Vì ậy, nghiên cứu thực hiện nh m mục tiêu: xác định tỷ lệ các kiểu đột biến gen β-globin à xây dựng phả hệ theo dõi sự di truyền bệnh β-Thal trên bệnh nhân β-Thal ở khu ực ng b ng sông C
GIỚI THIỆU
Ý nghĩa của luận án
* Ý nghĩa về mặt khoa học, phục vụ công tác đào tạo:
Nghiên cứu đã cung cấp thêm số liệu khoa học về tỷ lệ các kiểu đột biến gen gây bệnh β-Thal, đồng thời phân tích sự di truyền của bệnh trong phả hệ của một số gia đình bệnh nhân tại khu vực Đồng bằng sông Cửu Long.
- Làm tiền đề cho các nghiên cứu tiếp theo
Nâng cao nhận thức về gen bệnh -Thal sẽ giúp giảm tỷ lệ mắc bệnh thalassemia, cải thiện chất lượng sống và kéo dài tuổi thọ cho những người bị ảnh hưởng.
- Sàng lọc và chẩn đoán trước sinh hạn chế chào đời các bé thể nặng, giảm gánh nặng cho gia đình và xã hội.
Luận án tốt nghiệp tiến sĩ - Khóa 2013 Trường ĐHC T
Chuyên ngành Công nghệ sinh học 3 Viện nghiên cứu & phát triển CNSH
Tính mới của luận án
- Nghiên cứu về bệnh -Thal trên cả 4 nhóm dân tộc: Kinh, Chăm, Khmer, Hoa ở khu vực Đồng bằng sông Cửu Long
- Nghiên cứu thực hiện theo định hướng mới:
Phối hợp nhiều kỹ thuật sinh học phân tử khác nhau giúp xác định hiệu quả và nhanh chóng các đột biến gây bệnh ở bệnh nhân mắc bệnh -Thal.
Nghiên cứu về bệnh -Thal rất toàn diện, tập trung vào nguyên nhân gây bệnh, bao gồm các kiểu đột biến và sự di truyền qua các thế hệ Bài viết cũng đề cập đến tầm quan trọng của tư vấn di truyền kết hợp với chẩn đoán trước sinh cho những người mang gen bệnh.
Chuyên ngành Công nghệ sinh học 4 Viện nghiên cứu & phát triển CNSH
LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU
Bệnh Beta thalassemia
Bệnh β-Thal là một rối loạn huyết học do đột biến gen gây giảm hoặc ngừng tổng hợp chuỗi β-globin trong phân tử hemoglobin (Hb), dẫn đến sự hình thành các hemoglobin bất thường và giảm khả năng vận chuyển khí trong cơ thể Khi đột biến gen ảnh hưởng đến chuỗi α-globin, bệnh được gọi là α-Thal Ngoài ra, có trường hợp cả hai chuỗi β và α đều bị thiếu hụt, được gọi là thể phối hợp α/β thalassemia.
Bệnh hemoglobin E (HbE) là do đột biến sai nghĩa tại vị trí nucleotide 129 của chuỗi β-globin, cụ thể là sự thay thế GAG bằng AAG, dẫn đến việc acid amin tại vị trí thứ 26, Glutamic acid, bị thay thế bằng Lysine Sự thay đổi này làm giảm số lượng chuỗi β-globin, do đó HbE được xem là một dạng β-Thal thể nhẹ.
2.1.1 Đặc điểm phân tử của bệnh Beta thalassemia
Gen β-globin nằm trên nhánh ngắn của nhiễm sắc thể số 11 (11p15.5), có chiều dài 73.308 cặp base và mã số U01317 trong ngân hàng gen Cấu trúc gen này bao gồm các gen theo trật tự: 5’– epsilon – gamma – G – gamma – A – delta – beta – 3’.
Gen β-globin dài 1606 cặp base, nằm ở vị trí nucleotide 5203272-
5204877 của NST số 11, tương ứng với nucleotide 62137-63742 của c m gen β-globin và đoạn khởi động sát đầu 5’ ở vị trí các nucleotide thứ 62061, 62106 và 62144
Gen β-globin bao gồm 3 exon và 2 intron, mã hóa cho chuỗi β-globin dài 146 acid amin Exon 1 nằm ở nucleotide 1-142, mã hóa cho các acid amin từ 1 đến 30, với acid amin đầu tiên bắt đầu từ nucleotide 50 Exon 2 ở nucleotide 273-495, mã hóa cho acid amin từ 31 đến 104, trong khi exon 3 bắt đầu từ nucleotide 1346-1606, mã hóa cho acid amin từ 105 đến 146 Các exon này tương ứng với 3 vùng cấu trúc và chức năng của chuỗi β-globin, trong đó exon 1 và exon 3 chủ yếu chứa các acid amin ưa nước, còn exon 2 chứa các acid amin kỵ nước Khi có đột biến gen, trình tự acid amin sẽ thay đổi, dẫn đến việc các acid amin ở bề mặt bị thay thế bằng các acid amin kỵ nước, gây ra sự thay đổi hóa học, giảm đàn hồi và làm mất ổn định của protein, tạo ra các chuỗi β-globin bị lỗi.
Luận án tốt nghiệp tiến sĩ - Khóa 2013 Trường ĐHC T
Chuyên ngành Công nghệ sinh học 5 Viện nghiên cứu & phát triển CNSH
Hình 2.1 Cấu trúc gen -Thal (Chanane Wanapirak et al, 2009)
2.1.2 Di truyền bệnh Beta thalassemia
Beta thalassemia là một bệnh di truyền lặn trên nhiễm sắc thể thường, tuân theo quy luật di truyền Mendel Nếu chỉ một trong hai bậc phụ huynh mang gen bệnh, có 50% khả năng con sinh ra sẽ là thalassemia dị hợp tử, trong khi không có trẻ nào đồng hợp tử bị bệnh Khi cả cha và mẹ đều là thalassemia dị hợp tử, khả năng sinh con bình thường là 25%, 50% khả năng con dị hợp tử và 25% khả năng con đồng hợp tử.
Hình 2.2 Di truyền bệnh -Thal
2.1.3 Cơ chế gây mất chức năng sinh học của các kiểu đột biến gen beta-globin
Các đột biến trên gen β-globin có thể làm thay đổi cấu trúc và số lượng phân tử Hb, dẫn đến sự hình thành các hồng cầu với nhiều biến đổi khác nhau Thông thường, các đột biến này làm giảm hoặc ngừng tổng hợp Hb bình thường, gây ra tình trạng nhược sắc và tăng sinh hồng cầu non trong tủy Đột biến gây thiếu hụt chuỗi β dẫn đến dư thừa chuỗi α, tạo thành các hạt tủa trên màng và nguyên sinh chất của hồng cầu Những hạt tủa này làm giảm độ mềm dẻo của màng hồng cầu, khiến chúng trở nên cứng và khó vượt qua các "màng lọc" ở lách.
Chuyên ngành Công nghệ sinh học 6 Viện nghiên cứu & phát triển CNSH
Hình 2.3 Hình dạng hồng cầu bất thường của bệnh nhân -Thal
Các hạt tủa làm tăng diện tích tiếp xúc của màng hồng cầu, khiến chúng dễ bị oxy hóa và phá hủy Sự thay đổi tính thấm của màng dẫn đến việc kali trong tế bào thoát ra ngoài huyết tương Những tác động này gây ra hiện tượng tan máu do hồng cầu bị vỡ sớm.
Sơ đồ 2.1 Cơ chế sinh bệnh do thừa chuỗi ở bệnh nhân -Thal β
Các hạt tủa trong tủy xương gắn lên nguyên sinh chất và màng của hồng cầu non, khiến chúng chết trước khi trưởng thành Điều này dẫn đến sự tăng sinh mạnh mẽ các hồng cầu trong tủy, gây ra biến dạng xương và tăng hấp thu sắt, dẫn đến nhiễm sắt trong cơ thể Hiện tượng hồng cầu non chết sớm là một vấn đề nghiêm trọng.
Luận án tốt nghiệp tiến sĩ - Khóa 2013 Trường ĐHC T
Chuyên ngành Công nghệ sinh học 7 Viện nghiên cứu & phát triển CNSH đã xác định rằng hiện tượng sinh hồng cầu không hiệu quả xảy ra do dư thừa chuỗi α, dẫn đến tuỷ xương không sản xuất hồng cầu hiệu quả Đây là cơ chế chính gây ra các biến đổi lâm sàng và huyết học ở bệnh nhân mắc bệnh β-Thal thể nặng Ở thể dị hợp tử, các biến đổi về hồng cầu tương tự như ở đồng hợp tử nhưng mức độ nhẹ hơn, chỉ gây ra hiện tượng thiếu máu nhẹ Đối với bệnh nhân thể nhẹ, sự mất cân bằng giữa chuỗi α và chuỗi β không nghiêm trọng, do đó hầu như không có biểu hiện lâm sàng của thiếu máu (Run, D et al, 1992).
2.1.4 Đột biến gây bệnh Beta thalassemia
Bệnh β-Thal có sự phân bố rộng rãi từ Địa Trung Hải, Trung Đông, Ấn Độ, Pakistan đến Đông Nam Á, với tần số cao ở một số vùng thuộc Liên Xô cũ và Trung Quốc Mặc dù bệnh này ít gặp ở châu Âu và châu Phi, nhưng sự di dân gần đây đã làm cho gen bệnh lan rộng, biến thalassemia thành một vấn nạn toàn cầu Đức, một quốc gia không nằm trong vành đai phân bố của bệnh β-Thal, là một ví dụ điển hình cho sự phát tán này.
Vào năm 2010, bệnh β-Thal chiếm 23,2% tổng số bệnh nhân mắc bệnh thiếu máu tại Đức Trong số 23.330 bệnh nhân β-Thal ở quốc gia này, chỉ có 3.693 người, tương đương 15,8%, có nguồn gốc bản địa Phần lớn, 84,2%, là những bệnh nhân di cư từ các quốc gia Địa Trung Hải ở phía nam châu Âu và Thổ Nhĩ Kỳ.
Bảng 2.1 Phân bố bệnh nhân theo các thể bệnh tại Đức
Thể bệnh - thal Số người (%) Dân nhập cư (%) Dân bản xứ (%)
Ngày nay, gần 200 kiểu ĐB khác nhau trên gen β-globin đã được mô tả
Có nhiều loại đột biến như đột biến điểm, đột biến khung và đột biến vô nghĩa xuất hiện trên tất cả các vùng của gen β-globin, bao gồm cả intron và vùng promoter Các đột biến này xuất hiện tùy theo kiểu và vị trí, ảnh hưởng đến việc tổng hợp chuỗi β, gây ra bệnh β-Thal với các mức độ thiếu máu khác nhau Các đột biến chủ yếu được phân loại thành các nhóm khác nhau.
Chuyên ngành Công nghệ sinh học 8 Viện nghiên cứu & phát triển CNSH
- Nhóm 1: đột biến gây mất hoàn toàn chuỗi β-globin, gọi là β 0 thalassemia: gồm các ĐB vô nghĩa, lệch khung hoặc ĐB cắt/nối RNA.
Hình 2.4 Bản đồ phân bố tỷ lệ bệnh -Thal và HbE ở Đông Nam Á (De
Nhóm 2 của thalassemia, được gọi là + thalassemia, liên quan đến các đột biến làm giảm tổng hợp chuỗi globin Các đột biến này có thể xảy ra ở đoạn khởi động, poly A, đầu 5’ hoặc đầu 3’ mà không có sự dịch mã, hoặc do quá trình cắt nối RNA Các đột biến này có thể được phân loại thành nhiều nhóm khác nhau.
Đột biến đoạn khởi động là một yếu tố quan trọng, với 18 đột biến được phát hiện, ảnh hưởng đến quá trình phiên mã bằng cách giảm khả năng gắn kết của enzyme RNA polymerase Những đột biến này dẫn đến sự giảm số lượng chuỗi β-globin, gây ra các biểu hiện lâm sàng của β-Thal thể trung gian, chẳng hạn như đột biến c.-78A>G (-28A>G).
Đột biến cắt/nối mRNA xảy ra sau quá trình phiên mã, khi mRNA được cắt và nối để loại bỏ intron Những đột biến này có thể dẫn đến việc mất hoàn toàn hoặc giảm một phần quá trình cắt/nối bình thường, hoặc tạo ra vị trí cắt/nối mới trong intron hoặc exon Điều này có thể gây ra các dạng thalassemia như 0 hoặc +, ví dụ như các đột biến c.92+1 G>T (IVS1.1 G>T) và c.316-197 C>T (IVS2.654 C>T).
+ Đột biếntạo mRNA không có chức năng:
Đột biến vô nghĩa: xảy ra khi thay thế một nucleotide này bằng một nucleotide khác làm xuất hiện mã dừng, gây chấm dứt dịch mã sớm tạo chuỗi
Luận án tốt nghiệp tiến sĩ - Khóa 2013 Trường ĐHC T
Phương pháp lập à phân tích phả hệ bệnh Beta thalassemia
hiện trên một bộ phận dân số, nước ta chưa có chương trình phòng bệnh thalassemia thật sự hiệu quả từ các nghiên cứu
Vào năm 2010, chương trình quốc gia đã chú trọng đến việc quản lý bệnh nhân thalassemia, với hy vọng rằng trong tương lai gần, sẽ có những chính sách đặc biệt để việc tầm soát, chẩn đoán trước sinh và tư vấn di truyền (TVDT) được thực hiện rộng rãi, nhằm nâng cao hiệu quả phòng bệnh.
2.2 Phương pháplập và phân tích phả hệ bệnh Beta thalassemia
2.2.1 Ý nghĩa của phương pháp nghiên cứu phả hệ
Phương pháp nghiên cứu phả hệ giúp phân tích tính trạng và bệnh tật có di truyền, xác định quy luật di truyền liên quan Phương pháp này được áp dụng để theo dõi tính trạng qua ít nhất ba thế hệ, từ đó dự đoán sự xuất hiện của các tính trạng hoặc bệnh tật ở thế hệ tiếp theo Ngoài ra, nó còn cho phép xác định người mang gen bệnh, tạo cơ sở cho cán bộ y tế cung cấp lời khuyên di truyền chính xác và hữu ích Điều này hỗ trợ các gia đình mong muốn sinh con và các cặp đôi trong độ tuổi kết hôn đưa ra quyết định đúng đắn khi lập gia đình.
Phả hệ đóng vai trò quan trọng trong các gia đình có bệnh di truyền như β-Thal, cung cấp thông tin về tiền sử gia đình Điều này không chỉ ảnh hưởng đến cuộc sống trong quá khứ mà còn định hình tương lai của những cá nhân có nguy cơ mắc bệnh Tiền sử gia đình có thể được sử dụng như một công cụ chẩn đoán, giúp bác sĩ chỉ định các xét nghiệm di truyền cho bệnh nhân và các thành viên có nguy cơ trong gia đình (Angastiniotis, M et al, 2013).
Nghiên cứu phả hệ trong gia đình bệnh nhân β-Thal có thể giúp loại trừ căn bệnh di truyền này thông qua tư vấn và thực hành tốt Việc nâng cao ý thức phòng bệnh cho thế hệ sau và cách chăm sóc bệnh nhân sẽ giúp giảm biến chứng và dễ dàng thấm nhuần vào ý thức của các thành viên trong phả hệ Điều này tạo ra cơ sở quý giá cho cá nhân và nhân viên y tế thực hiện các bước nhằm giảm nguy cơ và ngăn chặn sự xuất hiện của bệnh trong gia đình.
Phương pháp phả hệ là một phương pháp kinh điển và phổ biến trong nghiên cứu, giúp tiên đoán các bệnh tật di truyền, bao gồm cả bệnh β-Thal.
Luận án tốt nghiệp tiến sĩ - Khóa 2013 Trường ĐHC T
Chuyên ngành Công nghệ sinh học 19 Viện nghiên cứu & phát triển CNSH
2.2.2 Phương pháp lập phả hệ
Mỗi cá thể trong phả hệ được gán một ký hiệu theo quy ước quốc tế, phản ánh giới tính, tình trạng bệnh tật cần phân tích, và khả năng mang gen bệnh lặn.
Sơ đồ phả hệ thường được vẽ theo hình bậc thang, từ trên xuống theo thứ tự các thế hệ ông bà, cha mẹ, con cháu.
Mỗi thế hệ trong phả hệ được thể hiện như một bậc thang, với các con của một cặp bố mẹ được ghi từ trái sang phải, bắt đầu từ người con lớn nhất Bệnh nhân đến khám sẽ được bác sĩ hỏi và tìm hiểu về các thành viên khác trong phả hệ để lập sơ đồ phả hệ Đương sự được đánh dấu bằng một mũi tên bên dưới ký hiệu, và phía bên trái mỗi thế hệ sẽ ghi các chữ số tương ứng.
La mã được sử dụng để chỉ thứ tự các thế hệ trong phả hệ, với các chữ số Ả Rập bên phải mỗi thành viên để xác định số thứ tự trong thế hệ đó Khi theo dõi một tính trạng qua nhiều thế hệ và nhiều cá thể, sơ đồ phả hệ hình bậc thang không đủ để chứa tất cả các cá thể, do đó phả hệ được lập theo hình cung (Trịnh Văn Bảo và ctv, 2008).
Hình 2.6 Một phả hệ điển hình của di truyền alen trội nhiễm sắc thểthường
Khi phân tích phả hệ, cần nắm rõ mối quan hệ huyết thống của các cá thể trong sơ đồ, sự biểu hiện bệnh liên tục hoặc ngắt quãng qua các thế hệ, cũng như mức độ biểu hiện bệnh nặng hay nhẹ và sự khác biệt giữa nam và nữ.
Trong một phả hệ có bệnh di truyền, tần số mắc bệnh giảm dần theo mức độ quan hệ huyết thống Cụ thể, họ hàng bậc một như bố mẹ, anh chị em ruột và con cái có tỷ lệ mắc bệnh cao nhất Tỷ lệ này tiếp tục giảm ở họ hàng bậc hai như ông bà, chú bác, cô dì ruột và cháu ruột, và cuối cùng là họ hàng bậc ba.
Chuyên ngành Công nghệ sinh học tại Viện nghiên cứu & phát triển CNSH cho phép chúng ta kết hợp quy luật di truyền trong phả hệ để dự đoán khả năng xuất hiện bệnh tật cho thế hệ tiếp theo.
2.2.4 Các ký hiệu d ng để lập gia hệ Ý nghĩa của các ký hiệu Ký hiệu theo hệ thống quốc tế
Người kiểu hình lành mang gen lặn trên NST thường
Người kiểu hình lành mang gen lặn liên kết NST X
Người chưa có thông tin hoặc thông tin không đầy đủ về tính trạng
Người không được kiểm tra hoặc cũng bị bệnh Đương sự
Vợ chồng ngoài giá thú
Luận án tốt nghiệp tiến sĩ - Khóa 2013 Trường ĐHC T
Chuyên ngành Công nghệ sinh học 21 Viện nghiên cứu & phát triển CNSH
Hôn nhân cùng huyết thống
Hôn nhân không có con
Anh chị em cùng bố mẹ
Hai hôn nhân với các con của mỗi hôn nhân
Số con riêng không biết
Con nuôi (không cùng huyết thống
Con sinh đôi một hợp tử
Con sinh đôi hai hợp tử
Không r kiểu sinh đôi là một hay hai hợp tử
Các thế hệ I, II, III, IV
Anh chị em cùng một thế hệ 1, 2, 3, 4…
2.3 Tư vấn di truyền và các phương pháp chẩn đoán trước sinh phòng bệnh Beta thalassemia
2.3.1 Tư ấn di truyền cho bệnh nhân Beta thalassemia
Tư vấn di truyền giúp bệnh nhân và người thân hiểu rõ về hậu quả của rối loạn di truyền, nguy cơ mắc bệnh, cũng như các biện pháp ngăn ngừa và cải thiện tình trạng bệnh.
Tư vấn di truyềncần thực hiện được các yêu cầu:
+ Chẩn đoán chính xác thể bệnh ở các thành viên trong gia đình
Chuyên ngành Công nghệ sinh học 22 Viện nghiên cứu & phát triển CNSH
+ Giải thích về bản chất của bệnh và dự báo các biểu hiện, rối loạn, cách điều trị cần thiết và nơi có thể điều trị.
Ước lượng nguy cơ di truyền bệnh tật của cha mẹ và các thành viên trong gia đình là một quá trình quan trọng Điều này thường yêu cầu việc vẽ phả hệ và có thể cần điều tra thêm các thành viên khác trong dòng họ để có cái nhìn toàn diện hơn về di truyền.
Truyền đạt các nguy cơ di truyền của bệnh và các biện pháp phòng ngừa là rất quan trọng, đặc biệt đối với cha mẹ và các thành viên trong gia đình khi có kế hoạch sinh con Hỗ trợ cá nhân hoặc cặp đôi trong việc đưa ra quyết định phù hợp với hoàn cảnh của họ là cần thiết để giảm thiểu rủi ro di truyền.
+ Những người có nguy cơ thường cần được tư vấn và hỗ trợ tại một số điểm trong cuộc đời nên TVDT cần phải tiếp cận lâu dài.
Theo Liên đoàn Thalassemia Thế giới, công tác phòng chống bệnh thalassemia (TVDT) hiện nay là một thách thức phức tạp TVDT gắn liền với chẩn đoán di truyền để xác định nguyên nhân bệnh và cách chăm sóc, kiểm soát sức khỏe cho bệnh nhân Việc cung cấp thông tin chính xác cho bệnh nhân và gia đình là rất quan trọng, và thành công của TVDT phụ thuộc vào việc gia đình có kiến thức đầy đủ và thực hành đúng.