(Luận Án Tiến Sĩ) Nghiên Cứu Một Số Đặc Điểm Của Bệnh Care Ở Chó Nuôi Tại Hà Nội Và Chế Kháng Thể Phòng Trị Bệnh.pdf

LA NOPBV HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM ¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯ NGUYỄN THỊ HUYỀN NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM CỦA BỆNH CARE Ở CHÓ NUÔI TẠI HÀ NỘI VÀ CHẾ KHÁNG THỂ PHÒNG TRỊ BỆNH LUẬN ÁN TIẾN SĨ NHÀ XU[.]

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯

NGUYỄN THỊ HUYỀN

CỦA BỆNH CARE Ở CHÓ NUÔI TẠI HÀ NỘI

VÀ CHẾ KHÁNG THỂ PHÒNG TRỊ BỆNH

LUẬN ÁN TIẾN SĨ

NHÀ XUẤT BẢN HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP - 2021

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯

NGUYỄN THỊ HUYỀN

CỦA BỆNH CARE Ở CHÓ NUÔI TẠI HÀ NỘI

VÀ CHẾ KHÁNG THỂ PHÒNG TRỊ BỆNH

Mã số : 9 64 01 02

Người hướng dẫn khoa học:

2 PGS.TS Phạm Ngọc Thạch

HÀ NỘI - 2021

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi, cùng công ty Hanvet Các kết quả nghiên cứu được trình bày trong luận án là trung thực, khách quan và chưa từng dùng để bảo vệ lấy bất kỳ học vị nào

Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận án đã được cám ơn, các thông tin trích dẫn trong luận án này đều được chỉ rõ nguồn gốc

Hà Nội, ngày tháng năm 2021

Tác giả luận án

LỜI CẢM ƠN

Trong thời gian học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án, tôi đã nhận được sự hướng dẫn, chỉ bảo tận tình của các thầy cô giáo, sự động viên của đồng nghiệp và bạn bè; sự giúp đỡ cả về vật chất lẫn tinh thần của cơ quan và gia đình

Nhân dịp này, cho phép tôi được bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn đến Cha, Mẹ người đã sinh thành dưỡng dục tôi Biết ơn PGS.TS Nguyễn Hữu Nam, PGS.TS Phạm Ngọc Thạch đã hết lòng hướng dẫn, động viên và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập, thực hiện và hoàn thành luận án này

Xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến Ông Nguyễn Hữu Vũ, Chủ Tịch Hội Đồng Quản Trị - Tổng Giám đốc Công ty Cổ phần Dược thú y Hanvet cùng toàn thể Ban Lãnh Đạo Công ty, đã giúp đỡ tôi về vật chất, tinh thần và tạo điều kiện cho tôi về thời gian, địa điểm nghiên cứu trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới Ban Giám đốc Học viện, Ban Quản lý đào tạo và Các thầy cô giáo trong Bộ môn Bệnh lý; Các thầy cô giáo trong Khoa Thú y – Học viện Nông nghiệp Việt Nam: đã tận tình hướng dẫn chỉ bảo, dành nhiều công sức, thời gian và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài

Cảm ơn Anh Trần Văn Khánh, PTGĐ Công ty Hanvet; Ban Lãnh đạo Trung tâm Nghiên cứu và sinh phẩm công ty Hanvet và đặc biệt là toàn bộ cán bộ nhân viên Bệnh viện Thú Cảnh Hanvet: Chị Lê Thị My, anh Lê Phạm Trịnh Công, chị Lê Thị Nụ đã giúp đỡ hỗ trợ tôi trong suốt quá trình nghiên cứu này

Xin gửi lời cảm ơn và lời yêu thương đến đại gia đình tôi: Bố, Mẹ, Chồng và các con , các anh chị em của tôi, người thân, bạn bè, đồng nghiệp đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi về mọi mặt, động viên khuyến khích tôi hoàn thành luận án./

Hà Nội, ngày tháng năm 2021

Nghiên cứu sinh

Nguyễn Thị Huyền

MỤC LỤC

Lời cam đoan i

Lời cảm ơn ii

Mục lục iii

Danh mục chữ viết tắt vi

Danh mục bảng vii

Danh mục hình ix

Trích yếu luận án x

Thesis abstract xii

Ph ần 1 Mở đầu 1

1.1 Tính cấp thiết của đề tài 1

1.2 Mục tiêu nghiên cứu 2

1.3 Phạm vi nghiên cứu 2

1.3.1 Đối tượng nghiên cứu 2

1.3.3 Phạm vi nghiên cứu 3

1.4 Những đóng góp mới của đề tài 3

1.5 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 3

1.5.1 Ý nghĩa khoa học 3

1.5.2 Ý nghĩa thực tiễn 4

Ph ần 2 Tổng quan tài liệu 5

2.1 Tình hình nghiên cứu bệnh Care 5

2.1.1 Tình hình nghiên cứu bệnh Care trên thế giới 5

2.1.2 Tình hình nghiên cứu bệnh Care ở Việt Nam 8

2.2 Đặc tính sinh học của virus gây bệnh Care 10

2.2.1 Đặc điểm hình thái, cấu trúc, phân loại 10

2.2.2 Đặc tính sinh học của virus 13

2.2.3 Đặc tính sinh học phân tử của virus 15

2.3 Bệnh Care trên chó 18

2.3.1 Dịch tễ học 18

2.3.2 Cơ chế sinh bệnh 19

2.3.3 Đặc điểm bệnh lý 20

ẩn đoán bệnh 23

2.3.5 Phòng và điều trị bệnh 26

2.4 Một số nghiên cứu về áp dụng điều trị bệnh Care bằng kháng huyết thanh 29

Ph ần 3 Nội dung và Phương pháp nghiên cứu 33

3.1 Nội dung nghiên cứu 33

3.1.1 Nghiên cứu một số đặc điểm bệnh Care ở chó tại Hà Nội 33

3.1.2 Nghiên cứu chế tạo kháng thể kháng virus Care 33

3.1.3 Nghiên cứu gây bệnh thực nghiệm và điều trị thử nghiệm bệnh Care bằng kháng thể kháng virus Care 33

3.2 Vật liệu nghiên cứu 33

3.2.1 Trang thiết bị và dụng cụ 33

3.2.2 Phạm vi nghiên cứu 34

3.3 Phương pháp nghiên cứu 35

3.3.1 Phương pháp nghiên cứu một số đặc điểm của bệnh Care 35

3.3.2 Phương pháp nghiên cứu chế tạo kháng thể kháng virus Care 38

3.3.3 Phương pháp gây bệnh thực nghiệm và điều trị thực nghiệm 42

3.3.4 Phương pháp điều trị thử nghiệm bằng kháng thể kháng virus Care 45

3.3.5 Phương pháp xử lý số liệu 47

Ph ần 4 Kết quả và Thảo luận 48

4.1 Kết quả xác định một số đặc điểm của bệnh Care 48

4.1.1 Kết quả xác định tỷ lệ mắc bệnh Care ở chó đến khám tại các phòng khám thú y trên địa bàn Hà Nội 48

4.1.2 Kết quả kiểm tra chó mắc Care bằng test chẩn đoán nhanh CDV-Ag 49

4.1.3 Tỷ lệ chó mắc bệnh Care theo địa bàn điều tra 52

4.1.4 Tỷ lệ mắc bệnh Care theo giống chó 53

4.1.5 Tỷ lệ chó mắc bệnh Care theo lứa tuổi 55

4.1.6 Tỷ lệ chó mắc bệnh Care theo mùa 57

4.1.7 Tỷ lệ chó mắc bệnh Care theo tính biệt 58

4.1.8 Một số hình ảnh triệu chứng điển hình của chó mắc bệnh Care 59

4.1.9 Kết quả nghiên cứu bệnh tích đại thể và vi thể của chó mắc bệnh Care 61

4.2 Nghiên cứu chế tạo kháng thể kháng virus Care 64

4.2.1 Nghiên cứu quy trình chế tạo kháng thể kháng virus Care 64

4.2.2 Chế tạo thử nghiệm kháng thể kháng virus Care quy mô Pilot 71

4.3 Kết quả gây bệnh thực nghiệm và điều trị thử nghiệm 74

4.3.1 Kết quả gây bệnh thực nghiệm 74

4.3.2 Kết quả nghiên cứu thử nghiệm kháng thể kháng virus Care trong phòng và trị bệnh 93

Ph ần 5 Kết luận và Kiến nghị 102

5.1 Kết luận 102

5.2 Kiến nghị 103

Danh mục các công trình đã công bố liên quan đến luận án 104

Tài liệu tham khảo 105

Phụ lục 114

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

tin di truyền

tin di truyền

Eagle Medium

Môi trường nuôi cấy tế bào

do ông Dulbecco phát triển

DANH MỤC BẢNG

2.1 Các loại vaccine và kháng thể kháng virus Care đang dùng tại Việt Nam 31

4.1 Kết quả xác định tỷ lệ mắc bệnh Care ở chó đến khám tại các phòng khám trên địa bàn Hà Nội 48

4.2 Kết quả kiểm tra chó mắc Care bằng test chẩn đoán nhanh CDV Ag 51

4.3 Tỷ lệ mắc bệnh Care ở chó theo địa bàn điều tra tại Hà Nội 52

4.4 Kết quả xác định tỷ lệ mắc bệnh Care theo giống chó 53

4.5 Kết quả xác định tỷ lệ mắc Care theo lứa tuổi 55

4.6 Kết quả xác định tỷ lệ chó mắc bệnh Care theo mùa vụ 57

4.7 Kết quả xác định tỷ lệ chó mắc bệnh Care theo tính biệt 58

4.8 Kết quả cô đặc huyết thanh bằng hệ thống lọc TFF 73

4.9 Kết quả thử nghiệm chế tạo kháng thể Care quy mô Pilot 74

4.10 Kết quả ra chai và kiểm nghiệm 03 lô sản phẩm kháng thể Care 74

4.11a Kết quả xét nghiệm virus Care bằng phương pháp RT - PCR 75

4.11b Kết quả xét nghiệm virus Care bằng phương pháp RT - PCR 76

4.12 Biến động thân nhiệt của chó sau khi được gây bệnh với chủng CDV-HV và điều trị thực nghiệm bằng chế phẩm kháng huyết thanh Care 79

4.13 Biến động tần số hô hấp của chó sau khi được gây bệnh với chủng CDV-HV và điều trị thực nghiệm bằng chế phẩm kháng huyết thanh Care 81

4.14 Biến động tần số tim của chó sau khi được gây bệnh với chủng CDV-HV và điều trị thực nghiệm bằng chế phẩm kháng huyết thanh Care 83

4.15 Triệu chứng lâm sàng của chó gây nhiễm CDV-HV thực nghiệm 85

4.16 Kết quả khảo sát một số chỉ tiêu huyết học chủ yếu của chó gây bệnh với chủng CDV-HV thực nghiệm 87

4.17 Bệnh tích vi thể chủ yếu của chó được gây nhiễm CDV-HV thực nghiệm 89

4.18 Kết quả nhuộm hóa mô miễn dịch của các cơ quan 92

4.19 Kết quả bước đầu điều trị thử nghiệm chó gây nhiễm virus Care 93

4.20 Kết quả thử nghiệm kháng thể kháng virus Care trong phòng bệnh Care 94

4.21 Kết quả thử nghiệm kháng thể trong điều trị bệnh Care 95

4.22 Hiệu quả điều trị bằng kháng thế kháng virus Care tại các phòng khám ều tiêm 0,5 ml/2-5kg thể trọng) 97

4.23 Hiệu quả điều trị bằng kháng thể kháng virus Care tại phòng khám (liều

tiêm 1 ml-1,5/2-5kg thể trọng) 984.24 So sánh 2 phác đồ điều trị bằng kháng thể chống bệnh Care theo lứa tuổi 994.25 So sánh 2 phác đồ điều trị bằng kháng thể chống bệnh Care theo giống chó 100

DANH MỤC HÌNH

2.1 Mô hình cấu trúc của virus Canine Distemper (CDV) 11

3.1 Minh họa cho kết quả kiểm tra nhanh bệnh Care bằng test CDV Ag 37

4.1 Hình ảnh một số kết quả thử nghiệm nhanh bằng test CDV-Ag 50

4.2 Một số triệu chứng điển hình của chó mắc bệnh Care 60

4.3 Bệnh tích đại thể của chó mắc bệnh Care 62

4.4 Một số hình ảnh bệnh tích vi thể ở chó bị nhiễm virus Care 63

4.5 Sơ đồ tối mễn dịch cho động vật thí nghiệm để xác định loài động vật dùng sản xuất kháng thể Care 65

4.6 Hiệu giá kháng thể Care sau gây tối miễn dịch ở động vật thí nghiệm 66

4.7 Hiệu giá kháng thể Care theo lứa tuổi động vật 67

4.8 Hiệu giá kháng thể Care theo quy trình tiêm 68

4.9 Sơ đồ chế kháng thể Care trên thỏ 71

4.10 Sơ đồ lắp đặt hệ thống TFF 72

4.11 Máy lọc tiếp tuyến TFF 72

4.12 Kết quả điện di thực hiện phản ứng RT-PCR sau 5 ngày gây nhiễm CDV-HV 77

4.13 Biểu đồ biến động thân nhiệt của chó ở các lô thí nghiệm 80

4.14 Đồ thị biến động tần số hô hấp của chó được gây bệnh và điều trị thực nghiệm 82

4.15 Bệnh tích chó gây nhiễm Care thực nghiệm chủng CDV - HV 84

4.16 Bệnh tích đại thể của chó được gây nhiễm CDV - HV 88

4.17 Hình ảnh vi thể các tổ chức tế bào ở chó gây nhiễm Care thực nghiệm chủng CDV - HV 91

TRÍCH YẾU LUẬN ÁN

Tên Luận án: Nghiên cứu một số đặc điểm của bệnh Care ở chó nuôi tại Hà Nội và chế

kháng thể phòng trị bệnh

Tên cơ sở đào tạo: Học viện Nông nghiệp Việt Nam

Mục tiêu nghiên cứu

- Xác định được một số đặc điểm chủ yếu của bệnh Care ở chó tại khu vực Hà Nội

- Chế tạo thành công kháng thể kháng virus Care và xây dựng phác đồ điều trị thử nghiệm bệnh Care hiệu quả

Phương pháp nghiên cứu

Điều tra theo dõi và thống kê mức độ mắc bệnh Care trên chó bằng phương pháp ghi chép, mô tả, thống kê sinh học, áp dụng những phương pháp hồi cứu và phương pháp cắt ngang (theo dõi và phỏng vấn chủ nuôi) Xác định chó mắc bệnh Care dựa vào lịch tiêm phòng Vaccine, những triệu chứng lâm sàng đặc trưng của bệnh Mặt khác dùng Test chẩn đoán nhanh CDV Ag để khẳng định bệnh ở những con chó có nhiều triệu chứng điển hình Kiểm tra bệnh tích đại thể và vi thể ở chó bị bệnh Care bằng phương pháp mổ khám, quan sát bệnh tích đại thể của chó được gây nhiễm theo tiêu chuẩn trong TCVN 8402: 2010 (Bộ Khoa học & Công nghệ, 2010) Tiêu bản vi thể được làm theo phương pháp của (Prophet & cs., 1992) Nghiên cứu chế tạo kháng thể kháng virus Care theo quy trình tiêm tạo miễn dịch cho động vật Phương pháp kiểm tra hiệu giá kháng thể bằng phản ứng Elisa Kiểm tra hiệu giá kháng thể bằng phản ứng trung hòa Kiểm nghiệm chỉ tiêu vô trùng và thuần khiết được thực hiện theo tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 8684-6:2001 Nghiên cứu gây bệnh thực nghiệm bằng phương pháp ghi chép và kiểm tra triệu chứng sau khi công cường độc; đánh giá các chỉ tiêu sinh lý, các triệu chứng đại thể vi, thể thực tế Sử dụng phương pháp nhuộm hóa mô miễn dịch đối với những mẫu bệnh phẩm (phổi, hạch, lách, ruột…) theo phương pháp của (Carpenter, 1998; Lan & cs., 2009) Nghiên cứu quy trình điều trị thử nghiệm kháng thể kháng virus Care trên chó mắc bệnh Care gây bệnh thực nghiệm và những ca mắc bệnh trong tự nhiên bằng phương pháp chia phác đồ và định liều điều trị theo từng giai đoạn bệnh

Kết quả chính và kết luận

1) Bệnh Care luôn lưu hành ở đàn chó nuôi hầu khắp trên địa bàn Hà Nội với tỷ

lệ mắc là 3,15% trong tổng số 18.244 ca bệnh đến khám tại các Bệnh viện thú y, phòng khám thú y trên địa bàn nghiên cứu từ năm 2013 đến 2018 Trong đó giống chó Bergie

có tỷ lệ mắc cao nhất trong nhóm chó ngoại là 5,42% Nhóm chó nội thì giống chó Mông cộc có tỷ lệ mắc cao nhất là 5,72%

Ở nhóm chó từ 2 - 6 tháng tuổi có tỷ lệ mắc bệnh cao nhất (7,13%) và thấp nhất ở nhóm chó dưới 2 tháng tuổi (1,48%) Về mùa đông tỷ lệ mắc bệnh là cao nhất (5,24%) Thấp nhất là mùa thu (1,45%) Test chẩn đoán nhanh CDV- Ag cho độ nhạy dương tính với bệnh Care cao Nhóm chó ngoại tỷ lệ dương tính với test CDV-Ag từ 88,24% đến 95,24% Nhóm chó nội từ 81,82% đến 90,91% trên tổng số mẫu làm test

2) Xây dựng thành công quy trình sản xuất kháng thể kháng virus Care Kết quả lựa chọn động vật nghiên cứu dùng thỏ 3 - 4 tháng tuổi cho đáp ứng miễn dịch cao nhất (7,4 log2) Sản phẩm kháng thể kháng virus Care đạt tiêu chuẩn vô trùng độ thuần khiết và tính an toàn, hiệu giá kháng thể thành phẩm đạt (9 log2)

3) Dùng chủng virus Care cường độc CDV-HV gây bệnh thực nghiệm thành công trên chó và tiến hành điều trị thực nghiệm Kết quả cụ thể như sau:

- Liều tiêm để phòng bệnh là 1ml/ 2-5 kg thể trọng

- Liều điều trị: Nếu phát hiện bệnh sớm (Giai đoạn 1 của bệnh) dùng liều (0,5

ml/2-5 kg trọng lượng) tiêm bắp hoặc dưới da liệu trình 3 ngày hiệu quả đạt tới (99%)

- Nếu phát hiện muộn hơn (giai đoạn 2 của bệnh) chó đã có biểu hiện lâm sàng điển hình dùng liều kháng thể gấp đôi liều điều trị ở giai đoạn 1 (1ml-1,5ml /2-5 kg thể trọng) với liệu trình 5 ngày, hiệu quả điều trị đạt 80%

- Khi bệnh đã nặng, có biểu hiện thần kinh, chó suy kiệt, dùng liều tối đa (2ml/2-5

kg thể trọng) với liệu trình 5-7 ngày vẫn có thể điều trị khỏi nhưng với tỷ lệ thấp chỉ 20%

THESIS ABSTRACT PhD candidate: Nguyen Thi Huyen

Thesis title: Researching on epidemiological characteristics of Care disease in canine in

Hanoi and producing antibody for the treatment

Major: Veterinary pathology and Therapeutics of the diseases of domestic animal Code: 9 64 01 02

Educational organization: Vietnam National University of Agriculture (VNUA) Research Objectives

Identifying some main features of Care disease in dogs in the Hanoi area

Successfully fabricated Care antibodies and develop an effective treatment regimen for Care

Research Methods

CDV epidemiological investigation was completed by descriptive epidemiology, retrospective epidemiology and cross-sectional research Identify cases of Care based on epidemiological characteristics, clinical symptoms, and use of CDV Ag rapid diagnostic test Checking for general and microscopic lesions in dogs suffering from Care's disease

by the method of dissecting and observing the general lesions of dogs infected by the standard in TCVN 8402: 2010 (Ministry of Science & Technology, 2010) while the microscopic lesions were described by Prophet & cs (1992) Research and manufacture Care antibody according to immunization procedure for animals Method of testing antibody titer by Elisa reaction Check for antibody titer by neutralization reaction Testing of sterility and purity criteria is carried out according to Vietnam standard TCVN 8684-6: 2001 The experimental pathological study by the method of recording and checking symptoms after intense poisoning, assessing physiological criteria and actual microscopic general symptoms Using immunohistochemistry method for samples (bellows, lymph nodes, spleen, intestines ) according to Carpenter (1998); Lan (2009) Research on CDV antibody test treatment procedure in dogs with CDV disease-causing experimental diseases and cases in nature by the method of dividing regimen and dosing treatment according to each stage of the disease

Main results and conclusions

1) CDV disease is always circulating in dog herds throughout Hanoi, with an incidence rate of 3.15% out of 18,244 cases case to be examined at veterinary hospitals,

veterinary clinics in the research area from 2013 to 2018 In which, Bergie breed has the highest incidence rate among foreign dogs at 5.42% The Mong dog breed has the highest incidence rate among domestic dogs at 5.72%

The highest prevalence of the disease is in dogs 2 - 6 months old (7.13%), and lowest in the group of dogs under 2 months old (1.48%) In winter, the disease incidence

is the highest (5.24%) Autumn is the lowest (1.45%) With CDV-Ag rapid diagnostic test, the positive rate for CDV is quite high The positive rate of dogs with the CDV-Ag test ranged from 88.24% to 95.24% Domestic dogs group from 81.82% to 90.91% 2) Successfully built the production process of antibodies to CDV Results of animal research using rabbits 3 - 4 months old for the highest immune response (7.4 log2) Antiviral CDV products are sterile standard, purity and safety, the titre of the finished antibody is reached (9 log2)

3) Use the virulent Care virus strain CDV-HV to successfully cause disease in dogs and conduct experimental treatment The specific results are as follows:

- The dose for prevention is 1ml / 2-5 kg body weight

- Treatment dose: If the disease is detected early (Stage 1 of the disease) using a dose (0.5 ml / 2-5 kg of weight) intramuscularly or subcutaneously, the 3-day course of effect is achieved (99%)

- If detected later (stage 2 of the disease), the dog has a typical clinical presentation using an antibody dose twice as much as the first treatment dose (1ml-1.5ml / 2-5 kg body weight) with a 5-day course, treatment effectiveness reaches 80%

- When the disease is severe, with neurological manifestations, dogs are depressed, the maximum dose (2ml / 2-5 kg of body weight) can be cured with a 5-7-day course, but with a low rate of only 20 % At a dose of 0.5ml / 2-5 kg body weight, the treatment has not a good result

Conducting experimental treatment of antibodies to CDV in veterinary clinics, veterinary hospitals in Ha Hoi province, giving high therapeutic effect Develop 2 effective treatment regimens for CDV, according to each disease stage and dog's age Results of the 1st-stage regimen of treatment for the cure rate were (61.7%) Regimen 2 used for later detection of the disease (stage 2 and stage 3 of the disease) the cure rate was only (39.4%) on the total number of test samples

PHẦN 1 MỞ ĐẦU

1.1 TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI

Bệnh Sài sốt chó (Canine Distemper) hay Care là một trong những bệnh quan trọng và phổ biến nhất trên chó Bệnh phân bố ở nhiều quốc gia trên thế giới và gây bệnh trên hầu hết các loại thú ăn thịt như chồn, cáo, hổ, báo, sư tử, (Appel Max Jg & cs., 1994; Gilbert & cs., 2015; Wyllie & cs., 2016) Do đó, bệnh được

tổ chức thú y thế giới (OIE) quan tâm và cập nhật tình hình trong những năm qua Nguyên nhân gây bệnh là do canine distemper virus (CDV) thuộc chi

Morbilli họ Paramixoviridae Đây là virus có cấu trúc là nucleocapsid chứa một

sợi đơn RNA không phân đoạn gồm khoảng 15.690 nucleotide có khả năng lây lan rộng qua đường hô hấp hoặc dịch bài tiết (Frisk & cs., 1999; Sykes, 2013) Bệnh cũng có khả năng lây truyền từ mẹ sang con qua nhau thai nhưng rất ít gặp (Greene

& Carmichael, 2013) Bệnh có thời gian ủ bệnh thay đổi từ 3 ngày tới hơn 4 tuần (Sykes, 2013) Triệu chứng lâm sàng của bệnh đặc trưng với các đặc điểm như sốt cao, nổi nốt sài trên các vùng da mỏng Đặc biệt, CDV gây tiêu chảy nghiêm trọng, phân lẫn máu, mùi tanh đặc trưng, có triệu chứng thần kinh (Appel Max Jg & cs., 1994; Frölich & cs., 2000; Martella & cs., 2002)

Ở Việt Nam, bệnh Care được phát hiện từ năm 1920 Chó mắc bệnh thường chết với tỷ lệ rất cao, có thể lên đến 100% nếu không được điều trị kịp thời (Hồ Đình Chúc, 1993) Mặc dù việc nuôi dưỡng, chăm sóc chó của người chăn nuôi ngày càng được chú trọng, và đã có nhiều loại vaccine được sử dụng nhưng bệnh Care vẫn xảy ra trên đàn chó nuôi ở các tỉnh và gây thiệt hại lớn đối với người chăn nuôi trong nước do tỷ lệ chết của bệnh rất cao (Lê Thị Tài, 2006)

Tại Hà Nội, Bệnh Care chiếm tỷ lệ cao trong số chó được mang đến khám tại phòng khám thú y của chi cục thú y Hà Nội (Vương Đức Chất, 2004).Trong những năm gần đây, phong trào nuôi chó cảnh ở nước ta tăng nhanh khiến số lượng chó giống ngoại nhập tăng lên đáng kể Các giống chó ngoại phổ biến ở nước ta thường là giống có kích thước lớn như Bergie, Alaska,… và một số giống chó nhỏ như Phốc, Poodle, Corgi hay Pomeranian Theo đó, nguy cơ về bệnh truyền nhiễm nguy hiểm lây lan như Care bùng phát cũng tăng lên Lan & cs (2009) đã phân lập thành công virus Care trên giống chó Phú Quốc 4 tháng tuổi nuôi ở Hà Nội

Tuy vậy, nghiên cứu về đặc điểm của bệnh Care vẫn còn hạn chế Thông tin

về tỷ lệ chó mắc bệnh Care, đặc điểm lưu hành và phân bố bệnh vẫn chưa được thống kê đầy đủ tại khu vực Hà Nội Chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài này nhằm xác định sự lưu hành của bệnh Care ở khu vực nội thành Hà Nội làm cơ sở khoa học cho việc phòng và trị bệnh, tìm ra các yếu tố nguy cơ liên quan đến bệnh Đồng thời nghiên cứu chế tạo chế phẩm kháng thể kháng virus Care để điều trị bệnh Care cho chó đạt hiệu quả cao

1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

Hoàn thiện nghiên cứu về các đặc điểm của bệnh Care trên địa bàn Hà Nội Với mục đích mô tả bệnh và sự phân bố của bệnh dưới ảnh hưởng của thời tiết mùa vụ, lứa tuổi chó Đồng thời xác định được tỷ lệ nhiễm bệnh giữa các giống chó nội và chó ngoại nhập Đồng thời nghiên cứu chế tạo kháng thể Care từ chủng virus thực địa, xác định liều điều trị cho chó mắc bệnh Xây dựng phác đồ điều trị thử nghiệm bệnh Care cho từng giai đoạn của bệnh Phục vụ cho công tác phòng

và trị bệnh có hiệu quả cao

1.3 PHẠM VI NGHIÊN CỨU

1.3.1 Đối tượng nghiên cứu

Chó mắc bệnh Care trong tự nhiên ở các lứa tuổi mang đến khám tại hệ thống 5 cơ sở của Bệnh Viện thú cảnh của công ty Hanvet tại Hà Nội và một số Bệnh viện thú y, phòng khám thú y trên địa bàn Hà Nội: Bệnh viện thú y Petheath

- Quận Tây Hồ, Bệnh viện thú y Hải Đăng - Quận Đống Đa, Phòng khám thú y

Hà Nội Quận Hai Bà Trưng Chó đến khám bao gồm tất cả các giống chó nội và ngoại, ở các lứa tuổi khác nhau trong 6 năm liên tục (từ tháng 1/2013 tới tháng 12/2018) Thông tin về thời gian khám, giống, lứa tuổi, lịch tiêm phòng được ghi chép đầy đủ và chi tiết

- Chó 2 tháng tuổi chưa tiêm phòng, dùng trong nghiên cứu gây tối miễn dịch

- Thỏ 2-4 tháng tuổi, dùng trong nghiên cứu gây tối miễn dịch

1.3.2 Địa điểm, thời gian nghiên cứu

* Địa điểm nghiên cứu:

- Phòng thí nghiệm Trung tâm của Học viện Nông nghiệp Việt Nam;

- Phòng thí nghiệm Bộ môn Bệnh lý - Khoa Thú y - Học viện Nông Nghiệp Việt Nam;

- Trung tâm Nghiên cứu Sinh phẩm, Công ty cổ phần Dược Hanvet;

- Hệ Thống Bệnh viện Thú cảnh Hanvet - Công ty Dược Hanvet

- Một số Bệnh viện Thú y và Phòng khám Thú y trên địa bàn Hà Nội

* Thời gian nghiên cứu:

- Thời gian tiến hành đề tài luận án từ tháng 6/2014 - tháng 12/ 2018;

- Số liệu của đề tài được thu thập từ tháng 01/2013 đến tháng 12/2018

1.4 NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA ĐỀ TÀI

Đây là công trình nghiên cứu hoàn chỉnh và có hệ thống về bệnh Care trên chó ở khu vực Hà Nội Kết quả khảo sát thực trạng của bệnh Care, đánh giá mô tả được các đặc điểm của bệnh ở trên tất cả các giống chó, lứa tuổi chó, mùa vụ mắc bệnh Bên cạnh đó xây dựng được quy trình chế tạo kháng thể kháng virus Care bằng chủng phân lập ở Việt Nam chữa bệnh cho chó đạt hiệu quả cao

1.5 Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI

1.5.1 Ý nghĩa khoa học

Kết quả nghiên cứu là cơ sở cho việc hiểu biết rõ hơn về đặc điểm của bệnh Care (CDV) tại Việt Nam Đây cũng là tư liệu khoa học có giá trị cho các nghiên cứu tiếp theo về bệnh Care và trong nghiên cứu vaccine phòng bệnh Luận án là tài liệu tham khảo tốt phục vụ nghiên cứu khoa học và là tư liệu tham khảo dùng trong giảng dạy chuyên ngành thú y Là tài liệu cần thiết cho các bác sĩ thú y thực hành tại các Bệnh viện Thú y và các Phòng khám thú y

1.5.2 Ý nghĩa thực tiễn

Đề tài là cơ sở khoa học để đưa ra những biện pháp phòng chống bệnh Care

ở chó Từ đó khuyến cáo người nuôi chó sử dụng vaccine Care phù hợp theo từng lứa tuổi Kết quả nghiên cứu đã đưa ra được một sản phẩm kháng thể kháng virus Care để phòng và trị bệnh, đồng thời xây dựng được phác đồ điều trị hiệu quả trên đàn chó mắc bệnh Care

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU BỆNH CARE

2.1.1 Tình hình nghiên cứu bệnh Care trên thế giới

Care là một bệnh truyền nhiễm cấp tính trên chó do Canine distemper virus (CDV) gây ra Bệnh lây lan rất nhanh, xảy ra ở mọi lứa tuổi nhưng chủ yếu ở chó non với các các triệu chứng sốt, viêm phổi, viêm ruột và cuối cùng thường có hội chứng thần kinh (Greene & cs., 2006; Appel & cs., 1978) Đặc biệt bệnh gây chết với tỷ lệ rất cao

Bệnh Care được báo cáo lần đầu tiên ở châu Âu vào năm 1760 (Appel Max Jg

& cs., 1972) Bệnh cũng xuất hiện ở một số nước châu Á và Nam Mỹ từ giữa thế kỷ

18 (Timothy, 2008; Woma & cs., 2009) Các triệu chứng lâm sàng và tiến triển của bệnh đã được mô tả từ năm 1809 bởi Edward Jenner (Shell, 1990) Năm 1905, bác

sĩ thú y người Pháp Henri Carré đã phân lập được virus Care từ nước mũi của chó

bị bệnh Sau đó năm 1923, Putoni lần đầu tiên chế Vaccine nhược độc, tuy nhiên virus Vaccine này độc tính vẫn còn cao Từ năm 1948 về sau, với sự phát triển mạnh

mẽ của virus học, nhiều Vaccine phòng bệnh Care có hiệu quả đã ra đời Các công trình nghiên cứu về sự liên quan kháng nguyên giữa virus Care và virus sởi, giữa virus Care và virus dịch tả trâu bò đã mở rộng ra được nhiều triển vọng cho việc phòng bệnh Care bằng cách dùng virus dịch tả trâu bò và virus sởi theo nghiên cứu của Merchant trong giai đoạn 1961 - 1969

Một ổ dịch bệnh Care cũng đã được nghiên cứu vào năm 1991 ở chó cảnh vùng Copenhagen (Đan Mạch) Khi kiểm tra 49 trong số 66 mẫu huyết thanh từ chó nghi mắc bệnh Care bằng phản ứng ELISA, đều xác định sự có mặt của kháng thể IgM kháng virus Care (Blixenkrone-Møller, 1993)

Một nghiên cứu về bệnh Care tại một vùng nông thôn ở Nam Phi, có 5,5% trong số chó được kiểm tra thấy có nhiễm virus Care (Eckersley & cs., 1992) Một nghiên cứu khác so sánh trạng thái bệnh của những con chó nhiễm bệnh Care có biểu hiện lâm sàng giữa những vùng đã phát triển với những vùng đang phát triển trong khoảng thời gian hơn 3 năm cho thấy có sự khác biệt đáng kể giữa hai nhóm Trong khi ở vùng đang phát triển số chó bị nhiễm bệnh có biểu hiện triệu chứng lâm sàng của bệnh Care là 43,6% Còn ở vùng phát triển số chó bị nhiễm bệnh có triệu chứng lâm sàng của bệnh Care là 8,2% (Eckersley & cs., 1992) Chó nhiễm

bệnh Care cũng có liên quan đến việc lây nhiễm bệnh trên sư tử (Roelke-Parker & cs., 1996) và cũng được xem là nguyên nhân dẫn đến sự tuyệt chủng của giống chó

hoang dã châu Phi (Lycaon pictus) ở vùng sinh thái Serengeti (Woodroffe &

Ginsberg, 1999)

Butler & cs (2004) đã xác nhận rằng việc ăn thịt chó nhiễm bệnh là một phương thức lây nhiễm rộng rãi cho các loài thú ăn thịt ở Zimbabwe Ước tính khoảng 4 triệu con chó trong những năm 1999 - 2000 ở Nam Phi và trong đó đã xác nhận rằng khoảng 1 triệu con phải đưa đến bác sỹ thú y khám bệnh ít nhất 1 lần trong năm (Leisewitz & cs., 2001) Tính tổng hàng năm, số chó ở Tanzania tăng 5% (Cleaveland & cs., 2006) và ở Zimbabwe là 6,5% (Butler & Bingham, 2000) Ở Nam Phi có thể có 6 triệu con trong những năm 2007 - 2008, trong đó khoảng 1,5 triệu con phải đưa đến bác sỹ thú y khám ít nhất 1 lần trong năm Điều này cho thấy rằng chó ở Nam Phi đã không được tiêm phòng Vaccine và có khả năng bị tái nhiễm bệnh, có thể tồn tại virus Care trong môi trường, và đã xác định rằng có ít nhất 300.000 cá thể được ghi nhận có mang virus giống Morbillivirus trong quần thể Từ đó cho thấy chó nuôi và chó hoang dã là nguồn lây bệnh trong tự nhiên

Ở những vùng đang phát triển ở ven đô thị của Nam Phi, tỷ lệ nhiễm bệnh Care cao nhất vào mùa xuân và những tháng đầu của mùa hè, từ tháng 8 đến tháng

11 (Eckersley & cs., 1992) Tuy nhiên ở một số vùng đô thị lại cho thấy tỷ lệ nhiễm cao hơn vào mùa đông, chó nhiễm virus Care có tỷ lệ cao hơn 25-75% mà không

có biểu hiện bệnh về mặt lâm sàng (Leisewitz & cs., 2001)

Theo nghiên cứu của tác giả Timothy (2008), khi phân lập virus Care trên tế bào Vero.DogSLAM từ các con chó bị nhiễm bệnh trong tự nhiên ở Nam Phi đã cho kết quả là một số những đặc tính cơ bản của virus Care

Nhiều nghiên cứu kiểm tra huyết thanh học và những nghiên cứu dịch tễ học

ở nhiều nơi trên thế giới đã chỉ ra rằng bệnh Care xuất hiện ở nhiều nơi trên thế giới Ở châu Phi, bệnh Care đã được xác nhận xuất hiện ở các chó nuôi tại Nam Phi và Nigeria cũng như ở các châu lục khác (Leisewitz & cs., 2001) Nhiều dẫn chứng của việc nhiễm virus Care đã được xác định ở các loài động vật hoang dã ở Botswana, Zimbabwe, Nam Phi, Tanzania và nhiều vùng khác ở châu Phi (Butler

& cs., 2004; Woodroffe & Ginsberg, 1999)

Hiện nay bệnh có ở khắp nơi trên thế giới, không những xảy ra ở chó

nuôi mà còn ở nhiều quần thể động vật hoang dã Giới nghiên cứu cho rằng những chó mắc bệnh Care không có biểu hiện triệu chứng rõ ràng là mối đe dọa nghiêm trọng cho việc bảo tồn nhiều loài thú ăn thịt và thú có túi Thống kê từ các nghiên cứu cho thấy, bệnh Care là một trong những nguyên nhân chủ yếu dẫn đến

sự tuyệt chủng của chồn chân đen, hổ Tasmania và là nguyên nhân gây tử vong định kỳ của chó hoang dã châu Phi (Assessment, 2005) Năm 1991, bệnh xảy ra trên quần thể sư tử Serengeti ở Tanzania làm giảm 20% số lượng toàn đàn (Woma

& Van Vuuren, 2009) Đặc biệt virus Care đã biến đổi và có khả năng gây bệnh cho một số động vật biển (Kennedy & cs., 1989)

Bệnh Care xuất hiện nhiều ở các loài vật nuôi và động vật hoang dã ở Mỹ (Pardo & cs., 2005) Hơn 300 con chó đã được ghi nhận là bị chết khi bị nhiễm bệnh Care ở Alaska (Maes & cs., 2003) và minh chứng của việc nhiễm virus Care đã được xác định ở những con chó đã được tiêm phòng Vaccine ở Mexico (Simon-Martinez & cs., 2008) Bệnh Care xuất hiện ở Brazil (Headley & Graça, 2000) Bệnh Care cũng được phát hiện thấy trên cả hai loại chó đã được tiêm phòng Vaccine và chó chưa được tiêm phòng Vaccine ở Argentina (Calderon

& cs., 2007) Dịch bệnh còn xuất hiện ở gấu trúc ở Chicago vào năm 1998 (Lednicky & cs., 2004)

Ở châu Âu, đã có những dẫn chứng của việc nhiễm virus Care ở Ý (Martella

& cs., 2006), Đức (Frisk & cs., 1999), Hungary (Demeter & cs., 2007) và Bắc Irelend (Harder & Osterhaus, 1997) Một đợt dịch bệnh xuất hiện ở chó đã được tiêm phòng Vaccine cũng xuất hiện ở Phần Lan Ở Ba Lan, virus Care gây nhiễm trên 71% số chó đã được tiêm Vaccine phòng bệnh (Jóžwik & Frymus, 2002), và

ở Úc dịch bệnh Care xuất hiện ở các trang trại chăn nuôi chó (Norris & cs., 2006) Bệnh Care cũng thường thấy ở châu Á Như tài liệu của các tác giả đã mô tả: Dịch bệnh diễn ra ở các vùng khác nhau của Nhật Bản, (Lan & cs., 2006); Thái Lan (Keawcharoen & cs., 2005); Hàn Quốc (An & cs., 2008); Ấn Độ (Latha & cs., 2007)

Pawar & cs (2011) đã phân lập thành công virus Care tại Ấn Độ và đã ứng dụng kỹ thuật Realtime PCR, miễn dịch huỳnh quang để chẩn đoán phát hiện bệnh Care Gần đây các nhà khoa học của Trung Quốc đã phát hiện ra ổ dịch Care trên loài khỉ Rhesus với tỷ lệ chết rất cao, với các triệu chứng như ho, sốt cao, gan bàn chân bị dày lên, các triệu chứng này kéo dài trong một tháng Nhóm nghiên cứu

của Sun & cs (2010) cũng cảnh báo loài vượn và một số loài động vật ăn thịt quý hiếm khác cũng có thể có nguy cơ nhiễm bệnh Care

Kubo & cs (2007) đã nghiên cứu về sự phân bố của các thể bao hàm trên các

cơ quan khác nhau của 100 chó được chẩn đoán dương tính với bệnh Care Thể bao hàm được tìm thấy ở các cơ quan như: phổi (70 chó), não (20 chó), bàng quang (73 chó), dạ dày (78 chó), lách (77 chó), và hạch lympho (81 chó) Kết quả nghiên cứu đã chỉ ra hạch amidan là cơ quan phù hợp nhất để phát hiện thể bao hàm ở bệnh Care

Del Puerto & cs (2010) đã nghiên cứu cơ chế apoptosis của tế bào lympho và não bằng cách đánh giá hàm lượng mRNA trong máu ngoại vi, hạch lympho và não của chó mắc bệnh Care và chó khỏe mạnh bằng phương pháp rRT-PCR Kết quả nghiên cứu đã chỉ ra cơ chế apoptosis tế bào của virus Care ở não và hạch lympho của chó mắc bệnh Care là theo các cách thức khác nhau

2.1.2 Tình hình nghiên cứu bệnh Care ở Việt Nam

Bệnh Care được phát hiện tại Việt Nam từ năm 1920 Nghiên cứu của Hồ Đình Chúc (1993) đã chỉ ra thời kỳ ủ bệnh Care thường là 3 - 6 ngày (dài nhất là

17 - 21 ngày) và có thể kéo dài trong khoảng thời gian trên dưới 1 tháng Chó phát bệnh thường chết với tỷ lệ 50 - 80%, thậm chí lên đến 100% nếu không điều trị kịp thời Cho đến nay, bệnh xảy ra ở hầu hết các tỉnh và gây thiệt hại lớn do tỷ lệ tử vong của bệnh rất cao (Lê Thị Tài, 2006) Tất cả các loài chó đều cảm thụ bệnh, nhưng mẫn cảm ở là loài chó lai, chó cảnh, chó nội ít mẫn cảm hơn (Tô Du & Xuân Giao, 2006)

Lan & cs (2005) đã nghiên cứu thành công đặc tính sinh trưởng cụ thể của một số chủng CDV trên dòng tế bào Vero có gắn receptor tương ứng với virus Care (Vero-DogSLAMtag hay Vero-DST) Qua đó tác giả cũng chỉ ra tế bào Vero-DST là dòng tế bào thích hợp có thể sử dụng để phân lập và xác định hiệu giá virus

Để chẩn đoán bệnh Care, có rất nhiều phương pháp đã được các nhà nghiên cứu

sử dụng như: Miễn dịch gắn với enzyme (ELISA), phản ứng hóa mô miễn dịch (Immunohistochemistry), phản ứng Reverse Transcription - Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) để chẩn đoán bệnh Care ở Việt Nam (Lan & cs., 2006) Lan & cs (2008) đã phân lập thành công chủng virus gây bệnh trên chó mắc bệnh tại Việt Nam Virus Care được phân lập trên dòng tế bào Vero-DST, sau đó

được kiểm tra bằng phản ứng RT-PCR Chủng CDV-HN1 có hiệu giá virus đạt 3,16 × 105 TCID50/25 l Kết quả nghiên cứu đã chỉ ra đàn chó ở Hà Nội đã lây nhiễm với virus Care

Trong nghiên cứu của Lan & cs (2009), hai chủng virus Care là Vn86 và Vn99 đã được phân lập từ chó 4 tháng tuổi có đặc điểm là viêm não không mưng

mủ, viêm phổi, suy giảm tế bào lympho và viêm dạ dày ruột Kết quả phân tích sinh học phân tử đã chỉ ra 2 chủng phân lập được này đều thuộc nhóm cổ điển (Classic type), khác xa với nhóm Asia 1 và Asia 2

Nguyễn Thị Lan & Keonam Kheo (2012) đã chỉ ra đặc điểm bệnh lý của chó Phú Quốc mắc bệnh Care và ứng dụng kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang để chẩn đoán bệnh Các dấu hiệu lâm sàng đầu tiên khi mắc bệnh Care là sốt cao, biếng ăn hoặc không ăn, nôn mửa đối với chó con, ho ở chó trưởng thành, có nốt sài tại vùng da mỏng ở vùng bụng, tiêu chảy và có triệu chứng thần kinh như đi vòng tròn Bệnh tích đại thể tập trung chủ yếu ở phổi và ruột Mặt cắt phổi có nhiều dịch chảy ra; ruột có hiện tượng sung huyết, xuất huyết; đại não bị sung huyết Các dấu hiệu bệnh tích khác là: lách sưng, mặt cắt lồi, hạch lympho sưng, gan thoái hóa, túi mật sưng to Các bệnh tích vi thể gồm có xuất hiện nhiều hồng cầu trong lòng phế nang, vách phế nang đứt nát, thoái hóa tế bào nhu mô, lông nhung ruột bị đứt nát, thâm nhiễm tế bào viêm ở não

Nguyễn Thị Lan & cs (2015) đã nghiên cứu một số đặc điểm bệnh lý của chó được gây bệnh thực nghiệm bằng chủng virus Care (CDV-768) Kết quả gây nhiễm chủng virus Care (CDV-768) cho 3 chó lai Becgie 2 tháng tuổi với liều 106 TCID50/25l qua đường mắt, khí dung và miệng cho thấy chó có triệu chứng ủ rũ, mệt mỏi, bỏ ăn, sốt, nôn mửa, tiêu chảy, ỉa ra máu, có nốt sài trên

da, sừng hóa gan bàn chân Các bệnh tích đại thể chủ yếu ở phổi (mặt cắt phổi

có dịch, phổi nhục hóa), ruột có hiện tượng sung huyết, xuất huyết, đại não bị sung huyết, hạch lympho sưng, gan thoái hóa, túi mật sưng to Các bệnh tích vi thể như xuất hiện nhiều hồng cầu trong lòng phế nang, vách phế nang đứt nát, thoái hóa tế bào nhu mô, lông nhung ruột bị đứt nát, thâm nhiễm tế bào viêm ở não Virus tập trung chủ yếu ở các cơ quan như phổi, hạch lympho, ruột Các kết quả thí nghiệm cho thấy chủng virus Care (CDV-768) có độc lực và có khả năng gây bệnh cho chó

Theo Trần Văn Nên & cs (2017), vaccine vô hoạt Care được chế từ chủng

CDV-VNUA-768 đã được đánh giá có khả năng bảo hộ trên chó bằng công cường độc với chủng CDV-HUA-04H Thí nghiệm tiêm vaccine vô hoạt Care chế từ chủng CDV-VNUA-768 cho những chó becgie cái 6 tuần tuổi, sau đó 3 tuần công cường độc bằng chủng virus CDV-HUA-04H Đáp ứng miễn dịch kháng thể của chó thí nghiệm sau khi tiêm vaccine vô hoạt Care gây ra được khảo sát bằng phản ứng ELISA phát hiện kháng thể Hiệu giá kháng thể đạt ngưỡng trên giá trị tới hạn sau 21 ngày tiêm vaccine, sau đó đạt cực đại sau 35-42 ngày tiêm (với hiệu giá trung bình đạt 1,54) Ở các ngày 42 tới 49 ngày sau khi tiêm, hiệu giá kháng thể giảm dần nhưng vẫn đạt trên ngưỡng giá trị tới hạn ở 49 ngày với giá trị hiệu giá trung bình đạt 1,35 Sau 21 ngày tiêm vaccine lần hai, các chó thí nghiệm và đối chứng được công cường độc với chủng CDV-HUA-04H Kết quả theo dõi hiệu giá kháng thể đã chỉ ra ở lô tiêm vaccin đã tạo ra kháng thể đặc hiệu với virus Care với giá trị hiệu giá trung bình đạt 0,69 lớn hơn giá trị tới hạn Kết quả nghiên cứu này cho thấy chó được tiêm vaccine vô hoạt Care chế từ chủng CDV-VNUA-768 được bảo hộ 100%

2.2 ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA VIRUS GÂY BỆNH CARE

2.2.1 Đặc điểm hình thái, cấu trúc, phân loại

* Đặc điểm hình thái của CDV

Virus Care (CDV) có hình vòng tròn, hình bán nguyệt do virus có dạng các sợi tóc cuộn tròn hình thành Dạng vòng tròn này có đường kính từ 115 nm đến

230 nm Màng cuộn kép có độ dày từ 75 đến 85Ao với bề mặt tráng xoắn từ bên trong theo Kennedy & cs.(1989) mô tả

* Đặc điểm cấu trúc hệ gen virus CDV

Virus CDV được bao phủ bởi các gai glycoprotein có kích thước 8-14 nm và chứa một nucleocapsid đối xứng xoắn ốc, có chiều dài 1 μm và đường kính 18 nm (Maclachlan & Dubovi, 2010) Hệ gen CDV là phân tử RNA sợi đơn âm, có kích thước khoảng ~ 16 kb, không chứa đầu 5'-UTR và không có chuỗi poly (A) ở đầu 3'-UTR, nhưng có các phân tử mã hóa chức năng 5' và 3' Hệ gen của virus mã hóa cho hai protein không cấu trúc (là C và V protein) và 6 protein cấu trúc, gồm: large protein (L), haemagglutinin (H), phosphoprotein (P), nucleocapsidprotein (N), fusion protein (F) và matrix protein (M) (Diallo, 1990)

Hình 2.1 Mô hình c ấu trúc của virus Canine Distemper (CDV)

Nguồn: Green & cs (1998)

Trong đó, Protein không cấu trúc (C) được mã hóa từ một khung đọc mở khác ở gen P (Lamb & Kolakofsky, 2001) Chức năng của protein C cho đến nay vẫn chưa được xác định rõ ràng

N: Nucleocapside, khối lượng phân tử 60 - 62 Kda bao quanh và phòng vệ cho hệ gen của virus, nhạy cảm với những chất phân giải protein

P: Phosphoprotein, khối lượng phân tử 73 - 80 Kda, nhạy cảm với những yếu

tố phân giải protein, đóng vai trò quan trọng trong sự sao chép ARN (Sidhu & cs., 1993)

M: Matrix, khối lượng phân tử 34 - 39Kda, đóng vai trò quan trọng trong sự trưởng thành của virus và nối nucleocapside với những protein vỏ bọc

F: Fusion là glycoprotein trên bề mặt của vỏ bọc, khối lượng phân tử 59- 62 Kda, đóng vai trò trong sự kết hợp virus với thụ thể màng tế bào, dẫn đến kết hợp nhiều tế bào cảm nhiễm (hợp bào)

H: Protein ngưng kết hồng cầu (Haemagglutinin) hay yếu tố kết dính, là glycoprotein thứ hai của vỏ bọc, khối lượng phân tử 76 - 80 Kda, thể hiện tính chuyên biệt của loài virus Ở virus Care, protein này không hấp thụ hồng cầu cũng không ngưng kết hồng cầu

L: Large protein có khối lượng phân tử lớn 200 Kda, chưa rõ chức năng (Hughes & cs., 1992)

* Phân loại virus CDV

CDV là một thành viên của giống Morbillivirus, thuộc họ Paramixoviridae Các thành viên khác của giống Morbillivirus như virus gây bệnh sởi trên người (Measles virus - MV), virus dịch tả trâu bò (Rinderpest virus - RPV), virus gây bệnh trên động vật nhai lại nhỏ (Peste des petits ruminants virus - PPRV), virus gây bệnh trên động vật có vú dưới nước (cá heo, hải cẩu) (Murphy & cs., 1999) Cho đến nay CDV vẫn được công nhận gồm một serotype duy nhất (Maclachlan & Dubovi, 2010; Mccarthy & cs., 2007) Tuy nhiên có ít nhất 08 genotype đã được công bố, bao gồm: Asia-1, Asia-2, Asia-3, Europe, European wildlife, Arctic-like, America-1 (Vaccines) và America-2 (Cheng & cs., 2015)

* Sức đề kháng của virus Care

Virus Care tương đối không ổn định dễ bị mất tính gây nhiễm ở nhiệt độ cao, thời tiết khô, hóa chất tẩy rửa, dung môi hòa tan mỡ và thuốc sát trùng Trong điều kiện hoang dã virus sống ít nhất một năm khi giữ ở 70C Trong Nitrogen không có Oxy sống được một năm, đông khô sống được nửa năm, bảo quản ở -240C virus sống được hai năm và sống được hai tháng ở 100C

Celiker & Gillespie (1954) đã dùng virus sài sốt chó thích nghi trên môi trường phôi trứng để nghiên cứu sự ảnh hưởng của nhiệt độ đến tính mẫn cảm của virus và các tác giả thấy: virus Care rất mẫn cảm với sức nóng Virus bị phá hủy ở

50 - 60oC trong 30 phút Trong mô cơ phân lập virus tồn tại ít nhất một giờ ở 37oC

và 3 giờ ở 200C (nhiệt độ phòng) Thời tiết ấm áp virus không thể tồn tại lâu trong chuồng nuôi chó sau khi chó bị bệnh chuyển đi

Thời gian sống và duy trì độc lực của virus sẽ dài hơn trong nhiệt độ lạnh Ở nhiệt độ đóng băng (00C) virus có thể tồn tại trong môi trường hàng tuần, dưới nhiệt độ đóng băng virus được ổn định Virus tồn tại ở nhiệt độ -650C ít nhất là 7 năm Việc bảo quản virus ở dạng đông khô có ý nghĩa lớn trong việc bảo quản giống virus, sản xuất Vaccine và nghiên cứu trong phòng thí nghiệm

Độ pH: virus ổn định ở pH= 4,5- 9,0

Vỏ bọc virus rất mẫn cảm với ete, chloroform, fomalin loãng (<0,5%), phenol (75%), dung dịch amoni Do vậy, khi dùng những chất này để tiêu độc chuồng và bệnh viện mang lại hiệu quả cao (Roelke-Parker & cs., 1996; Craig & Maxj., 1897)

Virus Care mẫn cảm với tia UV mặc dù có vỏ bọc protein chống lại sự vô hoạt của các tác nhân bên ngoài

Virus Care rất dễ bị phá hủy, dễ bị vô hoạt ở môi trường ngoài, vì vậy việc lây gián tiếp là rất hiếm gặp

2.2.2 Đặc tính sinh học của virus

* Đặc tính phân lập và nuôi cấy:

Phân lập: virus Care có độc lực được phân lập trên tế bào (Macrophage pulmonaier), trên chó hay chồn xương (furet)

Khi phân lập đầu tiên, nó cần sự thích ứng trước khi nhân lên trên tế bào biểu

mô (như tế bào nguyên thủy thận chó hay chồn)

Nuôi cấy: virus Care gốc được giữ bằng truyền đời qua chồn furo mẫn cảm Cabasso & Cox (1949) khi nghiền virus này truyền qua chồn furo có thể thích nghi phát triển trên màng túi niệu phôi thai gà, không có dấu hiệu bệnh tích gì khi đã truyền qua 9- 10 lần tiêm truyền Tiếp tục tiêm truyền thấy tăng độ dày màng túi niệu ngay

ở vùng trắng Tiêm truyền đến 208 lần thì không thấy chồn furo ốm nữa, nhưng vẫn gây được miễn dịch với virus cường độc này

Virus Care thích nghi sinh trưởng được trong canh thang tế bào thận chó, mô chồn Furo và nguyên bào sợi của gà

Những chủng virus thích ứng có thể bị mất độc lực chủng Rochbom trên tế bào thận chó

Sự nhân lên của virus Care tương tự như các virus khác giống billi và hệ paraxoviridae

Virus kết dính vào thụ thể tế bào glycoprotein H- Nucleocapside , sau khi có

sự kết hợp màng tế bào- vỏ bọc virus ARN và những protein virus được tổng hợp trong tế bào chất Phân tử khối hình thành nụ chồi ở màng tế bào chất

Độc lực của phân tử virus thay đổi tùy vào chủng virus, và mức độ cảm nhiễm Bằng kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang, người ta có thể thấy nhiều hạt nhỏ trong tế bào chất gần nhân 12-24 giờ sau gây nhiễm Những thể vùi thường xuất hiện chậm

Trước đây, việc phân lập và xác định hiệu giá của virus Care rất khó khăn do không tìm được dòng tế bào thích hợp để virus sinh trưởng và gây bệnh tích tế bào Seki & cs (2003) đã nghiên cứu và chứng minh được dòng tế bào Vero biểu hiện SLAM rất phù hợp trong việc phân lập virus Care từ mẫu bệnh phẩm

Lan & cs (2005) đã nghiên cứu đặc tính sinh trưởng của một số chủng virus Care trên dòng tế bào Vero (có gắn receptor tương ứng với virus Care) (Vero-Dog SLAM tag hay Vero-DST) Nghiên cứu của Seki & cs (2003) đã làm rõ những đặc tính sinh trưởng khác nhau khi gây nhiễm các virus Care lên tế bào Vero và tế bào Vero-DST Qua đó, có thể nhận thấy, Vero-DST là dòng tế bào thích hợp, có thể sử dụng để phân lập và xác định hiệu giá virus

Lan & cs (2006) đã tiến hành phân lập 3 chủng virus 007Lm, S124C, Ac96I

và chủng virus Vaccine Onderstepoort trên môi trường nuôi cấy tế bào Vero-DST nhằm xác định sự ổn định về đặc tính sinh học của các chủng virus nghiên cứu Các chủng virus này được cấy chuyển một đời (chủng gốc) và 20 đời qua môi trường tế bào Vero-DST Tiến hành so sánh về trình tự gene và đặc tính nuôi cấy giữa chủng virus gốc và chủng virus ở đời cấy truyền 20 Cả 4 chủng virus ở đời cấy truyền thứ 20 đều sinh trưởng tốt hơn so với chủng giống gốc ban đầu Virus

ở đời 20 có khả năng gây bệnh tích tế bào chậm hơn so với chủng gốc ban đầu Kết quả nghiên cứu đã chỉ ra dòng tế bào Vero có biểu hiện SLAM phù hợp để phân lập và cấy chuyển nhiều đời virus Care mà không làm thay đổi về đặc điểm

di truyền của virus

Nghiên cứu của Lan & cs (2009) đã phân loại 10 chủng virus Care được phân lập trước đó dựa vào khả năng sinh trưởng và gây bệnh tích tế bào (CPE) trên dòng tế bào Vero Các chủng virus P94S, Ac96I, S124C, MD231, MS232, MSA5 và 095Cr thuộc genotype Asia 1 hiếm khi gây bệnh tích tế bào trên dòng

tế bào Vero-DST Kết quả nghiên cứu cũng chỉ ra các chủng virus Care được phân lập tại Nhật Bản thuộc genotype Asia 2, có khả năng gây bệnh tích tế bào trên dòng tế bào Vero, điều này có thể liên quan tới đặc điểm sinh học phân tử của chúng

Nghiên cứu của Pratakpiriya & cs (2012) đã làm rõ thêm một số đặc tính sinh học của virus Care phân lập trên dòng tế bào Vero-DST Các mẫu bệnh phẩm của chó mắc bệnh Care như: phổi, hạch lympho, ruột cho khả năng phân lập virus rất cao Tế bào Vero-DST là tế bào thích hợp để phân lập virus CDV Virus nhân lên nhanh trong tế bào Vero-DST và gây bệnh tích tế bào điển hình thể Syncytium

- thể hợp bào Bệnh tích tế bào xuất hiện sau 12h gây nhiễm, đạt cao nhất sau 60 giờ gây nhiễm và phá hủy muộn nhất là 96 giờ sau gây nhiễm Để tìm hiểu sâu hơn về đặc tính sinh học của virus phân lập được, tác giả không chỉ tiến hành

nghiên cứu với những virus phân lập được mà còn đồng thời tiến hành đối với cả chủng virus Vaccine Onderstepoort Virus CDV4-H phân lập được có khả năng phá hủy tế bào mạnh hơn virus vaccine chủng Onderstepoort Virus CDV4-H có hiệu giá virus cao nhất sau 36 giờ gây nhiễm với CPE đạt 90% Hai chủng virus này đều tồn tại trong tế bào và ngoài tế bào, hiệu giá virus trong tế bào cao hơn hiệu giá virus giải phóng ra ngoài tế bào Kết quả này có ý nghĩa cho người làm nghiên cứu virus có thể xác định được thời điểm thu hoạch virus dựa vào việc quan sát bệnh tích tế bào (CPE)

* Chủng virus:

- Chủng gây bệnh: chủng tiêu chuẩn là chủng CDV-SH dùng để công cường độc kiểm soát hoạt tính của vaccine trên chó được tiêm với chủng này bằng đường tiêm thẳng vào não chó non nhạy cảm, tỷ lệ chết 100% trong 8 – 10 ngày, bằng đường hô hấp qua những giọt khí dung, tử số chỉ bằng 50% trong tự nhiên

Những chủng Cornell A75- 17 và Ohio R252 kém độc lực hơn thường tác động lên thần kinh khá chậm gây viêm não tủy mất Nyeline

Chủng Green là chủng rất độc với chồn xương một loài chồn nhạy cảm hơn chó

Chủng Vaccine:

Chủng chó hóa biến đổi bằng việc nuôi cấy liên tục trên tế bào thận chó tiêu biểu là chủng Rockborn Những chủng này có thể gây viêm não sau khi tiêm vaccine trên chó non, gây suy giảm miễn dịch

Chủng gà hóa biến đổi độc lực sau khi tiếp đời nhiều lần qua màng nhung niệu trứng gà có phôi rồi sau đó cấy tế bào phôi gà tiêu biểu là chủng Onderstepoort và chủng Lederles, những chủng này thì không gây bệnh trên chồn và ít dẫn đến phản ứng sau khi tiêm so với chủng chó hóa đồng thời có phòng vệ tốt

2.2.3 Đặc tính sinh học phân tử của virus

CDV có hệ gen là RNA sợi đơn âm, độ dài khoảng 15.7kb, thuộc họ

Paramixoviridae, gồm 6 protein cấu trúc: nucleocapsid (N), matrix (M), fusion (F), hemagglutinin (H), phospho- (P) và large- (L) protein) và 2 protein không cấu trúc (C and V protein) Trong đó protein H có vai trò rất quan trọng đối với độc lực của virus và có nhiều biến đổi nhất giữa các chủng và giữa các genotype nên được chọn là đối tượng chính cho nghiên cứu dịch tễ phân tử và nguồn gốc phả hệ

Các tác giả cho rằng đã có sự biến đổi lớn trong hệ gen của virus, dẫn đến sự không tương đồng với các chủng vaccine Có ít nhất 08 genotype khác nhau của CDV đã được công bố, bao gồm: Asia-1, Asia-2, Asia-3, Europe, European wildlife, Arctic-like, America-1 (Vaccines), và America-2 (Cheng & cs., 2015) Không những thế, một số công bố mới còn cho rằng có tới 14 nhóm CDV khác nhau (Bi & cs., 2015;

Ke & cs., 2015) Trong đó nhóm genotype America-1, bao gồm chủ yếu là các trình

tự phân lập từ Mỹ được cho là nguồn gốc của dịch bệnh CDV trên toàn thế giới, đóng vai trò trung tâm trong việc truyền lây CDV đến các khu vực khác (Panzera & cs., 2015) Ở Áo đã tìm thấy sự đa dạng cao về nguồn gốc các chủng CDV gây bệnh trên chó, bao gồm cả các dòng châu Âu và dòng châu Á (Benetka & cs., 2009) Ở Châu Á, một số nghiên cứu cho thấy các chủng CDV của Trung Quốc thuộc về genotype Asia-1, các chủng của Hàn Quốc thuộc về hai genotype Asia-1 và Asia-2 (An & cs., 2008), trong khi các chủng CDV phân lập tại Ấn Độ lại tách riêng khỏi nhóm Asia-1 và Asia-2, gần gũi với các chủng của Thụy Điển, Hungary và Đức (Cheng & cs., 2015; Deka & cs., 2015) Cho đến nay đã có tổng số 63 hệ gen của CDV được mã toàn bộ hệ gen và đăng kí trên Ngân hàng Gen, bao gồm các chủng virus phân lập tại Mỹ, Anh, Italia, Thụy Điển, Brazil, Canada, Ca-dắc-xtan, Uruguay, Trung Quốc và Nhật Bản

Roelke-Parker & cs (1996) đã tiến hành nghiên cứu bệnh Care trên đàn sư

tử tại Serengeti ở châu Phi Một số loài động vật khác ở Serengeti cũng mắc bệnh Care Nghiên cứu đã tiến hành giải trình tự gene H và P của các chủng virus phân lập được từ sư tử (Panthera leo), linh cẩu (Crocuta crocuta), cáo (Otocyon megalotis) và chó nhà (Canis familiaris) ở Serengeti Kết quả phân tích trình tự gene đã chứng minh các chủng virus Care được phân lập từ các loài động vật ở Serengeti có mối quan hệ di truyền gần gũi và khác so với các chủng virus Care được phân lập trên các loài động vật khác ở các khu vực khác Kết quả nghiên cứu này đã chỉ ra: (1) một chủng virus Care độc lực cao đã xuất hiện trên loài động vật

ăn thịt ở Serengeti trong vài năm qua; (2) các chủng virus phân lập được khác về mặt di truyền ở gene H và P khi so sánh với các chủng virus Care ở các nơi khác trên thế giới; và (3) các chủng virus Care thường truyền qua các vật chủ là các loài động vật ăn thịt ở Serengeti

Iwatsuki & cs (1997) đã phân lập 3 chủng virus Care là Ueno, Hamamatsu

và Yanaka từ chó ở Nhật Bản và phân tích đặc điểm di truyền ở đoạn gene H Phân tích trình tự gene H đã chỉ ra 9 vị trí glycosyl hóa liên kết với Asparagine ở trình

tự amino acid mã hóa từ gene H của các chủng virus mới phân lập được, ngược lại chủng virus Onderstepoort chỉ có 4 vị trí Do đó, sự sai khác về số lượng vị trí glycosyl hóa ở trình tự amino acid mã hóa từ gene H có thể dẫn đến sự sai khác về tính kháng nguyên của các chủng virus Trình tự gene H của các chủng virus mới được phân lập ở Nhật Bản có mức độ tương đồng giữa các chủng là 99%, và 95% với chủng Châu Âu và Hoa Kì (phân lập từ chó biển, chó Đức và chồn sương và thú thuộc họ mèo) và 90% với chủng Vaccine Dựa trên cây sinh học phân tử, các chủng virus mới phân lập tại Nhật Bản thuộc một nhánh phát sinh khác với các chủng phân lập được tại Châu Âu và Hoa Kỳ, và tất cả các chủng này khác với nhánh phát sinh của chủng vaccine

Hirama & cs (2004) đã phân tích trình tự gene Hemagglutinin (H) của hai chủng virus Care (Haku93 và Haku00) phân lập được từ loài cầy hương hoang dã (Paguma larvata) Trình tự amino acid mã hóa từ gene H của hai chủng virus phân lập được có độ dài là 607 amin acid mã hóa 1 khung đọc mở Trình tự nucleotide

và amino acid mã hóa từ đoạn gene H của chủng virus Haku93 và Haku00 có mức

độ tương đồng cao với các chủng virus được phân lập từ thực địa như Yanaka và Tanu96, nhưng lại tương đồng thấp với chủng virus Vaccine phân lập trước đó Vị trí glycosyl hóa liên kết với N (Asparagine) của cả 2 chủng Haku93 và Haku00 giống với các chủng virus Care phân lập trước đó Phân tích cây sinh học phân tử

đã chỉ ra các chủng virus Care phân lập từ cầy hương hoang dã thuộc nhánh phát sinh với các chủng virus Care gần đây được phân lập tại Nhật Bản

Nghiên cứu của Lan & cs (2007) đã tiến hành so sánh về đặc điểm di truyền phân tử và đặc tính nuôi cấy của 2 chủng virus Care mới phân lập được thuộc genotype Asia 1 và Asia 2 Các chủng virus nghiên cứu được phân lập từ chó có biểu hiện lâm sàng mắc bệnh Dữ liệu kết quả giải trình tự gene H và P được so sánh với đặc tính nuôi cấy của các virus nghiên cứu Trình tự amino acid của đoạn gene H gồm 12 Cysteine ở cả genotype Asia 1 và Asia 2 Vùng kị nước ở trình tự amino acid mã hóa từ gene H của genotype Asia 2 dài hơn so với genotype Asia 1

là 1 amino acid Trình tự amino acid được mã hóa từ đoạn gene H của các virus thuộc genotype Asia 1 có 9 vị trí glycosyl hóa liên kết với Asparagine, trong khi genotype Asia 2 có 8 vị trí glycosyl hóa liên kết với Asparagine Ở các chủng virus thuộc genotype Asia 1, hàm lượng virus trong tế bào của các chủng thuộc genotype Asia 1 cao hơn so với hàm lượng virus giải phóng ngoài môi trường tế bào và các chủng virus thuộc genotype Asia 2 thì ngược lại Đặc điểm di truyền phân tử và

đặc tính nuôi cấy của 2 genotype Asia 1 và Asia 2 rất khác nhau dù không có sự khác biệt về triệu chứng lâm sàng và bệnh tích quan sát được trên các chó mắc 2 genotype này

Guo & cs (2013) đã phân tích cây sinh học phân tử dựa trên trình tự đoạn gene H và chỉ ra các chủng virus Care phân lập từ gấu trúc và chó hoang có nguồn gốc khác xa với chủng Vaccine và các chủng virus Care tự nhiên khác Các chủng virus Care phân lập được đều thuộc genotype Asia 1 và có mức độ tương đồng cao là 91,5-99,8% (trình tự nucleotide) và 94,4-99,8% (trình tự amino acid) Kết quả nghiên cứu này giúp nâng cao hiểu biết về đặc điểm bộ gene của các chủng virus Care phân lập được và góp phần vào việc phát triển các phương pháp giám sát và kiểm soát dịch bệnh Care trực tiếp hoặc gián tiếp ở Trung Quốc

2.3 BỆNH CARE TRÊN CHÓ

2.3.1 Dịch tễ học

Trong tự nhiên các giống chó đều cảm thụ, nhưng mẫn cảm nhất là chó nhập ngoại, chó nội ít mắc hơn (Trần Thanh Phong, 1996) Ngoài ra cáo, cầy và các loài động vật ăn thịt khác cũng mắc, đặc biệt là loài chồn vô cùng mẫn cảm, thú ăn thịt

Tô Du & Xuân Giao (2006), khi nghiên cứu về dịch tễ bệnh Care cho rằng tất cả các loài chó đều cảm thụ bệnh, nhưng mẫn cảm hơn là chó lai và chó ngoại nhập, chó nội ít mẫn cảm hơn Bệnh xuất hiện nhiều khi có sự thay đổi thời tiết đặc biệt vào những ngày mưa

Trong cơ thể chó bệnh, virus thường có trong máu, phủ tạng, chất bài tiết, đặc biệt nước tiểu thường xuyên có virus, não, lách, phổi, hạch, tủy xương thường

có nhiều virus nhất

Trong tự nhiên, virus chủ yếu lây lan qua đường hô hấp dưới dạng những giọt khí dung hay giọt nước nhỏ Chó bị bệnh bài xuất virus qua các chất bài tiết

của cơ thể Virus trong chất bài tiết này dễ dàng lây nhiễm cho những con chó khác khi chúng tiếp xúc Do vậy, bệnh có tính lây lan cao (Wills & Simpson, 1994) Chó bị bệnh điển hình gây nhiễm cho chó khác theo dịch tiết ở đường hô hấp do

ho bắn ra Mặc dù virus được bài tiết ra trong hầu hết những dịch tiết của cơ thể bao gồm cả nước tiểu nhưng bệnh ít lây lan theo những chất tiết này (Trần Thanh Phong, 1996; Wills & Simpson, 1994; Merchant & Packer, 1961)

Virus cũng có thể xâm nhập vào đường tiêu hóa theo thức ăn, nước uống Nguyễn Vĩnh Phước (1979) cho rằng: virus xâm nhập vào cơ thể qua đường

hô hấp, tiêu hóa, cũng có thể qua da

Trong phòng thí nghiệm: tiêm, uống, bôi niêm mạc mũi đều gây đươc bệnh

2.3.2 Cơ chế sinh bệnh

Thời kỳ ủ bệnh của Care thường là từ 3-6 ngày (dài nhất là 17-21 ngày) và

có thể kéo dài khoảng trên dưới 1 tháng Bệnh có tỷ lệ chết từ 50-80%, thậm chí 100% nếu không được phát hiện và điều trị sớm (Hồ Đình Chúc, 1993) Lúc bệnh phát ra ở dạng kế phát (thường kết hợp cùng bệnh Parvovirus, viêm gan truyền nhiễm) thì tỷ lệ chết của bệnh càng cao (Tô Du & Xuân Giao, 2006)

Theo Trần Thanh Phong (1996), sau khi virus xâm nhập vào cơ thể qua đường mũi, miệng và ngay lập tức nhân lên trong đại thực bào và những tế bào lympho của đường hô hấp, trong vòng 24 giờ virus đã tới các hạch lympho của phổi Vào ngày thứ 6 virus đã di cư tới lách, dạ dày, ruột non và gan Vào thời điểm này thì chó bắt đầu sốt

Từ 6 - 9 ngày sau khi cảm nhiễm, virus vào máu và lan rộng đến tất cả các

cơ quan lympho rồi đến cơ quan khác Nếu kháng thể trung hòa được tổng hợp trong 10 ngày sau khi cảm nhiễm thì biểu hiện lâm sàng sẽ không rõ ràng Nếu không có kháng thể virus sẽ xâm lấn tất cả các cơ quan tạo những biểu hiện lâm sàng và gây chết

Theo Nguyễn Vĩnh Phước (1979), thời kỳ nung bệnh khoảng 4 - 5 ngày, dao động từ 2- 3 ngày đến 2 tuần Sau khi qua niêm mạc, virus được lâm ba cầu mang đến các hạch lân cận và phát triển ở đấy Sau đó virus vào máu gây bại huyết Nó tác động đến nội mạc, mạch máu, gây sốt Cơn sốt chỉ khoảng 2 - 3 ngày rồi lùi Con vật có thể chết, nhưng ít Do cơ thể bị yếu đi, một số vi khuẩn ký sinh sẵn trên

cơ thể như: Staphylococcus, Bronchisepticum, Salmonella, Pasteurella,… trỗi dậy, nên ít ngày sau cơn sốt thứ hai xuất hiện nặng hơn, chứng tỏ có sự nhiễm trùng nặng trong phủ tạng Vì vậy con vật bị bệnh có triệu chứng như viêm phổi, viêm não, viêm ruột thể cata

2.3.3 Đặc điểm bệnh lý

2.3.3.1 Triệu chứng

Theo Trần Văn Nên & cs (2017), biểu hiện bệnh thường rất đa dạng phụ thuộc vào tuổi chó mắc bệnh, giống chó, tình trạng sức khỏe, chế độ chăm sóc nuôi dưỡng và độc lực của mầm bệnh

Đầu tiên chó xuất hiện những triệu chứng chung: mệt mỏi, ủ rũ, ăn ít, lười vận động, chảy nước mắt, nước mũi, nôn mửa, sau đó sốt, thân nhiệt lên đến 40-41,5°C kéo dài từ 24-26 giờ rồi thân nhiệt giảm xuống 38,5-39,5ºC lúc này chó ăn

ít, mệt mỏi 3-4 ngày sau xuất hiện cơn sốt thứ hai, đó là do có sự bội nhiễm của các vi khuẩn kế phát, cơn sốt kéo dài 3-4 ngày, lúc này bệnh trầm trọng hơn, không chỉ do độc lực của virus mà còn do số lượng và độc lực của các vi khuẩn bội nhiễm cùng xuất hiện với cơn sốt thứ hai, chó bắt đầu biểu hiện các triệu chứng ở đường

hô hấp, tiêu hóa, da và thần kinh

- Triệu chứng ở đường tiêu hóa:

Do viêm cata ở dạ dày và ruột non nên con vật khát nước, nôn mửa rồi ỉa chảy, lúc đầu phân loãng, có bọt sau đó lẫn máu, phân có màu cà phê nhạt Trường hợp nặng phân có thể lẫn máu tươi, niêm mạc ruột bong ra làm phân có mùi tanh khắm rất khó chịu Chó thường bị viêm niêm mạc miệng và hạch hạnh nhân

Nôn là triệu chứng thường gặp của bệnh Care Nôn thường xuất hiện sớm, lúc đầu nôn ra thức ăn sau đó nôn khan hoặc nôn ra bọt có màu vàng

- Triệu chứng đường hô hấp:

Chó bị viêm mũi, thanh quản, phế quản rồi viêm phổi nên chó khó thở, nhịp thở tăng rõ, phổi có tiếng ran ướt Con vật chảy nhiều nước mũi, lúc đầu loãng sau đặc dần, đôi khi có mủ xanh hoặc máu đen Chó bị ho, lúc đầu ho khan sau ho ướt, chó thở gấp thè lưỡi ra mà thở

Ngoài ra, chó bệnh thường xuyên có viêm mắt, chảy nước mắt Lúc đầu, nước mắt trong sau đặc dần như có mủ, chó bị loét, đục giác mạc

- Triệu chứng trên da:

Đặc trưng là sự xuất hiện các nốt sài ở bụng, bẹn, ngực, phía trong đùi Đầu tiên, ở các vị trí trên da nổi lên những nốt chấm đỏ, những chấm đỏ đó biến thành những nốt sài to bằng hạt đỗ xanh, hạt gạo, lúc đầu đỏ sau đó bội nhiễm vi khuẩn nên mềm ra, có mủ, khi vỡ làm lông bết lại, hôi hám Các nốt sài có thể vỡ ra hoặc

không vỡ rồi hình thành vảy, bong đi, để lại một vết thương nhanh lành và không hình thành sẹo

- Triệu chứng thần kinh:

Quá trình tiến triển, con vật có thể thể hiện các triệu chứng thần kinh như ủ

rũ, buồn rầu hoặc hung dữ sau đó là các cơn co giật đều đặn ở bắp thịt, mũi tai, chân hoặc toàn thân cuối cùng là liệt Con vật loạng choạng, đứng lên ngã xuống, đâm sầm vào tường, sùi bọt mép Cuối cùng chó nằm bệt, loạn nhịp tim, thân nhiệt

hạ và chết Tỷ lệ chết có thể trên 80%, bệnh kéo dài 2-5 tuần Những con lành bệnh thường có di chứng gầy còm, đi xiêu vẹo, mù và điếc v.v

2.3.3.2 Bệnh tích

Theo Appel Max & Summers (1995), bệnh tích đại thể có thể gặp sừng hoá

ở mõm và gan bàn chân Tuỳ theo mức độ kế phát các vi khuẩn có thể thấy viêm phế quản phổi, viêm ruột, mụn mủ ở da v.v

Bệnh tích đường tiêu hóa: Viêm cata ruột, loét ruột, hạch ruột sưng, gan thoái hóa mỡ

Đường hô hấp: Viêm mũi, thanh quản, khí quản, viêm phổi, có mụn mủ trong phổi, có khi vỡ ra gây viêm phế mạc

Thần kinh: Viêm não, não tụ máu, các tế bào thần kinh bị hoại tử

Tế bào thượng bì đường hô hấp, tiết niệu, lưỡi, mắt, hạch và tuyến nước bọt

có thể tìm thấy tiểu thể lents trong nguyên sinh chất

Chó con trước sinh hoặc sơ sinh bị nhiễm Care thường bị teo tuyến ức, viêm phổi hoặc viêm ruột thể cata, tổn thương đường hô hấp trên, viêm kết mạc mắt, viêm mũi, viêm nhánh khí phế quản, chó bị sừng hoá gan bàn chân Tổn thương nhẹ trung khu thần kinh, hiếm gặp sung huyết màng não, trong buồng não và tăng

áp lực hệ thần kinh trung ương do phù não

Suy giảm lympho là bệnh tích điển hình ở chó có triệu chứng toàn thân Viêm kẽ phổi đặc trưng là sự dày lên của vách phế nang và sự tăng sinh của biểu mô vách phế nang Lòng phế nang gồm các tế bào long vách phế nang và đại thực bào

Viêm tinh hoàn thường thấy ở chó mắc bệnh Care Điều này có thể giải thích được sự giảm sinh tinh trùng, giảm chất tiết của tiền liệt tuyến sau khi hồi phục ở chó đực

Chó sơ sinh mắc bệnh có bệnh tích viêm não cấp tính, thoái hoá tế bào thần kinh và phá huỷ myelin Những con sống sót, các vùng đốm hoại tử thay vào bởi các tế bào sao phì đại, nơi tạo thành mạch lưới do đại thực bào hấp thu myelin Biến đổi trầm trọng nhất là chất trắng ở thần kinh trung ương, biến đổi có thể tìm thấy ở trên cuống tiểu não, sát trên sừng lưng đến buồng não IV Tổn thương cũng thấy ở não giữa và thuỳ thái dương Các vùng trên bề mặt như bó thị giác, gốc nếp

vỏ não, dây thần kinh bề mặt não cũng bị ảnh hưởng

Ở một số chó, chủ yếu gây ảnh hưởng ở đại não và đồi thị Trường hợp nặng

có thể làm huỷ myelin tạo các không bào xốp ở chất trắng, viêm phản ứng tế bào thần kinh đệm Thể vùi trong bào tương và trong nhân chủ yếu tìm thấy ở tế bào sao và tế bào thần kinh

Chó được miễn dịch sẽ phát triển thành viêm não và giảm bạch cầu Những tổn thương này thường kết hợp với các triệu chứng mất thăng bằng và rối loạn tiền đình Tổn thương này được đặc trưng bởi sự lan rộng của những đám cặn lympho bào xung quanh vùng myelin bị hủy và thần kinh bị thoái hoá Chúng có thể lan rộng

và trầm trọng hơn ở trường hợp viêm não cấp tính Trường hợp mạn tính, tổn thương

có thể phát triển thành xơ cứng trong não đặc trưng bởi sự lắng cặn và thay thế của các mô thần kinh bởi các mạng lưới các tế bào sao dày đặc

Ngược lại, tổn thương do tiêm Vaccine được đặc trưng bởi sự viêm não dẫn tới hoại tử não với vùng ưu tiên là sừng bụng Thể vùi có thể tìm thấy trong nhân hoặc bào tương tế bào sao và tế bào thần kinh

Kiểm tra tổ chức học, thể vùi Care thường thấy nhất trong bào tương và nhuộm màu axít Chúng có đường kính bằng 1 - 5µm và tìm thấy ở tế bào biểu mô trong lớp màng nhầy, tế bào mắt, bạch cầu, tế bào thần kinh đệm và tế bào thần kinh Thể vùi tìm thấy sau khi nhiễm bệnh 5 - 6 tuần trong hệ lympho và đường tiết niệu Thể vùi trong nhân phân bố nhiều nhất ở biểu mô tuyến

Hình thái thể vùi vẫn chưa được biết rõ Hoá tổ chức cho thấy thể vùi được tạo ra từ sự kết hợp giữa vỏ nucleocapsid của virus và cặn của các tế bào là kết quả

sự nhiễm virus Ta không thể khẳng định hoàn toàn là có bệnh Care khi chỉ có sự xuất hiện của thể vùi Thể vùi đặc trưng trong bào tương khi nhiễm Care cũng xác định được ở bàng quang chó bình thường Đáng tiếc thể vùi không chỉ không đặc trưng mà còn có thể xuất hiện muộn trong bệnh

Sự hình thành tế bào khổng lồ đầu tiên trong chất trắng của thần kinh trung ương và tiếp đó là hạch lympho, phổi, lớp màng não mỏng là điểm riêng biệt của virus Care Những phát hiện bệnh lý này có thể sử dụng để chẩn đoán chính xác

sự nhiễm Care

2.3.4 Chẩn đoán bệnh

2.3.4 1 Dựa vào đặc điểm dịch tễ học

Bệnh chủ yếu xảy ra ở chó từ 2-12 tháng tuổi, ở thời điểm giao mùa, thời tiết thay đổi, độ ẩm cao hoặc lạnh đột ngột

2.3.4 2 Dựa vào triệu chứng lâm sàng

Chẩn đoán bệnh Care thể cấp tính và á cấp tính có thể dựa vào bệnh sử và triệu chứng lâm sàng Khi có những triệu chứng sốt, triệu chứng ở đường hô hấp (viêm mũi, ho, viêm phổi, tiết dịch nhầy có mủ ở mắt và mũi), ỉa chảy, tăng sinh sừng hoá gan bàn chân, triệu chứng thần kinh thì có thể nghi chó mắc bệnh Care đặc biệt ở chó non chưa tiêm phòng

Chẩn đoán lâm sàng trên chó có thể nhẫm lẫn với những bệnh sau:

- Viêm gan truyền nhiễm: gan sưng to, đục giác mạc;

- Bệnh do Parvovirus gây viêm dạ dày, ruột xuất huyết (do hoại tử những tế bào thượng bì nhung mao ruột), chó non viêm cơ tim gây chết cao;

- Bệnh do Leptospira: viêm dạ dày, ruột chảy máu, viêm loét miệng và thường xuất huyết ở chó lớn, vàng da và niêm mạc, số lượng bạch cầu tăng;

- Với triệu chứng thần kinh: cần phân biệt với bệnh dại, bệnh do toxoplasma, các trường hợp ngộ độc hoặc bị ung thư v.v

2.3.4 3 Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm

• Tìm thể Lents

Lấy mẫu bệnh phẩm là dịch cạo niêm mạc mắt hay mũi chó bị bệnh, đem nhuộm Hematoxillin - Eosin, tìm tiểu thể Lents qua kính hiển vi Cần chú ý ở não thể Lents rất giống thể Negri ở bệnh dại (David & Donald, 1979)

• Chẩn đoán virus học

Tiêm truyền bệnh phẩm cho động vật thí nghiệm

Mẫu bệnh phẩm là máu, lách, gan, phổi, các chất bài tiết và dịch nước mũi, nước mắt của chó nghi mắc bệnh đem nghiền, chế thành huyễn dịch và tiêm cho

động vật thí nghiệm Tốt nhất là tiêm cho chồn hoặc chó con Ngoài ra có thể tiêm cho chuột lang, chuột nhắt trắng, thỏ

Quan sát tiến triển của bệnh gây ra trên động vật thí nghiệm, mổ khám bệnh tích đại thể và kết luận

Trong bệnh phẩm có thể phân lập được một số vi khuẩn kế phát như

Pasteurella, Bacillus bronchisepticus, Staphylococcus, E Coli và Salmonella

Phân lập virus trên môi trường tế bào

Mẫu bệnh phẩm đem nghiền thành huyễn dịch, xử lý kháng sinh, ly tâm lấy nước trong và lọc qua màng lọc vi khuẩn rồi đem gây nhiễm lên môi trường tế bào

một lớp thích hợp Virus Care chỉ có thể nhân lên và gây bệnh tích tế bào (Cyto

pathogenic Effect-CPE) khi gây nhiễm lên tế bào phù hợp Bệnh tích tế bào do CDV gây ra có thể quan sát được là những thể hợp bào, tế bào bị phá hủy màng và xuất hiện thể vùi, ở trung tâm vùng tế bào xuất hiện CPE

Sự xuất hiện nhiều hay ít, nhanh hay chậm của CPE phụ thuộc vào số lượng, độc lực của virus và “tuổi” tế bào Tế bào mới nuôi cấy thì virus gây nhiễm dễ dàng hơn, CPE xuất hiện nhanh và nhiều hơn ở những tế bào đã nuôi cấy nhiều ngày (Lan & cs., 2005)

• Chẩn đoán huyết thanh học

Dùng phản ứng miễn dịch đánh dấu Enzym (ELISA)

Phương pháp kháng thể huỳnh quang trực tiếp phát hiện kháng thể nghi

• Chẩn đoán phát hiện ARN của virus Care bằng kỹ thuật RT-PCR

Phương pháp RT-PCR (Reverse Transcription Polymerase ChainReaction)

là sự kết hợp giữa phương pháp phiên mã ngược và phương pháp PCR Phương pháp này có thể phát hiện các ARN tồn tại với lượng rất thấp mà không thể phát hiện bằng các phương pháp khác

Do Taq polymerase sử dụng trong PCR không hoạt động trên RNA nên trước hết cần chuyển RNA thành cDNA nhờ enzyme phiên mã ngược Reverse Transcriptase (RT) Sau đó, cDNA này sẽ được khuếch đại nhờ Taq polymerase Dấu hiệu xác định bệnh là sản phẩm nhân bản một đoạn gen đặc hiệu của virus

Sự hiện diện của sản phẩm này được nhận biết qua điện di trên gel agarose (Lan

& cs., 2008)

• Chẩn đoán phát hiện bệnh Care bằng test chẩn đoán nhanh (kỹ thuật sắc

ký miễn dịch)

Nguyên tắc: Phức hợp kháng kháng thể (KKT) gắn chất màu được phân bố đều trên vạch giấy sắc ký Kháng nguyên đặc thù của vi sinh vật được gắn cố định tại “vạch phản ứng” Khi nhỏ dung dịch cần xác định kháng thể lên bản sắc ký, KT đặc hiệu (nếu có) trong dung dịch sẽ kết hợp với KKT gắn màu, phức hợp miễn dịch KT-KKT gắn màu này di chuyển trên giấy sắc ký sẽ bị giữ lại tại” vạch phản ứng” do kháng thể kết hợp với KN vi sinh vật, kết quả “vạch phản ứng hiện màu” Nếu trong dung dịch không có kháng thể đặc hiệu, ở “vạch phản ứng” KN không thể giữ được KKT gắn màu, vì vậy không hiện màu

Nguyên lý: Kit thử chẩn đoán Care là dụng cụ sắc ký miễn dịch tính bằng dòng chảy một chiều để phát hiện sự có mặt của kháng nguyên virus Care trong các dịch tiết của động vật mắc bệnh Màng kit thử được phủ một lớp kháng thể kháng virus Care ở vùng kết quả trong quá trình làm xét nghiệm, mẫu dung dịch từ dịch tiết của chó bệnh phản ứng với các phân tử mang theo kháng thể Care Hỗn hợp tạo thành thấm theo màng di chuyển hướng lên nhờ các mao dẫn, gặp và phản ứng kết tủa màu với các kháng thể Care trên lớp màng và tạo ra vạch màu Sự có mặt của vạch màu ở vừng kết quả trên Kit thử cho biết kết quả dương tính, ngược lại trong trường hợp không có vạch màu là kết quả âm tính Nhằm mục đích kiểm tra quy trình thao tác xét nghiệm, một vạch màu luôn luôn xuất hiện tại vùng chứng (gọi là vạch chứng) để khẳng định rằng lượng mẫu đã

- Âm tính: xuất hiện chỉ một vạch chứng (C) không thấy xuất hiện vạch kết quả (T)