Thiết kế và biểu hiện protein tiểu đơn vị b độc tố không chịu nhiệt lt của etec trên quy mô phòng thí nghiệm

PAGE 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Chất l​ượng ATVSTP có liên quan trực tiếp hàng ngày, thường xuyên, liên tục đến sức khỏe con người, ảnh hưởng lâu dài đến nòi giống dân tộc Sử dụng thực phẩm không đảm bảo chất lượng[.]

ĐẶT VẤN ĐỀ

Chất lượng ATVSTP có liên quan trực tiếp hàng ngày, thường xuyên,liên tục đến sức khỏe con người, ảnh hưởng lâu dài đến nòi giống dân tộc Sửdụng thực phẩm không đảm bảo chất lượng, vệ sinh sẽ dẫn đến ngộ độc cấptính, ngộ độc mạn tính, các bệnh truyền qua thực phẩm Chất độc tính lũytrong cơ thể gây ảnh hưởng đến sức khỏe lâu dài, giảm khả năng lao động,gây các bệnh mạn tính, rối loạn chuyển hóa và có thể gây ung thư Khôngnhững thế, nó còn ảnh hưởng đến sự phát triển kinh tế, xã hội, an ninh chínhtrị và quan hệ quốc tế [13] Theo thống kê của Trung tâm kiểm soát và phòngngừa bệnh tật Mỹ thì hàng năm trên thế giới có khoảng 1,3 tỷ người tiêu chảytrong đó có 70% nguyên nhân do sử dụng thực phẩm không an toàn [26] Tại cácnước đang phát triển, mỗi năm có khoảng 1/3 dân số bị các bệnh do thực phẩmgây ra, trong đó bệnh tiêu chảy là thường gặp nhất và gây tử vong khoảng 2,2triệu người [22]

Ở Việt Nam ngộ độc thực phẩm là một vấn đề đang được quan tâm hàngđầu, theo ước tính của bộ Y tế, chỉ riêng năm 2001 đó cú 4,2 triệu người bịngộ độc thực phẩm Từ năm 2001-2006, cả nước ghi nhận được hơn 5600000

ca tiêu chảy do ngộ độc thực phẩm, trong đó có 84 ca tử vong Riêng trong 9tháng đầu năm ngoái ghi nhận được hơn 750.000 ca tiêu chảy trong đó có 12

ca tử vong Thực tế theo các chuyên gia phải gấp ít nhất 10 lần con số đượccông bố [10].[20]

Các bệnh liên quan đến thực phẩm hiện nay vẫn là một mối nguy cơchính tác động đến sức khoẻ con người trên thế giới (Wood và CS 1983).Trong đó, vi khuẩn E.coli sinh độc tố (ETEC) là một trong những nguyênnhân gây bệnh tiêu chảy quan trọng cho trẻ em ở các quốc gia đang phát triển

và cho khách du lịch đến những vựng cú dịch lưu hành Thực phẩm và nước

bị ô nhiễm là những phương tiện lây truyền chủ yếu của loại vi khuẩn này.Các mẫu xét nghiệm thực phẩm và nước thường có tỷ lệ ô nhiễm cao vớiETEC ở vựng cú dịch lưu hành (Black và CS, 1981,1982; Ryder và CS,1976) Nhiễm trùng do ETEC thường xảy ra vào những mùa nóng, ẩm ướt sẽ

là những điều kiện thuận lợi cho vi khuẩn phát triển trong thực phẩm và nước.ETEC có khả năng sinh độc tố chịu nhiệt ST và độc tố không chịu nhiệt LT.Độc tố không chịu nhiờt cú cấu trúc và chức năng như độc tố tả (choleraetoxin) Vì vậy người bị nhiễm độc tố này sẽ bị tiêu chảy cấp tính với mức độmất nước trầm trọng Trên thế giới nhiều nhà khoa học đó nhiờn cứu và sảnxuất thành công protein tái tổ hợp tiểu đơn vị B của độc tố LT của ETEC và

sử dụng protein tái tổ hợp này để thiết kế các bộ sinh phẩm chẩn đoán cácETEC gây bệnh bằng kỹ thuật ELSA và latex đã thu được kết quả tốt (CryanB,1990; Oto và CS,1983) Nguyên lý của kỹ thuật là sử dụng protein tái tổhợp tiểu đơn vị B của độc tố LT gây miễn dịch tạo ra kháng thể kháng LT sau

đó sử dụng kháng thể này để phát hiện độc tố LT của ETEC Tuy nhiên giáthành của sản phẩm này còn cao do vậy chưa đáp ứng được với điều kiện kinh

trong thực phẩm bằng kỹ thuật ELISA hay latex nhằm phát hiện các gen mãhóa độc tố của các chủng ETEC trong thực phẩm

Cho đến nay có một nghiên cứu ở Việt Nam của tác giả Nguyễn ThịThanh Yến và CS năn 2005 tại viện dinh dưỡng về ứng dụng kỹ thuật ELISA

để phát hiện khả năng sinh độc tố LT của E coli trong các mẫu thực phẩm.Tuy nhiên các kỹ thuật này giá thành còn cao và phức tạp cho nên rất khó ápdụng cho các phong xét nghiệm thực phẩm ở tuyến tỉnh Xuất phát từ thực

tiễn đó chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Thiết kế và biểu hiện protein tiểu đơn vị B độc tố không chịu nhiệt LT của ETEC trên quy mô phũng thớ nghiệm” Đây là tiền đề quan trọng cho nghiên cứu tiếp theo nhằm mục đích

sản xuất bộ sinh phẩm immunoblotting chẩn đoán độc tố không chịu nhiệt(LT) của E.coli sinh độc tố ở trên một số nhóm thực phẩm

Mục tiêu nghiên cứu:

1 Thiết kế vector biểu hiện gen mã hóa cho kháng nguyên tái tổ hợp EltB và biến nạp vào tế bào khả biến DH5αα

2 Biểu hiện và tinh sạch Protein EltB trong tế bào vi khuẩn E.coli để sản xuất kháng thể kháng LT trên quy mô phòng thí nghiệm

Chương 1

TỔNG QUAN

1.1.Tỡnh hình vệ sinh an toàn thực phẩm

1.1.1.Trên thế giới

Theo thống kê của Trung tâm kiểm soát và phòng ngừa bệnh tật Mỹ thìhàng năm trên thế giới có khoảng 1,3 tỷ người tiêu chảy trong đó có 70%nguyên nhân do sử dụng thực phẩm không an toàn [26] Tại các nước đangphát triển, mỗi năm có khoảng 1/3 dân số bị các bệnh do thực phẩm gây ra,trong đó bệnh tiêu chảy là thường gặp nhất và gây tử vong khoảng 2,2 triệungười [22]

Tại Úc, mỗi ngày có khoảng 11.500 người bị ngộ độc thực phẩm Ở Mỹhàng năm ước đoán có khoảng 5 đến 6 triệu người bị mắc bệnh do nguyênnhân ăn uống và hơn 9000 trường hợp tử vong [12].[48]

Một nghiên cứu khác về bệnh từ thực phẩm bị ô nhiễm VSV gây bệnh

ở New-York Mỹ, phát hiện có sự gia tăng gấp 4 lần từ 1980 đến 1990 [6]

Ở Trung Quốc năm 1998 có 292.000 người bị ngộ độc thực phẩm dovirus viêm gan A làm tử vong 9 người Năm 1999 xảy ra 591 vụ ngộ độc thựcphẩm với 17.971 người mắc, chết 108 người Nguyên nhân chính là do thựcphẩm bị ô nhiễm VSV là 8.505 trường hợp, do hóa chất là 9.506 trường hợp,thực vật hặc động vật có chất độc là 2.719 trường hợp Phần lớn các trườnghợp ngộ độc xảy tại các căng tin là 7.529 trường hợp[2] Một thống kê trong

10 năm xác định các yếu tố nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm tại TrungQuốc cho thấy 93,24 % là nguyên nhân vi sinh vật, chỉ có 6,76% bởi các yếu

1.2 Ở Việt Nam.

Tình trạng ô nhiễm thực phẩm đang diễn ra khá phổ biến trên cả nước,chủ yếu là ô nhiễm mầm bệnh sinh học và hóa chất [10] Tại Hà Nội, tỷ lệthức ăn đường phố ô nhiễm vi khuẩn cao (46,7%) [10] Điều tra tại thành phố

Hồ Chí Minh cho thấy, 100% các mẫu thực phẩm được kiểm tra: bánh mì, thịtnguội, thịt quay và dưa muối không đảm bảo vệ sinh thực phẩm về mặt visinh [3] Tại Hải Phòng có 76,4% thực phẩm không đạt tiêu chuẩn vệ sinh,trong đó tỷ lệ không đạt vệ sinh của thức ăn đường phố là 92,9% Có tới 85%mẫu thực phẩm ăn ngay tại các chợ không đạt tiêu chuẩn về vi sinh, với số lượng

vi khuẩn có trong thực phẩm vượt mức cho phép nhiều lần, kể cả các vi khuẩn gâybệnh nguy hiểm [20] Không chỉ ở các thành phố lớn, tình trạng nhiễm vi sinh vậtgây bệnh trong thực phẩm còn diễn ra phổ biến ở rất nhiều địa phương khác trên

Riêng trong quý IV năm 2010, cả nước xảy ra 18 vụ ngộ độc làm 4 người

tử vong, trong đó có 3 vụ ngộ độc lớn từ 30 người trở lên Số người bị ngộđộc là 323 người với 242 người nhập viện

Nguyên nhân chính là do vi sinh (gồm 4 nhóm vi khuẩn chính làSalmonella, Streptoccocus, E.Coli và Staphylococcus); do độc tố tự nhiên vàhóa chất Có 5/18 vụ ngộ độc không xác định được nguyên nhân do không lấyđược mẫu thực phẩm lưu tại cơ sở

Mới đây nhất, ngày 30/12, có 461 công nhân thuộc 4 công ty trên địabàn quận 12 và huyện Húc Mụn, TP.HCM đã lần lượt phải nhập viện cấp cứu

vì ngộ độc thực phẩm (Dinh dưỡng com.vn)

1.3.Ngộ độc thực phẩm do E.coli

1.3.1 Vài nét về E.coli

E.coli do Eschirich phân lập từ phân người năm 1885

E.coli ký sinh bình thường trong đại tràng người và một số động vật.Sau khi trẻ ra đời khoảng 3h, người ta đã thấy E.coli trong đại tràng và từ đó

nó sống suốt đời với cơ thể vật chủ

E.coli góp phần tiêu hóa thức ăn, phân giải muối mật, sản xuất một sốsinh tố, giữ thăng bằng vi khuẩn chí ở ruột Trong số vi khuẩn hiếu khí ở đạitràng, E.coli chiếm 80%

Một số hình ảnh của E.coli

1.3.2 Phân loại

Có nhiều cách phân chia loài E.coli nhưng cách phân loại theo typehuyết thanh là hay được dùng hơn cả Cách phân loại này dựa trên cấu trúckháng nguyên khác nhau cú trờn bề mặt tế bào vi khuẩn

- Kháng nguyên O là quyết định kháng nguyên quan trọng nhất Bản chấtcủa nó là lipopolisaccharide nằm trờn vỏch tế bào vi khuẩn Có 171 loạikháng nguyên O đã được xác định, một số trong số chỳng cú phản ứng chéovới các vi khuẩn khác [34].[44]

- Kháng nguyên K là kháng nguyên bề mặt Kháng nguyên K nằm bênngoài kháng nguyên O Người ta đã xác định được khoảng 80 loại khỏngnguyên K khác nhau [14].[34]

- Kháng nguyên H là kháng nguyên lụng cú bản chất hóa học là protein

Có 56 loại kháng nguyờn lụng khác nhau [14].[34]

Dựa trên các kháng nguyên O, K và H người ta đã phân biệt được trên

700 type huyết thanh khác nhau của E.coli

Phân loại dựa vào sự ly giải bởi phage đặc hiệu có khoảng 50 type phagePhân loại dựa vào tính chất gây bệnh chia làm 5 loại [21]

- EPEC (Enteropathogenic E.coli): E.coli gây bệnh đường ruột

- EHEC ( Enterohemorrhagic E.coli): E.coli gây chảy máu đường ruột

- ETEC (Enterotoxigenic E.coli): E.coli sinh độc tố ruột

- EIEC (Enteroinvasive E.coli): E.coli xâm nhập đường ruột

- EAEC Enteroadherent E.coli) E.coli bỏm dớnh đường ruột

1.3.3 Đặc điểm sinh học

1.3.3.1 Hình thái học

- E.coli là trực khuẩn kích thước trung bình 1-3àx 0,5àm, đứng riêng rẽhoặc đôi khi thành đôi Trong những điều kiện không thích hợp (ví dụ: trongmôi trường có kháng sinh), vi khuẩn có thể dài như sợi chỉ

- Bắt mầu Gram (-)

- Di động bằng hệ thống lông xung quanh thân hoặc không di động

- Có thể có vỏ

1.3.3.2 Tính chất nuôi cấy

- Là loại hiếu khí hay hiếu kỵ khí tùy tiện

- Nhiệt độ thích hợp 37oC nhưng có thể mọc ở 40oC, sống được ở nhiệt

đô 5-40o C

- pH 7,4

- E.coli phát triển dễ dàng trên môi trường nuôi cấy thông thường, một

số có thể phát triển trên môi trường tổng hợp rất nghèo chất dinh dưỡng

- Ở những điều kiện thích hợp, E.coli phát triển rất nhanh, thời gian phânchia thành một thế hệ mới khoảng 20 đến 30 phút

- Trong môi trường lỏng (như canh thang) sau 3-4h E.coli đã làm đụcnhẹ môi trường, sau 24h làm đục đều Những ngày sau, dưới đáy ống có thể

có cặn

- Trên môi trường đặc sau khoảng 8-10h, dùng kính lúp có thể thấy đượckhuẩn lạc Sau 24h đường kính khuẩn lạc khoảng 1,5mm, hình thái khuẩn lạcđiển hình là dạng S: tròn, lồi, ướt, màu xám, bề mặt sáng bóng, bờ đều, nhưngcũng có thể gặp dạng M hoặc dạng R

- Trên môi trường thạch dinh dưỡng NA tạo khúm trũn ướt (dạng S)màu trắng đục Để lâu khóm trở nên khô nhăn (dạng R) Kích thước khóm 2-3mm

- Trên thạch mỏu: Cú chủng dung huyết β, có chủng không dung huyết α

- Trên môi trường chẩn đoán chuyên biệt EMB (Eozin Methyl Blue) tạokhúm tớm ánh kim

- Trên môi trường Rapid’ E.coli tạo khuẩn lạc màu tím

- Trên môi trường Macconkey, Endo, SS tạo khóm hồng đỏ

- Trờn các môi trường đường: Lên men sinh hơi lactose, glucose,galactose Lên men không đều saccarose và không lên men dextrin,glycogen.

1.3.3.3 Tính chất sinh vật hóa học

- Phản ứng oxydase(-), Citrat Simmons(-)

- Lên men glucose (+), Lên men sorbitol (-), Lên men lactose(+/-)

- Phản ứng RM (+), Phản ứng VP (-), Urease (-), Indole (+), H2S (-),Sinh hơi (+), Lysine decarboxylase (+), Arginine dihydrolase (+), Ornithindecarboxylase (+), ONPG (+)

1.3.4 Khả năng gây bệnh ở đường tiêu hóa

E.coli là vi khuẩn gây bệnh cơ hội

Hiện tại người ta đã xác định được 5 loại E.coli có khả năng gây tiêuchảy: ETEC , EPEC , EHEC, EIEC, EAEC

- Cho đến nay người ta đã phát hiện ra một số loại CFA khác nhau nhưCFA Insulin, CFA II, CFA III, CFA IV CFAII được mô tả như một yếu tố

kháng nguyên lông riêng biệt có chứa 1 hoặc 2 kháng nguyên lông bề mặtkhác [36].[38].[46].

- Các CFA này còn liên quan chặt chẽ với các yếu tố độc lực LT và ST:CFA Insulin và CFA II liên quan với LT và ST hoặc chỉ ST đơn thuần nhưngCFA III chỉ liên quan với chủng ETEC chỉ sản xuất LT [36]

- Các yếu tố CFA được mã hóa bởi các gen nằm trên plasmid và plasmidnày cũng mã hóa cho các độc tố LT và ST, [36].[38].[46]

- Các nghiên cứu về dịch tễ học thấy rằng CFA Insulin, CFA II và CFA

IV xuất hiện khoảng 75% trong các chủng ETEC gây bệnh ở người trên thếgiới [34]

● Độc tố

ETEC gây tiêu chảy nhờ hoạt động của độc tố ruột không chịu nhiệt LT

và độc tố ruột chịu nhiệt ST Một chủng E.coli có thể chỉ có LT, chỉ có SThoặc cả 2 loại độc tố này

◘ Độc tố không chịu nhiệt LT

LT là một protein có tính kháng nguyên mạnh, có tính chất của một

ngoại độc tố Cấu trúc và chức năng gần giông với choleragen can vi khuẩn

tả Có 2 type huyết thanh can LT là LT Insulin và LT II, chúng không có phảnứng miễn dịch chéo với nhau LT Insulin có ở những chủng gây bệnh cho cảngười và động vật, LT II hiếm khi phân lập được ở trên người Nhưng cảđộng vật và người, sự có mặt can LT II không liên quan đến bệnh Do vậythuật ngữ LT chỉ để ám chỉ LT I LT là độc tố có trọng lượng phân tử thấp 86kDa bao gồm 28 kDa tiểu đơn vị A và 11,5 kDa của 5 tiểu đơn vi B Khảnăng bỏm dớnh của tiểu đơn vị B vào thụ thể GM1 trên niêm mạc ruột non sẽcho phép độc tố này xâm nhập vào bên trong của tế bào niêm mạc ruột Tiểuđơn vị A mang hoạt tính enzym gồm 2 peptid A1 và A2 nối với nhau bởi cầunối disulfide (Giannella và CS, 1974, 1981; Streatfield và CS, 1992) [41]

- Cơ chế gây tiêu chảy của LT

Sau khi phần B giúp độc tố bám vào tế bào biểu mô ruột thì phần A đượcđẩy vào bên trong tế bào Peptide A1 có hoạt tính enzym ADP-ribosyltransferase và hoạt động bằng cách chuyển một nửa phân tử ADP-ribosyl từ NAP tới tiểu đơn vị A của protein gắn GTP, Gs, làm hoạt hóaenzym adenylate cyclase Khi enzym adenylate cyclase hoạt hóa thì AMPcvòng nội bào tăng lên dẫn đến ức chế hấp thu Na+ ở tế bào niêm mạc ruột colông, tăng bài tiết Cl- vào lòng ruột, làm cho áp lực thẩm thấu trong lòng ruộttăng nhanh Hậu quả là một lượng lớn nước từ trong tế bào được kéo ra ngoàilòng ruột để cân bằng áp lực thẩm thấu giữa trong và ngoài tế bào, gây tiêuchảy (Giannella và CS, 1974, 1981; Streatfield và CS, 1992) [41]

◘ Độc tố chịu nhiệt ST

ST có trọng lượng phân tử thấp trong cấu trúc can nú cú chứa nhiềucystein mà chính nhờ các cầu nối disufide, ST bền vững với nhiệt độ Có 2lớp ST khác nhau về cấu trúc và cơ chế hoạt động là Sta và STb Gen mã hóacho 2 lớp này thường nằm trên plasmid, cũng có khi nằm trên transposon Độc tố

ST hoàn chỉnh chứa 18-19 acid amin trọng lượng phân tử 2 kDa Receptor củaSTa là enzym trên màng gai là Guanyl cyclase(GC-C) Khi Sta gắn với GC-Ctrên tế bào biểu mô ruột, kích thích hoạt động can GC làm tăng GMPc GMPchoạt động giống AMPc STb chứa 48 acid amin throng lượng phân tử 5,1 kDa.STb làm mất nhung mao hoặc teo một phần nhung mao ruột [41]

- Những dòng E.coli có cả 2 loại nội độc tố LT và ST sẽ gây ra tiêu chảytrầm trọng và kéo dài

♦ Nhóm EPEC (Enteropathogenic E.coli): gồm các type thường gặpO26:B6, O44, O55:B5, O112:B11, O124, O125:B5, O142 là nguyên nhângây tiêu chảy ở trẻ em dưới 2 tuổi

♦ Nhóm EIEC (Enteroinvasine E.coli): những E.coli này bỏm lờn niêmmạc và làm tróc niêm mạc gõy loột niêm mạc do đó gây tiêu chảy có đàm lẫnmáu (giống Shigella) Các chủng này có thể lên men hay không lên menđường lactose và có phản ứng lysin decarboxylaza âm tính Thường gặp cáctype O125, O157, O144…

♦ Nhóm VETEC (Verocytoxin produccing E.coli): Vừa gây tiêu chảyvừa là nguyên nhân gây viêm đại tràng xuất huyết (hermorrhagic colilic) vàlàm tổn thương mao mạch gây hiện tượng sưng phù (ederma) rất nguy hiểmđến tính mạng (do biến chứng) Nhóm VETEC bao gồm các type: O26, O11,O113, O145, O157 ; đây là ngoại độc tố vetec gây tiêu chảy Các biến chứngtrên do vi khuẩn tiết ra một trong 2 loại ngoại độc tố VT1 (verocytoxin) vàVT2 gây tác động thần kinh

Gần đây người ta phát hiện chủng E.coli mới ký hiệu là E.coli O157:H7.Chủng này đã gây ra những vụ ngộ độc lớn trên thế giới trong những năm gầnđây (theo CDC, Center for Disease Control and prevention của Mỹ) :

*Triệu chứng lâm sàng:

Bệnh tiêu chảy do ETEC thường bắt đầu đột ngột sau một thời gian ủbệnh ngắn 14- 50h Biểu hiện lâm sàng là tiêu chảy toàn nước, không có nhầymáu, ít khi có sốt và cú nụn Bệnh có thể diễn biến nhẹ, tự khỏi nhưng cũng

có thể diễn biến nặng giống tả

*Dịch tễ học

ETEC gây bệnh chủ yếu cho trẻ em và khách du lịch, thường gây ra các

vụ dịch nhỏ có tính chất lẻ tẻ Có một số vụ dịch tiêu chảy do ETEC đã đượcmiêu tả trong các y văn

- Ở trẻ em ETEC gây tiêu chảy chiếm tỷ lệ 10-31 % [41]

- Người ta thấy rằng trong số những người đi du lịch bị tiêu chảy thỡ cú

20 -40% là do ETEC

- Bệnh thường xảy ra vào mùa nóng ẩm.

- Bệnh lây qua thực phẩm và ít gặp hơn ở nguồn nước bị nhiễm khuẩn

Sự lây truyền qua thức ăn sam của trẻ cai sữa là rất quan throng đối với nhiễmbệnh ở trẻ nhỏ Hiếm gặp bệnh lây trực tiếp qua tay bị nhiễm khuẩn [17].[34]

- Sự lưu hành của bệnh là nhiễm trùng chủ yếu ở các nước đang pháttriển Ở các nước đang phát triển, trẻ em trong 3 năm đầu của cuộc đời nhiềulần bị nhiễm trùng đường tiêu hóa do ETEC Trẻ lớn và người lớn ít gặp hơn[17].[34].[39]

2 2.Các phương pháp xác định E.coli

2.2.1 Phương pháp định danh kinh điển

- Bệnh phẩm phân được cấy trên môi trường ức chế chọn lọc cho các vikhuẩn đường ruột như Endo, Mac- Conkey, DCL,SMAC Việc xác địnhE.coli dựa vào các tính chất sinh vật hóa học, nhưng chỉ khoảng 90% sốchủng E.coli lên men đường lactose, một số chủng DEC chủ yếu là các EIECkhông có khả năng lên men đường này Test indole dương tính ở 99% chủngE.coli Đây là test đơn giản nhất để phân biệt E.coli với các thành viên kháctrong họ vi khuẩn đường ruột Tiếp theo, định loại E.coli bằng kháng huyếtthanh mẫu đặc hiệu với các yếu tố kháng nguyên O, H, K Tuy nhiên phươngpháp này thường chỉ có giá trị phân biệt E.coli với các thành viên khác trong họ vikhuẩn đường ruột Nó hầu như cũng không thể phân biệt giữa các DEC với nhau

và DEC với các E.coli trong khuẩn chí ở đại tràng của người do các tính chất sinhvật hóa học của nhiều DEC giống nhau và giống E.coli khụng gõy tiờu chảy [11].[34]

- Các chủng E.coli được định type bằng cỏc khỏng huyết thanh mẫu [34].Trước khi có phương pháp định loại E.coli gây tiêu chảy dựa trên yếu tốđộc lực đặc hiệu, phương pháp định type bằng cỏc khỏng huyết thanh mẫuvới các yếu tố kháng nguyên O, H, K là một phương pháp chiếm ưu thế

- Ngày càng xuất hiện nhiều type huyết thanh ở cỏc nhúm DEC khác.Hơn nữa, các huyết thanh nhiều khi không có đủ để xác định các chủng DEC

- Đồng thời người ta cũng thấy với cùng một type huyết thanh có thể gây

ra các bệnh cảnh lâm sàng khác nhau thuộc hai nhóm DEC gây tiêu chảy khácnhau Ví dụ: bệnh cảnh lâm sàng do ETEC (tiêu chảy phân toàn nước không

có máu) và EIEC (tiêu chảy phân nhầy mũi) là hoàn toàn khác nhau nhưng cóthể có chung một type huyết thanh gây ra: O124: H9, O167: H9 [34]

- Do sự đa dạng về cấu trúc kháng nguyên nờn đó hạn chế độ nhạy và độđặc hiệu can phản ứng này Thêm vào đó phương pháp này cũng tốn kém vàmất rất nhiều thời gian do có quá nhiều tupe huyết thanh của E.coli Đồng thờimột số chủng vi khuẩn gây bệnh đường ruột khác có thể phản ứng chéo vớikháng huyết thanh can E.coli như Shigella, Samonella, V cholerae non01 [34]

2.3 Thử nghiệm tạo váng và gây ngưng kết hồng cầu

Thử nghiệm này tường được dùng để sàng lọc EAEC Độ nhạy và độ đặchiệu của thử nghiệm tạo vỏng trờn môi trường lỏng trong chẩn đoán EAECkhoảng 90% Hơn nữa nó cho kết quả nhanh, đơn giản, dễ thực hiện ở các la

bo vi sinh bệnh viện [11]

2.4 Phương pháp thử nghiệm trên động vật thực nghiệm

Một số thử nghiệm trên súc vật dựa trên đặc điểm độc lực can DEC đãđược thực hiện như phương pháp quai ruột dùng để phát hiện độc tố ruột ST,phương pháp thử nghiệm trên chuột đang bú, thử nghiệm Sereny…[34].Phương pháp này không những tốn kém mà còn thiếu sự tiêu chuẩn hóa( Nguyễn Vũ Trung, 2004)

2.5 Phương pháp miễn dịch

Một vài xét nghiệm miễn dịch đã được sử dụng như miễn dịch phóng xạ

và ELISA dùng để xác định các độc tố LT và ST của ETEC , Kỹ thuật ELISAdùng để phát hiện nhanh các chủng EPEC và EHEC thuộc nhóm huyết thanhO26 [34]

2.6 Phương pháp nuôi cấy trên tế bào

Các tế bào Hela, Hep-2… được dùng để xác định khả năng và cơ chếgây bệnh can DEC, đặc biệt là khả năng sinh độc tố và các gen quy định cácyếu tố độc lực Thử nghiệm bỏm dớnh trờn tế bào Hep-2 hiện nay vẫn đượccoi là “tiờu chuẩn vàng” để xác định EAEC Phương pháp này cũng có giá trịnhất định trong phân biệt cỏc nhúm E.coli bỏm dớnh và gây tiêu chảy Thửnghiệm bỏm dớnh trờn tế bào Hep-2 được thực hiện bằng cách cấy truyền cácchủng E.coli cần xác định trên tế bào 1lớp và ủ trong 3h ở điều kiện 37o C,khí trường có 5% CO2 Sau đú các tế bào này được rửa, trộn, nhuộm và kiểmtra dưới kính hiển vi khuẩn quang học có vật kính dầu Các kiểu cách bỏmdớnh trờn tế bào thể hiện rất rõ ràng [34]

Tuy nhiên phương pháp này không được sử dụng phổ biến vì rất phứctạp và tốn kém, đòi hỏi các chuyên gia nhiều kinh nghiệm cũng như chỉ thựchiện được ở một số rất ít những labo tiêu chuẩn

2.6 Kỹ thuật sinh học phân tử

Sự ra đời của kỹ thuật PCR đã đưa lại một cuộc cách mạng trong việcnghiên cứu, phân tich gen và hệ gen Trước đây, khó khăn lớn nhất trong việcphân tích gen nằm ở chỗ chúng là những đơn vị rất nhỏ, số lượng ít trong một

hệ gen phức tạp và khổng lồ Kỹ thuật PCR ra đời đã thay đổi tất cả, giúpchúng ta có thể tạo ra một số lượng lớn các bản sao của một đoạn DNA mongmuốn [4].[7]

Phản ứng PCR dựa trên nguyên lý tổng hợp DNA trong tế bào, trong đóDNA được nhân lên theo cơ chế bán bảo tồn Về nguyên tắc để bắt đầu quátrình tổng hợp DNA, hai sợi DNA làm khuôn mẫu bị tách ra dưới tác dụngcủa nhiệt độ Hai đoạn oligonucleotide từ 20-40 nucleotide gọi là mồi sẽ gắnvào các vị trí bổ sung trên đoạn DNA mẫu

Trong điều kiện của PCR, hai mồi sẽ được kéo dài về hai phía, tạo rađoạn DNA mới bổ sung với đoạn khuôn mẫu Với một cặp mồi đặc hiệu mộtđoạn DNA nào đó sẽ được tổng hợp sau mỗi chu kỳ của PCR Việc thao tácđược thực hiện trực tiếp trên chất liệu di truyền (đặc biệt trờn cỏc gen của vikhuẩn ) để khuyếch đại đặc hiệu trên hàng triệu hay hàng tỷ lần trong thờigian ngắn [7].[9].

Như vậy, số cặp mồi cần thiết sẽ tương ứng với số đoạn DNA cần khuếchđại Mỗi phản ứng PCR sẽ được thực hiện với sự tham gia của một cặp mồi đặchiệu Tuy nhiên trong nhiều trường hợp, việc tiến hành nhiều phản ứng PCR sẽmất khá nhiều thời gian và việc sàng lọc sẽ gây tốn kém [15]

Chính vì vậy, nhiều tác giả đã cải tiến đưa ra phương pháp sử dụngnhiều cặp mồi trong một phản ứng PCR, để cùng một lúc khuếch đại đượcnhiều đoạn DNA Trong chẩn đoán vi sinh, điều này đông nghĩa với việc pháthiện được nhiều tác nhân gây bệnh chỉ bằng một phản ứng PCR Kỹ thuật nàyđược gọi là PCR đa mồi Ưu điểm của PCR đa mồi là tiết kiệm được rất nhiềuthời gian và nguyên vật liệu

Tuy nhiên sự có mặt của một số chất trong phân như: sắc tố mật, muốimật, polysaccharid, các chất cặn bã, xơ từ thức ăn đó tiờu húa…và một lượnglớn DNA không phải từ E.coli sẽ ức chế phản ứng PCR, làm giảm đáng kể độnhạy và độ đặc hiệu của kỹ thuật Vấn đề đặt ra ở đây là làm sao chiết tách vàtinh sạch được DNA của các chủng E.coli gây tiêu chảy trực tiếp từ bệnh phẩm

Đó có một số phương pháp tách chiết và tinh sạch DNA trực tiếp từphân như phương pháp tách chiết dùng ethanol, phương pháp sắc ký lỏng cao

áp, phương pháp dung bi thủy tinh hoặc bi silic….[1] Đơn cử như phươngpháp dùng phenol và chloroform của Viện quân y Mỹ (AFRIMS) [42] Quytrình cụ thể như sau:

- 100mg phân được hòa trong 0,5ml nước muối sinh lý và ly tâm vớitốc độ 600rpm trong 3 phút, lấy nước nổi.

- Ly tâm tiếp với tốc độ 11000rpm trong 3 phút, lấy cặn

- Thờm 50àl dung dịch lyozyme, ủ 37o C/30 phỳt Thờm 150àl hỗn dịchproteinase K ủ 50oC trong vòng 30 phỳt Thờm 300àl dung dịch phenol bãohòa Ly tâm với tốc độ 11000rpm trong 3 phut lấy nước nổi

- Thờm 12àl dung dịch acetat natri 3.3M Thêm 330 àl cồn tuyệt đối đã

để lạnh, để ở nhiệt độ phòng 10 phút

- Ly tâm tiếp với tốc độ 12000rpm trong 15 phút, lấy cặn

- Rửa cặn bằng cách thêm 300 àl cồn 70o đã để lạnh và ly tâm với tốc độ11000rpm trong 10 phút, lấy cặn

- Làm khô cặn bằng bỡnh hỳt chân không trong 15 phút

* Hầu hết các phòng thí nghiệm VSATTP hiện nay ở Việt nam chưa pháthiện được độc tố không chịu nhiệt LT của E.coli trong thực phẩm Tại việndinh dưỡng quốc gia đó cú một đề tài nghiên cứu sử dụng kỹ thuật ELISA đểphát hiện độc tố LT trong thực phẩm, tuy nhiên do kỹ thuật này còn tương đốiphức tạp, tốn nhiều thời gian hơn so với que thử nhanh và giá thành cao nênvẫn chưa được áp dụng rộng rãi tại Việt Nam

Ngày nay kỹ thuật sắc ký miễn dịch (immunochromatographic) đang được

sử dụng rất rộng rãi trong các nghiên cứu và chẩn đoán như que thử nhanh pháthiện kháng nguyên bề mặt (HbsAg) của vius viêm gan B, hay que thử nhanh

để phát hiện V cholerae O1 và O139 trong các mẫu bệnh phẩm lâm sàng(Crystal Vc, dipstick)… Ở nghiên cứu của chúng tôi cũng dựa trên nguyên lýcủa kỹ thuật sắc ký miễn dịch (immunochromatographic), kháng thể tiểu đơn

vị B của độc tố LT đã được gắn hạt vàng được sử dụng để phát hiện nhanh,chính xác độc tố LT của ETEC trong các mẫu thực phẩm

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

2.1.1 Chủng vi khuẩn và plasmid

Tế bào vi khuẩn khả biến Escherichia coli chủng DH5α sử dụng cho

mục đích tỏch dũng và biểu hiện protein EltB, vector biểu hiện pGEX mangđoạn gen mã hóa cho protein EltB

2.1.2 Hóa chất, máy móc và thiết bị

- Máy PCR System 9700 (Applied Biosystem, Mỹ)

- Máy đọc trình tự gen ABI (Applied Biosystem)

- Máy điện di ngang Mupid (Nhật Bản)

- Máy soi gel và chụp ảnh tự động :Chemidoc EQ- Bio-Rad ( Mỹ)

- Máy Vortex (Mimishaker, IKA, CHLB Đức

- Máy ly tâm lạnh Beckman (USA) và máy ly tâm để bàn Eppendorf (Đức)

- Máy đo nồng độ DNA và độ đục vi khuẩn Eppendorf (Đức)

- Môi trường LB đặc

200ml LB đặc4g agarose→ môi trường LB đặc 2%

Khử trùng 121o C/20 phút

2.1.4 Cặp mồi sử dụng

Cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu này để tạo các điểm cắt của hai

enzym giới hạn là XhoI- R và BamHI – F ở hai đầu đoạn gen mó hoỏ cho

protein EltB có trình tự như sau

5’ CGCGGATCCGGAGCTCCTCAGTCTATTA 3’EltB BamHI-F

5’ CCGCTCGAGGTTTTCCATACTGATTGCCG 3’ EltB XhoI-R

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Sơ đồ nghiên cứu

Nghiên cứu được tiến hành theo sơ đồ như mô tả tại hình 2.1

Hình 2.1 Sơ đồ các bước thí nghiệm

Khuyếch đại gen EltB bằng

PCR

Tách dòng gen EltB

Đưa gen EltB vào vector biểu

hiện pGEX

Kiểm tra vector biểu hiện

chứa gen EltB

PCREnzym cắtSequencing

Biểu hiện protein tái tổ hợp

EltB

Kiểm tra Protein EltB bằng

Western blott

2.2.2 Các phương pháp nghiên cứu

2.2.2.1 Phương pháp đo quang phổ

Trên cơ sở mức độ hấp thụ ánh sáng khác nhau của base nitto trong cácmạch đơn và mạch kép của DNA có thể xác định hàm lượng DNA trong dịchchiết bằng các chỉ số hấp thụ quang phổ

Kiểm tra độ tinh sạch DNA trong dịch chiết dựa vào tỷ lệ A260/A280.Giá trị mật độ quang ở bước songs260nm (OD260nm) của các mẫu DNA chophép xác định nồng độ DNA trong dung dịch Protein có phổ hấp thụ cao nhất

ở bước sóng 280nm, đồng thời hấp thụ ở bước sóng 260nm, do vậy tỷ lệ A260/A280 biểu thị mức độ protein cũn sút trong dịch chiết DNA được coi là tinhsạch khi giá trị A260/A280 = 1,8 – 2,0

2.2.2.2 Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction)

Nguyên lý:

Kỹ thuật tổng hợp DNA nhân tạo cũng tuân thủ những nguyên tắc cơbản của sao chép DNA trong tế bào vi sinh vật như: Đoạn DNA cần được mởxoắn thành 2 mạch đơn, cần có các cặp mồi xuôi, ngược, cần nguyên liệu vàđiều kiện môi trường thích hợp và enzym DNA polymerase Tuy nhiên kỹthuật PCR cú khỏc là dùng nhiệt độ cao (95oC) để biến tính chuỗi DNA sợi

kép, kết hợp với enzym Taq DNA

polymerase chịu nhiệt và hệ thống điều khiển nhiệt thích hợp cho từng giaiđoạn phản ứng tổng hợp cùng với các đoạn mồi được thiết kế chủ động Kỹthuật PCR nhân bản lượng lớn DNA chỉ với một lượng nhỏ DNA ban đầu

Tiến hành:

- Sau khi đo nồng độ DNA khuụn , tớnh và tạo các nồng độ DNA củacác mẫu như nhau để khi đưa vào mỗi ống phản ứng thể tích DNA khuônđược giống nhau và đạt khoảng 200ng/ml