Trong phần 2 này chúng ta sẽ đến với các bài báo như sau: 1. GIẢI TRÌNH TỰ GEN THẾ HỆ MỚI: CUỘC CÁCH MẠNG TRONG CHẨN ĐOÁN VÀ NGHIÊN CỨU Y SINH HỌC 2. CẬP NHẬT KHẢ NĂNG CÁC XÉT NGHIỆM SINH HỌC PHÂN TỬ TRONG VIÊM GAN SIÊU VI MẠN TÍNH
Trang 1GIẢI TRÌNH TỰ GEN THẾ HỆ MỚI: CUỘC CÁCH MẠNG
TRONG CHẨN ĐOÁN VÀ NGHIÊN CỨU Y SINH HỌC
NEXT GENERATION SEQUENCING: THE REVOLUTION IN DIAGNOSIS AND
BIO-MEDICAL RESEARCH
Phạm Hùng Vân*, Nguyễn Đỗ Phúc**
TỪ GIẢI TRÌNH TỰ SANGER Giải trình tự là tìm ra được thứ tự sắp xếp
của 4 loại nucleotide A, T, C và G trên một đoạnDNA Kỹ thuật giải trình tự của Sanger gồm haigiai đoạn: (1) Giai đoạn đầu gọi là giai đoạn
phản ứng giải trình tự là dùng enzyme
polymerase để nhân bản đoạn DNA muốn giải
Hình 1: Hai giai đoạn của giải trình tự Sanger một đoạn gene (DNA) với giai đoạn đầu là giai đoạn phản ứng giải trình tự và giai đoạn kế là giai đoạn điện di giải trình tự (P.H.Vân vẽ 2012)
Đại học Y dược thành phố Hồ Chí Minh ** Viện Vệ sinh – Y tế Công cộng thành phố Hồ Chí Minh
Tác giả liên lạc: Ts.Bs.Phạm Hùng Vân ĐT: 0903698920 Email: phhvan.nkbiotek@gmail.com
Trang 2trình tự thành các đoạn cách biệt nhau chỉ có
một nucleotide tận ở đầu 3’ và nucleotide tận
này có thể nhận diện được nhờ kỹ thuật đánh
dấu huỳnh quang trên chính nucleotide tận đó
hay đánh dấu huỳnh quang trên mồi; (2) Giai
đoạn kế gọi là giai đoạn điện di giải trình tự là
dùng điện di độ phân giải cao (điện di bản gel
polyacrylamide hay diện di mao quản) để sắp
xếp các đoạn trình tự dài ngắn khác nhau theo
kích thước (ngắn trước, dài sau dù chỉ cách
nhau có một nucleotide) và chính nhờ thứ tự
này mà biết được thứ tự sắp xếp các nucleotide
của trình tự đoạn DNA được giải trình tự này
(hình 1) Kể từ khi được phát minh bởi F Sanger
vào năm 1977 đến nay(11,12,10), kỹ thuật giải trình
tự Sanger đã có những bước tiến vượt bậc về
hóa chất cho phản ứng giải trình tự và thiết bị
cho điện di giải trình tự do vậy mà kỹ thuật giải
trình tự có thể triển khai được khá dễ dàng tại
các phòng thí nghiệm, kể cả phòng thí nghiệm
lâm sàng(5) Không chỉ vậy, ứng dụng của giải
trình tự không chỉ trong nghiên cứu mà cả trong
chẩn đoán Xin kể ra đây một số các công dụng
của giải trình tự(5): (1) Giải trình tự để biết được
trình tự nucleotide của bất cứ một đoạn DNA
nào đó và đây chính là cơ sở để các nhà khoa
học có thể giải trình tự gene hay bộ gen cho các
nghiên cứu có liên quan; (2) Giải trình tự để
phát hiện các thay đổi của trình tự nucleotide
của một đoạn DNA và đây là cơ sở để phát hiện
các đột biến gene (liên quan đến ung thư, đến
kháng thuốc), các SNP (trong cá nhân hóa các
liệu pháp điều trị), các kiểu gene (genotype của
virus gây bệnh)…; (3) Định danh vi khuẩn hay
vi nấm dựa trên giải trình tự DNA của gene qui
định RNA của ribosome (16S của vi khuẩn và
28S của vi nấm) đặc biệt là các tác nhân khó
định danh hay thất bại nuôi cấy từ mẫu thử; (4)
Ngoài ra công nghệ điện di độ phân giải cao đặc
biệt là công nghệ điện di mao quản tự động
được sử dụng trong giải trình tự còn được áp
dụng trong phân tích đoạn (fragment analysis)
tức là phân tích để phân biệt được các đoạn
DNA có kích thước khác biệt nhau chỉ vài
nucleotide và áp dụng này được sử dụng trongxét nghiệm dấu vân tay DNA (DNA fingerprinting) để nhận dạng cá nhân và mối quan hệ
cá nhân (pháp y), trong chẩn đoán tiền sanh,trong phát hiện đa dạng loài…
ĐẾN PYROSEQUENCING
Khác với giải trình tự Sanger là kỹ thuật giảitrình tự phải có hai giai đoạn và giai đoạn giảitrình tự được thực hiện sau phản ứng giải trìnhtự; Trong pyrosequencing, giải trình tự đượcthực hiện ngay trong giai đoạn tổng hợp sợiDNA bổ sung cho sợi khuôn được giải trình tự,nghĩa là tổng hợp sợi DNA bổ sung đến đâu thìgiải trình tự đến đó mà không phải chờ sau khitổng hợp sợi bổ sung rồi mới đem điện di đểgiải trình tự Pyrosequencing được Pål Nyrén vàMostafa Ronaghi tại Viện Kỹ Thuật Hoàng GiaThuỵ Điển phát minh năm 1996(4,8,7) Nguyên tắccủa kỹ thuật giải trình tự trong pyrorequencing
là ghi nhận tín hiệu phát quang từ giếng phảnứng mỗi khi sợi bổ sung dựa trên sợi khuôn kéodài được một nucleotide Để làm được điều này,
Hình 2: Nguyên tắc của kỹ thuật pyrosequencing
Trang 3dung dịch chứa các loại nucleotide A, hay T, hay
C, hay G được lập trình để cho vào giếng phản
ứng (có chứa đoạn DNA muốn giải trình tự, mồi
giải trình tự, và các thành phần cho phản ứng
tổng hợp sợi khuôn); và mỗi khi dung dịch
nucleotide cho vào là đúng với nucleotide được
bắt cặp vào sợi khuôn để tổng hợp sợi bổ sung
thì một pyrophosphate (PPi) sẽ được phóng
thích ra để được enzyme sulfurylase tạo ra một
ATP, ATP này sẽ giúp hệ thống phát quang
luciferin-luciferase (cũng được cho vào cùng lúc)
phát ra ánh sáng do men luciferase oxide hóa
được luciferin thành oxyluciferin và phát ra ánh
sáng (hình 2) Với sự ghi nhận tín hiệu phát
quang từ ống phản ứng theo trình tự bổ sung
dung dịch các loại nucleotide, thiết bị
pyrosequencing sẽ dịch ra trình tự các
nucleotide trên đoạn DNA được giải trình tự
Do ATP được sử dụng để làm hệ thống
luciferin-luciferase phát quang nên trong dung
dịch dNTP cho vào giếng phản ứng, dATP-S
được sử dụng để thay thế dATP vì dATP-S
không có hoạt tính của ATP Ngoài ra, để có thể
huỷ được ATP và các nucleotide tự do còn thừa
sau mỗi lần bổ sung nucleotide, men apyrasecũng được cho vào giếng phản ứng sau khi tínhiệu phát quang được ghi nhận
Pyrosequencing là một bước ngoặc về kỹthuật trong giải trình tự, cho phép giải trình tựngay trong quá trình tổng hợp sợi bổ sung chođoạn DNA giải trình tự, do vậypyrosequencing chính là công nghệ khởi đầucho kỹ thuật giải trình tự bằng tổng hợp(sequencing by synthesis, SBS), nền tảng của
kỹ thuật giải trình tự bộ gene hay còn gọi là
kỹ thuật giải trình tự thế hệ mới (nextgeneration sequencing) sau này Với ưu thếthời gian giải trình tự nhanh, trình tự giảiđược rất chính xác, cường độ phát quang địnhlượng được nên dù trình tự giải đuợc khôngdài (không quá 100 bases) nhưngpyrosequencing cũng có nhiều ứng dụng có
ưu thế hơn kỹ thuật giải trình tự Sanger, đặcbiệt là trong phát hiện và định lượng các độtbiến là một áp dụng rất quan trọng trong chẩnđoán, tiên đoán dự hậu và chỉ định điều trịđích phân tử ung thư(1,6)
G (67%),
A (33%
Hình 3 : Kết quả phát hiện và định lượng đột biến KRAS với hình bên trái tỷ lệ đột biến codon 12 (GGT
thành GAT) là 50% vì cường độ phát quang của G là gấp 150% so với cường độ phát quang bình thường còn cường độ phát quang của A tiếp theo đó chỉ đạt 50% bình thường và hình bên phải tỷ lệ đột biến là 33% vì cường độ phát quang của G là gấp 167% so với cường độ phát quang bình thường còn cường độ phát quang của A tiếp theo đó chỉ đạt 33% bình thường (Hình từ Internet)
Trang 4Hình 3 là một ví dụ cho thấy
pyrosequencing có thể phát hiện các tỷ lệ đột
biến KRAS mà kỹ thuật giải trình tự Sanger
không thể làm được vì cường độ huỳnh quang
ghi nhận được trong Sanger là không định
lượng được Hiện nay đã có nhiều bộ thuốc thử
đã được chấp nhận IVD (In-Vitro Diagnosis)
trong phát hiện các đột biến gene ung thư liên
quan đến chỉ định và theo dõi điều trị đích, định
lượng các CpG với C bị gắn methyl (Cytosine
methylation) để tiên đoán ung thư, phát hiện
đột biến gene trong chẩn đoán và sàng lọc bệnh
di truyền, và đặc biệt trong vi sinh lâm sàng là
định danh các vi khuẩn Ngoài ra, kỹ thuật
pyrosequencing là một kỹ thuật mở cho phép
các nhà nghiên cứu có thể thiết kế các qui trình
pyrosequencing cho các mục đích khác nhau tùy
theo các đề án của mình Chính vừa là kỹ thuật
mở, vừa có sẵn các bộ thuốc thử thương mại, do
vậy pyrosequencing là một kỹ thuật không thể
thiếu trong các phòng thí nghiệm sinh học phân
tử vì vừa có thể sử dụng cho các dịch vụ chẩn
đoán lâm sàng, vừa làm công cụ cho nghiên
cứu
Trang 6Tách rời và tóm bắt các
mảnh DNA được giải trình tự
lên các giá bám
Dùng PCR với mồi đặc hiệu
adapter để khuếch đại các
mảnh DNA trên giá bám
thành từng clone
Thực hiện giải trình tự bằng tổng hợp (SBS)
Hình 4: Ba giai đoạn của giải trình tự thế hệ mới (1) Tách rời và
tóm bắt các mảnh DNA được giải trình tự lên các giá bám; (2) Dùng
PCR với mồi đặc hiệu adapter để khuếch đại các mảnh DNA trên giá
bám thành từng clone; (iii) Thực hiện giải trình tự bằng tổng hợp
(P.H Vân vẽ 2012)
Trang 7Giải trình tự thế hệ mới – một bước tiến
nhảy vọt về công nghệ
Đây là một cuộc cách mạng về công nghệ
giải trình tự vì nếu giải trình tự Sanger chỉ cho
phép giải trình tự không quá 1500bps, hay
pyrosequencing không quá 100bps, thì giải trình
tự thế hệ mới cho phép giải được từ 8Gbases
đến 600Gbases, có nghĩa là cho phép giải trình
tự nguyên bộ gene Do vậy giải trình tự thế hệ
mới còn được gọi là giải trình tự bộ gene (whole
genome sequencing) Về nguyên tắc hoạt động,
kỹ thuật giải trình tự thế hệ mới là giải trình tự
bằng tổng hợp (SBS) bao gồm các giai đoạn
chính sau đây (hình 4):
.(1) Tách rời và tóm bắt các mảnh DNA được
giải trình tự lên các giá bám: Trước hết DNA bộ
gene được bẻ gãy thành các mảnh DNA ngắn
nhờ siêu âm hay nhờ khí dung, sau đó các
mảnh DNA ngắn này được gắn vào hai đầu các
đoạn trình tự ngắn gọi là adapter (có hai loại:
một có trình tự nhận biết bởi các đoạn dò được
gắn trên các giá bám, một được nhận biết bởi
trình tự mồi PCR) Các mảnh DNA này sẽ được
tóm bắt trên các giá bám là các hạt nano (Roche
hay ABI) hay trên các vi bản (Illumina) nhờ các
đoạn dò đặc hiệu adapter đã gắn sẵn trên các
giá bám này Phải pha loãng các mảnh DNA đã
gắn adapter ở nồng độ thích hợp để nếu giá
bám là các vi hạt thì đa số sẽ chỉ có một mảnh
DNA được tóm bắt hay nếu giá bám là vi bản
thì các mảnh DNA bị tóm bắt phải cách xa nhau
(2) Dùng PCR với mồi đặc hiệu adapter để
khuếch đại các mảnh DNA trên giá bám thành từng
clone: Nếu giá bám là vi bản thì thuốc thử PCR
được bơm trải lên vi bản và khi thực hiện PCR
sẽ có từng clone sản phẩm khuếch đại được tóm
bắt trên các vị trí tách rời nhau trên vi bản; nếu
giá bám là các vi hạt thì phải nhủ hoá thuốc thử
PCR để đa số các giọt nhủ là chỉ chứa một vi hạt
nhờ vậy mà khi thực hiện PCR mỗi vi hạt sẽ chỉ
có một clone sản phẩm khuếch đại bám lên Sau
khi giải bỏ dạng nhủ dịch, các vi hạt sẽ được
bơm vào một bản chip có chứa hàng chục ngàn
đến hàng trăm ngàn giếng kích thước nano gọi
là nano-well và kích thước này cho phép mỗinano-well chỉ chứa được một vi hạt mà thôi
(3) Thực hiện giải trình tự bằng tổng hợp:
Nguyên tắc của giai đoạn thực hiện giải trình tựnày cũng gần giống nguyên tắcpyrosequencing, tuy nhiên có một số điểm khácbiệt, đó là: (i) Thay vì phải huỷ bỏ các thànhphần A T, C, và G trong thuốc thử đã cho vàogiếng phản ứng trước khi cho thuốc thử mớivào như pyrosequencing thì trong giải trình tựthế hệ mới, thuốc thử giải trình tự được thổichảy vào chip nano-well hay vi bản theo chươngtrình và sau khi ghi nhận được tín hiệu thì thuốcthử cũ sẽ được thổi chảy ra để thuốc thử mới lạiđược bơm vào (ii) Tín hiệu tổng hợp được ghinhận sau mỗi lần bơm thuốc thử vào có thể làtín hiệu phát quang dựa trên hệ thống luciferin-luciferase (454 của Roche)(3,13), tín hiệu điện dothay đổi pH (Ion-Tolent hay Ion-Proton củaABI)(9), tín hiệu huỳnh quang được đánh dấutrên các nucleotide A, T, C hay G (Solexa củaIllumina)(2), hay cũng có thể là tín hiệu huỳnhquang được gắn lên probe (solid của ABI)(14) (iii)Tổng hợp mạch bổ sung dựa trên mạch khuôn
có thể là kéo dài đầu 3’ của mạch bổ sung bằngcác nucleotide (A, T, C hay G) và cứ mỗi khi mộtnucleotide được kéo dài thì sẽ có một tín hiệuphát quang (Roche) hay huỳnh quang(Illumina) được ghi nhận, hay có thể là kéo dàiđầu 3’ của mạch bổ sung mỗi lần 2 base nhờ sựkéo dài và nối probe dựa trên sợi khuôn và cứmỗi khi tổng hợp được 2 base thì sẽ có một tínhiệu huỳnh quang được ghi nhận (Solid củaABI) Thứ tự của các lần thổi thuốc thử giải trình
tự vào chip nano-well hay vào vi bản được máytính ghi lại đồng thời với thứ tự và cường độ tínhiệu tổng hợp sợi bổ sung của từng clone DNAbám lên vi bản hay trên vi hạt, nhờ vậy mà sẽgiải được trình tự của các mảnh DNA trên từngclone bám trên vi bản hay trên các vi hạt Vì cóđến hàng chục ngàn đến hàng trăm ngàn clonenên sẽ có hàng chục ngàn đến hàng trăm ngàntrình tự sẽ giải được tương ứng với hàng chục
Trang 8ngàn đến hàng trăm ngàn mảnh DNA từ bộ
gene sẽ giải được Các trình tự của các mảnh
DNA giải được sẽ được phần mềm của thiết bị
nối lại với nhau bằng cách so chuỗi tìm các trình
tự trùng lặp nhau ở hai đầu và như vậy là sẽ có
kết quả của trình tự nguyên bộ gene
Giải trình tự thế hệ mới và các ứng dụng
cách mạng trong chẩn đoán và nghiên cứu
Giải trình tự thế hệ mới thật sự là một cuộc
cách mạng trong công nghệ giải trình tự nói
riêng và trong công nghệ sinh học phân tử nói
chung
Với các tiến bộ về thiết bị và thuốc thử, hiện
nay giải trình tự bộ gene của một cá nhân không
còn là một nghiên cứu chỉ thực hiện được tại các
trung tâm giải trình tự lớn trên thế giới mà có
thể được thực hiện tại các phòng thí nghiệm
trung bình có thiết bị giải trình tự thế hệ mới
như solid, solexa, ion-proton, 454…và thời gian
để có kết quả không phải kéo dài đến hàng năm
mà chỉ trong vài ngày, thậm chí chỉ trong 24 giờ
với giá thành không phải đến hàng triệu dolla
mà chỉ cần vài ngàn dolla Đối với giải trình tự
bộ gene vi khuẩn hay virus thì giải trình tự thế
hệ mới có thể thực hiện được một cách dễ dàngvới các thiết bị có công suất nhỏ khoảng 6 đến10Gbases chứ không cần phải đến hàng trămGbases
Giải trình tự thế hệ mới là một công cụmạnh nhất để phát hiện được các tác nhânnhiễm trùng bí mật vì với khả năng giải đượchàng trăm ngàn mảnh DNA có trong mẫu thửthì công nghệ này rất dễ dàng lôi ra ánh sángbất cứ một trình tự nucleic acid của bất cứ tácnhân gì có mặt trong mẫu thử lấy từ vật chủ haybệnh nhân
Giải trình tự thế hệ mới cũng là công cụnhạy cảm nhất để có thể phát hiện các đột biếncho dù tỷ lệ đột biến hiện diện trong mẫu thử làrất thấp, chỉ vài đột biến trong cả một quần thểkhông đột biến, chính vì vậy giải trình tự thế hệmới là một công cụ không thể thiếu được trongphát hiện và định lượng các đột biến trong ungthư, trong bệnh di truyền…
Hình 5: Hai cách đánh dấu barcode các mảnh DNA (sản phẩm PCR) trước khi đưa vào SBS (giải trình tự bằng
tổng hợp)(P.H.Vân vẽ 2012)
PCR với mồi gắn barcode ở đầu 5’
Trang 9Một ứng dụng đặc biệt nữa của giải trình tự
thế hệ mới, đó là chẩn đoán tiền sanh phát hiện
dị bội của thai nhi bằng phân tích DNA của bào
thai hiện diện trong máu mẹ dựa trên ưu điểm
độ nhạy cao của kỹ thuật Chính nhờ ứng dụng
này mà trong tương lai các chẩn đoán tiền sanh
phát hiện dị bội trong thai nhi không còn là một
xét nghiệm xâm lấn phải lấy mẫu chọc nước ối
nữa mà chỉ cần xét nghiệm trên máu mẹ mà
thôi
Ngoài ra, một câu hỏi mà nhiều nhà nghiên
cứu đặt ra là liệu SBS có thể giải trình tự các sản
phẩm PCR để phát hiện đột biến hay không vì
liệu SBS có thể phân biệt các trình tự được giải là
của sản phẩm PCR nào? Câu hỏi này thật ra đã
được kỹ thuật barcode (mã vạch) của SBS giải
quyết, đó là gắn lên adapter các mã vạch là thứ
tự đã biết của các nucleotide (A, T, C, và G) hay
sử dụng các mồi có có đầu 5’ được thêm các
trình tự barcode đã biết của các nucleotide, nhờ
vậy mà với một hỗn hợp của nhiều sản phẩm
PCR được giải trình tự bởi SBS, nhờ trình tự
nucleotide trên barcode, có thể nhận diện được
trình tự được giải là của sản phẩm PCR nào
(hình 5)
Chính vì có nhiều ứng dụng không chỉ
trong nghiên cứu mà cả trong chẩn đoán phục
vụ nhiều khoa lâm sàng khác nhau như vậy nên
chúng ta nhất thiết phải trang bị và thuần thục
kỹ thuật giải trình tự thế hệ mới này
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1 Baysal BE et al (2004) Analysis of CHEK2 gene for ovarian cancer susceptibility Gynecol Oncol, Oct 2004; 95(1): 62-69.
2 Mardis ER (2008) "Next-generation DNA sequencing
methods" Annu Rev Genomics Hum Genet 9: 387–402
3 Margulies M, Egholm M, Altman WE et al (2005) "Genome Sequencing in Open Microfabricated High Density Picoliter Reactors" Nature 437 (7057): 376–80.
4. Nyrén, P (2007) "The History of Pyrosequencing" Methods
Mol Biology 373: 1–14.
5 Phạm Hùng Vân (2009) PCR và real-time PCR – Những vấn
đề cơ bản và các áp dụng thường gặp Nhà Xuất Bản Y Học.
6 Poehlmann, A.et al (2007) "K-ras mutation detection in colorectal cancer using the Pyrosequencing technique."Pathol Res Pract.203, 489-97.
7 Ronaghi et al.; Karamohamed, S; Pettersson, B; Uhlén, M; Nyrén, P (1996) "Real-time DNA sequencing using detection
of pyrophosphate release" Analytical Biochemistry 242 (1): 84–9
8 Ronaghi et al.; Uhlén, M; Nyrén, P (1998-07-17) "A sequencing method based on real-time pyrophosphate" Science 281 (5375): 363.
9 Rusk, N (2011) "Torrents of sequence." Nat Meth 8(1): 44
44-10 Sanger F (8 Dec 1980) Determination of nucleotide sequences in DNA Nobel lecture.
11 Sanger F, Coulson AR (1975) "A rapid method for determining sequences in DNA by primed synthesis with
DNA polymerase" J Mol Biol 94 (3): 441–8.
12 Sanger F, Nicklen S, Coulson AR (1977) "DNA sequencing with chain-terminating inhibitors" Proc Natl Acad Sci U.S.A 74 (12): 5463–7.
13 Schuster SC (2008) "Next-generation sequencing transforms
today's biology" Nat Methods 5 (1): 16–8.
14 Valouev A, Ichikawa J, Tonthat T et al (July 2008) "A resolution, nucleosome position map of C elegans reveals
high-a lhigh-ack of univershigh-al sequence-dicthigh-ated positioning" Genome Res 18 (7): 1051–63.
Trang 10CẬP NHẬT KHẢ NĂNG CÁC XÉT NGHIỆM SINH HỌC PHÂN TỬ
TRONG VIÊM GAN SIÊU VI MẠN TÍNH
UPDATE THE POSSIBILITIES OF THE MOLECULAR TESTINGS
IN CHRONIC VIRAL HEPATITIS
Phạm Hùng Vân*, Võ Đức Xuyên An**
XÉT NGHIỆM SINH HỌC PHÂN TỬ TRONG
VIÊM GAN B
Xét nghiệm phát hiện và định lượng
HBV-DNA
Đa số người bị nhiễm virus viêm gan B thì
sẽ có được đáp ứng miễn dịch bảo vệ, tức là sẽ
tạo được kháng thể chống HBsAg (gọi là
anti-HBsAg) và tiêu diệt được virus viêm gan B
Người đó khi thử máu sẽ dương tính
anti-HBsAg Tuy nhiên có một số người hệ miễn
dịch lại không thể tạo ra được kháng thể bảo vệ
này nên thử máu lúc nào cũng dương tính với
HBsAg Trong cơ thể của người đó có một sự
đấu tranh qua lại giữa hệ miễn dịch và virus
Nếu hệ miễn dịch cân bằng được hay ưu thế
hơn thì sẽ kiềm hãm không cho virus nhân bản
được thành các virus hoàn chỉnh do vậy mà sẽ
không có hay sẽ có rất ít virus hoàn chỉnh vào
trong máu Những trường hợp này được gọi là
người lành mang virus, nếu thử máu sẽ thấy
HBsAg dương tính nhưng dấu hiệu cho thấy có
virus hoàn chỉnh là HBV-DNA, tức là acid nhân
của virus, thường âm tính hay dương tính với
số lượng (số copies) rất thấp (<105/ml) Nhưng
nếu hệ miễn dịch không kiềm hãm được mà để
virus thắng thế thì chúng sẽ nhân bản được
nhiều trong tế bào gan tạo ra được nhiều virus
hoàn chỉnh vào máu của bệnh nhân và lúc này
thử máu sẽ thấy HBsAg dương tính đồng thời
có virus hoàn chỉnh hiện diện trong máu với số
lượng cao phát hiện thông qua xét nghiệm
HBV-DNA cho kết quả dương tính và số lượng
vượt trên 105 copies/ml Trong trường hợp này
cần phải xác định gan người bệnh có bị tổn hại
không, tức là người đó có bị viêm gan mạn tính
không? Nếu xác định là bị viêm gan mạn tínhthì phải được điều trị đặc hiệu Do vậy, nếu mộtngười bị HBsAg dương tính, chúng ta cần phảithử máu xem HBV-DNA có bị dương tính
không và số lượng bao nhiêu? Đây chính là xét
nghiệm phát hiện và định lượng DNA(22,8,21) Nếu HBV-DNA dương tính với sốlượng quá 105/ml thì phải tiếp tục xem men gan(là thử nghiệm ALT hay SGPT) của họ có caokhông? Nếu cao vượt ngưỡng 2 lần bình thường(ALT bình thường là 19 IU ở nữ(29) và 33 IU ởnam(29)) thì được coi là viêm gan mạn tính vàphải điều trị Nếu men gan bình thường thì cầnphải chắc chắn là tế bào gan có bị thương tổnkhông thông qua xét nghiệm về hình thái tế bàogan như sinh thiết gan hay fibroscan Nếu kếtquả cho thấy có thương tổn thì họ cũng phảiđược xem là đang bị viêm gan mạn tính và phảicần điều trị đặc hiệu cho bệnh nhân dù men ganbình thường Xét nghiệm phát hiện và địnhlượng HBV-DNA là một loại xét nghiệm sinhhọc phân tử, thông thường được thực hiện bằng
HBV-kỹ thuật PCR định lượng, được gọi là qPCR hayreal-time PCR Về mặt nguyên tắc qPCR cũnggiống như PCR nhưng có thêm một tính năngnữa là có thể đếm được có bao nhiêu bản gốcDNA trước khi được nhân bản nhờ một hệthống quang học có khả năng phát hiện đượcphản ứng xảy ra trong ống nghiệm trong khinhân bản xảy ra Do áp dụng được đặc điểmPCR là một kỹ thuật mở hoàn toàn, người làmxét nghiệm có thể tự pha thuốc thử để làm xétnghiệm mà không phải bị lệ thuộc và các kit xét
* Đại học Y dược thành phố Hồ Chí Minh **Công ty Nam Khoa