Xây dựng mô hình định lượng 3d qsar dựa trên dữ liệu chống oxy hóa tương đương trolox (teac) và ứng dụng để thiết kế peptide chống oxy hóa

Nhiệm vụ: - Thu thập dữ liệu peptide chống oxy hóa TEAC; - Tối ưu hóa cấu trúc của các peptide trong data sử dụng phương pháp Semi Emperical PM7; - Thực hiện tính toán các mô tả phân tử

KHOA CÔNG NGHỆ HÓA HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP XÂY DỰNG MÔ HÌNH ĐỊNH LƯỢNG 3D- QSAR DỰA TRÊN DỮ LIỆU CHỐNG OXY HÓA TƯƠNG ĐƯƠNG TROLOX (TEAC)

VÀ ỨNG DỤNG ĐỂ THIẾT KẾ PEPTIDE

CHỐNG OXY HÓA

Giảng viên hướng dẫn: TS TRẦN THỊ THANH NHÃ

Sinh viên thực hiện: NGUYỄN THỊ MINH ANH

MSSV: 18019881

Lớp: DHHC14A

Khoá: 2018 – 2022

Tp Hồ Chí Minh, tháng 7 năm 2022

KHOA CÔNG NGHỆ HÓA HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP XÂY DỰNG MÔ HÌNH ĐỊNH LƯỢNG 3D- QSAR DỰA TRÊN DỮ LIỆU CHỐNG OXY HÓA TƯƠNG ĐƯƠNG TROLOX (TEAC)

VÀ ỨNG DỤNG ĐỂ THIẾT KẾ PEPTIDE

CHỐNG OXY HÓA

Giảng viên hướng dẫn: TS TRẦN THỊ THANH NHÃ

Sinh viên thực hiện: NGUYỄN THỊ MINH ANH

MSSV: 18019881

Lớp: DHHC14A

Khoá: 2018 – 2022

Tp Hồ Chí Minh, tháng 7 năm 2022

- // - - // -

NHIỆM VỤ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Họ và tên sinh viên: Nguyễn Thị Minh Anh

2 Nhiệm vụ:

- Thu thập dữ liệu peptide chống oxy hóa TEAC;

- Tối ưu hóa cấu trúc của các peptide trong data sử dụng phương pháp Semi Emperical PM7;

- Thực hiện tính toán các mô tả phân tử sử dụng phần mềm Maestro;

- Xây dựng mô hình mối quan hệ định lượng cấu trúc – hoạt tính chống oxy hóa

(QSAR) với các thông số thống kê tin cậy;

- Sử dụng mô hình để dự đoán hoạt tính chống oxy hóa của peptide mới và thiết kế peptide có hoạt tính oxy hóa cao;

- Thực hiện phân tích thực nghiệm bắt gốc;

- So sánh kết quả thực nghiệm và mô hình để đánh giá hiệu quả của quy trình phân tích

3 Ngày giao khóa luận tốt nghiệp: 22/10/2021

4 Ngày hoàn thành khóa luận tốt nghiệp: 08/07/2022

5 Họ tên giảng viên hướng dẫn: TS Trần Thị Thanh Nhã

Tp Hồ Chí Minh, ngày 08 tháng 07 năm 2022

Chủ nhiệm bộ môn Giảng viên hướng dẫn

chuyên ngành

Trải qua 4 năm học tập và gắn bó tại trường Đại học Công nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh chắc hẳn sẽ để lại trong kí ức mỗi sinh viên rất nhiều kỉ niệm, không chỉ đơn giản là tình bạn, tình thầy trò mà còn là cả bầu trời tri thức làm hành trang chắp cánh cho những ước

mơ bay xa, bay cao hơn nữa Giảng đường Đại học có lẽ là nơi bắt nguồn cho những ước

mơ thành hiện thực, còn hiện thực được vẽ theo cách nào và vẽ như thế nào là nhiệm vụ của mỗi sinh viên Đề tài tốt nghiệp mà em thực hiện lần này được coi như thành quả cho sự nỗ lực và cố gắng của bản thân em đồng thời là cột mốc đánh dấu việc hoàn thành chương trình Đại học, đánh giá toàn bộ quá trình học tập và năng lực tư duy nghiên cứu của sinh viên

Em xin gửi lời tri ân chân thành đến Ban lãnh đạo và Ban Giám hiệu nhà trường đã luôn quan tâm đến điều kiện cơ sở vật chất, môi trường học tập để em được an tâm học tập Chính vì thế bản thân em luôn cảm thấy tự hào trước quyết định của mình khi chọn Đại học Công nghiệp là nơi để chinh phục những đỉnh cao tri thức mới Bên cạnh đó em cũng không quên gửi lời cám ơn đến Quý Thầy cô Khoa Công nghệ Hóa học đã tạo điều kiện để em được học tập và trau dồi những kiến thức nền tảng cơ bản, rèn luyện những thao tác thực nghiệm qua các buổi học thực hành để nâng cao kỹ năng chuyên môn Em hi vọng với những gì đã được học, được đón nhận từ Quý Thầy cô sẽ giúp những sinh viên như em đây đem ra áp dụng trong nhu cầu công việc sau này

Đặc biệt, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất đến giảng viên hướng dẫn TS Trần Thị Thanh Nhã, mặc dù công việc bận rộn khiến cô phải lo lắng nhưng cô vẫn luôn dành thời gian để quan tâm giúp đỡ, hướng dẫn, định hướng cho những nghiên cứu của em Cô luôn kịp thời hỗ trợ và đồng hành trước những khó khăn trong quá trình thực hiện đề tài để

em hoàn thành đồ án một cách tốt nhất

Sau cùng em xin dành lời cám ơn này đến cha mẹ Cảm ơn cha mẹ đã cho con một hình hài nguyên vẹn và nuôi nấng con nên người Để con được bước vào cánh cổng Đại học này chắc hẳn cha mẹ đã phải hy sinh và vất vả rất nhiều Những năm tháng trưởng thành cùng với những bài học vấp ngã đầu đời thôi thúc con phải cố gắng nhiều hơn nữa Con cảm

ơn cha mẹ thật nhiều! Cảm ơn bạn bè đã luôn đồng hành và sẻ chia cùng tôi trong suốt quãng thời gian qua, cùng tôi viết lên những kỉ niệm tươi đẹp nhất Chúc các bạn đạt được những ước mơ và dự định trong tương lai!

Với những hạn chế trong thời gian và điều kiện nghiên cứu, đồng thời dưới góc nhìn của một sinh viên nên chưa thể bao quát toàn bộ kiến thức và không thể tránh khỏi những sai sót, em rất mong nhận được những đóng góp và ý kiến của Quý Thầy cô để đề tài của em được hoàn thiện tốt hơn

Em xin chân thành cám ơn!

TP Hồ Chí Minh, ngày 08 tháng 07 năm 2022

Sinh viên thực hiện Nguyễn Thị Minh Anh

Phần đánh giá: (thang điểm 10) • Thái độ thực hiện: • Nội dung thực hiện: • Kỹ năng trình bày: • Tổng hợp kết quả: Điểm bằng số: ……… Điểm bằng chữ: ………

TP Hồ Chí Minh, ngày…… Tháng …… năm 20…

TP Hồ Chí Minh, ngày … tháng … năm 20…

Giảng viên phản biện

(Ký ghi họ và tên)

LỜI NÓI ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3

1.1 Amino acid 3

1.1.1 Khái niệm 3

1.1.2 Phân loại 3

1.1.3 Thuộc tính hóa học 4

1.2 Peptide 4

1.2.1 Khái niệm 4

1.2.2 Cấu trúc 5

1.2.3 Phân loại 6

1.2.4 Danh pháp 6

1.2.5 Hoạt tính sinh học của peptide 6

1.2.6 Ứng dụng của peptide 7

1.3 Protein 8

1.3.1 Khái niệm 8

1.3.2 Phân loại 8

1.4 Gốc tự do 9

1.4.1 Khái niệm 9

1.4.2 Nguyên nhân hình thành gốc tự do 9

1.4.3 Cơ chế hình thành gốc tự do 10

1.4.4 Tác động của gốc tự do đến cơ thể con người 10

1.5 Chất chống oxy hóa 11

1.5.1 Khái niệm 11

1.5.2 Phân loại 11

1.5.3 Cơ chế hoạt động 11

1.5.4 Hoạt tính chống oxy hóa của các peptide 12

1.6 Glutathione (GSH) và khả năng chống oxy hóa tương đương trolox TEAC 12

1.6.1 Glutathione GSH 12

1.6.2 Khả năng chống oxy hóa tương đương trolox TEAC 13

1.8 Các phương pháp đánh giá hoạt tính chống oxy hóa 14

1.8.1 Khả năng khử Ferric của huyết tương (FRAP) 15

1.8.2 Định lượng khả năng hấp thụ gốc oxy của chất chống oxy hóa trong huyết thanh (ORAC) 15

1.8.3 Xét nghiệm hóa học cho hoạt tính chống oxy hóa của gốc tự do DPPH 15

1.9 Phương pháp phổ hấp thu phân tử UV - Vis 16

1.9.1 Cơ sở lý thuyết của phương pháp 16

1.9.2 Nguyên lý của phương pháp 16

1.9.3 Các đại lượng thường dùng trong trắc quang 16

1.9.4 Các bước tiến hành đo 17

1.9.5 Các phương pháp phân tích UV – Vis 17

1.10 Lý thuyết về QSAR 18

1.10.1 Lịch sử ra đời của QSAR 18

1.10.2 Khái niệm phương pháp mô hình hóa QSAR 18

1.10.3 Quy trình xây dựng mô hình QSAR 19

1.10.4 Ưu điểm của mô hình QSAR 21

1.10.5 Ứng dụng của mô hình QSAR 22

1.11 Bộ mô tả 22

1.11.1 Khái niệm 22

1.11.2 Phân loại 23

1.11.3 Phương pháp tiếp cận mô hình hóa 3D-QSAR 26

1.12 Các thuật toán xây dựng mô hình QSAR 32

1.12.1 Thuật toán hồi quy tuyến tính đa biến MLR 32

1.12.2 Thuật toán bình phương nhỏ nhất một phần PLS 33

CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM 34

2.1 Xây dựng mô hình 3D QSAR từ cơ sở dữ liệu TEAC 34

2.1.1 Các công cụ và phần mềm xây dựng mô hình QSAR 34

2.1.2 Nguồn dữ liệu 35

2.1.3 Xây dựng và giảm năng lượng cấu trúc peptide 37

2.1.4 Mô hình hóa 3D QSAR 37

2.1.5 Các chỉ số đánh giá 39

2.2.1 Phương pháp bắt gốc tự do ABTS của peptide 39

2.2.2 Dụng cụ và thiết bị 40

2.2.3 Hóa chất 41

2.2.4 Khảo sát các thông số của phương pháp ABTS 41

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 44

3.1 Kết quả thống kê mô hình dựa trên trường Gaussian (CoMSIA) 44

3.2 Kết quả nghiên cứu khả năng bắt gốc tự do ABTS của peptide 47

3.2.1 Khảo sát bước sóng tối ưu 47

3.2.2 Xây dựng đường chuẩn trolox 48

3.2.3 Phân tích mẫu 48

3.2.4 So sánh khả năng bắt gốc của peptide với peptide chống oxy hóa Glutathione 49

KẾT LUẬN 51

KIẾN NGHỊ 52

TÀI LIỆU THAM KHẢO 53

Bảng 1.1 Bộ mô tả 2D và 3D 24

Bảng 2.1 Tập dữ liệu huấn luyện (Training set) của mô hình……….36

Bảng 2.2 Tập dữ liệu đánh giá (Test set) của mô hình 37

Bảng 2.3 Tên dụng cụ và thiết bị sử dụng cho quá trình nghiên cứu khả năng bắt gốc tự do ABTS của peptide 40

Bảng 2.4 Tên hóa chất sử dụng và cách pha cho nghiên cứu khả năng 41

Bảng 2.5 Quy trình khảo sát phổ hấp thu của phức 42

Bảng 2.6 Quy trình xây dựng đường chuẩn trolox 42

Bảng 2.7 Quy trình phân tích mẫu 43

Bảng 2.8 Quy trình so sánh khả năng bắt gốc với GSH 43

Bảng 3.1 Bảng thống kê các mô hình dựa trên trường Gaussian (CoMSIA)……… 44

Bảng 3.2 Đóng góp của năm trường tương tác vào mô hình Gaussian 46

Bảng 3.3 Kết quả phân tích mẫu 48

Bảng 3.4 Kết quả so sánh khả năng bắt gốc với GSH 49

Hình 1.1 Cách đánh chữ cái Hy Lạp đối với các amino acid 3

Hình 1.2 Cấu trúc của amino acid 4

Hình 1.3 Các liên kết của chuỗi amino acid 5

Hình 1.4 Công thức cộng hưởng của liên kết amide 5

Hình 1.5 Danh pháp của các peptide ngắn 6

Hình 1.6 Cấu trúc không gian của protein 9

Hình 1.7 Cấu trúc hóa học của Glutathione 13

Hình 1.8 Cấu trúc 2D của peptide Pro – Trp – Leu (NH2) 14

Hình 1.9 Cấu trúc 3D của peptide Pro – Trp – Leu (NH2) 14

Hình 1.10 nguyên lý hoạt động của máy đo UV-Vis 16

Hình 1.11 Mô hình Field QSAR 19

Hình 1.12 Sơ đồ tổng quát nghiên cứu QSAR [37] 21

Hình 1.13 Mô phỏng cấu trúc không gian của một phân tử hóa học 26

Hình 1.14 Cấu trúc phân tử đặt trong không gian mạng lưới hình hộp chữ nhật 27

Hình 1.15 Quy trình xây dựng mô hình trường phân tử 3D – QSAR CoMFA 28

Hình 1.16 Đồ thị biểu diễn giá trị ngưỡng CoMFA của thế Lennard-Jones và Coulomb 29

Hình 1.17 Quy trình xây dựng mô hình trường phân tử 3D-QSAR CoMSIA [46] 30

Hình 1.18 Bản đồ đường biên dạng cho mô hình CoMSIA 31

Hình 2.1 Các công cụ xây dựng mô hình QSAR……….35

Hình 2.2 Mô hình trước khi xếp chồng 85 peptide từ cơ sở dữ liệu chống oxy hóa tương đương Trolox (TEAC) với PWY làm cấu trúc mẫu 38

Hình 2.3 Mô hình sau khi xếp chồng 85 peptide từ cơ sở dữ liệu chống oxy hóa tương đương Trolox (TEAC) với PWY làm cấu trúc mẫu 38

Hình 2.4 Phản ứng bắt gốc tự do ABTS của peptide 39

Hình 3.1 Đồ thị biểu diễn tập đánh giá mô hình dựa trên trường Gaussian (CoMSIA) … 45

Hình 3.2 Đồ thị biểu diễn tập huấn luyện mô hình dựa trên trường Gaussian (CoMSIA) 45 Hình 3.3 Bản đồ đường biên dạng của các trường tương tác có nguồn gốc từ mô hình phân tích CoMSIA 46

Hình 3.4 Khảo sát phổ hấp thu cực đại 47

Hình 3.5 Xây dựng đường chuẩn trolox 48

Kí hiệu Tên đầy đủ

ABTS 2,2'-azino-bis(3 ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)

CoMSIA Comparative Molecular Similarity Indices Analysis

IUPAC International Union of Pure and Applied Chemistry

QSAR Quantitative Structure-Activity Relationship

QSPR Quantitative Structure Property Relationship

SD Standard Deviation

Trolox 6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid

UV - Vis Ultra Violet - Visible

LỜI NÓI ĐẦU

Ngày nay người ta đã phát hiện và tìm ra được hơn 7000 loại peptide trong tự nhiên, với những tính chất sinh hóa nổi trội Peptide có nhiều ứng dụng quan trọng như kháng virut, làm chất bảo quản thực phẩm, thuốc thử chẩn đoán, thực phẩm chức năng và hơn hết là khả năng đóng góp vào chức năng sinh lý của sinh vật Chính vì vậy đã thúc đẩy các cuộc nghiên cứu và các công trình tổng hợp peptide kháng khuẩn, kháng viêm Đặc biệt là những nghiên cứu hoạt tính chống oxy hóa của peptide ứng dụng trong lĩnh vực Thực phẩm và Y khoa đã

có những đóng góp và thành công đáng kể Chi phí để tổng hợp peptide là khá lớn, quá trình tổng hợp tiêu tốn một lượng hóa chất đáng kể khi thực hiện hàng loạt các cuộc thử nghiệm peptide để đánh giá hoạt tính của chúng Mặt khác các cuộc thử nghiệm trên động vật đắt tiền tốn rất nhiều thời gian và ảnh hưởng đến môi trường Từ cơ sở đó, các nghiên cứu gần đây đang có xu hướng thiết kế mô hình định lượng 3D QSAR nhằm khám phá mối tương quan giữa cấu trúc phân tử và hoạt tính sinh học, đồng thời dự đoán hoạt tính của các cấu trúc mới, sàng lọc ra những cấu trúc có hoạt tính tốt và ứng dụng thiết kế peptide chống oxy hóa thay thế cho việc tổng hợp

Peptide Pro – Trp – Leu (NH2) là peptide thuộc họ Tryptophyllin L, xuất hiện chủ yếu trong dịch tiết ra từ tuyến da lưng của động vật lưỡng cư Peptide này đóng vai trò như một hàng rào vũ khí bảo vệ da Ếch trước những tác nhân oxy hóa từ môi trường và sự thay đổi khí hậu khác nhau khi chuyển đổi từ môi trường nước sang môi trường cạn Pro – Trp – Leu (NH2) chỉ chiếm tỉ lệ ít trong thành phần dịch tiết tuyến da lưng và bị cô lập, hoạt tính sinh học của chúng vẫn chưa được khám phá Vì thế đề tài nghiên cứu lần này hướng tới mục tiêu nghiên cứu khả năng chống oxy hóa của peptide Pro – Trp – Leu (NH2) này

Đề tài nghiên cứu lần này tác giả chủ yếu tập trung thiết kế mô hình định lượng QSAR từ 85 peptide dựa trên cơ sở dữ liệu TEAC có sẵn để dự đoán hoạt tính của peptide Pro – Trp – Leu (NH2), đồng thời nghiên cứu khả năng bắt gốc tự do ABTS của peptide bằng thực nghiệm Kết quả thống kê của việc xây dựng mô hình CoMSIA cho mô hình Factor 5 đạt kết quả tốt nhất với các chỉ số đánh giá lần lượt là R2 = 0.9318, R2

3D-CV = 0.8577, R2Sramble

= 0.2902, Stability = 0.982, F = 154.8 và các hệ số đánh giá ngoại như Q2, RMSE,

Pearson-r tương ứng là 0.8567, 0.24 và 0.928 Thử nghiệm bắt gốc tự do ABTS cho giá tPearson-rị TEAC đạt 1.412 tương quan với kết quả dự đoán 0.865 được cung cấp từ mô hình CoMSIA mở rộng

Từ đó đánh giá được tính chính xác và độ tin cậy của mô hình dựa trên kết quả thực nghiệm vừa có Thông qua mối quan hệ giữa cấu trúc hóa học và hoạt tính của peptide giúp dự đoán hoạt tính chống oxy hóa của peptide, đồng thời khai thác các tiềm năng mới của peptide phục vụ cho nhiều lĩnh vực nghiên cứu khác

Nghiên cứu này chủ yếu tập trung vào việc xây dựng và đánh giá mô hình Sau đó dùng mô hình để dự đoán hoạt tính của peptide Pro – Trp – Leu (NH2) không có sẵn trong

hệ dữ liệu Từ đó có những điều chỉnh trong việc tối ưu hóa cấu trúc và tăng hoạt tính chống oxy hóa của peptide

Không chỉ dừng lại ở những ý nghĩa về mặt khoa học mà mô hình QSAR còn góp phần hợp lý hóa cơ chế hoạt động của peptide, giảm bớt được tình trạng thử nghiệm trên động vật, thúc đẩy sự phát triển của lĩnh vực hóa học xanh, ngăn chặn nguy cơ ô nhiễm môi trường Mặt khác việc tìm ra những peptide có hoạt tính chống oxy hóa tốt từ tự nhiên sẽ là giải pháp hữu hiệu để thay thế các chất bảo quản trong lĩnh vực thực phẩm.

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1 Amino acid

1.1.1 Khái niệm

Amino acid là những hợp chất hữu cơ mà trong đó có chứa các nhóm chức amine

(-NH2) và carboxylic (-COOH), điểm đặc trưng để phân biệt các amino acid với nhau chính

là nhánh bên (nhóm R) Các amino acid được cấu thành từ các nguyên tố chính như carbon (C), hydro (H), oxy (O), và nito (N), riêng đối với gốc R có thể là một gốc hữu cơ nào đó

Có khoảng hơn 500 amino acid trong tự nhiên được con người tìm thấy, nhưng trong mã di truyền chỉ xuất hiện 20 amino acid và có thể dùng nhiều cách khác nhau để phân loại chúng [1]

Đối với hóa sinh, các amino acid có nguyên tử Cacbon nằm ở vị trí alpha đầu tiên gắn đồng thời cả hai nhóm amine và nhóm carboxylic có tầm quan trọng rất lớn Chính vì được gắn tại vị tí alpha nên chúng được gọi là α-amino acid (có công thức chung là

H2NCHRCOOH, với R là nhóm thế hữu cơ hay còn gọi là “chuỗi bên”), thông thường thì khái niệm amino acid được dùng để chỉ những chuỗi bên này [1]

Nhóm amino acid kị nước: không phân cực nên phần lớn ít tan hoặc không tan trong nước Nhóm R của các amino acid loại này thường là các chuỗi bên ngắn có mômen lưỡng cực lớn nên có xu hướng hút nước Các amino acid thuộc nhóm này bao gồm: Serine, Cysteine, Threonine, Glutamine, Tyrosine

Hình 1.1 Cách đánh chữ cái Hy Lạp đối với các amino acid

1.1.3 Thuộc tính hóa học

Quá trình trùng hợp các 𝛼 amino acid tạo thành các peptide hoặc protein Trong khi

đó có 20 amino acid tự nhiên được tìm thấy trong peptide và protein trong cơ thể sinh vật Bên cạnh đó một số amino acid tồn tại dưới dạng tự do hay hợp chất không tạo ra peptide và protein [2]

Hình 1.2 Cấu trúc của amino acid 1.2 Peptide

1.2.1 Khái niệm

Các chuỗi α-amino acid ngắn hình thành liên kết với nhau bằng liên kết amine thì được gọi là peptide Liên kết amine được hình thành khi và chỉ khi nhóm amine của α-amino acid này phản ứng với nhóm carboxyl của α-amino acid khác Các chuỗi α-amino acid dài được gọi là polypeptide, tuy nhiên các polypeptide này sẽ không phân nhánh mà liên tục Còn các peptide ngắn được gọi là dipeptide, tripepite, tetrapeptide [1]

Để phân biệt được giữa peptide và protein người ta phải dựa vào kích thước Polypeptide được gọi là protein khi nó có kích thước lớn hơn 50 α-amino acid, ngược lại nếu nhỏ hơn 50 α-amino acid thì được gọi là peptide [1]

Nhờ phản ứng polymer hóa các amino acid mà liên kết peptide được hình thành để tạo ra peptide và protein (R-CO-NH-R’) [2]

Hình 1.3 Các liên kết của chuỗi amino acid 1.2.2 Cấu trúc

Peptide và protein là những biopolymer của các monomer (tiểu phân) amino acid liên kết với nhau bằng liên kết peptide Một nhóm amine của amino acid thứ nhất liên kết với nhóm carboxylic của amino acid thứ hai, nhóm amine của amino acid thứ hai liên kết với nhóm carboxylic của amino acid thứ ba, và cứ tiếp tục nối dài như vậy

Cũng giống như các liên kết amide thông thường, liên kết amide trong protein hoặc peptide không khác biệt gì nhiều Cặp electron còn lại do không phân chia của nguyên tử nitrogen cộng hưởng với liên kết đôi của nhóm C=O nên đã làm cho nguyên tử nitrogen trong liên kết amide mất đi tính kiềm Vì vậy, liên kết C-N sẽ chứa một ít tính chất của liên kết đôi đồng thời cản trở sự quay tự do của nguyên tử C và N xoay quanh liên kết này Liên kết peptide rất bền (hơn 400 J/mol) nhờ có sự cộng hưởng Độ dài liên kết C-N thông thường

là 1,47Ao tuy nhiên độ dài liên kết C-N trong liên kết peptide chỉ có 1,32 Ao Còn độ dài liên kết C=O bình thường bằng 1,24Ao lại nhỏ hơn độ dài liên kết C=O trong liên kết peptide (1,25Ao) [1]

Hình 1.4 Công thức cộng hưởng của liên kết amide

Theo quy ước, khi viết công thức phân tử của peptide, amino acid đầu N (còn gốc

NH3+ tự do) thì nằm ở bên trái và amino acid đầu C (còn gốc CO2- tự do) thì nằm bên phải của công thức Tên của một peptide thì được viết bằng chuỗi tên của amino acid viết tắt ba

ký tự hoặc một ký tự [1]

Ví dụ: một dipeptide (peptide gồm hai amino acid) với alanine nằm bên trái còn đầu amino tự do và serine nằm bên phải còn đầu carboxylate tự do, gọi là alanylserine, được viết gọn là Ala-Ser hay A-S Ngược lại, serylalanine với serine nằm bên trái còn đầu amino tự

do và alanine nằm bên phải còn đầu carboxylate tự do thì được viết gọn là Ser-Ala hay S-A [1]

Hình 1.5 Danh pháp của các peptide ngắn 1.2.5 Hoạt tính sinh học của peptide

Các peptide có hoạt tính sinh học có thể là các đoạn protein, có những tác động tích cực đến các chức năng của các cơ quan trong cơ thể nói riêng và sức khỏe của con người nói chung Hoạt động của peptide dựa trên hai yếu tố là thành phần và trình tự amino acid Kích

cỡ của các trình tự peptide có hoạt tính có thể thay đổi từ 2 đến 20 amino acid hoặc có thể nhiều hơn 20 amino acid, ví dụ như insuline [3]

Nguồn gốc sinh ra của những peptide có hoạt tính sinh học chính là trong cơ thể và trong quá trình tổng hợp từ phòng thí nghiệm Thêm vào đó quá trình thuỷ phân protein bằng enzyme và các sản phẩm sữa lên men cũng hình thành nên các peptide này Những loại peptide có hoạt tính sinh học thường là các peptide chống viêm, các peptide chống đột quỵ, peptide có hoạt tính chống oxy hóa, các peptide hạ huyết áp [3]

Gần đây rất nhiều peptide mang hoạt tính sinh học đã được nghiên cứu và công nhận Hơn thế nữa, sự xuất hiện của tổng hợp peptide tự động đã làm giảm giá thành của các thuốc thử xuống mức thấp đồng thời góp phần mở rộng quy mô sản xuất dễ dàng hơn [1]

Các peptide có sẵn trong tự nhiên như hormone, mang chức năng kích hoạt hoặc điều

chỉnh các quá trình trao đổi chất Chẳng hạn như: somatostatin được tạo thành từ 14 amino

acid, liên kết với các thụ thể G-protein trên bề mặt tế bào để ức chế quá trình giải phóng nhiều hợp chất liên quan đến sinh lý như glucagon, insulin, secretin và gastrin Ngoài ra các loại peptide này còn đóng vai trò là chất dẫn truyền thần kinh, một số nghiên cứu còn chứng minh được khả năng ức chế việc hình thành khối u của nó [1]

Tuy nhiên một số peptide có chứa thành phần độc tố đã ngăn cản khả năng sinh trưởng và tái tạo của các tế bào Điển hình như omega-agatoxin 48-amino-acid thành phần chính có trong nọc độc của nhện làm suy giảm các kênh canxi loại P phụ thuộc vào điện áp dẫn đến ức chế chức năng tế bào thần kinh Hay saxitoxin được điều chế bởi dinoflagellate chặn các kênh natri Ngoài ra, một số peptide như ß-defensin-2 có đặc tính kháng khuẩn [1]

1.2.6 Ứng dụng của peptide

Trong thực phẩm: các peptide có tác dụng điều khiển một số chức năng của cơ thể thông qua cơ chế hoạt động của chúng Thực phẩm thể hiện sự thối rữa không thể phục hồi đối với các đặc tính chất lượng của nó, có thể bị trì hoãn từ vài giờ đến vài tháng và thậm chí hàng năm khi các chiến lược thích hợp được áp dụng Trong dòng này, việc sử dụng chất chống oxy hóa để làm phụ gia thực phẩm là xu hướng gia tăng trong ngành công nghiệp thực phẩm Tuy nhiên nhu cầu sử dụng thực phẩm không chất phụ gia tổng hợp, do những tác động có hại cho sức khỏe của chúng, đã khiến cả ngành công nghiệp thực phẩm và các nhà nghiên cứu khám phá những cách mới để có được chất chống oxy hóa từ tự nhiên Xu hướng này tăng cường nhu cầu thu được và sử dụng các chất phụ gia thực phẩm có nguồn gốc từ tự nhiên cũng có hoạt tính sinh học [4]

Trong trường hợp ở cấp độ phòng thí nghiệm, làm phụ gia thực phẩm tiềm năng Các nghiên cứu được thực hiện để đánh giá tác dụng của các peptide chống oxy hóa trong chất nền thực phẩm Trong các sản phẩm thực phẩm có sẵn, các sản phẩm thịt dễ bị oxy hóa lipid

và cần được bảo vệ thêm chống lại các loại phản ứng [4]

Trong y học: peptide ngày càng được ứng dụng rộng rãi trong y học bởi khả năng tương thích của nó với các phản ứng sinh học cũng như tính chọn lọc và hiệu quả của chính peptide [5]

Kháng virut: quá trình lây lan của virut sẽ trải qua nhiều giai đoạn và quá trình khác nhau Peptide tham gia sàng lọc thuốc kháng virut thông qua cơ chế hấp thụ các virut đồng thời sao chép acid nucleic

Chống khối u: các enzim và các yếu tố điều chỉnh chính là nguyên nhân dẫn đến việc gia tăng hoạt động của gen ung thư, hình thành nên các khối u Các peptide lúc này có vai trò kìm hãm hoạt động của các gen ung thư và các yếu tố điều chỉnh để ngăn chặn vị trí hoạt động, hình thành các khối u

Kháng khuẩn: việc sàng lọc hơn 100 peptide kháng khuẩn đã được công bố Thí nghiệm in vivo và in vitro đã chỉ ra rằng peptide có khả năng khử trùng và diệt khuẩn mạnh

Chẩn đoán: trong thuốc thử chẩn đoán peptide đóng vai trò như một kháng nguyên

để tìm ra các kháng thể chống lại sự xâm nhập của virut, kí sinh trùng gây bệnh (cysticercosis, trypanosoma) cũng như các tác động từ bên ngoài môi trường

Bệnh tim mạch: các peptide phân tử nhỏ chứa nhiều hoạt chất giúp giảm mỡ trong máu và hạ huyết áp Không những dùng làm thuốc mà còn làm thực phẩm tốt cho sức khỏe con người

Trong mỹ phẩm: các peptide đóng vai trò như một enzim truyền tín hiệu, kiểm soát

và chi phối quá trình hình thành cũng như phân hủy collagen và eslatin trong da, giúp da săn chắc và mịn màng Mặt khác peptide còn có khả năng vận chuyển các khoáng chất thiết yếu như đồng, magie cho da [6]

1.3 Protein

1.3.1 Khái niệm

Protein là hợp chất polymer của amino acid, trong protein có chứa các nguyên tố bao gồm: C (52%), H (7%), O (22%), N (16%), còn lại là các nguyên tố chiếm tỷ lệ thấp như (Zn, Fe, Ca, S, Mn, P…) Protein có khối lượng phân tử tương đối lớn khoảng hàng vạn đến hàng triệu đvC Sự sống gắn liền với sự tồn tại của protein, mọi nền tảng cấu trúc và hoạt động sống của cơ thể sinh vật đều do protein quyết định [1]

1.3.2 Phân loại

Theo quá trình thủy phân của protein:

Protein đơn giản: khi thủy phân chỉ cho ra amino acid;

Protein phức tạp: khi thủy phân ngoài cho amino acid thì còn cho ra các thành phần khác như (lipid, nucleic acid, saccarit…);

Theo hình dạng ba chiều:

Protein hình sợi: gồm các chuỗi polypeptide được sắp xếp dọc với nhau như (myosin trong mô cơ, collagen trong dây chằng) Đa số protein dạng này thường bền và không tan trong nước;

Protein hình cầu: tồn tại dưới dạng khối cầu tròn và thường cuộn chặt lại với nhau,

dễ tan trong nước;

Cấu trúc bậc ba: là hình dạng không gian ba chiều hoàn chỉnh nhất của protein, toàn

bộ protein cuộn lại hình thành không gian ba chiều của nó;

Cấu trúc bậc bốn: mô tả liên kết của các phân tử protein để tạo ra cấu trúc liên hợp [1]

Hình 1.6 Cấu trúc không gian của protein 1.4 Gốc tự do

1.4.1 Khái niệm

Gốc tự do là các nguyên tử, phân tử hoặc ion có một điện tử chưa tham gia ghép đôi

ở lớp ngoài cùng nên mang điện tích âm và có khả năng oxy hóa các tế bào, các phân tử, nguyên tử khác để giải phóng năng lượng Các gốc tự do có thể liên quan đến nhiều phản ứng trong các mô sống với vai trò như chất trung gian có hoạt tính mạnh trong thời gian ngắn Chính vì bị mất điện tử nên các gốc tự do luôn có xu hướng lấy điện tích của các cấu trúc xung quanh nó để tạo ra gốc tự do mới Phản ứng này xảy ra liên tục nên ảnh hưởng đến màng tế bào, các phân tử protein và Axit Deoxyribo Nucleic (ADN) [7] Có hai loại gốc tự

do là Reactive Oxygen Species (ROS) và Reactive Nitrogen Species (RNS)

ROS là sản phẩm chuyển hóa tự nhiên của cơ thể, có nhiệm vụ liên lạc tế bào và cân bằng nội môi ROS có thể tăng một cách đột ngột nếu như bị tác động bởi các yếu tố môi trường bên ngoài Một số gốc tự do thuộc nhóm ROS như: OH-, O2-, H2O2

Gốc RNS: NO• là phân tử chứa một electron lẻ trên 2𝜋*y

1.4.2 Nguyên nhân hình thành gốc tự do

Các gốc tự do như OH•, O2 •-, 𝑁𝑂• được sinh ra từ tia UV, ô nhiễm không khí, bức

xạ ion hóa, hút thuốc, căng thẳng, cháy… Đồng thời các gốc tự do là lý do chính dẫn đến việc tổn thương các tế bào, protein, ADN… Mặt khác có thể dẫn tới các bệnh lý nghiêm trọng như ung thư, tiểu đường, tim mạch Chính vì thế cần phải bổ sung các loại vitamin A,

C, E, Polyphenol… để ngăn chặn khả năng oxi hóa của các gốc tự do [7]

Gốc tự do được sinh ra từ hai nguồn: nguồn nội sinh và ngoại sinh

Nguồn nội sinh:

Từ chuỗi truyền điện tử trong ty thể (các phản ứng phosphoryl oxy hóa của mitochondria): superoxide anion 𝑂2•, peroxinitrate 𝑂𝑁𝑂−, hydrogen peroxide H2O2, gốc hydroxyl •OH

Từ hoạt động hô hấp của leucocyte, gốc tự do hình thành để giết vi khuẩn

Từ quá trình tự chết của tế bào

Nguồn ngoại sinh: gốc tự do hình thành từ khí ozon, bức xạ điện tử hay khói thuốc

Sau đó Superoxide Dismutase (SOD) sẽ chuyển hóa O2 •- thành H2O2 [8]

Một số loại ROS phổ biến như: 1O2 (oxy singlet), O2 •- (gốc anion superoxide), •OH (gốc hydroxyl), RO• (gốc alkoxyl), ROO• (gốc peroxyl), H2O2 (hydrogen peroxide), LOOH (lipid hydroperoxide) [9]

1.4.4 Tác động của gốc tự do đến cơ thể con người

Các gốc tự do có thể tấn công vào cơ thể con người bất cứ lúc nào Các gốc tự do chủ yếu tấn công vào ADN và các vật chất di truyền trong cơ thể dẫn đến tình trạng đột biến gen, hậu quả của đột biến này là nguy cơ tiềm ẩn dẫn đến ung thư Đồng thời các gốc tự do

có thể gây tổn thương cho các mô trong cơ thể như màng tế bào, protein, mỡ Mô mỡ chính

là nơi bị tổn thương nhiều nhất và sớm nhất Tổn thương protein có thể dẫn đến hoạt động của các cơ quan bị rối loạn chẳng hạn như protein collagen ở da hay các enzim hoạt động không hiệu quả làm cho các phản ứng sinh hóa của cơ thể không thể diễn ra, lâu dần sẽ làm

cơ thể bị lão hóa

Các gốc tự do gây tổn hại đến các nucleotit tham gia cấu thành ADN như adenine, thymine, guanine, cytosine Chính điều này đã làm cho quá trình sao mã của ADN không còn chính xác nữa

Sự tác động đến các yếu tố gây viêm, sự hủy hoại các phân tử polysaccarid do oxy hóa có thể làm mất tính nhớt của acid hyalunoric (một chất làm trơn khớp), ảnh hưởng tới quá trình viêm có thể dẫn tới bệnh viêm khớp dạng thấp, lupus ban đỏ [10]

Gốc tự do liên quan đến các chất tiết ra từ thành mạch máu sẽ quyết định khả năng bám dính của tiểu cầu và mảng xơ vữa, là nguyên nhân của các bệnh tim mạch (tai biến mạch máu não, nhồi máu cơ tim ) [10]

1.5 Chất chống oxy hóa

1.5.1 Khái niệm

Chất chống oxy hóa được hiểu là chất có khả năng kìm hãm và ức chế các gốc tự do hoặc hoạt động của gốc oxy để tránh sinh ra các phản ứng gây hại đến hoạt động sinh học của con người cũng như trong lĩnh vực công nghiệp thực phẩm [11]

Chất chống oxy hóa khi ở nồng độ thấp cũng có thể ức chế hoặc làm chậm quá trình oxy hóa Nó thường được sử dụng trong thực phẩm và thuốc để bảo vệ sản phẩm trước các tác nhân oxy hóa Ngoài ra chất chống oxy hóa còn được dùng làm chất phụ gia trong ngành công nghiệp chế biến thực phẩm [11]

Chất chống oxy hóa có thể điều chỉnh các enzim liên quan đến gốc ROS, đồng thời làm giảm mức độ tế bào của các gốc tự do thông qua việc ức chế hoạt động của các enzim tạo ra gốc tự do hoặc tăng cường hoạt động của các enzim chống oxy hóa (catalase CAT, glutathione peroxidase GPX, superoxide dismutase SOD) Ngoài ra cơ thể có thể tạo ra một lớp hàng rào bảo vệ chống lại các gốc tự do nhờ các enzim chống oxy hóa này [12]

1.5.2 Phân loại

Chất chống oxy hóa có thể phân loại theo nhiều cách như sau [8]:

Theo khả năng hòa tan trong lipit và nước: chất chống oxy hóa hòa tan trong lipit (carotenoid, vitamin E, acid lipoic) xuất hiện chủ yếu ở màng tế bào và chất chống oxy hóa hòa tan trong nước (vitamin C) xuất hiện chủ yếu trong chất nền tế bào hoặc dịch tế bào

Theo cơ chế hoạt động: chất chống oxy hóa enzim và chất chống oxy hóa không enzim Chất chống oxy hóa enzim hoạt động nhờ khả năng loại bỏ và phá hủy các gốc tự do, lúc này các enzim sẽ tăng cường chuyển hóa các chất oxy hóa độc hại thành hydrogen peroxide và sau cùng là chuyển thành nước Chất chống oxy hóa không enzim hoạt động bằng cách ngăn chặn sự xảy ra chuỗi phản ứng của các gốc tự do, một số chất chống oxy hóa không enzim như (vitamin E, glutathione, carotenoid, polyphenol thực vật, vitamin C)

Theo kích thước: chất chống oxy hóa phân tử lớn và chất chống oxy hóa phân tử nhỏ Chất chống oxy hóa phân tử lớn thường là các protein (albumin) hay các enzim tiêu biểu như (CAT, GSHPx, SOD) giúp ngăn cản việc tấn công các protein thiết yếu đồng thời hấp thụ ROS Chất chống oxy hóa phân tử nhỏ (GSH, vitamin E, vitamin C carotenoid) trung hòa ROS

1.5.3 Cơ chế hoạt động

Chất chống oxy hóa hoạt động để chống lại các gốc tự do trong cơ thể, cung cấp điện

tử cho các gốc tự do để thu hút các phân tử tồn tại bên ngoài tế bào gây hại cho các phân tử sinh học [13]

Năng lượng phân ly của liên kết và khả năng ion hóa là những tính chất quyết định đến cơ chế cũng như hiệu quả chống oxy hóa Chất chống oxy hóa chủ yếu hoạt động dựa trên 2 cơ chế chính: Quá trình chuyển hóa nguyên tử Hydro từ chất chống oxy hóa sang gốc

tự do (Hydrogen Atom Transfer – HAT) và quá trình chuyển electron từ chất chống oxy hóa

sang gốc tự do (Electron Transfer – ET) Hai quá trình này thường xảy ra đồng thời với nhau [14]

Quá trình chuyển hóa nguyên tử Hydro từ chất chống oxy hóa sang gốc tự do (Hydrogen Atom Transfer – HAT): khả năng chống oxy hóa theo cơ chế HAT có mối tương quan với etanpi phân ly liên kết thấp, khả năng cho Hydro tốt hơn [15]

Quá trình chuyển electron từ chất chống oxy hóa sang gốc tự do (Electron Transfer

- ET): chuyển electron để làm giảm lượng electron trong bất kỳ hợp chất nào bao gồm cả carbonyl, kim loại [14]

Chất chống oxy hóa nhường electron hay nhường nguyên tử hydro cho gốc tự do tạo thành một phân tử mới và một gốc tự do mới Lúc này khả năng hoạt động của gốc tự

do mới sẽ yếu hơn so với gốc tự do ban đầu nên giảm bớt được quá trình gây hại của chúng [14]

1.5.4 Hoạt tính chống oxy hóa của các peptide

Gần đây một số nghiên cứu về khả năng chống oxy hóa trên peptide được thực hiện cho các sản phẩm thủy phân nhau thai cừu và sản phẩm thủy phân đậu hay thủy phân da ếch

sa mạc (Litoria Rubella) Bên cạnh đó cũng có một vài nghiên cứu xác định các chất chống oxy hoá peptide tiềm năng trong gelatin da cá, dịch thủy phân protein từ nguồn thực vật và động vật [4]

Hoạt tính chống oxy hóa của peptide được đẩy mạnh nghiên cứu, đặc biệt là những nghiên cứu trong việc bảo quản thực phẩm trước các tác nhân gây hại và chữa trị các bệnh liên quan đến thoái hóa mãn tính không truyền nhiễm Ngoài ra hoạt tính chống oxy hóa của peptide còn phụ thuộc vào cấu trúc hóa học, thành phần axit amin như Phe, Pro, Gly, Tyr, Lys, Val, Trp, His với tính kị nước, vòng indole/ imidazole/ pyrrolidin Các peptide có hoạt tính chống oxy hoá có kích thước nằm trong khoảng từ 400 đến 650 Da (Dalton), chiếm 70% trong số 42 peptide có hoạt tính chống oxy hóa đã được xác định [3]

1.6 Glutathione (GSH) và khả năng chống oxy hóa tương đương trolox TEAC

Ở dạng khử glutathione GSH sẽ triệt tiêu các gốc tự do như OH•, O2• và các gốc tự

do khác tồn tại ở trung tâm ADN GSH là thành phần chính có của phức chất Cytochrome P450 trong các phần tử khử độc, chuyển hóa phase I-II trong tế bào thận, gan, phổi và một

số cơ quan khác Cân bằng quá trình khử Thiol, khi ở mức điện thế của Thiol trong tế bào

cao thì các Thioredoxins, các protein điều tiết oxy hóa khử và Metallothioneins được điều tiết bởi GSH và tỉ lệ oxy hóa khử GSH/GSSG [17]

GSH đóng vai trò quan trọng trong việc duy trì trạng thái oxy hóa khử của tế bào đồng thời thải độc kim loại nặng Ngoài ra GSH được coi như một đầu dò tín hiệu của tế bào, làm trung gian kiểm soát và điều khiển mọi hoạt động của enzim và quá trình điều hòa của protein Tỉ lệ GSH/GSSG và những biến đổi trong quá trình tổng hợp cũng như thoái hóa của GSH ít nhiều sẽ làm ảnh hưởng đến quá trình phát huy tiềm năng oxy hóa khử của chúng Trong tế bào bộ đôi GSH/GSSG này hoạt động như một bộ đệm oxy hóa khử nhằm mục đích duy trì cân bằng nội môi oxy hóa khử cho quá trình sinh trưởng của tế bào [18]

Hình 1.7 Cấu trúc hóa học của Glutathione 1.6.2 Khả năng chống oxy hóa tương đương trolox TEAC

Trolox là một chromanol được thay thế bởi một nhóm carboxyl ở vị trí thứ 2 bằng các nhóm methyl tại vị trí 2, 5, 7, 8 Nó được sử dụng như một tiêu chuẩn để đo khả năng chống oxy hóa, một chất khử gốc, một chất ức chế tín hiệu [19]

Khả năng chống oxy hóa tương đương Trolox Equivalent Antioxidant Capacity (TEAC) được thử nghiệm dựa trên khả năng loại bỏ gốc 2,2’- azinobis – 3 ethylbenzothiazoline – 6 sulfonic acid (ABTS*) để biến nó thành chất không màu Độ khử màu phụ thuộc vào hợp chất liên quan đến mức độ gây ra bởi Trolox, từ đó xuất hiện giá trị TEAC Khả năng chống oxy hóa tương đương dùng để xây dựng mối quan hệ cấu trúc QSAR TEAC cho thấy khả năng chống oxy hóa của hợp chất gốc cộng với khả năng chống oxy hóa của các sản phẩm phản ứng Thử nghiệm TEAC không chỉ phản ánh tác dụng chống oxy hóa của một cấu trúc Điều này gây khó khăn trong việc ứng dụng của thực nghiệm xây dựng mối quan hệ cấu trúc và sắp xếp thứ hạng của các chất chống oxy hóa [20]

1.7 Tổng quan về peptide Pro – Trp – Leu (NH2)

Động vật lưỡng cư có một bước tiến hóa mới khi chuyển đổi từ môi trường nước lên môi trường cạn, dẫn đến sự thay đổi nhiệt độ và nồng độ oxy trong quá trình hô hấp của chúng Để kịp thời thích nghi với điều kiện sống, vùng da ở tuyến lưng của một số loài lưỡng

cư tiết ra một loại hợp chất làm hàng rào bảo vệ và chống lại các tác nhân oxy hóa từ bên ngoài Người ta còn phát hiện ra rằng trên tuyến lưng của lưỡng cư có chứa một lượng lớn peptide chống oxy hóa (AOPs), việc sản sinh ra các peptide này ngày một tăng đồng nghĩa tầm quan trọng của chúng trong việc bảo vệ da trước sự thay đổi của các vùng khí hậu khác nhau và bức xạ UV Chính những thay đổi này bắt nguồn tạo ra các loại oxy phản ứng nội sinh ROS [21]

Các cuộc nghiên cứu gần đây cho thấy hàng trăm loại peptide được tìm thấy từ tuyến

da lưng của khoảng 30 loài ếch và cóc Úc trong số đó có Litoria Rubella (Ếch cây đỏ), dịch tiết ra từ tuyến lưng của loài này có chứa họ peptide Tryptophilin L có hoạt tính sinh học tương đối tốt nhưng lại không có hoạt tính kháng khuẩn Tryptophilin L chứa trình tự Pro – Trp đặc trưng và có nguồn gốc từ protein tự nhiên, mang hoạt tính mạnh khi phản ứng với các gốc tự do Thành phần chính của Tryptophilin L là tetrapeptide Phe – Pro – Trp – Leu (NH2) và một số thành phần phụ trong đó có Pro – Trp – Leu (NH2) là dẫn xuất của Phe – Pro – Trp – Leu (NH2) Tuy nhiên Pro – Trp – Leu (NH2) bị cô lập và chưa được khám phá hoạt tính sinh học nhiều [22]

Pro – Trp – Leu (NH2) có khối lượng phân tử là 414 MW Được cấu tạo bởi ba amino acid bao gồm: Proline, Tryptophan, Leusine Liên kết với nhau bằng liên kết peptit (CO-

NH)

Hình 1.8 Cấu trúc 2D của peptide Pro – Trp – Leu (NH2)

Hình 1.9 Cấu trúc 3D của peptide Pro – Trp – Leu (NH2)

1.8 Các phương pháp đánh giá hoạt tính chống oxy hóa

Để đánh giá hoạt tính chống oxy hóa cần trải qua các bước sàng lọc như sau:

Sàng lọc hoạt tính chống oxy hóa hóa học in vitro: dựa vào cơ chế hoạt động của

chất chống oxy hóa để giúp ích cho việc sàng lọc các thử nghiệm hóa học Các chất này thực hiện khả năng chống oxy hóa dựa trên cơ chế nhường nguyên tử Hydro hoặc cho/nhận electron vì vậy có nhiều mô hình xác định hoạt tính chống oxy hóa tương ứng Mỗi mô hình

có thể sử dụng thuốc thử (chất oxy hóa) khác nhau Như vậy, mỗi mô hình thử nghiệm chỉ cho thấy một khía cạnh về hoạt tính chống oxy hóa của một chất, do đó để đánh giá khả năng chống oxy hóa cần phải sử dụng nhiều mô hình thử nghiệm hơn Sàng lọc hóa học có ưu điểm là rẻ tiền, có thể thực hiện hàng loạt, nhưng đây chỉ là thử nghiệm bước đầu, vì chất có hoạt tính chống oxy hóa tốt trong mô hình thử nghiệm hóa học chưa chắc đã có hoạt tính chống oxy hóa trong cơ thể sinh vật

Sàng lọc hoạt tính chống oxy hóa sinh học in vitro trên tế bào: thực hiện thử nghiệm

hoạt tính chống oxy hóa, bảo vệ tế bào đã tách ra khỏi cơ thể sinh vật thử nghiệm (chuột, thỏ ) và bị gây tổn thương bằng chất oxy hóa

Sàng lọc hoạt tính chống oxy hóa sinh học in vivo: thử nghiệm hoạt tính chống oxy

hóa - bảo vệ tế bào ngay trên cơ thể sinh vật bị gây tổn thương bởi chất oxy hóa

1.8.1 Khả năng khử Ferric của huyết tương (FRAP)

Xét nghiệm Ferric Reducing Antioxidant Power (FRAP) giúp đo được khả năng làm

giảm Ferric trong huyết tương Đây được coi là phương pháp đánh giá khả năng chống oxy hóa một cách hiệu quả Ferric làm giảm lượng ion tạo màu ở nồng độ pH thấp để tạo ra hỗn hợp phức ferrous-tripyridyltriazine Thu được giá trị FRAP bằng cách so sánh độ hấp thu ở bước sóng 530nm trong hỗn hợp phản ứng thử nghiệm với những chất chứa ion màu khi đã

1.8.3 Xét nghiệm hóa học cho hoạt tính chống oxy hóa của gốc tự do DPPH

Phương pháp này dựa trên nguyên lý sử dụng chất oxy hóa để giảm gốc 2,2- diphenylpicrylhydrazyl (DPPH) bằng cách chuyển nguyên tử hydro làm thay đổi màu sắc của phân tử DPPH Xét nghiệm này thường đơn giản vì chỉ liên quan đến thuốc thử gốc DPPH và cần một yếu tố nữa đó là chất chống oxy hóa So với các xét nghiệm truyền thống thì xét nghiệm hóa học cho hoạt tính chống oxy hóa của gốc tự do DPPH đòi hỏi điều kiện thực nghiệm ít khắt khe hơn Tuy nhiên lượng dung dịch DPPH sử dụng cho xét nghiệm phải tương đối lớn [25]

1.9 Phương pháp phổ hấp thu phân tử UV - Vis

1.9.1 Cơ sở lý thuyết của phương pháp

Phương pháp hấp thu phân tử Ultra Violet - Visible (UV – Vis) hay còn gọi là phương pháp trắc quang dựa trên nguyên lý đo cường độ của dòng ánh sáng chiếu tới bị hấp thu một cách chọn lọc bởi chất màu

Khi nguồn năng lượng bức xạ kích thích phân tử trong vùng UV – Vis sẽ dẫn đến hiện tượng dịch chuyển của electron từ nơi có mức năng lượng thấp đến nơi có mức năng lượng cao Dung dịch mẫu có nồng độ càng cao thì khả năng hấp thu quang của mẫu càng mạnh [26]

1.9.2 Nguyên lý của phương pháp

Ánh sáng từ nguồn sáng được đưa đến bộ đơn sắc để tách ánh sáng thành những chùm tia đơn sắc Sau đó ánh sáng đơn sắc được dẫn tới cuvet chứa mẫu, tuy nhiên ánh sáng đơn sắc này chỉ được mẫu hấp thu một phần Phần ánh sáng đi ra khỏi dung dịch sẽ được chuyển tới đầu dò để ghi nhận tín hiệu dưới dạng mật độ quang [26]

Hình 1.10 nguyên lý hoạt động của máy đo UV-Vis 1.9.3 Các đại lượng thường dùng trong trắc quang

Định luật hấp thu cơ bản Lambert – Beer:

Mật độ quang A của dung dịch và bước sóng λ có mối quan hệ phụ thuộc với nhau,

đo mật độ quang A của dung dịch với các tia bức xạ điện từ có bước sóng khác nhau, từ đó thiết lập đồ thị có tọa độ A-𝜆 dưới dạng đường cong Gauss Từ Amax tìm được 𝜆max, điểm giao nhau giữa Amax và 𝜆max gọi là điểm hấp thu cực đại Khi tiến hành đo mật độ quang

A thì nên đo ở 𝜆max vì tại đây kết quả phân tích sẽ đạt độ nhạy và độ chính xác cao

Bước 2: Chuẩn bị mẫu phân tích

Thông thường mẫu phân tích tồn tại dưới dạng lỏng hoặc dung dịch Nhưng nếu mẫu phân tích ở thể rắn không tan thì phải tìm cách hòa tan mẫu bằng phương pháp và dung môi thích hợp Còn nếu chất phân tích là chất không có hiệu ứng phổ hấp thụ thì phải sử dụng các biện pháp oxy hóa khử, tạo phức chất Tuy nhiên phải dùng cuvet đặc biệt nếu chất phân tích là chất khí

Bước 3: Ghi nhận phổ

Mẫu sau khi chế hóa xong sẽ được chuyển vào cuvet ghi phổ hấp thụ, lựa chọn 𝜆max

và tiến hành đo mật độ quang ở 𝜆max

Bước 4: Xử lý số liệu

Kết quả thu được có thể ở dạng đường ghi phổ hệ tọa độ A - 𝜆, bảng số liệu thành phần của chất nghiên cứu và đồ thị biểu diễn tùy thuộc vào mục đích thực nghiệm [27]

1.9.5 Các phương pháp phân tích UV – Vis

Phương pháp đường chuẩn:

Chọn hệ dung dịch chất nghiên cứu có nồng độ chính xác C1, C2, C3…Cn tạo các hợp chất hấp thu bức xạ điện từ ở bước sóng cực đại đã chọn để đo các mật độ quang tương ứng

A1, A2, A3…An Từ đó thiết lập đồ thị theo hệ tọa độ A – C là đường thẳng đi qua gốc tọa

độ

Phương pháp thêm chuẩn:

Phương pháp thêm chuẩn khắc phục được những yếu điểm liên quan đến sai số xảy

ra trong quá trình thực nghiệm Đo mật độ quang của dung dịch chuẩn sau đó thêm một

lượng dung dịch chuẩn vào dung dịch nghiên cứu để thu được dung dịch có nồng độ Cc+nc

và Ac+nc

Phương pháp đo quang vi sai:

Khi mật độ quang của dung dịch quá lớn không thể xác định được nồng độ người ta thường dùng phương pháp đo quang vi sai với dung dịch so sánh là dung dịch đã biết nồng

độ cho trước [27]

1.10 Lý thuyết về QSAR

1.10.1 Lịch sử ra đời của QSAR

Mô hình Quantitative Structure-Activity Relationship (QSAR) bắt nguồn và trải qua nhiều giai đoạn phát triển khác nhau Năm 1863 Cros đã tìm ra mối quan hệ giữa độc tính

có trong alcol béo sơ cấp với khả năng hòa tan trong nước của chúng Sau đó không lâu vào khoảng 1868 thì Brown và Frasher đề xuất phương trình đầu tiên biểu diễn mối quan hệ định lượng giữa hoạt tính và cấu trúc của các alkaloids khác nhau Hammett đã giới thiệu một phương pháp để nhằm giải thích các hiệu ứng phụ xảy ra trên cơ chế phản ứng vào năm

1935 Cũng từ đây mô hình của Hammett được sử dụng cho tài khoản Taft năm 1956 để tiếp cận gần hơn cho quá trình phân chia điện cực và tác dụng cộng hưởng giữa các chất phụ trong hợp chất Aliphatic [28]

Năm 1969 Corwin Herman Hansch chính là cha đẻ của khái niệm mối quan hệ định lượng giữa cấu trúc phân tử và hoạt tính sinh học (QSAR) [29]

Người ta cho rằng sự ra đời của mô hình QSAR bắt nguồn từ giả thuyết cho rằng cấu trúc của một phân tử hóa học bao gồm các đặc tính (steric, trường tĩnh điện, hình học không gian) phải chứa các đặc điểm mang tính chất vật lý, hóa học và sinh học của nó Có khả năng đại diện cho hóa chất bằng một hoặc nhiều bộ mô tả Mở đầu ứng dụng của mô hình QSAR chính là lĩnh vực độc học Thực tế cho rằng mối quan hệ giữa cấu trúc hóa học và độc tính của một hợp chất đã là một phần trong kho tàng tài liệu độc tính sử dụng cho hơn 100 năm [30]

Mô hình QSAR đã được ứng dụng trong hóa chất nông nghiệp, độc học cũng như công nghiệp hóa chất và môi trường từ 40 năm về trước Và ngày càng phát triển mạnh mẽ, thúc đẩy các quá trình nghiên cứu, tiếp cận sâu rộng trong nhiều lĩnh vực [31]

1.10.2 Khái niệm phương pháp mô hình hóa QSAR

Phương pháp mô hình hóa Quantitative Structure-Activity Relationship (QSAR) là phương pháp nghiên cứu mối quan hệ định lượng giữa cấu trúc của các hợp chất hóa học và hoạt tính sinh học bằng mô hình tính toán Dựa trên mô hình QSAR mà hoạt tính sinh học của một hóa chất mới hoặc hóa chất chưa được thử nghiệm sẽ được suy ra từ cấu trúc phân

tử của những hợp chất tương tự mà hoạt tính của chúng đã được đánh giá trước đó [31]

Hình 1.11 Mô hình Field QSAR 1.10.3 Quy trình xây dựng mô hình QSAR

Quy trình xây dựng mô hình QSAR được biểu diễn ở hình 1.12 và bao gồm các bước

cơ bản sau:

Thu thập hệ dữ liệu của các hợp chất với hoạt tính sinh học được xác định bằng các phương pháp thực nghiệm trước đó, hoặc do chính nhà nghiên cứu tiến hành trên một loại tính chất nhất định Hiện nay cơ sở dữ liệu phát triển với các hoạt tính sinh học được sử dụng cho các phân tử nhỏ, chứa một lượng thông tin lớn về hoạt tính sinh học của hàng triệu hóa chất Các cơ sở dữ liệu đang phổ biến hiện nay như PubChem, PDSP Ki, chEMBL Riêng

cơ sở dữ liệu chEMBL có hơn 1,5 triệu hợp chất hoạt tính sinh học và 9000 mục tiêu sinh học [32]

Lựa chọn bộ mô tả phân tử: việc sử dụng bộ mô tả phân tử và các tính toán liên quan đến cấu trúc phân tử nhằm mục đích sàng lọc các phân tử Các đặc điểm cấu trúc và một số

kí hiệu mô tả phân tử được tính toán tự động cho các phân tử được truy xuất Một số phương pháp lọc trực tiếp bao gồm chuẩn Fisher, ma trận tương quan, bình phương nhỏ nhất một phần Partial Least-Squares (PLS), phân tích thành phần chính như Principal Component Analysis (PCA) Ngoài ra có thể sử dụng phương pháp lặp, hoặc kết hợp giữa PLS và thuật toán di truyền Genetic Algorithm (GA) Phương pháp lọc trực tiếp thường đơn giản và lọc biến nhanh hơn vì chúng chỉ yêu cầu tính toán số liệu và áp dụng những giá trị trong phạm

vi giới hạn để loại trừ những biến không ảnh hưởng hoặc ảnh hưởng ít đến việc xây dựng

mô hình Ngược lại các phương pháp lặp lại đòi hỏi chi phí tính toán cao và kĩ thuật phức tạp [32]

Chuẩn hóa nhóm mô tả ban đầu: khả năng dự đoán của mô hình phụ thuộc vào nhiều yếu tố như (phân bố khả năng hoạt động, kích thước của hệ dữ liệu, tính đa dạng hóa học) Thực tế cho thấy rằng việc xây dựng mô hình QSAR không phải lúc nào cũng đáng tin cậy nên cần phải chú ý đến khả năng mô hình hóa tập dữ liệu Sử dụng một không gian mô tả cho trước cho tập dữ liệu của các phân tử để dự đoán tính khả thi của mô hình Các hợp chất

có cấu trúc tương tự nhau sẽ biểu hiện hoạt tính tương tự nhau [32]

Xây dựng mô hình: mô hình QSAR sử dụng rất nhiều thuật toán khác nhau để dự đoán hoạt tính của một hợp chất thông qua cấu trúc của nó Một số thuật toán được sử dụng

phổ biến gần đây như phương pháp bình phương nhỏ nhất một phần PLS, phương pháp hồi quy tuyến tính đa biến Multiple Linear Regression (MLR), phương pháp phân tích thành phần chính PCA, phương pháp mạng thần kinh nhân tạo Artificial Neural Network (ANN), thuật toán di truyền GA Mỗi phương pháp đều có cách tiếp cận khác nhau và có những ưu nhược điểm riêng Phương pháp mạng thần kinh nhân tạo ANN là kỹ thuật nhận dạng mẫu dựa trên cơ sở tương tự như hoạt động của bộ não con người bằng cách ghi nhận các thông tin dữ liệu thông qua tập đào tạo để nhận dạng các đặc điểm và phân biệt các thông tin một cách chính xác nhất có thể [33] Thuật toán di truyền GA lựa chọn biến bằng cách trộn và kết hợp tất cả các biến hay còn gọi là các mô tả, GA cho phép khai thác mối quan hệ tuyến tính giữa các mô tả đồng thời tìm ra sự kết hợp tối ưu của các mô tả để mô hình hóa mối quan hệ định lượng cấu trúc – hoạt tính [34] Kĩ thuật PCA xác định mẫu trong hệ dữ liệu bằng cách biểu diễn điểm tương đồng và điểm khác biệt của hệ dữ liệu Giảm số lượng thứ nguyên để nén những dữ liệu cần thiết và có ích nhưng không làm mất đi thông tin liên quan đến các lĩnh vực như phát hiện ngoại lệ, xây dựng hồi quy PCA biểu diễn dữ liệu đa biến trong không gian được bao phủ bởi các biến trực giao mới Thành phần thu được dưới dạng kết hợp tuyến tính của các biến ban đầu bằng cách tối đa hóa mô tả phương sai của dữ liệu [35] Các phương pháp được sử dụng để xây dựng mô hình trong nghiên cứu lần này bao gồm: phương pháp PLS, MLR sẽ được đề cập chi tiết tại mục 1.12

Kiểm tra - đánh giá mô hình: mục đích của việc đánh giá mô hình là nhằm cung cấp một mô hình thống kê có đủ độ tin cậy dựa trên các chỉ số thống kê thu được Kiểm tra được

mô hình vừa xây dựng có dự đoán chính xác hoạt tính sinh học của hợp chất hay không bằng cách so sánh kết quả dự đoán từ mô hình với kết quả thực nghiệm [36]

Ứng dụng mô hình: những dự đoán từ mô hình góp phần làm rõ hơn các tính chất vật

lý, hóa học và sinh học của một hợp chất hóa học, từ đó tiết kiệm được thời gian và chi phí cho quá trình thử nghiệm [29]

Cấu trúc phân tử Tập dữ liệu Hoạt tính

Tập đào tạo (Training set)

Tập hiệu chỉnh (Test set)

Đánh giá mô hình

Dự đoán hoạt

tính

Hình 1.12 Sơ đồ tổng quát nghiên cứu QSAR [37]

Việc thực hiện các bước để xây dựng mô hình theo quy trình còn tùy thuộc vào ý muốn cá nhân và kinh nghiệm của các nhà nghiên cứu cũng như khả năng tính toán của công

cụ phần mềm Tuy nhiên các giá trị kết quả thu được chỉ mang tính tương đối Các kết quả

mô hình sau đó được ứng dụng trước tiên trên cơ sở lý thuyết để từ đó thiết kế các phân tử hóa học nhờ vào đặc điểm, tính chất được phát hiện có mối liên quan với hoạt tính sinh học căn bản dựa trên chỉ số đánh giá thống kê thu được Những thành công trong việc xây dựng thuật toán và thiết kế phần mềm là đáng kể nhưng không thể phủ nhận rằng mô hình QSAR vẫn tồn tại những hạn chế nhất định do kích thước tập dữ liệu quá lớn, dẫn đến sự phân hóa

về cấu trúc hóa học của tập hiệu chuẩn cũng như sai số thí nghiệm [37]

1.10.4 Ưu điểm của mô hình QSAR

Mô hình QSAR mang một số ưu điểm nổi bật như sau [29]:

Dự đoán hoạt tính sinh học và các thuộc tính hóa lý của phân tử bằng các phương pháp cụ thể;

Hợp lý hóa các cơ chế hoạt động của một số hợp chất;