khảo sát khả năng sinh trưởng của một số chủng nấm men và ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy tới tính chất bề mặt của tế bào nấm men

Xác định lượng sterol trong màng tế bào được nuôi cấy trên các môi trường khác nhau ..... LỜI MỞ ĐẦU Khả năng sinh trưởng và phát triển của nấm men chịu ảnh hưởng của nhiều yếu tố như n

LỜI CẢM ƠN

Em xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành và lòng biết ơn sâu sắc đến:

Các Thầy Cô giáo trong viện Công Nghệ Sinh Học và Môi Trường cũng như toàn thể các Thầy Cô đã dạy em trong suốt thời gian học tập tại trường và đặc biệt

là TS Tạ Thị Minh Ngọc, người đã tận tình hướng dẫn để em có thể hoàn thành

một cách tốt nhất đồ án tốt nghiệp này

Các Thầy Cô giáo, anh chị đang công tác tại Trung tâm thí nghiệm thực hành, Trường Đại học Nha Trang đã nhiệt tình hướng dẫn và giúp đỡ em, tạo điều kiện thuận lợi cho em trong thời gian làm nghiên cứu

Cảm ơn gia đình và bạn bè những người đã luôn bên cạnh cổ vũ động viên em trong suốt bốn năm học tập và nghiên cứu tại trường Đại học Nha Trang

Nha Trang, tháng 7 năm 2012 Sinh viên thực hiện

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

MỤC LỤC ii

DANH MỤC CÁC BẢNG v

DANH MỤC HÌNH vi

KÝ HIỆU CÁC CỤM TỪ VIẾT TẮT vii

LỜI MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG I TỔNG QUAN 2

1.1 Tổng quan về nấm men 2

1.1.1 Đặc điểm phân bố 2

1.1.2 Đặc điểm về hình dạng và kích thước của nấm men 2

1.1.3 Đặc điểm dinh dưỡng của nấm men 2

1.1.3.1 Nguồn cacbon 2

1.1.3.2 Nguồn nitơ 3

1.1.3.3 Dinh dưỡng các nguyên tố vô cơ 3

1.2 Màng tế bào 4

1.2.1 Đặc điểm, cấu trúc của màng 4

1.2.1.1.Lipid màng 5

1.2.1.2 Protein màng 6

1.2.1.3 Glucide 6

1.2.2 Phương thức vận chuyển chất qua màng 7

1.2.2.1 Vận chuyển thụ động (passive transport) 7

1.2.2.2.Vận chuyển chủ động (active transport) 8

1.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng của nấm men 11

1.3.1 Ảnh hưởng của nguồn cacbon 11

1.3.2 Ảnh hưởng của nguồn nitơ 11

1.3.3 Ảnh hưởng của nguyên tố khoáng 12

1.3.4 Ảnh hưởng của oxy 12

1.3.5 Ảnh hưởng của nhiệt độ 12

1.3.6 Ảnh hưởng của pH môi trường 13

1.4 Giới thiệu về các chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae và Yarrowia lipolytica 13

1.4.1 Saccharomyces cerevisiae 13

1.4.1.1 Một số đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa của S cerevisiae 13

1.4.2 Yarrowia lipolytica 14

1.4.2.1 Một số đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa của Y lipolytica 14

1.4.2.2 Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến quá trình sinh trưởng của Y lipolytica 15

1.5 β-carotene 16

CHƯƠNG II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18

2.1 Đối tượng – vật liệu 18

2.1.1 Đối tượng 18

2.1.2 Vật liệu 18

2.1.2.1 Thiết bị 18

2.1.2.2 Hóa chất 18

2.1.3 Môi trường nuôi cấy vi sinh vật 19

2.1.3.1 Môi trường hoạt hóa, giữ giống 19

2.1.3.2 Môi trường quan sát đặc điểm khuẩn lạc ở các nhiệt độ nuôi cấy khác nhau 19

2.1.3.3 Môi trường nuôi cấy khảo sát đường cong sinh trưởng của nấm men 21

2.2 Các phương pháp nghiên cứu 21

2.2.1 Phương pháp giữ giống, cấy chuyền 21

2.2.2 Một số phương pháp nghiên cứu đặc điểm sinh học của nấm men 21

2.2.2.1 Phương pháp quan sát đặc điểm khuẩn lạc 21

2.2.2.2 Phương pháp làm tiêu bản tế bào sống 21

2.2.3 Phương pháp nghiên cứu đặc điểm khuẩn lạc trên các điều kiện nuôi cấy

khác nhau 22

2.2.4 Xây dựng đường cong sinh trưởng trên các môi trường khác nhau 22

2.2.5 Phương pháp xác định lượng sterol trong màng tế bào 22

2.2.6 Phương pháp xác định tính thấm của màng tế bào nấm men đối với chất kỵ nước β-carotene trên các điều kiện nuôi cấy được lựa chọn 23

CHƯƠNG III: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 24

3.1 Kết quả nghiên cứu: 24

3.1.1 Quan sát đặc điểm hình thái của chủng nấm men 24

3.1.1.1 Chủng nấm men Y lipolytica 24

3.1.1.2 Chủng nấm men S cerevisiae 27

3.1.2 Khảo sát khả năng sinh trưởng trên các môi trường khác nhau 28

3.1.2.1 Chủng Y lipolytica W29 28

3.1.2.2 Chủng S cerevisiae 29

3.1.3 Xây dựng đường cong sinh trưởng của Y lipolytica và S cerevisiae trên các môi trường nuôi cấy khác nhau 36

3.1.3.1 Y lipolytica 36

3.1.3.2 S cerevisiae 37

3.1.4 Khả năng thấm β-carotene qua màng tế bào 38

3.1.5 Xác định lượng sterol trong màng tế bào được nuôi cấy trên các môi trường khác nhau 40

CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 42

KẾT LUẬN 42

KIẾN NGHỊ 42

TÀI LIỆU THAM KHẢO 43

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1: Thành phần môi trường hoạt hóa, giữ giống 19 Bảng 2.2: Thành phân môi trường quan sát đặc điểm khuẩn lạc ở các nhiệt độ nuôi cấy khác nhau 20

Bảng 3.1: Khả năng sinh trưởng của Y lipolytica W29 trên các môi trường khác

nhau ở các nhiệt độ khác nhau 30

Bảng 3.2: Khả năng sinh trưởng của Y lipolytica 0544 trên các môi trường khác

nhau ở các nhiệt độ khác nhau 32

Bảng 3.3: Khả năng sinh trưởng và phát triển của S cerevisiae TNS.c trên các môi

trường khác nhau ở các nhiệt độ khác nhau 34

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1: Cấu trúc của màng sinh chất 5

Hình 1.2: Hiện tượng nhập bào 10

Hình 1.3: Hiện tượng xuất bào 10

Hình 1.4: Cấu trúc hóa học của β-carotene 16

Hình 1.5: Quang phổ hấp thụ của β-carotene 17

Hình 3.1: Hình thái khuẩn lạc của Y lipolytica W29 trên môi trường YPDA ở 27oC 24

Hình 3.2: Hình thái tế bào Y lipolytica W29 khi nuôi trên YPDA ở 27oC 25

Hình 3.3: Hình thái khuẩn lạc Y lipolytica 0544 trên môi trường YPDA ở 27oC 26

Hình 3.4: Hình thái tế bào Y lipolytica 0544 khi nuôi trên môi trường YPDA ở 27oC 26

Hình 3.5: Hình thái khuẩn lạc của S cerevisiae TNS.c trên môi trường YPDA ở 27oC 27

Hình 3.6: Hình thái tế bào của S cerevisiae TNS.c trên môi trường YPDA ở 27oC 28

Hình 3.7: Đường cong sinh trưởng của Y lipolytica W29 trên một số môi trường 36

Hình 3.8: Đường cong sinh trưởng của Y lipolytica 0544 trên một số môi trường 37

Hình 3.9: Đường cong sinh trưởng của S cerevisiae TNS.c trên một số môi trường 38

Hình 3.10: Đường cong sinh trưởng của S cerevisiae HNS.c trên môi trường YPD 38

Hình 3.11: Hàm lượng β-carotene trên 1g sinh khối nấm men của 4 chủng 39

Hình 3.12: Hàm lượng sterol trên các môi trường khác nhau (Y lipolytica W29) 40

KÝ HIỆU CÁC CỤM TỪ VIẾT TẮT

Y lipolytica: Yarrowia lipolytica

S cerevisiae: Saccharomyces cerevisiae

RDA: rice dextrose agar

PDA: potato dextrose agar

YNBA: yeast nitrogen base

YPOA: yeast pepton oleate agar

YPDA: yeast pepton dextrose agar

YNBOA: yeast nitrogen base oleate agar

YNBDA: yeast nitrogen base dextrose agar

YPA: yeast pepton agar

NXB: nhà xuất bản

LỜI MỞ ĐẦU

Khả năng sinh trưởng và phát triển của nấm men chịu ảnh hưởng của nhiều yếu tố như nhiệt độ, oxy, đặc biệt là môi trường nuôi cấy Các chủng nấm men khác nhau có khả năng sinh trưởng trong môi trường có các nguồn dinh dưỡng khác nhau Các nguồn dinh dưỡng chính đối với sinh trưởng của nấm men gồm nguồn cacbon (đường, tinh bột, các chất kỵ nước như ankan, lipid, các acid béo ) và nguồn nitơ (cao nấm men + pepton, các acid amin cơ bản ) Các nguồn dinh dưỡng này tác động mạnh đến sinh trưởng nấm men cũng ảnh hưởng đến các bộ phận trong tế bào, đặc biệt là bề mặt tế bào Để khảo sát khả năng sinh trưởng và phát triển cũng như ảnh hưởng của các nguồn dinh dưỡng này ảnh hưởng như thế nào đến tính chất bề mặt của màng tế bào nấm men nên chúng tôi thực hiện đề tài:

“Khảo sát khả năng sinh trưởng của một số chủng nấm men và ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy tới tính chất bề mặt của tế bào nấm men” gồm các bước

Vì đây là lần đầu tiên làm quen với công tác nghiên cứu, với kinh nghiệm thực

tế và kiến thức bản thân còn hạn chế, thời gian thực hiện có hạn nên trong quá trình thực hiện đề tài không tránh khỏi những thiếu sót, sai lầm Rất mong nhận được sự đóng góp ý kiến của quý Thầy Cô và các bạn để đề tài được hoàn thiện hơn

CHƯƠNG I TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về nấm men

1.1.1 Đặc điểm phân bố

Nấm men phân bố rất rộng rãi trong tự nhiên, nhất là trong các môi trường có chứa đường, có pH thấp, chẳng hạn như trong hoa quả, rau dưa, mật mía, rỉ đường, mật ong, trong đất vườn trồng cây ăn quả, trong đất có nhiễm dầu mỏ

Trong các sản phẩm như sữa, sữa chua, bánh mì cũng chứa một lượng lớn

các loài nấm men như Saccharomyces cerevisiae, Kluyveromyces marxianus, Debaromuces hanseni, Torulopsis lactis condense

1.1.2 Đặc điểm về hình dạng và kích thước của nấm men

Nấm men là vi sinh vật điển hình cho nhóm nhân thật (eukaryote) Tùy

loài nấm men mà tế bào có thể hình tròn (Torulopsis utilis), hình trứng, hình ovan (Saccharomyces cerevisiae), hình quả chanh, hình elip, hình trụ…

Tế bào nấm men thường lớn gấp 10 lần so với vi khuẩn, ở dạng đơn bào kích thước của chúng là 2,5-10µm x 4,1-21µm Kích thước và hình thể của nấm men còn phụ thuộc vào điều kiện nuôi cấy như nhiệt độ, pH, thành phần môi

trường, oxy và tuổi của tế bào nấm men Ví dụ như S cerevisiae có hình bầu dục

nếu nuôi trong môi trường giàu chất dinh dưỡng Trong điều kiện yếm khí thì nó

có hình tròn và ngược lại trong điều kiện hiếu khí thì tế bào có dạng kéo dài hơn

Một số tế bào nấm men có hình dài nối tiếp nhau thành dạng sợi gọi là lá

khuẩn ty (mycelium) hoặc khuẩn ty giả (pseudomycelium), thường gặp ở các giống Endomycopsis, Candida, Trichosporon Nhiều nấm men chỉ sinh khuẩn ty

giả khi không được cung cấp đầy đủ oxy

1.1.3 Đặc điểm dinh dưỡng của nấm men

1.1.3.1 Nguồn cacbon

Nguồn dinh dưỡng cacbon của nấm men là các loại đường và dẫn xuất, các rượu, acid hữu cơ, acid amin…

Hầu hết các loài nấm men không có enzyme polyhydrolase, trong đó không có amylase và cellulase cho nên không sử dụng trực tiếp được tinh bột, cellulose, hemicellulose Đường hexose được tất cả các loài nấm men sử dụng

Trong môi trường có một hỗn hợp các nguồn cacbon dinh dưỡng thì nguồn cacbon nào cung cấp cho nấm men sinh trưởng sẽ được sử dụng trước

Trong họ hàng men rượu Saccharomyces với các chủng khác nhau cần có các

nguồn cacbon khác nhau, là các đường khác nhau lên men cũng khác nhau Lên men rượu etylic cần hoặc vật liệu lý tưởng cho lên men là đường glucose, lên men bia là đường maltose, lên men rượu vang là đường fructose sau là glucose Đối với những disaccharide trước khi được nấm men sử dụng phải trải qua quá trình thủy phân sơ bộ thành đường đơn nhờ enzyme tương ứng của nấm men

Các acid béo được làm nguồn cacbon dinh dưỡng phụ thuộc vào từng chủng loại nấm men, nồng độ axit, chiều dài mạch cacbon trong phân tử acid và mức độ điện ly Mạch từ C2- C4 làm nguồn cơ chất khá tốt ở nồng độ tương đối thấp

Ngoài ra có thể sử dụng nguồn cacbon từ dầu mỏ và khí đốt nhưng vẫn còn nhiều e ngại nếu ứng dụng sinh khối nấm men vào các sản phẩm như thức

ăn chăn nuôi do có thể tồn dư các chất nào đó hoặc rất ít, không thể xác định được chúng có ảnh hưởng đến sức khỏe của người và động vật hay không

1.1.3.2 Nguồn nitơ

Là các hợp chất hữu cơ hoặc vô cơ có sẵn trong môi trường

Các hợp chất hữu cơ chứa nitơ của tế bào là các acid amin, các nucleotide purin, protein, pirimidin và một số vitamin Nấm men có khả năng tổng hợp được tất cả các acid amin, đa số nấm men không đồng hóa được nitrate

Nguồn nitơ vô cơ được nấm men sử dụng tốt là các muối amoni của acid

vô cơ cũng như hữu cơ: amoni phosphate, muối acetat, lactat, malat…

1.1.3.3 Dinh dưỡng các nguyên tố vô cơ

Được quan tâm trước hết là phospho, sau đó đến kali, magie, lưu huỳnh…

Khi không đủ P trong môi trường, sự trao đổi chất ở nấm men bị thay đổi đáng kể liên quan đến sự phá vỡ nhu cầu và sử dụng hydratcacbon và nitơ Nhu cầu sinh lý về phospho đối với 10 tỷ tế bào nấm men vào khoảng 10-13mg P Trong phòng thí nghiệm người ta thường dùng muối KH2PO4 và K2HPO4 làm nguồn P và K

Lưu huỳnh có trong thành phần của một số axit amin trong phân tử protein và nhóm phụ của một số enzyme CoA Những chất chứa lưu huỳnh như: cystein, methionin, thiamin, biotin Trong môi trường nuôi cấy nấm men thường dùng (NH4)2SO4 Hàm lượng lưu huỳnh nhỏ làm tăng sự nảy chồi của nấm men Nếu lượng lưu huỳnh cao thì sẽ ảnh hưởng đến quá trình trao đổi chất và có thể không tổng hợp được protein

Ion kali được bổ sung cùng với các muối phosphate hoặc sunphat, còn

Mg2+ và Ca2+ thường dùng có trong nước sinh hoạt

Các nguyên tố vi lượng như Mn, Cu, Zn, Fe….cũng được bổ sung vào để quá trình sinh lý trong tế bào nấm men được xảy ra bình thường

1.1.3.4 Dinh dưỡng các chất sinh trưởng

Những chất kích thích sinh trưởng là các vitamin, các base purin, pyrimidin Các acid amin cũng đóng vai trò là chất kích thích sinh trưởng cho một số chủng nấm men Nhu cầu riêng biệt này rất nhỏ

1.2 Màng tế bào

1.2.1 Đặc điểm, cấu trúc của màng

Màng tế bào được tạo thành từ lớp lipid kép dày khoảng 7.5nm, chúng hình thành mặt phân cách giữa tế bào và môi trường tế bào Vì vậy, nó ngăn chặn các phân tử nội bào đi ra ngoài và các phân tử tự do bên ngoài đi vào trong

tế bào Màng tế bào có tính thấm chọn lọc, cho phép một số chất đi qua dễ dàng hơn các chất khác, thường thì chúng chỉ cho các phân tử có kích thước nhỏ hơn

600 Da thấm qua Màng còn là nơi chứa các enzyme truyền tín hiệu, enzyme sinh tổng hợp năng lượng, là nơi đến đầu tiên của các phần tử mang thông tin như hoocmon, các phân tử truyền nơron…

Màng tế bào gồm 3 thành phần cơ bản của sự sống: protein, lipid và glucide Ba thành phần này kết hợp lại tạo thành một màng lỏng, tách biệt với môi trường bên trong tế bào và cho phép nó tương tác với các bộ phận khác của

tế bào

Hình 1.1: Cấu trúc của màng sinh chất (trích Giáo trình sinh học tế bào,

Nguyễn Như Hiền, NXB Giáo Dục, 2006)

Lipid màng gồm có 2 loại: phospholipid và sterol

Các phospholipid tạo thành lớp lipid chủ yếu của tế bào bao gồm: phosphatidyletanolamine, phosphstidylglyglycerol, phosphatidylserine, phosphatidylcholine

Các sterol cần thiết để hình thành màng tế bào Chúng được xem như là phần tử quan trọng để duy trì trạng thái của màng, đảm bảo tính lỏng của màng Trong khi phần lớn sterol ở động vật có xương sống là cholesterol, sterol chính của nấm men là ergosterol Các sterol được giấu kỹ trong lớp kép lipid, nhóm

OH của sterol đối diện với nhóm COOH của mạch phospholipid Khi lượng sterol trong lớp kép giảm tạo điều kiện dễ dàng cho sự xâm nhập của các phân tử nước, tương tác giữa sterol và mạch acyl không bão hòa làm tăng khả năng kỵ nước của trung tâm lớp kép và làm giảm tính bán thấm của màng tế bào (Subczynski et al., 1994) Chúng được biết như thiết bị điều hòa tính lỏng của màng tế bào Thêm sterol sẽ làm cứng lại màng khi màng ở trạng thái lỏng và ngược lại, nếu màng lỏng sẽ cứng hơn (Aora et al., 2004; Dufourc, 2008)

1.2.1.2 Protein màng

Căn cứ vào cách liên kết với màng lipid, người ta chia protein màng ra làm 2 loại: protein xuyên màng và protein ngoại vi

Protein xuyên màng: các protein này trôi nổi trong tầng lipid kép như

những cái phao trên hồ, tạo ra các kênh đi qua màng tế bào, nhờ đó mà các phân

tử và thông tin đi qua lại được tế bào Protein xuyên màng có hình sợi, có thể xuyên qua màng một lần nhưng cũng có loại lộn vào lộn ra để xuyên qua màng nhiều lần, có khi tới 6-7 lần Chúng không cố định một chỗ mà di chuyển qua lại

và chiếm khoảng 70% protein màng tế bào

Protein ngoại vi: chiếm khoảng 30% thành phần protein màng, gặp ở mặt ngoài hay mặt trong màng tế bào

1.2.1.3 Glucide

Glucide màng là những đoạn dextrin ngắn, thường liên kết với phospholipid tạo thành glycolipid hoặc protein tạo thành glycoprotein phân bố ở mặt ngoài màng tạo nên tính bất đối xứng của màng, tham gia tạo nên khối chất nền ngoại bào giữa các tế bào trong mô của cơ thể đa bào Chất nền ngoại bào không chỉ có chức năng dính kết các tế bào trong mô mà còn có chức năng truyền đạt thông tin giữa các tế bào

1.2.2 Phương thức vận chuyển chất qua màng

Có 3 cách để vận chuyển các chất qua màng

1.2.2.1 Vận chuyển thụ động (passive transport)

Đây là hình thức vận chuyển nước và các chất theo gradient nồng độ và không tiêu tốn ATP của tế bào

 Hiện tượng thẩm thấu và khuếch tán qua màng tế bào

Tùy thuộc vào điều kiện môi trường và nồng độ các chất bên trong, nước

và các chất hòa tan trong nước có thể vào hoặc ra khỏi tế bào cho đến khi đạt mức độ cân bằng về áp suất và nồng độ Hiện tượng nước đi từ nơi có nồng độ cao đến nơi có nồng độ thấp gọi là hiện tượng khuếch tán (diffusion) Hiện tượng nước đi từ nơi có áp suất thẩm thấu cao đến nơi có áp suất thẩm thấu thấp gọi là hiện tượng thẩm thấu (osmosis)

Ta có thể chia ra làm 3 loại môi trường dựa vào áp suất thẩm thấu của dung dịch xung quanh tế bào: đẳng trương, ưu trương và nhược trương

Đẳng trương: môi trường dịch xung quanh tế bào có áp suất thẩm thấu bằng áp suất thẩm thấu của dịch tế bào Trong môi trường đẳng trương, số lượng phân tử nước đi vào tế bào bằng số lượng phân tử nước đi ra khỏi tế bào, tế bào không thay đổi về hình dạng và kích thước

Ưu trương: môi trường dịch bao quanh tế bào có áp suất thẩm thấu cao hơn so với dịch tế bào Trong môi trường ưu trương, các phân tử nước đi ra khỏi

tế bào, làm cho tế bào co lại, biến dạng tế bào

Nhược trương: dịch xung quanh tế bào có áp suất thẩm thấu thấp hơn so với dịch trong tế bào Các phân tử nước từ môi trường ngoài đi vào trong tế bào, làm cho tế bào phồng to lên, đến một mức độ nhất định có thể gây vỡ tế bào

 Vận chuyển các chất đơn giản trực tiếp qua lớp kép phospholipid

Các chất có kích thước nhỏ, không phân cực, không tích điện (CO2,

O2…), một số chất hòa tan trong lipid (alcol, aldehyt…) dễ dàng qua lớp phospholipid kép vào trong tế bào hoặc ra khỏi tế bào theo gradient nồng độ (từ nơi có nồng độ thấp đến nơi có nồng độ cao)

 Vận chuyển các chất qua màng tế bào chất nhờ protein mang

Các ion mang điện tích, các chất có kích thước nhỏ phân cực (glucose, acid amin, H2O…) không được vận chuyển trực tiếp qua màng phospholipid kép

mà được vận chuyển nhờ các protein mang đặc hiệu trên màng (carrier protein) Những chất này được vận chuyển qua màng theo gradient nồng độ, không tiêu tốn ATP của tế bào

Các protein mang này có thể vận chuyển một chất (kênh vận chuyển đơn) hoặc nhiều chất (kênh vận chuyển kép) ra hoặc vào trong tế bào

1.2.2.2.Vận chuyển chủ động (active transport)

Là hình thức vận chuyển ion và các chất qua màng tế bào chất ngược chiều gradient nồng độ và tiêu tốn ATP của tế bào

 Bơm Na-K

Bơm Na-K là phức hợp enzyme Na+-K+ adenosine triphosphatase (Na+

-K+ ATPaes) trên màng tế bào, giúp điều hòa nồng độ các ion Na+ và ion K+trong và ngoài tế bào Cơ chế hoạt động gồm 4 bước:

Bước 1: ba phân tử Na+ liên kết vào đầu cuối bên trong của hai dưới đơn

vị dẫn đến làm thay đổi hình thể của phức hệ protein xuyên màng

Bước 2: hình thể mới của phức hệ sẽ liên kết với một phân tử ATP phân cắt nó thành ADP + P ADP thì được giải phóng, còn gốc phosphate cũ thì được gắn vào phức

Bước 3: việc gắn phosphate vào phức sẽ làm cho phức hệ thay đổi cấu hình lần thứ hai Kết quả của sự thay đổi này là vận chuyển được ba ion Na+ qua màng và định vị ở vị trí ngoài màng Với hình thể mới này làm cho phức có ái lực với ion Na+ thấp, nên ion Na+ được tách ra và khuếch tán đi ngay, cấu hình mới có ái lực cao với ion K+ nên lập tức kết hợp với hai ion K+ ngay sau khi giải phóng ion Na+

Bước 4: sự kết hợp với các ion K+ lại dẫn đến sự thay đổi khác trong cấu hình của phức hệ protein xuyên màng, làm cho nhóm phosphate được giải phóng

và phức hệ protein trở về hình dạng ban đầu với hai ion K+ nằm phía trong

màng Cấu hình mới có ái lực với ion K+ nên nó được tách ra và khuếch tán ngay trong tế bào Với hình thể ban đầu nó lại có ái lực cao với các ion Na+ Khi các ion này kết hợp vào, chu kỳ bơm khác lại bắt đầu

Đặc tính duy nhất của bơm Na-K là quá trình vận chuyển tích cực các ion

Na+, K+ từ vùng có nồng độ thấp đến vùng có nồng độ cao Sự vận chuyển này xảy ra được là nhờ sự tiêu phí năng lượng trao đổi chất dưới dạng ATP

 Bơm proton

Là phức hợp protein đặc hiệu trên màng tế bào, thực hiện chức năng vận chuyển các ion H+ ngược chiều gradient nồng độ nhờ năng lượng ATP do tế bào cung cấp Bơm proton hoạt động, luôn đưa các ion H+ ra khỏi tế bào, làm cho nồng độ ion H+ trong tế bào luôn thấp hơn bên ngoài tế bào, tạo sự chênh lệch điện thế màng cần thiết cho hoạt động của tế bào Điều này có thể làm cạn kiệt ion H+ bên trong tế bào Để đảm bảo lượng ion H+ trong tế bào, các ion H+sẽ được đưa vào tế bào đồng thời với sự vận chuyển các chất khác nhờ protein mang trên tế bào

 Vận chuyển các chất qua tế bào chất theo cơ chế nhập bào và xuất bào

Ẩm bào (pinocytosis): là hình thức biến đổi của màng tế bào, màng tế bào chất lõm vào bao lấy các giọt dịch lỏng, đưa vào trong tế bào

Nhập bào - thụ thể: là hình thức các vật thể, chất rắn, hoặc dịch thể tiếp xúc với màng tế bào chất tại các điểm thụ thể đặc hiệu Tại vị trí các thụ thể, màng tế bào chất lõm vào bao lấy các vật thể hoặc giọt dịch đưa vào trong tế

bào Đây là hình thức đặc biệt của vận chuyển chủ động, quá trình này cần tiêu tốn nhiều ATP để phục hồi trạng thái bình thường của màng tế bào chất

Hình 1.2: Hiện tượng nhập bào

(trích Giáo trình sinh học tế bào, Nguyễn Như Hiền, NXB Giáo Dục,

2006)

 Xuất bào (exocytosis)

Là hiện tượng các túi xuất bào chứa các chất tiết như enzyme, hoocmon… từ lưới nội chất và phức hệ golgi được đưa đến màng tế bào chất, được màng tế bào đưa ra khỏi tế bào

Nhập bào và xuất bào là hình thức vận chuyển các chất đặc biệt của tế bào liên quan đến sự biến đổi cấu trúc màng tế bào chất để đưa các chất vào hoặc ra khỏi tế bào

Hình 1.3: Hiện tượng xuất bào

(trích Giáo trình sinh học tế bào, Nguyễn Như Hiền, NXB Giáo Dục,

2006)

1.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng của nấm men

1.3.1 Ảnh hưởng của nguồn cacbon

Nguồn cacbon trong môi trường nuôi cấy ảnh hưởng sâu sắc đến quá trình sinh trưởng của vi sinh vật nói chung và nấm men nói riêng Nấm men có hệ thống enzyme phong phú và khả năng chuyển hóa nhanh những nguồn cacbon khác nhau trong môi trường nuôi cấy qua các con đường trao đổi chất Phổ cacbon của nấm men rất rộng, chúng có khả năng sử dụng những hợp chất cacbon khác nhau như: các loại đường đơn, đường đôi, các acid hữu cơ…cho

quá trình sinh trưởng Một số nấm men Candida phân lập từ nước biển có khả

năng sử dụng nguồn cacbon là ethanol cho quá trình sinh trưởng

Một số chủng nấm men nếu sử dụng nguồn cacbon khác nhau thì tính

chất bề mặt sẽ khác nhau: loài Candida tropicalis khi nuôi cấy trong môi trường

có ankan thì bề mặt sẽ trơn nhẵn hơn trong môi trường có glucose (Osumi et al.,

1975), bề mặt Yarrowia sẽ xuất hiện các chỗ lồi (Fickers et al., 2005), bề mặt tế

bào có nhiều hạt lipid bám vào, đồng thời màng tế bào sẽ linh động hơn

1.3.2 Ảnh hưởng của nguồn nitơ

Trong quá trình sinh trưởng, nấm men chịu ảnh hưởng của nguồn nitơ có trong môi trường nuôi cấy Nguồn nitơ dễ hấp thụ nhất đối với tế bào nấm men

là NH4+ Muối nitrat là nguồn nitơ thích hợp nhất đối với nhiều loại tảo, nấm sợi

và xạ khuẩn nhưng lại ít thích hợp với nhiều loại nấm men Nấm men có khả năng sử dụng tốt nguồn nitơ có trong các chất hữu cơ Các chất hữu cơ này vừa

là nguồn cacbon vừa là nguồn nitơ cung cấp cho vi sinh vật nói chung và nấm men nói riêng Nấm men được nuôi trong môi trường có chứa nguồn nitơ hữu

cơ, thành phần lipid của màng sẽ cao hơn nuôi trong môi trường có nguồn nitơ là muối NH4+ (Blinc và Hocevar, 1953; Woodbine, 1959) Nguồn nitơ hữu cơ thường được sử dụng để nuôi cấy nấm men là pepton – loại chế phẩm thủy phân không triệt để của một nguồn protein nào đấy Chúng khác nhau về lượng chất

chứa các loại polypeptide và loại chứa acid amin tự do Sự đa dạng và thành phần của nguồn nitơ trong môi trường ảnh hưởng đến việc tích lũy ergosterol của màng tế bào nấm men Nấm men tăng trưởng trên môi trường giàu nitơ như muối amoni có thể thu hoạch được nhiều sinh khối nấm men hơn, nhưng số lượng ergosterol ở màng tế bào lại thấp Điều này làm cho tính linh động của màng cũng thay đổi

1.3.3 Ảnh hưởng của nguyên tố khoáng

Khi sử dụng các môi trường tự nhiên để nuôi cấy nấm men, người ta thường không cần thiết phải bổ sung các nguyên tố khoáng Trong nguyên liệu

tự nhiên dùng làm môi trường thường đã chứa đủ các nguyên tố khoáng cần thiết đối với nấm men Nguợc lại, với các môi trường tổng hợp bắt buộc phải bổ sung

đủ các nguyên tố khoáng cần thiết để cho nấm men sinh trưởng tốt Các nguyên

tố khoáng thường được bổ sung vào môi trường là P, Mg, K…

1.3.4 Ảnh hưởng của oxy

Mặc dù nấm men mọc được trong điều kiện hiếu khí và kỵ khí nhưng oxy

và độ thoáng khí rất cần thiết cho sự sinh trưởng của nấm men Đồng thời nó còn ảnh hưởng lớn đến quá trình trao đổi chất của nấm men như quá trình lên men Nấm men hấp thụ oxy một cách nhanh chóng và sử dụng oxy cho quá trình sinh tổng hợp các acid béo không no và sterol cho màng tế bào Do đó, oxy có vai trò hết sức quan trọng trong quá trình sinh trưởng của nấm men để đem lại hiệu quả cao nhất Ví dụ như chủng nấm men lên men bia, một số enzyme của nấm men chỉ phản ứng với oxy mà không gây phản ứng với bất kỳ một chất nhận hydro nào khác, điển hình như enzyme oxygenase tham gia vào quá trình sinh tổng hợp các acid béo không no và các sterol Do đó, nếu lượng oxy đầy đủ thì lượng sterol trên màng tế bào ổn định nếu thiếu oxy có thể làm cho màng lỏng hơn

1.3.5 Ảnh hưởng của nhiệt độ

Một nhân tố khác ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng và trao đổi chất của nấm men là nhiệt độ Hoạt động trao đổi chất của nấm men có thể coi là kết quả của các phản ứng hóa học Vì các phản ứng này phụ thuộc chặt chẽ vào

nhiệt độ nên yếu tố nhiệt độ rõ ràng ảnh hưởng sâu sắc đến quá trình sống của tế bào Tế bào thu được nhiệt chủ yếu từ môi trường bên ngoài và một phần cũng

do cơ thể thải ra từ kết quả hoạt động trao đổi chất Tùy theo quá trình sinh lý khác nhau mà đòi hỏi những nhiệt độ tối thích khác nhau Biên độ nhiệt độ cho quá trình sinh trưởng của nấm men rất rộng nhưng nhìn chung nấm men sinh trưởng tốt ở 28-30oC Ở nhiệt độ 4oC, nấm men vẫn có thể sinh trưởng được nhưng rất chậm Trên 38oC hầu hết nấm men sinh trưởng rất yếu và có thể bị chết nếu nhiệt độ vượt quá 40oC Nhiệt độ cũng làm thay đổi tính linh động của màng, ở nhiệt độ cao màng linh động hơn so với nhiệt độ thấp

1.3.6 Ảnh hưởng của pH môi trường

pH môi trường có ảnh hưởng đối với sinh trưởng của nấm men Các ion

H+ và OH- là 2 ion hoạt động lớn nhất trong các ion Những biến đổi dù nhỏ trong nồng độ các ion này cũng có thể có ảnh hưởng mạnh mẽ đến quá trình sinh trưởng của nấm men Cho nên việc xác định pH thích hợp ban đầu và việc duy trì pH cần thiết trong thời gian sinh trưởng của nấm men rất quan trọng pH môi trường không những ảnh hưởng đến sinh trưởng mà còn tác động sâu sắc đến quá trình trao đổi chất Trong lên men rượu vang, pH có ảnh hưởng đến khả năng sống và tăng trưởng của nấm men (Fleet và Heard, 1993) Với quá trình kiểm soát pH ban đầu của dịch lên men là 4,5 thì sau quá trình lên men, pH của rượu vang là 3,5-3,8 Giá trị pH này có thể cải thiện được độ ổn định của rượu,

ức chế sự phát triển của vi khuẩn và tạo điều kiện tốt cho quá trình lên men đường Tuy nhiên, nếu điều chỉnh dịch lên men ban đầu cao hơn 4,5 thì pH của rượu vang sau lên men khá cao (4,2-4,5) Ở pH này sẽ tạo điều kiện cho vi khuẩn phát triển nhanh chóng và dẫn đến quá trình lên men không mong muốn, rượu vang có chất lượng xấu, màu sắc kém (Kurtzman và Fell, 1998; Ribereau-Gayon et al., 2006) Nhìn chung nấm men ưa pH acid (pH= 4-6)

1.4 Giới thiệu về các chủng nấm men Saccharomyces

cerevisiae và Yarrowia lipolytica

1.4.1 Saccharomyces cerevisiae

1.4.1.1 Một số đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa của S cerevisiae

Phân loại:

Bộ: Saccharomycetales

Họ: Saccharomycetaceae

Giống: Saccharomyces

Loài: Saccharomyces cerevisiae

Saccharomyces thuộc nhóm vi sinh vật rất phổ biến trong tự nhiên Đây là

loài nấm men được sử dụng lâu đời trong lên men cồn và sản xuất bánh mì Chúng có dạng hình cầu hay hình trứng, có kích thước nhỏ, từ 5- 14µm, khuẩn lạc của chúng dạng bột nhão, màu trắng

S cerevisiae lên men hầu hết các loại đường trừ lactose và cellobiose Tuy nhiên, khả năng tăng trưởng của S cerevisiae trên các loại đường khác nhau

là khác nhau (Chen, 2009) S cerevisiae sinh sản chủ yếu bằng cách nảy chồi nhưng cũng có thể sinh sản hữu tính S cerevisiae là loài có thể phát triển trong

điều kiện hiếu khí hay kỵ khí, ở điều kiện hiếu khí sinh trưởng tăng sinh khối nhanh, điều kiện yếm khí chủ yếu lên men tạo cồn; pH phát triển trong khoảng 4 – 6,8, tối ưu ở pH 5,8; nhiệt độ phát triển trong khoảng 27 – 35oC, tối ưu ở 32oC Nguồn dinh dưỡng carbohydrate chính là các loại đường, thích hợp nhất là đường fructose, có thể sử dụng nguồn nitơ vô cơ lẫn hữu cơ

1.4.1.2 Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến quá trình sinh trưởng của

S cerevisiae

Điều kiên nuôi cấy có ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng của S cerevisiae Tùy theo mục đích nuôi cấy mà đảm bảo các yếu tố về oxy, pH, nhiệt

độ…Phổ nhiệt độ tăng trưởng tương đối rộng, ở nhiệt độ cao 37oC chúng vẫn

mọc được Là loài hiếu khí tùy tiện nên S cerevisiae không yêu cầu khắt khe về

khí oxy, phát triển tốt trên môi trường có đường, tuy nhiên lại không có khả năng tăng trưởng trong môi trường có bổ sung lipid Vì thế nếu trong môi trường

có bổ sung lipid thì S cerevisiae không tăng trưởng được (Freeze et al., 1973;

Hunkova và Fencl, 1977; Lafon – Lafourcade et al., 1984; Viegas et al., 1989)

1.4.2 Yarrowia lipolytica

1.4.2.1 Một số đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa của Y lipolytica

Phân loại:

Bộ: Saccharomycetales

Họ: Dipodascaceae

Giống: Yarrowia

Loài: Yarrowia lipolytica

Y lipolytica là một loài nấm lưỡng hình, có thành tế bào, dạng sợi dài,

vách khuẩn ty phụ thuộc vào chủng và điều kiện tăng trưởng như thành phần môi trường, nhiệt độ, thời gian nuôi cấy… (Dominguez et al., 2000) Khuẩn lạc

của Y lipolytica có nhiều hình dạng khác nhau như nhẵn và lấp lánh, cuộn xoắn

và sần sùi Hầu hết các chủng không thể tăng trưởng được ở nhiệt độ quá 32oC

và là loài hiếu khí nghiêm ngặt, nó được xem như không gây bệnh (GRAS – General Recognised as Safe) (Holzschu et al., 1979)

Y lipolytica thường được tìm thấy ở môi trường có protein hoặc các cơ

chất kỵ nước như ankan, lipid (Sinigaglia et al., 1994; Barth và Gaillardin, 1997; Fickers et al., 2005) Nấm men này có thể được phân lập từ bơ sữa hay các sản phẩm từ sữa bị hư hỏng như bơ, sữa chua, xúc xích Ngoài ra chúng cũng có thể được phân lập từ đất, nước thải và môi trường bị ô nhiễm dầu

Các chủng phân lập từ tự nhiên thường là thể đơn bội, một số ít là thể lưỡng bội Cả 2 thể đơn bội và lưỡng bội đều bền vững dưới điều kiện phòng thí nghiệm.Bào tử hình thành trong điều kiện tăng trưởng cụ thể và tạo ra 4 bào tử

có hình lưỡi liềm có thể được tách ra bằng máy vi xử lý (Barth và Gaillardin,

1996)

Y lipolytica có thể tăng trưởng trong môi trường có bổ sung lipid như

ricinoleic (dầu thầu dầu), sử dụng lipid để tổng hợp thành lacton do hoạt động của enzyme lipase và esterase (Ficker et al., 2005)

1.4.2.2 Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến quá trình sinh trưởng của

Y lipolytica

Y lipolytica là loài nấm men hiếu khí cho nên yêu cầu phải có đầy đủ

lượng oxy để sinh trưởng và phát triển, do đó tốc độ lắc cũng ảnh hưởng đến khả

năng phát triển của nó Đồng thời cũng đảm bảo yếu tố nhiệt độ và một số yếu tố khác

Ngoài ra, chúng có khả năng tăng trưởng trong môi trường có bổ sung các hợp chất kỵ nước (Peters và Nelson, 1948; Klug và Markovetz, 1967) Sử dụng các chất kỵ nước này như nguồn cacbon để sinh trưởng và phát triển, chuyển hóa thành một số hợp chất thơm như α-,γ-decalactone…Tuy nhiên, nếu những hợp chất này tích lũy cao trong tế bào có thể gây độc và ức chế hoạt động của nấm men (Feron et al., 1996)

1.5 β-carotene

β-carotene là một loại carotenoid phổ biến được tìm thấy nhiều trong một

số trái cây và rau quả có màu đỏ như: gấc, khoai lang đỏ, cà rốt…Là tiền thân chủ yếu của vitamin A (cơ thể có thể chuyển β-carotene thành vitamin A)

Công thức hóa học của β-carotene là C40H56, khối lượng phân tử là 536,88

Hình 1.4: Cấu trúc hóa học của β-carotene

(nguồn: internet) Β-carotene tự nhiên có khả năng chữa các bệnh nan y và được coi như liều thuốc làm tăng tuổi thọ của con người, có khả năng ngăn ngừa được bệnh ung thư, bảo vệ sắc tố da chống lại hiệu ứng của các tia tử ngoại, giúp phát triển thị giác, vị giác, tăng đáp ứng miễn dịch, tăng sự sinh sản và tạo tinh trùng

Tính chất vật lý: β-carotene hòa tan trong hầu hết các dung môi hữu cơ và

bị hấp thụ bởi ánh sáng, bền hơn ở nhiệt độ ổn định Hấp thụ bước sóng cực đại vào khoảng 450nm

Hình 1.5: Quang phổ hấp thụ của β-carotene

Tính chất hóa học:

Β-carotene là dẫn xuất của isopren chưa bão hòa, có dạng hình kim, màu nâu đỏ, bền trong môi trường kiềm và không bền trong môi trường acid, tan tốt trong dầu, ete, hexan và các dung môi hữu cơ như aceton, methanol…không tan trong nước Có hệ thống nối đôi liên hợp dài nên β-carotene có ái lực mạnh với oxy đơn bội, dễ bị oxy hóa, đồng phân hóa khi tiếp xúc với không khí, ánh sáng, nhiệt độ cao Vì vậy, β-carotene phải được bảo quản ở bao bì kín với nitro hoặc argon, tránh ánh sáng, nhiệt độ cao khi sử dụng lâu dài

CHƯƠNG II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng – vật liệu

2.1.1 Đối tượng

Chủng Y lipolytica W29 được cung cấp bởi trường AgroSup Dijon, Pháp Chủng

Y lipolytica 0544 và S cerevisiae HNS.c được cung cấp bởi Viện Công nghiệp

- Nồi hấp thanh trùng - Máy ly tâm

- Máy lắc - Các dụng cụ khác: pipet, đầu

típ, nồi, đĩa petri, ống nghiệm, bình tam giác, lam kính…