt hóa cho công nghệ cố định enzyme và các tế bào vi sinh vật, làm chất mang sử dụng trong sắc ký chọn lọc, màng lọc sinh học, tổng hợp polymer sinh học

e Ứng dụng trong các ngành công nghiệp khác

• Trong công nghiệp dệt

Chitosan được dùng để hồ vải: cố định hình in hoa, ưu điểm có thể thay thế được hồ tinh bột bằng chitosan làm cho vải hoa, ti, sợi bền chịu được cọ xát, bề mặt đẹp, bền trong kiềm

Làm vải chịu nước, không bắt lửa: Hòa tan chitosan trong dung dịch acid acetic loãng cùng với axetat nhôm và axit stearic thu được hỗn hợp Hỗn hợp này đem sơn lên vải, khi khô tạo thành màng mỏng, chắc, bền, chịu nước và không bắt lửa Vải này được sử dụng để sản xuất đồ bảo hộ lao động

Làm sợi Chitin: Ngâm chitosan trong dung dịch Na2SO4 bão hòa rồi đem kéo sợi, rửa trong nước ở nhiệt độ cao thu được giống sợi gai Đem sợi này trộn với sợi cellulose tỷ lệ 30% thu được sợi Chitin-cellulose Khả năng bắt màu thuốc nhuộm càng tăng khi ta tăng hệ sợi chitin

• Trong công nghiệp giấy

Chitosan có tác dụng làm tăng độ bền của giấy, chỉ cần thêm trọng lượng bằng 1% trọng lượng của giấy thì sẽ làm tăng gấp đôi độ bền của giấy khi ẩm ướt, tăng độ nét khi in Các loại giấy này dùng làm giấy vệ sinh, giấy in, túi giấy

1.2 TỔNG QUAN VỀ PHẾ LIỆU TÔM

1.2.1 Tỷ lệ thu hồi phế liệu tôm

Ở Việt Nam nguồn nguyên liệu tôm là rất dồi dào, được thu từ 2 nguồn chính là đánh bắt tự nhiên và nuôi trồng Đặc biệt, nuôi tôm đã phát triển mạnh trong những năm gần đây và trở thành ngành kinh tế mũi nhọn Diện tích nuôi tôm

đã tăng từ 250.000 ha năm 2000 lên đến 478.000 ha năm 2001 và 540.000 ha năm

2003, năm 2012 diện tích nuôi tôm của nước ta xấp xỉ khoảng 640.000 ha

Năm 2002, giá trị xuất khẩu thuỷ sản đạt hơn 2 tỷ USD, trong đó xuất khẩu tôm đông lạnh xấp xỉ 0.95 tỷ USD, chiếm 47% tổng kim ngạch Năm 2004, xuất

khẩu thuỷ sản đạt giá trị 2,4 tỷ USD, chiếm 8,9% tổng giá trị xuất khẩu cả nước trong đó tôm đông lạnh chiếm 53% tổng giá trị xuất khẩu thuỷ sản Năm 2006 kim ngạch xuất khẩu thủy sản đã qua mốc 3 tỷ đạt 3,36 tỷ USD, tăng gần 600 triệu USD

so với năm 2005, trong đó mặt hàng tôm truyền thống chiếm vị trí đầu bảng xấp xỉ 1,5 tỷ USD, chiếm 44,3% tổng kim ngạch xuất khẩu Tính đến hết năm 2011 xuất khẩu tôm của Việt Nam đã thu về gần 2,4 tỷ USD, trong đó, tôm sú đạt hơn 1,4 tỷ USD và tôm chân trắng đạt hơn 700 triệu USD

Phế liệu tôm (PLT) từ các cơ sở chế biến tôm bao gồm đầu, vỏ và đuôi tôm Theo thống kê Trung tâm Nghiên cứu Chế biến Thủy sản, Đại học Thủy sản thì lượng phế liệu năm 2004 tại Việt Nam ước tính khoảng 45.000 tấn, năm 2005 ước tính khoảng 70.000 tấn Hiện nay, khai thác lượng phế liệu này đang là vấn đề

mà các cở sở chế biến tôm chú ý tới bên cạnh việc giảm phế liệu từ các khâu chế biến như một cách giúp tăng lợi nhuận cho chính các cơ sở đó

Tuỳ thuộc vào loài và phương pháp xử lý mà lượng phế liệu này nhiều hay ít Nhiều công trình nghiên cứu cho thấy tỷ lệ của phế liệu tôm chiếm từ 30-70% (Watkin và cộng sự, 1982; Evers và Carroll [16]) so với khối lượng tôm chưa chế biến Halanda và Netto (2006) cho rằng phế liệu tôm có thể chiếm 50-70% so với nguyên liệu [17] Đối với tôm thẻ, lượng phế liệu đầu tôm chiếm 28% và vỏ chiếm 9%, và tổng lượng phế liệu vỏ đầu tôm thẻ là 37% [3] Như vậy, việc chế biến tôm nguyên liệu sẽ thải ra một lượng phế liệu rất lớn, cần nghiên cứu sử dụng phế liệu tôm để sản xuất các chế phẩm có giá trị trong đó quan trọng nhất là sản xuất chitin-chitosan

1.2.2 Cấu tạo và thành phần sinh hóa của vỏ tôm [3]

Lớp ngoài cùng của vỏ tôm có cấu trúc chitin-protein bao phủ, lớp vỏ này thường bị hóa cứng khắp bề mặt cơ thể do sự lắng đọng của muối canxi và các chất hữu cơ khác nằm dưới dạng phức tạp do sự tương tác giữa protein và các chất không hòa tan

Vỏ chia làm 4 lớp chính đó là lớp biểu bì, lớp màu, lớp canxi và lớp không bị canxi hóa

là con đường cho caxi thẩm thấu vào

- Lớp biểu bì: những nghiên cứu cho thấy lớp màng nhanh chóng bị biến đỏ bởi Fucxin, có điểm pH = 5.1 không chứa chitin Nó khác với các lớp vỏ còn lại, bắt màu xanh với anilin xanh Lớp biểu bì có lipid vì vậy nó cản trở tác động của acid ở nhiệt độ thường hơn các lớp bên trong Màu của lớp này thường vàng rất nhạt

- Lớp canxi hóa: Lớp này chiếm phần lớn lớp vỏ, thường có màu xanh trải đều khắp

- Lớp không bị canxi hóa: Vùng trong cùng của lớp vỏ được tạo bởi một phần tương đối nhỏ so với tổng chiều dày bao gồm các phức chitin – protein bền vững không có canxi và puinone

1.2.3 Thành phần sinh hoá của vỏ tôm

Protein: Thành phần protein trong phế liệu tôm thường tồn tại ở hai dạng Dạng tự do: Dạng này là phần thịt tôm từ một số tôm bị biến đổi được vứt lẫn vào phế liệu hoặc phần thịt còn sót lại trong đầu và nội tạng của đầu tôm Nếu công nhân vặt đầu không đúng kỹ thuật thì phần protein bị tổn thất vào phế liệu nhiều làm tăng định mức tiêu hao nguyên vật liệu, mặt khác phế liệu khó xử lý hơn

Dạng phức tạp: Ở dạng này protein không hòa tan và thường liên kết với chitin, Canxi Carbonate, với lipid tạo lipoprotein, với sắc tố tạo proteincarotenoit…như một phần thống nhất quyết định tính bền vững của vỏ tôm

Chitin: Tồn tại dưới dạng liên kết bởi những liên kết đồng hóa trị với các protein dưới dạng phức hợp chitin-protein, liên kết với các hợp chất khoáng và các hợp chất hữu cơ khác gây khó khăn cho việc tách và chiết chúng

Canxi: Trong vỏ, đầu tôm, vỏ ghẹ có chứa một lượng lớn muối vô cơ, chủ yếu là muối CaCO3

1.3 CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT CHITIN

1.3.1 Giới thiệu công nghệ sản xuất chitin

Chitin phân bố rộng rãi trong tự nhiên nhưng nó không được tìm thấy ở dạng tinh khiết Chitin ở trạng thái tự nhiên thì liên kết với protein, lipid, sắc tố và canxi

Vì vậy, cần phải có công nghệ thu hồi và làm sạch chitin trước khi sử dụng cho bất

kỳ mục đích thương mại nào Phương pháp dùng để phân tách và tinh sạch chitin phải đảm bảo lấy đi khoáng và tận dụng được các hợp chất có giá trị khác Cho đến nay đã có nhiều phương pháp được áp dụng cho việc thu hồi chitin từ vỏ giáp xác, chúng đều có chung đặc điểm là gồm hai bước công nghệ chính: khử khoáng và khử protein

Tuy nhiên tùy theo đặc điểm của nguyên liệu ban đầu, trình độ công nghệ và mục đích sử dụng, có thể sử dụng các tác nhân khác nhau để tiến hành khử khoáng

và khử protein Các tác nhân hay được sử dụng bao gồm:

- Khử khoáng: Loại bỏ khoáng bằng acid hoặc là một tác nhân tạo phức

- Khử protein: Tách protein bằng kiềm hoặc một enzyme protease

Hai bước này có thể đổi vị trí cho nhau phụ thuộc vào phương pháp thu hồi protein, carotenoid và mục đích sử dụng chitin Để thu hồi protein thì nên thực hiện bước khử protein trước Khi đó, sản lượng protein và chất lượng là cao nhất Sau quá trình khử khoáng và khử protein, sản phẩm chitin có thể được tẩy màu bằng acetone hoặc hydrogen peroxide Bước này là không bắt buộc và phụ thuộc vào yêu cầu của sản phẩm cuối cùng Dựa vào đặc điểm của tác nhân được sử dụng để khử khoáng và protein, công nghệ sản xuất chitin được chia thành hai phương pháp chính để sản xuất chitin: phương pháp hóa học và phương pháp sinh học

Phương pháp hóa học:

Các yếu tố ảnh hưởng tới công đoạn khử khoáng thông thường là:

Nồng độ acid: Nồng độ acid quá thấp sẽ không khử được hết khoáng dẫn đến sản phẩm còn nhiều tạp chất Nồng độ quá cao sẽ gây đứt mạch chitin, giảm chất lượng sản phẩm

Tỉ lệ acid/nguyên liệu: Nếu quá nhỏ thì sẽ không khử hết khoáng, nếu quá lớn sẽ ảnh hưởng xấu đối với mạch, tốn chi phí

Nhiệt độ, thời gian xử lí: hai yếu tố này cũng rất quan trọng, ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm Nếu thời gian xử lý dài và nhiệt độ cao thì sản phẩm bị nát sẽ rất khó xử lí sau này, đồng thời sẽ ảnh hưởng tới độ nhớt của sản phẩm sau này Nếu nhiệt độ thấp và thời gian xử lí ngắn thì khoáng sẽ không bị loại triệt để

Thông thường khi tiến hành ở nhiệt độ cao thì thời gian phải ngắn nếu có điều kiện ta có thể xử lý ở nhiệt độ thấp thời gian dài thì chất lượng sẽ tốt hơn.[3]

Trong quá trình khử protein người ta sử dụng hóa chất như NaOH, KOH,

NA2CO3 tuy nhiên NaOH được sử dụng nhiều nhất Dưới tác dụng của kiềm đặc

và nhiệt độ, protein bị thủy phân mạnh mẽ tạo thành acid amin và peptid, tách ra khỏi vỏ tôm, đồng thời quá trình deacytel cũng xảy ra mạnh mẽ Với việc sử dụng hóa chất nhiều sẽ cho hiệu quả khử protein cao nhưng chất lượng chitin không tốt, bên cạnh đó ảnh hưởng lớn đến môi trường.[3]

Phương pháp sinh học: Trong phương pháp sinh học người ta không sử dụng hóa chất để khử khoáng và khử protein Để khử khoáng có thể len men lactic hoặc ủ xilo, còn ở công đoạn khử protein có thể sử dụng hệ vi khuẩn, nấm men hoặc các enzyme để loại bỏ protein

- Việc sử dụng phương pháp sinh học cũng gặp phải rất nhiều khó khăn như giá thành sản phẩm có thể sẽ cao tuỳ thuộc vào loại enzyme sử dụng, hơn nữa thời gian của phương pháp này dài Vì vậy, người ta có thể kết hợp hai phương

Tóm lại, muốn sản phẩm chitin có chất lượng tốt thì chúng ta phải áp dụng phương pháp xử lý phù hợp như việc sử dụng enzyme

1.3.2 Tình hình nghiên cứu sản xuất chitin trên thế giới và ở Việt Nam

Việc nghiên cứu về dạng tồn tại, cấu trúc, tính chất lý hóa ứng dụng của Chitin - Chitosan đã được công bố từ những năm 30 của thế kỷ XX Những nước

đã thành công trong lĩnh vực nghiên cứu sản xuất chitosan đó là: Nhật, Mỹ, Trung Quốc, Ấn Độ, Pháp

Cho đến nay trên thế giới đã có nhiều quy trình sản xuất chitin-chitosan, với nhiều nguồn nguyên liệu khác nhau nhưng chủ yếu là vỏ tôm, cua, ghẹ

1.3.2.1 Sản xuất chitin, chitosan theo phương pháp hóa học

a Quy trình của Steven

Hình 1.2 Quy trình của Stevens (2002) Học Viện Công Nghệ Châu Á[3]

Kiểm tra hàm lượng khoáng

Chitin

Phế liệu tôm tươi

Khử protein (NaOH 4%, t = 24 giờ)

Kiểm tra hàm lượng protein

Khử khoáng (HCl 4%, t=24 giờ, to=30oC)

Cao hơn 1%

Cao hơn 1%

b Quy trình sản xuất Chitosan từ vỏ tôm hùm của Hackman

Hình 1.3 Quy trình sản xuất chitosan từ vỏ tôm hùm của Hackman[3]

NaOH 1M

to = 100oC t= 42h

w/v =

NaOH 1M

To = 100oC T= 12h

Nhận xét: Quy trình này gồm nhiều công đoạn, thời gian sản xuất kéo dài 65

giờ nên chỉ có ý nghĩa trong công tác nghiên cứu thí nghiệm vì khi đưa ra sản xuất đại trà thì thiết bị cồng kềnh, tốn kém, hóa chất đắt tiền, dễ hao hụt khi sản xuất

c Quy trình thủy nhiệt của Yamashaki và Nakamichi (Nhật Bản)

HCl 2M

to=120oC t= 1h Khử chất vô cơ

1.3.2.2 Sản xuất chitin, chitosan theo phương pháp hóa học cải tiến

a Quy trình sản xuất của Pháp

HCl 1N

to phòng

t = 2h w/v = 1/10

NaOCl 0,135%

to phòng

t = 6 phút w/v = 1/10 Rửa trung tính

Deacetyl chitin

NaOH 40%

to = 85oC

t = 4hw/v = 1/4 Rửa trung tính

Chitosan

Vỏ tôm

Hấp chín, phơi khô

Xay nhỏ Tách protein

Rửa trung tính

Ngâm HCl

Ngâm aceton To phòng T = 30 phút

w/v = 1/5 Ngâm NaOCl

Ưu điểm: Quy trình sản xuất này rút ngắn được thời gian sản xuất rất nhiều

Sản phẩm thu được rất sạch có màu trắng đẹp do đã khử được sắc tố triệt để

Nhược điểm: Do NaOCl là một chất oxy hóa mạnh nên ảnh hưởng đến mạch

polymer làm cho độ nhớt của sản phẩm giảm một cách rõ rệt Mặt khác, aceton rất đắt tiền, tổn thất nhiều, giá thành sản phẩm cao

Hiện nay ở Việt Nam cũng có nhiều cơ sở khoa học đang nghiên cứu sản xuất chitin - chitosan như: Trường Đại Học Nông Lâm - thành phố Hồ Chí Minh; Trung tâm nghiên cứu polyme - Viện Khoa Học Việt Nam; Viện Hoá thuộc phân Viện Khoa Học Việt Nam tại thành phố Hồ Chí Minh; Trung tâm công nghệ và sinh học Thuỷ sản - Viện nghiên cứu nuôi trồng Thuỷ sản 2 Năm 1978 trường Đại học Thủy sản bắt đầu nghiên cứu tách chiết Chitin-Chitosan do Đỗ Minh Phụng thực hiện:

b Quy trình của Đỗ Minh Phụng, trường Đại học Thủy Sản

Hình 1.6 Quy trình của Đỗ Minh Phụng, trường Đại học Thủy Sản[3]

NaOH 8%

to = 100oC

t = 2h w/v = 1/2,5

Tẩy màu Chitin Nấu trong NaOH

NaOH 40%

to = 80oC

t = 24h w/v = 1/1

Nhận xét : Chitin thu được có độ trắng cao mặc dù không có công đoạn tẩy

màu Tuy nhiên, lại có nhược điểm là thời gian sản xuất kéo dài, tiêu tốn nhân công, nồng độ hóa chất sử dụng cao kết hợp với thời gian sử lý dài (công đoạn khử khoáng) làm cắt mạch polymer trong môi trường acid dẫn đến độ nhớt giảm

c Quy trình sản xuất chitosan ở Trung tâm cao phân tử thuộc Viện khoa học Việt Nam

Hình 1.7 Quy trình sản xuất Chitosan ở Trung tâm cao phân tử thuộc Viện

khoa học Việt Nam[3]

Ngâm HCl Rửa trung tính Nấu trong NaOH Rửa trung tính Ngâm HCl

Nhận xét: Sản phẩm chitosan sản xuất theo quy trình này có màu sắc không

đẹp bằng sản phẩm theo quy trình của Đỗ Minh Phụng, thời gian thực hiện lại kéo dài, nhiều công đoạn

d Quy trình sản xuất Chitosan từ vỏ tôm Sú bằng phương pháp hóa học với một công đoạn xử lý kiềm (Trần Thị Luyến)

Hình 1.8 Quy trình sản xuất Chitosan từ vỏ tôm Sú bằng phương pháp hóa

học với một công đoạn xử lý kiềm[3]

Nhận xét: Phương pháp xử lý kiềm một giai đoạn cho sản phẩm chitosan có

chất lượng không thua kém so với quy trình thông thường với hai giai đoạn xử lý kiềm tổng thời gian cần thiết giảm rất nhiều và như vậy nếu so về mặt kinh tế thị đây là phương pháp tốt hơn hẳn Tuy nhiên phương pháp này vẫn còn nhược điểm

là dung dịch NaOH đặc sau khi deacetyl có màu sẫm gây khó khăn cho việc tái sử

HCl 10%

to phòng t= 5hw/v = 1/5

NaOH 40%

to = 80±2oC

t = 5h w/v = 1/10 Rửa trung tính

Chitosan

dụng Theo quy trình công nghệ này sản phẩm chitosan đạt được có các chỉ tiêu chất lượng như bảng 1.1

Bảng 1.1 Một số chỉ tiêu chất lượng của chitosan từ vỏ tôm sú theo phương

pháp xử lý kiềm một giai đoạn[3]

e Quy trình của Trung tâm Chế biến Đại học Thủy sản

Quy trình của trung tâm chế biến có ưu điểm là đơn giản, không đòi hỏi máy móc thiết bị phức tạp Do đó rất dễ dàng để sản xuất lớn Tuy nhiên thời gian sản xuất kéo dài và nồng độ hóa chất sử dụng còn khá cao, vẫn chưa có hướng xử lý nước thải từ quá trình sản xuất

NaOH 6%

v/w=5/1

To phòng T=24h Rửa trung tính

NaOH 40%

v/w10/1

To=80oC T=6,5h Deacetyl hóa

Ngâm rửa trung tính

Phơi, sấy

Chitosan

1.3.2.3 Sản xuất chitin, chitosan theo phương pháp sử dụng enzyme

a Quy trình sản xuất chitin của Holanda và Netto[18]

Hình 1.10 Quy trình sản xuất chitin của Holanda và Netto (2006)

Ưu điểm: Quy trình này rút ngắn được thời gian sản xuất rất nhiều Sản phẩm

Chitin thu được có chất lượng khá tốt, màu trắng đẹp do đã khử được sắc tố trong công đoạn chiết astaxanthin Ngoài ra còn tận thu được protein và astaxanthin mang lại hiệu quả kinh tế cao, đồng thời giảm thiểu đáng kể lượng hóa chất sử dụng

Nhược điểm: Enzyme đắt tiền dẫn đến chi phí giá thành sản phẩm cao

Sấy lạnh Khử khoáng HCl 2,5%, 2h, to

b Quy trình sử dụng Enzyme papain để sản xuất chitosan (Trần Thị Luyến, 2003)[8]

Hình 1.11 Quy trình sử dụng Enzyme papain để sản xuất chitosan[3]

HCl 10%

To phòng

T = 5h w/v = 1/5

Rửa sạch

Làm khô Deacetyl Rửa trung tính Rửa trung tính Chitosan Chitin

Nhận xét : Quy trình sử dụng papain để khử protein cho cho sản phẩm có độ

nhớt cao hơn các quy trình khác Đặc biệt độ deacetyl, độ tan và hiệu suất của quy trình có ưu thế hơn hẳn Nhưng để nâng cao chất lượng của chitosan có thể sử dụng enzyme papain thay thế cho NaOH để khử protein trong vỏ tôm Đặc biệt dịch thủy phân thu được sử dụng cho các mục đích thu hồi protein và tận dụng, điều đó chắc chắn mang lại hiệu quả cao Tuy nhiên, cần nghiên cứu quy trình xử lý tận dụng dịch thủy phân này Cần tiếp tục nghiên cứu và sản xuất enzyme deacetylase để thay thế hoàn toàn cho NaOH đặc trong công đoạn deacetyl

1.4 Tổng quan về enzyme protease

1.4.1 Phân loại protease

Protease được chia làm 2 loại: Endopeptidase và exopeptidase

- Dựa vào vị trí tác động trên mạch polypeptide, exopeptidase được chia thành 2 loại:

+ Aminopeptidase: Xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu N tự do của chuỗi polypeptide để giải phóng ra một amino acid, một dipeptide hoặc tripeptide

+ Carboxypeptidase: Xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu C của chuỗi polypeptide và giải phóng ra một amino acid hoặc một dipeptide

- Dựa vào động học của cơ chế xúc tác endopeptidase được chia thành 4 nhóm: + Serin proteinase: là những proteinase chứa nhóm –OH của gốc serine trong trung tâm hoạt động và có vai trò đặc biệt quan trọng đối với hoạt động xúc tác của enzyme Nhóm này thường hoạt động mạnh ở vùng kiềm tính và thể hiện tính đặc hiệu cơ chất tương đối rộng

+ Cysteine proteinase: là những proteinase chứa nhóm –SH trong trung tâm hoạt động Cysteine proteinase bao gồm các proteinase thực vật như Papain, Bromelin, một vài protein động vật và proteinase ký sinh trùng Nhóm này thường hoạt động ở pH trung tính, có tính đặc hiệu cơ chất rộng

+ Aspartic proteinase: Hầu hết các aspartic proteinase thuộc nhóm pepsin Các aspartic proteinase có chứa nhóm cacboxyl trong trung tâm hoạt động và thường hoạt động ở pH trung tính

+ Metallo proteinase: là nhóm được tìm thấy ở vi khuẩn, nấm mốc cũng như các vi sinh vật bậc cao khác Các metallo proteinase thường hoạt động ở vùng pH trung tính và hoạt độ giảm mạnh dưới tác dụng của EDTA

Ngoài ra, protease được phân loại một cách đơn giản thành 3 nhóm:

- Nguồn thực vật

Có 3 loại protease thực vật: Bromelin, Papain và Ficin Papain thu được

từ nhựa của lá, than, quả đu đủ Còn Bromelin thu từ quả, chồi dứa, vỏ dứa Các enzyme này sử dụng để chống lại hiện tượng tủa trắng của bia khi làm lạnh do kết tủa protein

+ Chủ động về nguyên liệu nuôi cấy vi sinh vật và giống vi sinh vật

+ Chu kỳ sinh trưởng của vi sinh vật ngắn

+ Có thể điều khiển sinh tổng hợp enzyme dễ dàng theo hướng có lợi…

1.4.3 Một số loại protese thường dùng

- Enzyme Alcalase: Đây là enzyme được phân tách và tinh sạch từ nguồn vi sinh vật, sử dụng enzyme Alcalase cho phép điều chỉnh dễ dàng độ thủy phân, tính toán được lượng base yêu cầu để duy trì pH không đổi trong suốt quá trình thủy phân Chọn enzyme này cũng dựa trên đặc trưng của nó cho khả năng không hút nước của các amino acid vào giai đoạn cuối, dẫn đến sản phẩm thủy phân không có

vị đắng (Adler-Nissen, 1986), đồng thời sản phẩm có sự cân bằng tốt các amino acid thiết yếu (Kristinsson và Rasco, 2000)

Điều kiện hoạt động tối ưu cho enzyme Alcalase AF 2.4 L: pH = 8

Hoạt độ: 800 ÷ 2500 Units/mg protein

Enzyme Pepsin bị bất hoạt trong 15 phút ở 85oC (1850F) hoặc pH > 4 hoặc chất ức chế pepstatin

Nhiệt độ 35-37oC

Hiện nay, việc nghiên cứu tách chiết Chitin từ vỏ tôm bằng các phương pháp sinh học đang được thử nghiệm rộng rãi và đem lại hiệu quả cao Tuy nhiên, qua các kết quả nguyên cứu thì hiệu suất khử protein khi sử dụng 1 loại enzyme là chưa cao, thời gian xử lý dài…Chính vì vậy cần nghiên cứu sử dụng kết hợp hai loại enzyme vào quy trình sản xuất để thu được hiệu quả cao hơn Đây đang là một hướng đi mới, tích cực góp phần sử dụng triệt để phế liệu tôm, cho ra sản phẩm chitin có chất lượng cao, góp phần bảo vệ sinh thái môi trường…

NGHIÊN CỨU

2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU

2.1.1 Nguyên liệu vỏ tôm

Vỏ tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei) được chọn là đối tượng nghiên

cứu Vỏ tôm được lấy từ phần nguyên liệu còn lại của quy trình chế biến tôm thẻ chân trắng tại Công ty Cổ phần Nha Trang Seafoods (F17), Khánh Hòa

2.1.2 Enzyme Protease

1 Enzyme Alcalase: được mua tại công ty Novozyme, Tp Hồ Chí Minh Hoạt tính 2,4 AU-A/g

Nhiệt độ bảo quản là 50C(410F)

2 Enzyme Pepsin: Enzyme Pepsin sử dụng trong quá trình thí nghiệm là sản phẩm của hãng Merck

2.1.3 Hóa chất

Các hóa chất được sử dụng trong ngiên cứu đều thuộc loại tinh khiết

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Phương pháp thu nhận mẫu

Nguyên liệu vỏ tôm được thu tại phân xưởng chế biến, Công ty Cổ phần Nha Trang Seafoods (F17) Yêu cầu nguyên liệu phải tươi, không có mùi lạ, không bị biến đỏ, không lẫn tạp chất Nguyên liệu sau khi lấy cho ngay vào thùng xốp cách nhiệt và vận chuyển ngay về phòng thí nghiệm Nguyên liệu được ép tách nước sơ

bộ, loại bỏ tạp và tiến hành làm thí nghiệm ngay Trong trường hợp chưa làm ngay thì rửa sạch, cân cho vào túi polyme (mỗi túi 1 kg), bảo quản đông ở điều kiện nhiệt độ -200C

2.2.2 Bố trí thí nghiệm

Phương pháp bố trí thí nghiệm: sử dụng phương pháp qui hoạch thực nghiệm

2.2.2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát

Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát được trình bày ở hình 2.1 Tiến trình nghiên cứu đề xuất qui trình sản xuất công nghệ sản xuất chitin-chitosan có sự kết hợp của

Alcalase, Pepsin và HCl được bắt đầu từ thí nghiệm nghiên cứu tối ưu chế độ khử protein lần 1 bằng Alcalase trong môi trường có pH tự nhiên với tỷ lệ E/S trong miền nghiên cứu được trình bày ở hình 2.1 Sau khi phân tích kết quả tối ưu sẽ chọn được thời gian, tỷ lệ E/S, nhiệt độ thích hợp để tiến hành công đoạn xử lý tiếp theo với Pepsin và HCl Mẫu sau khi xử lý tại chế độ khử protein với Alcalae sẽ được lọc tách riêng phần dịch và phần bã tiếp tục được khử khoáng bằng acid HCl trong 2h và tiếp đó khử protein lần 2 bằng enzyme Pepsin trong môi trường HCl Tiến hành thí nghiệm tối ưu quá trình khử protein lần 2 với Pepsin để chọn được chế độ tối ưu (nồng độ, thời gian xử lý), mẫu sau đó rửa sạch và thu được Chitin

Hàm mục tiêu cho quá trình tối ưu công đoạn khử protein là hiệu quả khử protein,bên cạnh đó hiệu quả khử khoáng cũng được xác định để có thêm dữ liệu lựa chọn chế độ xử lý

Hình 2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát

Tỉ lệ E/NL: 0,05÷0,25% Thời gian: 6÷10h

Rửa Rửa Đánh giá ảnh hưởng của xử lý nhiệt

Vỏ tôm được rã đông trước khi tiến hành

Cân 100g vỏ tôm cho vào bình tam giác 500ml, bổ sung nước với tỷ lệ 1/4 Sau đó tiến hành gia nhiệt mẫu cách thủy trên bếp điện, thời gian gia nhiệt 20 phút nhiệt độ trong bình khoảng 85-900C Sau khi gia nhiệt mẫu được bổ sung enzyme Alcalase rồi đem đi thủy phân ở nhiệt độ 600C trong 8h

Tuy nhiên, để đánh giá chính xác ảnh hưởng của xử lý nhiệt, các thí nghiệm đối chứng được tiến hành song song (Thí nghiệm 2,3,4 trên sơ đồ hình 2.2)

2.2.2.3 Thí nghiệm xác định chế độ khử protein tối ưu bằng enzyme Alcalase

Mục đích của quá trình tối ưu là chọn một chế độ công nghệ thích hợp cho quá trình loại bỏ protein từ đầu tôm bằng enzyme Alcalase sao cho hàm lượng protein khử được là tốt nhất

Phân tích ảnh hưởng của các yếu tố đến quá trình thủy phân, qua các thí nghiệm thăm dò và kế thừa kết quả nghiên cứu trước đây, đề tài chọn các yếu tố cố định như sau:

Vỏ tôm

Tỷ lệ nguyên liệu/nước: 1/4 pH: tự nhiên

Thời gian: 20 phút Nhiệt độ biến thiên theo thời gian( 5 phút: 700C, 10 phút:

800C, 15 phút: 850C)

Không sử dụng enzyme Alkalase

Khử protein

bằng enzyme

Alkalase

Khử protein bằng enzyme Alkalase

Không sử dụng enzyme Alkalase

- pH = 7-8

- Tỷ lệ nguyên liệu / nước là 1:4

- Các thông số nghiên cứu gồm: tỷ lệ bổ sung enzyme, nhiệt độ và thời gian thủy phân Sử dụng phương pháp mặt đáp ứng với mô hình Box-Behnken để tìm giá trị tối ưu

Các thông số cần tối ưu là:

- Nồng độ enzyme trong khoảng: [0,1%-0,3%]

- Nhiệt độ thủy phân trong khoảng: [50oC-70oC]

- Thời gian thủy phân trong khoảng: [4h-10h]

Hàm mục tiêu là: Hiệu quả khử protein là cao nhất (Y) → Max

Ma trận thí nghiệm được trình bày ở bảng 2.1

Bảng 2.1: Ma trận thí nghiệm tối ưu quá trình khử protein lần 1 với Alcalase

2.2.2.4 Thí nghiệm xác định chế độ khử protein tối ưu bằng enzyme Pepsin

N U1(nồng độ %) U2(nhiệt độ) U3(thời gian) X1 X2 X3 Y(%)