Vật liệu chitosanfe3o4c composite tổng hợp, đặc trưng và ứng dụng loại bỏ levofloxacin

TÊN ĐỀ TÀI: Thẩm định phương pháp và ứng dụng phân tích đồng thời các độc tố aflatoxin nhóm B và G trên nền mẫu đậu phộng thương phẩm bằng UPLC-FDL.. Kết quả phân tích mẫu thực tế đượ

BỘ CÔNG THƯƠNG

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

VÕ THỊ MỌNG TRINH

THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP VÀ ỨNG DỤNG PHÂN TÍCH ĐỒNG THỜI CÁC ĐỘC TỐ AFLATOXIN NHÓM B VÀ G TRÊN NỀN MẪU

Công trình được hoàn thành tại Trung tâm dịch vụ phân tích thí nghiêm thành phố

Hồ Chí Minh

Người hướng dẫn khoa học: TS Lê Đình Vũ

Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tại Hội đồng chấm bảo vệ Luận văn thạc sĩ Trường Đại học Công nghiệp thành phố Hồ Chí Minh ngày 25 tháng 06 năm 2022

Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm:

1 PGS.TS Nguyễn Văn Cường - Chủ tịch Hội đồng

2 PGS.TS Nguyễn Ngọc Tuấn - Phản biện 1

3 TS Nguyễn Huy Du - Phản biện 2

4 TS Trần Thị Thanh Thúy - Ủy viên

5 PGS.TS Trần Nguyễn Minh Ân - Thư ký

(Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị của Hội đồng chấm bảo vệ luận văn thạc sĩ)

CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG TRƯỞNG KHOA CÔNG NGHỆ HÓA HỌC

PGS.TS Nguyễn Văn Cường PGS.TS Nguyễn Văn Cường

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

Họ tên học viên: Võ Thị Mọng Trinh MSHV: 19630891

Ngày, tháng, năm sinh:07/02/1991 Nơi sinh: Đồng Tháp

Ngành: Hoá phân tích Mã ngành: 8440118

I TÊN ĐỀ TÀI:

Thẩm định phương pháp và ứng dụng phân tích đồng thời các độc tố aflatoxin nhóm

B và G trên nền mẫu đậu phộng thương phẩm bằng UPLC-FDL

NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG:

(1) Xây dựng quy trình phân tích aflatoxin B1, B2, G1, G2 trên nền mẫu đậu phộng với kỹ thuật sắc ký lỏng siêu hiệu năng đầu dò huỳnh quang UPLC-FLD đáp ứng quy định giới hạn ô nhiễm độc tố trong thực phẩm QCVN 8-1:2011/BYT và đáp ứng đầy đủ các thông số thẩm định theo TCVN ISO 17025:2017

(2) Ứng dụng quy trình phân tích để đánh giá thực trạng nhiễm aflatoxin B1, B2, G1, G2 trong đậu phông thương phẩm trên thị trường Thành phố Hồ Chí Minh

II NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: 25/10/2021

III NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: (Ghi theo trong Quyết định giao đề tài)

IV NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS Lê Đình Vũ

Tp Hồ Chí Minh, ngày … tháng … năm 20 …

i

LỜI CẢM ƠN

Con đường đi đến tri thức không dễ dàng, để có thể vượt qua mọi khó khăn và đi đến ngày hôm nay đó không chỉ là kết quả đến từ sự nỗ lực của bản thân mà còn là thành quả của sự giúp đở từ gia đình, thầy cô, bạn bè và đồng nghiệp Vì vậy, tôi muốn được gửi lời cảm ơn chân thành đến với những người mà tôi biết ơn và trân trọng

Đầu tiên, con xin cảm ơn gia đình đã dìu dắt nâng đỡ, lắng nghe và ủng hộ con trong suốt thời gian qua

Em xin chân thành cảm ơn thầy TS Lê Đình Vũ đã chỉ bảo em tận tình trong quá trình học tập tại trường Em đã học được nhiều điều cả về kiến thức, kinh nghiệm,

và suy luận trong nghiên cứu khoa học từ thầy

Em xin được gửi lời cảm ơn đến Lãnh đạo Khoa Công nghệ Hóa học, Quý thầy/cô bộ môn Hóa phân tích, những người đã chỉ dạy, truyền đạt cho em kiến thức khi học tại trường

Em xin được gửi lời cảm ơn các thầy cô phòng sau đại học đã hỗ trợ, hướng dẫn em rất nhiều khi em học tại trường

Em xin được cảm ơn Ban giám đốc Trung tâm dịch vụ phân tích thí nghiệm Tp HCM, anh chị phòng phân tích Sắc Ký, anh Kiệt, anh Duy, chị Diễm, chị Hằng, chị

Hà, anh Thân, anh Nhân, chị Phương đã tạo điều kiện thuận lợi và giúp đỡ trong quá trình học tập và làm việc tại CASE

Em xin được cảm ơn Sở Khoa học và Công nghệ TPHCM và Trung tâm dịch vụ phân tích thí nghiệm TPHCM đã tài trợ đề tài: xây dựng quy trình phân tích đồng thời aflatoxin B1, B2, G1, G2 bằng phương pháp không dẫn xuất với kỹ thuật UPLC-FLD và khảo sát hàm lượng aflatoxin trong một số loại thực phẩm trên địa bàn thành phố Hồ Chí Minh (mã số đề tài 48/2020/HĐ-QPTKHCN)

ii

TÓM TẮT

Aflatoxins (AFs) là một nhóm độc tố nấm mốc có độc tính cao nhất AF có thể dẫn đến ngộ độc cấp tính gây tử vong hoặc có thể dẫn đến ung thư gan nếu bị tích lũy ở hàm lượng thấp trong cơ thể Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành thẩm định aflatoxin bằng phương pháp sắc ký lỏng siêu hiệu năng ghép đầu dò huỳnh quang (UPLC-FLD) không dùng dẫn xuất của aflatoxins Với điều kiện tối ưu của thiết bị, giới hạn phát hiện của phương pháp (MDL) phân tích các độc tố aflatoxin B1(AFB1), aflatoxin B2 (AFB2), aflatoxin G2 (AFG2) và aflatoxin G1 (AFG1) là 0,1 µg/kg Hệ số tương quan (R2) của các đường chuẩn trong phép định lượng đạt 0,999 Hiệu suất thu hồi trung bình trên nền mẫu của phương pháp tại 3 nồng độ khác nhau cho cả 4 độc tố đều đạt từ 74,0-99,7 % Độ lặp lại (RSDr%) ở các nồng độ khác nhau đều thấp hơn 1,5 %, độ tái lặp (RSDR%) nhỏ hơn 4,0 % cho tất cả các chất ở ba mức nồng độ khác nhau Kết quả phân tích mẫu thực tế được so sánh với

kỹ thật LC-MS/MS và ứng dụng phân tích đồng thời các độc tố aflatoxin trong các mẫu đậu phộng thương phẩm So sánh với yêu cầu theo quy chuẩn của Bộ Y tế về hàm lượng tối đa cho phép của aflatoxin, các thông số của phương pháp thu được đáp ứng tốt về độ nhạy, độ chính xác để phân tích hàm lượng các độc tố nấm nhóm aflatoxin trong nền mẫu đậu phộng và có thể áp dụng trong thực tiễn về kiểm soát chất lượng và vệ sinh an toàn thực phẩm

iii

ABSTRACT

Aflatoxins are the highest toxicity group of mycotoxins that can lead to fatal if acute poisoning or liver cancer if accumulating in low levels in the body In this study, aflatoxin has been validated by ultra-performance liquid chromatography–fluorescence detecter (UPLC-FLD) without any steps of aflatoxins derivatization Under the optimal experimental conditions, the method detection limit (MDL) for aflatoxin B1 (AFB1), aflatoxin G1 (AFG1), aflatoxin B2 (AFB2), and aflatoxin G2 (AFG2) are 0.1 µg/kg The correlation coefficient (R2) of all calibration lines is higher than 0.999 The average method recovery (%) at three different levels and for all four aflatoxins range from 74.0 to 99.7% At different concentrations of aflatoxins, the relative standard deviations (RSD%) of repeatability are lower than 1.5% and the intermediate precision is lower than 4.0 % The results have also been compared with LC-MS/MS method and applied to simultaneous analysis of aflatoxins in peanut samples In comparison with the maximum permitted level of aflatoxins that are required by the Viet Nam Ministry of Health, the validated method is very sensitive and accurate to determine the aflatoxin in peanut product sample and can be used for quality control and food safety

iv

LỜI CAM ĐOAN

Tôi tên là: Võ Thị Mọng Trinh, học viên cao học chuyên ngành Hóa Phân tích, lớp CHHOPT9B, Trường Đại học Công nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh

Tôi cam đoan những kết quả nghiên cứu được trình bày trong luận văn là công trình của tôi với sự hướng dẫn của giảng viên hướng dẫn của TS Lê Đình Vũ, Trường Đại học Công nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh

Những kết quả nghiên cứu của các tác giả khác được sử dụng trong luận văn đều có trích dẫn đầy đủ

Học viên

(Chữ ký)

Võ Thị Mọng Trinh

v

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

TÓM TẮT ii

ABSTRACT iii

LỜI CAM ĐOAN iv

MỤC LỤC v

DANH MỤC HÌNH ẢNH viii

DANH MỤC BẢNG ix

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT xi

MỞ ĐẦU 1

1 Đặt vấn đề 1

2 Mục tiêu nghiên cứu 3

3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 3

4 Cách tiếp cận và phương pháp nghiên cứu 4

5 Ý nghĩa thực tiễn của đề tài 4

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 6

1.1 Tổng quan về độc tố nấm mốc aflatoxin 6

1.1.1 Điều kiện hình thành aflatoxin 6

1.1.2 Tính chất của aflatoxin 6

1.1.3 Độc tính của aflatoxin 8

1.1.4 Điều kiện môi trường hình thành aflatoxin 8

1.1.5 Giới hạn cho phép của aflatoxin 9

1.1.6 Tình hình nhiễm độc tố aflatoxin trong nước 9

1.1.7 Tình hình nhiễm độc tố aflatoxin nước ngoài 11

1.1.8 Các phương pháp xác định aflatoxins 13

1.2 Đánh giá kết quả các công trình nghiên cứu đã công bố 14

1.2.1 Một số kết quả nghiên cứu phương pháp xác định aflatoxin trong thực phẩm trong và ngoài nước 17

vi

1.2.2 Ưu điểm và hạn chế các kết quả nghiên cứu 17

1.3 Nội dung 20

1.3.1 Tổng quan về cây đậu phộng 20

1.3.2 Lý thuyết về sắc ký 22

CHƯƠNG 2 THỰC NGHIỆM 27

2.1 Thiết bị, dụng cụ 27

2.1.1 Hệ thống UPLC-FLD 27

2.1.2 Hệ thống LC-MS/MS 27

2.1.3 Thiết bị xử lý mẫu 27

2.1.4 Thuốc thử và vật liệu thử 28

2.2 Chuẩn bị hóa chất, pha động, dung dịch chuẩn 28

2.2.1 Chuẩn bị pha động 28

2.2.2 Chuẩn bị hóa chất 29

2.2.3 Chuẩn bị các dung dịch chuẩn 29

2.2.4 Đồng nhất, chuẩn bị mẫu thử 30

2.3 Khảo sát phương pháp UPLC-FLD 31

2.3.1 Xây dựng phương pháp cho hệ UPLC-FLD 31

2.3.2 Xác định điều kiện sắc ký để phân tích đồng thời aflatoxin B1, B2, G1, G2 ……….32

2.4 Khảo sát phương pháp LC-MS/MS 34

2.4.1 Khảo sát điều kiện khối phổ 34

2.4.2 Khảo sát điều kiện sắc ký 35

2.5 Đánh giá thực trạng nhiễm aflatoxins trong đậu phộng trên địa bàn Thành phố Hồ Chí Minh 37

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 38

3.1 Kết quả UPLC-FLD 38

3.1.1 Xác định điều kiện sắc ký thích hợp để phân tích đồng thời aflatoxin B1, B2, G1, G2 38

3.1.2 Thẩm định quy trình phân tích aflatoxin B1, B2, G1, G2 trong mẫu đậu phộng bằng UPLC-FLD 44

3.2 Kết quả LC-MS/MS 52

vii

3.2.1 Xác định điều kiện sắc ký LC-MS/MS 52

3.2.2 Thẩm định quy trình phân tích aflatoxin B1, B2, G1, G2 trong mẫu đậu phộng bằng LC-MS/MS 63

3.3 So sánh kết quả hai phương pháp LC-MS/MS và UPLC/FLD 73

3.4 Áp dụng phương pháp đánh giá hàm lượng aflatoxin trong đậu phộng 75

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 77

Kết luận 77

Kiến nghị 78

TÀI LIỆU THAM KHẢO 79

PHỤ LỤC 85

LÝ LỊCH TRÍCH NGANG CỦA HỌC VIÊN 151

viii

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1 Cấu trúc phân tử các loại aflatoxin 7

Hình 1.2 Nguyên lý hoạt động của đầu dò huỳnh quang 23

Hình 3.1 So sánh hệ số kéo đuôi của các aflatoxin trong các dung môi khác nhau 39 Hình 3.2 So sánh độ phận giải các aflatoxin khi thay đổi pha động khác nhau 40

Hình 3.3 So sánh hiệu suất thu hồi khi thay đổi dung môi chiết và dung môi hòa tan 42

Hình 3.4 Quy trình xử lý mẫu 43

Hình 3.5 Sắc ký đồ độ chọn lọc của phương pháp HPLC-FLD 45

Hình 3.6 Đường chuẩn của AFB2 AFG2 trên UPLC-FLD 46

Hình 3.7 Đường chuẩn của AFB1 và AFG1 trên UPLC-FLD 47

Hình 3.8 Sắc ký đồ về lượng tồn dư của mẫu 49

Hình 3.9 Sắc ký đồ các aflatoxin sử dụng cột Inest Sustaint C18 55

Hình 3.10 Sắc ký đồ aflatoxins sử dụng ZORBAX Eclipse Plus 55

Hình 3.11 Độ nhạy của các aflatoxin khi thay đổi pha tĩnh 56

Hình 3.12 Sắc ký đồ của AFG2 khi thay đổi các pha động khác nhau 57

Hình 3.13 Thời gian lưu ở các chương trình khác nhau 59

Hình 3.14 Độ nhạy các aflatoxin ở các chương trình gradient khác nhau 59

Hình 3.15 Diện tích peak các aflatoxin khi thay đổi dung môi pha chuẩn 61

Hình 3.16 Hiệu suất thu hồi khi thay đổi các dung môi chiết mẫu 62

Hình 3.17 Sắc ký đồ mẫu trắng, mẫu thêm chuẩn tại MDL 65

Hình 3.18 Đường chuẩn của AFG2, AFB2 trên LC-MS/MS 66

Hình 3.19 Đường chuẩn của AFG1, AFB1 trên LC-MS/MS 67

Hình 3.20 Sắc ký đồ lượng tồn dư các aflatoxin bằng phương pháp LC-MS/MS 70

Hình 3.21 Đường cong tương quan của các aflatoxin trong đậu phộng được phân tích bằng kỹ thuật phân tích UPLC-FLD và LC-MS/MS 74

ix

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Tích chất hóa lý của một số aflatoxin 7

Bảng 1.2 Giới hạn cho phép (ML) của aflatoxin theo qui định của các nước 9

Bảng 1.3 Tổng hợp kết quả phân tích aflatoxin của một số công trình tại Việt Nam 10

Bảng 1.4 Tổng hợp kết quả nhiễm aflatoxin từ năm 2005 đến năm 2017 của các nước trên thế giới 12

Bảng 1.5 Tóm tắt một số phương pháp phân tích aflatoxins ở trong nước và quốc tế 17

Bảng 2.1 Cách pha chuẩn làm việc aflatoxin 30

Bảng 2.2 Cách chuẩn bị các mẫu thêm chuẩn 31

Bảng 2.3 Các thông số hoạt động của hệ UPLC-FLD 32

Bảng 2.4 Quy định của Châu Âu về tỉ lệ ion xác định so với ion định lượng [45] 35

Bảng 2.5 Quy định số điểm nhận danh khi kết hợp các kỹ thuật phân tích 35

Bảng 2.6 Khảo sát chương trình gradient pha động LC-MS/MS 36

Bảng 3.1 Kết quả khảo sát dung môi định mức UPLC-FLD 38

Bảng 3.2 Diện tích peak các chất aflatoxin khi thay đổi pha động khác nhau 40

Bảng 3.3 Hiệu suất thu hồi các aflatoxin khi thay đổi dung môi chiết và dung môi pha loãng 41

Bảng 3.4 Sự phân bố giá trị % ME của các chất aflatoxin 44

Bảng 3.5 Kết quả tính phù hợp hệ thống 44

Bảng 3.6 Kết quả đường chuẩn các aflatoxin trên UPLC-FLD 46

Bảng 3.7 Kết quả giới hạn phát hiện của phương pháp UPLC-FLD 47

Bảng 3.8 Kết quả giới hạn định lượng của phương pháp UPLC-FLD 48

Bảng 3.9 Kết quả độ lặp lại phương pháp UPLC-FLD 50

Bảng 3.10 Kết quả độ tái lặp của phương pháp UPLC-FLD 51

Bảng 3.11 Kết quả hiệu suất thu hồi của phương pháp UPLC-FLD 51

Bảng 3.12 Kết quả độ không đảm bảo đo của phương pháp UPLC-FLD 52

Bảng 3.13 Phân tử khối và ion định lượng của các aflatoxin 53

x

Bảng 3.14 Thông số khối phổ đã tối ưu 54

Bảng 3.15 Các chương trình pha động được khảo sát trên thiết bị LC-MS/MS 58

Bảng 3.16 Diện tích peak các chất aflatoxin khi thay đổi dung môi pha chuẩn 61

Bảng 3.17 Hiệu suất thu hồi và độ lặp lại khi thay đổi dung môi chiết 62

Bảng 3.18 Ảnh hưởng nền % ME của các chất aflatoxin trên LC-MS/MS 63

Bảng 3.19 Kết quả tính phù hợp hệ thống trên LC-MS/MS 63

Bảng 3.20 Khoảng biến động cho phép của tỷ lệ cường độ giữa ion định tính và ion định lượng theo SANCO 12495/2011 64

Bảng 3.21 Tỷ lệ cường độ giữa ion định tính và ion định lượng của các aflatoxin 64

Bảng 3.22 Kết quả đường chuẩn của các aflatoxin phân tích bằng LC-MS/MS 66

Bảng 3.23 Kết quả giới hạn phát hiện của phương pháp LC-MS/MS 68

Bảng 3.24 Kết quả giới hạn định lượng của phương pháp LC-MS/MS 69

Bảng 3.25 Kết quả độ lặp lại các aflatoxin bằng phương pháp LC-MS/MS 71

Bảng 3.26 Kết quả độ tái lặp các aflatoxin bằng phương pháp LC-MS/MS 72

Bảng 3.27 Kết quả hiệu suất thu hồi các aflatoxin bằng phương pháp LC-MS/MS 72 Bảng 3.28 Kết quả độ không đảm bảo đo của phương pháp LC-MS/MS 73

AOAC Hiệp hội các nhà hoá phân tích chính thống

APCI Ion hoá ở áp suất khí quyển

BQLATTP Ban quản lý an tuàn thục phẩm

ECD Đầu dò điện hoá

ELISA Phương pháp hấp thu miễn dịch liên kết enzym

ELSD Đầu dò dựa trên cường độ phân tán của bức xạ laser

ESI Ion hoá bằng cách phun điện tử

FDA Cơ quan quản lý thực phẩm & dược phẩm Hoa Kỳ

FLD Đầu dò huỳnh quang

GC/MS Sắc ký khí đầu dò khối phổ

HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao

HPTLC Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao

IAC Cột ái lực miễn dịch

IARC Cơ quan nghiên cứu ung thư quốc tế

ICELISA Phương pháp ELISA gián tiếp

LC-MS/MS Sắc ký lỏng ghép khối phổ

LOD Giới hạn phát hiện

xii

LOQ Giới hạn định lượng

MeCN Acetonitrile

MeOH Methanol

ML Giới hạn cho phép tối đa

MRM Multiple reaction monitoring

MS Đầu dò khối phổ

N.A Không quy định

NN-PTNT Nông nghiệp và phát triển nông thôn

PBPB Pyridinium hydrobromua

RID Đầu dò chỉ số khúc xạ

Rs Độ phân giải

SIM Selected ion monitoring

SPE Vi chiết pha rắn

SRN Selected reaction monitoring

và hóa chất độc hại gây ra khoảng 200 loại bệnh liên quan đến tiêu hóa ngộ độc cấp tính và các loại ung thư [1] Nếu các loại thực phẩm nhiễm vi sinh thường gây ra các triệu chứng cấp tính đến sức khỏe con người (như đau bụng và tiêu chảy), thì ngược lại các độc tố sinh học, hóa học thường gây độc mãn tính, từ đó sinh ra các loại bệnh như ung thư Độc tố mycotoxins là một trong nhưng độc tố nguy hiểm sinh ra từ một số loại nấm mốc [2], Độc tố mycotoxins và các loại nấm chính gây ra độc tố mycotoxins được Tổ chức y tế Thế giới (WHO) và Cơ quan quản lý thực phẩm và dược phẩm Hoa Kỳ (FDA) cảnh báo trong nông sản và thực phẩm (lạc, ngô, lúa mì, cà phê và các sản phẩm chế biến từ chúng) [3] Các loại nấm này sinh

ra ở hầu hết các giai đoạn của quá trình chế biến thực phẩm từ ngoài cánh đồng (Fusarium trên lúa mì, lúa mạch và ngô) cho đến khi đã chế biến thành thực phẩm (Aspergillus và Penicillium phát triển trong thực phẩm dưới điều kiện bảo quản không tốt) [4] Hiện tại, có hơn 300 mycotoxin như: aflatoxins, ochratoxins, fumonisin, patulin, zearalenone, deoxynivalenol, T2-toxin… tồn tại trong thực phẩm [5]

Trong nhóm mycotoxins, aflatoxins (AFs) có độc tính cao nhất và được sinh ra bởi nấm mốc (Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus) phát triển trong đất, thảm thực vật mục nát và ngũ cốc Hạt có dầu (đậu tương, đậu phộng, hạt hướng dương

và hạt bông), ngũ cốc (ngô, lúa miến, lúa mì, và gạo) thường bị nhiễm aflatoxin sinh ra bởi loại nấm Aspergillus spp Với hàm lượng cao, aflatoxin có thể dẫn đến ngộ độc cấp tính (aflatoxicosis) và đe dọa tính mạng con người Aflatoxin cũng đã được chứng minh là genotoxic (độc do biến đổi gen), làm hỏng DNA và gây ung thư Chính vì vậy, các nước đã đặt ra giới hạn tối đa cho phép của aflatoxin trong

2

thực phẩm ở ngưỡng rất thấp, thông thường nhỏ hơn 10 µg/kg Tại Việt Nam, Bộ Y

tế qui định giới hạn cho phép tối đa (ML) aflatoxin từ 0,1 µg/kg (thực phẩm dành cho trẻ nhỏ dưới 36 tháng) đến 12 µg/kg (hạt dẻ cười) [6]

Nhiều phương pháp phân tích aflatoxin trong các nền mẫu thực phẩm đã được nghiên cứu và công bố, bao gồm các phương pháp định tính nhanh và các phương pháp định lượng bằng sắc ký [7] [8] Những phương pháp này có ưu điểm là cho kết quả nhanh, chi phí thấp, có thể áp dụng sàng lọc đối với nguyên liệu tại nhà máy Nhược điểm: Khả năng cho dương tính giả và âm tính giả còn cao, chỉ phân tích được aflatoxin ở dạng tổng chứ không phân biệt được từng chất Đối với phương pháp phân tích định lượng, hiện nay Việt Nam đang áp dụng như:

a) Định lượng aflatoxin trong ngô, hạnh nhân, quả hạch Brazil, đậu phộng và hạt hồ trăn bằng kỹ thuật sắc ký lỏng đầu dò huỳnh quang, mẫu được ly trích bằng MeCN/H2O (9/1), làm sạch bằng cột đa chức năng Multifunctional và tạo dẫn xuất trước cột bằng trifluoroacetic acid, giới hạn phát hiện tổng aflatoxin là 10 µg/kg (AOAC 994.08) [9]

b) Xác định aflatoxin trong ngô, đậu phộng và bơ đậu phộng bằng kỹ thuật sắc ký lỏng đầu dò huỳnh quang, mẫu được ly trích bằng hỗn hợp dung dịch MeCN/H2O (84/16) và đệm phosphate, làm sạch bằng cột ái lực miễn dịch và tạo dẫn xuất quang hoá sau cột, giới hạn phát hiện aflatoxin B1 là 0,5 µg/kg (AOAC 2005.08) [10]

Các phương pháp nêu trên đã được áp dụng trên thế giới và trong nước Tuy nhiên,

có một số nhược điểm lớn đó là việc tạo dẫn xuất trước hoặc sau cột Điều này dẫn đến một số khó khăn như: phải trang bị bộ dẫn xuất sau cột khá đắt tiền (nếu tạo dẫn xuất sau cột), còn phương pháp dẫn xuất trước cột bằng trifluoroacetic acid, sẽ tiêu tốn nhiều dung môi, hoá chất và thời gian phân tích cũng như ảnh hưởng đến môi trường [11]

Gần đây, phương pháp sắc ký lỏng ghép khối phổ (LC-MS/MS) đã được áp dụng, cho độ nhạy đáp ứng được giới hạn cho phép của các nước [12, 13] Tuy nhiên thiết

3

bị này có giá thành cao, chi phí phân tích cao, khó trang bị cho các phòng thí nghiệm của đa số nhà máy cũng như các cơ quan quản lý nhà nước tại các địa phương Ngoài ra, phương pháp này còn đòi hỏi kỹ thuật viên phân tích phải có khả năng vận hành tốt thiết bị

Từ những vấn đề hạn chế được trình bày trên, chúng tôi thực hiện đề tài nghiên cứu

“Thẩm định phương pháp và ứng dụng phân tích đồng thời các độc tố aflatoxin nhóm B và G trên nền mẫu đậu phộng thương phẩm bằng UPLC-FLD” Trong đề tài này, các thông số về độ chính xác sẽ được đánh giá cho quy trình phân tích độc

tố aflatoxin B1, B2, G1, G2 bằng phương pháp không dẫn xuất với kỹ thuật sắc ký lỏng siêu hiệu năng đầu dò huỳnh quang UPLC-FLD Phương pháp cho phép thực hiện với chi phí đầu tư thấp, hiệu quả kinh tế cao và thân thiện môi trường hơn Thiết bị sử dụng có đầu dò huỳnh quang hiện đại, có nhiễu nền thấp hứa hẹn cho độ nhạy của phương pháp đáp ứng được qui định quốc tế và trong nước Độ chính xác của phương pháp được đối sánh với kết quả phân tích bằng phương pháp sắc ký lỏng ghép khối phổ (LC-MS/MS) nhằm đảm bảo tính tin cậy khi áp dụng trong thực

tế Quy trình phân tích sau khi thẩm định sẽ được áp dụng để khảo sát hàm lượng aflatoxins trong đậu phộng thương phẩm trên địa bàn Thành phố Hồ Chí Minh

2 Mục tiêu nghiên cứu

(1) Xây dựng quy trình phân tích aflatoxin B1, B2, G1, G2 trên nền mẫu đậu phộng bằng phương pháp xử lý mẫu không dẫn xuất với kỹ thuật sắc ký lỏng siêu hiệu năng đầu dò huỳnh quang UPLC-FLD đáp ứng quy định giới hạn ô nhiễm độc tố trong thực phẩm QCVN 8-1:2011/BYT và đáp ứng đầy đủ các thông số thẩm định theo TCVN ISO 17025:2017

(2) Ứng dụng quy trình phân tích để đánh giá thực trạng nhiễm aflatoxin B1, B2, G1, G2 trong đậu phộng thương phẩm trên thị trường Thành phố Hồ Chí Minh

3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

 Đối tượng nghiên cứu:

o Bằng phương pháp sắc ký lỏng ghép khối phổ (LC-MS/MS)

- So sánh kết quả phân tích với phương pháp LC-MS/MS để chứng minh phương pháp UPLC-FLD có độ tin cậy cao và phù hợp với giới hạn tối thiểu cho phép theo QCVN 8-1:2011/BYT, có tính hiệu quả kinh tế cao khi phân tích hàm

lượng aflatoxin trong đậu phộng

- Ứng dụng quy trình phân tích tối ưu để khảo sát hàm lượng aflatoxin trong đậu

phộng trên địa bàn Thành phố Hồ Chí Minh

4 Cách tiếp cận và phương pháp nghiên cứu

Nhóm nghiên cứu chúng tôi đã tiến hành tìm kiếm và thu thập các tài liệu, tiêu chuẩn, bài báo khoa học, các hướng dẫn phân tích trong và ngoài nước về quy trình định lượng aflatoxin bằng kỹ thuật sắc ký lỏng siêu hiệu năng đầu dò huỳnh quang UPLC-FLD và sắc ký lỏng ghép khối phổ (LC-MS/MS)

Sau khi nghiên cứu lý thuyết, chúng tôi xây dựng kế hoạch thực nghiệm triển khai

đề tài, chuẩn bị các điều kiện về thiết bị, hóa chất và chất chuẩn và tiến hành nghiên cứu thực nghiệm

5 Ý nghĩa thực tiễn của đề tài

Phương pháp phân tích aflatoxin phổ biến nhất hiện nay được thực hiện bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao đầu dò huỳnh quang (HPLC-FLD) Phương pháp này cần sử dụng chất tạo dẫn xuất trước cột hoặc sau cột để tăng độ nhạy nhằm đáp ứng giới hạn cho phép aflatoxin trong thực phẩm theo qui chuẩn Việt Nam và thế giới Tuy

5

nhiên, các chất dẫn xuất với aflatoxin là hóa chất độc hại cho người phân tích ảnh hưởng xấu đến môi trường và có giá thành cao Một phương pháp khác ít được sử dụng hơn để phân tích aflatoxin trong thực phẩm là sắc ký lỏng ghép khối phổ (HPLC-MS/MS) Mặc dù phương pháp này có độ tin cậy và độ nhạy cao, nhưng giá thành thiết bị và chi phí rất lơn khi thực hiện phân tích đang là một rào cản trong việc áp dụng phổ biến

Từ những hạn chế của những phương pháp phân tích nói trên, trên cơ sở thiết bị UPLC-FLD với đầu dò FLD thế hệ mới có độ nhạy tốt hơn, chúng tôi thực hiện nghiên cứu phương pháp phân tích aflatoxin thay thế không sử dụng chất tạo dẫn xuất mà vẫn đạt độ nhạy, độ chọn lọc, đáp ứng các yêu cầu khắt khe của bộ y tế và các nước trên thế giới Để đạt được mục tiêu đề ra, chúng tôi dự kiến lựa chọn phân tích aflatoxin trên hệ thống sắc ký lỏng siêu hiệu năng đầu dò huỳnh quang (UPLC-FLD, Waters) có lợi thế lớn vì giảm được nhiễu nền do ít chất phát huỳnh quang tự nhiên Thêm vào đó, việc lựa chọn kỹ thuật sắc ký lỏng siêu hiệu năng UPLC thay cho kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC cho phép thực hiện phân tích với thời gian nhanh hơn, góp phần giảm chi phí từ dung môi và thời gian phân tích, tăng hiệu quả kinh tế nhưng vẫn đảm bảo các yêu cầu kỹ thuật về độ nhạy, độ đặc hiệu

và độ chính xác của phép phân tích

Phương pháp UPLC-FLD sau khi thẩm định sẽ được áp dụng vào thực tế phân tích

để khảo sát mức độ ô nhiễm aflatoxin nhóm B và G trong các mẫu đậu phộng thương phẩm tại Thành Phố Hồ Chí Minh Kết quả phân tích nhằm đưa ra những cảnh báo có tính chất khoa học đối với người tiêu dùng các sản phẩm của đậu phộng, đồng thời có thể được sử dụng trong lĩnh vựu quản lý vệ sinh an toàn thực phẩm và các lĩnh vực liên quan khác

6

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan về độc tố nấm mốc aflatoxin

1.1.1 Điều kiện hình thành aflatoxin

Aflatoxin được sản sinh ra bởi nấm thuộc chi nấm Aspergillus, với khoảng 300 loài

đã biết Trong đó, chỉ có Aspergillus flavus (A flavus) và Aspergillus parasiticus (A parasiticus) sản sinh ra aflatoxin thực sự gây ra tác động tiêu cực đến sức khỏe của con người Nấm A parasiticus tạo ra cả aflatoxin B và G, trong khi A flavus

chỉ tạo ra độc tố aflatoxin B [14]

Theo tác giả Bùi Xuân Đồng và cộng sự, sự sản sinh độc tố aflatoxin ngoài việc phụ thuộc vào các chủng sinh độc tố còn phụ thuộc rất nhiều vào cơ chất và điều kiện

môi trường [15] A flavus phát triển nhanh khi độ ẩm không khí cao 86 – 97%, hàm

lượng nước trong hạt 22 – 26% và nhiệt độ môi trường 25 – 32°C Điều kiện phát sinh aflatoxin là nhiệt độ môi trường trên 27°C, độ ẩm môi trường phải lớn hơn 62% và độ ẩm trong thực phẩm, nông sản, thức ăn lớn hơn 14% [16] [17] Đặc biệt

ở các nước có khí hậu nóng ẩm nên aflatoxin phát triển nhanh, gây ảnh hưởng trực tiếp đến chất lượng nông sản, thực phẩm [18]

1.1.2 Tính chất của aflatoxin

Aflatoxin G1 có cấu trúc rất gần với cấu trúc aflatoxin B1: Aflatoxin G1 có hai chức lacton, còn aflatoxin B1 chỉ có một Bằng cách khử nối đôi trong nhân hidrofuran tận cùng của aflatoxin B1 và G1 ta thu được hai sản phẩm độc khác là aflatoxin B2 và G2 Carnaghan đã tìm thấy dẫn xuất hydroxy của aflatoxin B1, B2 trong sữa bò và thịt bò được gọi là aflatoxin M1 và aflatoxin M2 (M là một chữ viết tắt của Milk) [19]

tử

Phân tử khối (g/mol)

Tính chất

AFB1 C17H12O6 312

- Nhiệt độ nóng chảy: 268-269ºC

- Huỳnh quang màu xanh da trời

- Hấp thu UV cực đại trong môi trường ethanol: 223; 265; 362 nm

AFB2 C17H14O6 314

- Nhiệt độ nóng chảy: 286-289ºC

- Huỳnh quang màu xanh da trời

- Hấp thu UV cực đại trong môi trường ethanol: 265; 363 nm

AFG1 C17H12O7 328

- Nhiệt độ nóng chảy: 244-246ºC

- Huỳnh quang màu xanh lá cây

- Hấp thu UV cực đại trong môi trường ethanol: 243; 257; 364; 362 nm

AFG2 C17H14O7 330

- Nhiệt độ nóng chảy: 237-240ºC

- Huỳnh quang màu xanh lá cây

- Hấp thu UV cực đại trong môi trường ethanol: 265; 363 nm

8

1.1.3 Độc tính của aflatoxin

Bốn aflatoxin phổ biến nhất là B1, B2, G1 và G2, trong đó aflatoxin B1 là độc tố gây ngộ độc gan mạnh nhất và được phân loại là chất gây ung thư loại I cho con người Nó tác dụng gây ung thư, quái thai, gây độc cho gan, đột biến gen và ức chế

hệ thống miễn dịch của con người hay gia súc bị phơi nhiễm Các aflatoxin gây ra tác dụng cấp tính và mãn tính ở động vật, có thể gây tổn thương gan, ung thư, giảm sản xuất sữa, ức chế miễn dịch và thiếu máu Hơn nữa, các loại aflatoxin cũng liên quan đến việc giảm tiêu thụ thức ăn và tăng trưởng, làm chậm phát triển ở bò sữa Khi bò được nuôi bằng chế độ ăn không có aflatoxin, sản xuất sữa tăng hơn 25% Aflatoxin được bài tiết vào sữa trong vòng 12 giờ ở dạng aflatoxin M1 có dư lượng xấp xỉ bằng 1,7% mức aflatoxin trong chế độ ăn uống Các giới hạn của FDA đối với aflatoxin M1 trong sữa là 0,5µg/kg và đối với aflatoxin B1 không được nhiều hơn 20µg/kg [21, 22]

Gan chính là cơ quan dễ tổn thương xảy ra khi gia cầm, cá, động vật gặm nhấm và các loài linh trưởng không phải người được cho ăn cùng với thức ăn bị nhiễm aflatoxin B1 Vì gan là một cơ quan lipophilic, nó lưu trữ và tập trung tất cả các hợp chất mang theo dòng máu (bao gồm thức ăn, thuốc, chất gây ô nhiễm, vàcác độc tố như mycotoxin) trong tế bào gan và với thời gian phơi nhiễm lâu, có thể tự biến thành dòng tế bào ung thư [3] Gía trị LD50 cho aflatoxin B1 và M1 lần lượt là 18

và 12-16 µg/kg/thể trọng [23, 24]

1.1.4 Điều kiện môi trường hình thành aflatoxin

Nhiệt độ và độ ẩm ảnh hưởng đến sự tạo thành aflatoxin Nhiệt độ tối thiểu và tối đa cho tổng hợp aflatoxin theo nghiên cứu lần lượt là 12ºC và 42ºC Nhiệt độ tối ưu để hình thành aflatoxin là 25-35ºC, nhiệt độ tối ưu để tổng hợp aflatoxin B1 là 24-28ºC Độ ẩm cần thiết cho tổng hợp aflatoxin của nấm mốc là trên 62%, hàm lượng

ẩm nông sản cho tổng hợp aflatoxin tối đa ở nông sản nhiều tinh bột là 18% và trong quả, hạt có dầu là 9-10

9

Như vậy, khí hậu và điều kiện bảo quản ảnh hưởng rất lớn đến sự hình thành aflatoxin trong thực phẩm Các nước nhiệt đới và cận nhiệt đới trong đó có Việt nam có khí hậu nóng ẩm, nhiệt độ cao, mưa nhiều phần lớn thời gian trong năm, thường có sản phẩm bị nhiễm aflatoxin nhiều hơn so với các nước ôn đới Các nước đang phát triển như ở khu vực Đông Nam Á, Châu Phi chưa có nền nông nghiệp hiện đại hóa với những điều kiện trồng trọt và bảo quản chưa đạt tiêu chuẩn làm tăng nguy cơ xuất hiện aflatoxin trong các sản phẩm nông nghiệp

1.1.5 Giới hạn cho phép của aflatoxin

Do độc tính và khả năng gây ung thư cao của aflatoxin, giới hạn tối đa cho phép (ML) của chúng được qui định rất thấp [6,25]

Bảng 1.2 Giới hạn cho phép (ML) của aflatoxin theo qui định của các nước

phẩm

ML, µg/kg Châu Âu Mỹ Trung

Quốc Nhật Việt Nam

AFB1

Đậu phộng

Total

1.1.6 Tình hình nhiễm độc tố aflatoxin trong nước

Năm 2020, Đỗ Hữu Tuấn và cộng sự [6] đã sử dụng kỹ thuật sắc ký lỏng ghép khối phổ LC-MS/MS để xác định aflatoxin B1 (AFB1), ocharatoxin, fumonisin B1 và zearalenone trong thực phẩm và đánh giá nguy cơ nhiễm độc tố trong 606 mẫu tại khu vực Hà Nội, Thanh Hóa và Hà Giang gồm: 144 mẫu gạo, 189 mẫu ngô, 144 mẫu lạc và 129 mẫu mè [3] Kết quả cho thấy AFB1 được phát hiện nhiều nhất với 116/606 mẫu (chiếm 19,1%), trong đó ngô nhiễm nhiều nhất với 57/189 mẫu (30,2%), tiếp theo là lạc với 34/144 mẫu (chiếm 23,6%) Các kết quả AFB1 trung bình trong ngô và lạc đều cao hơn giới hạn tối đa cho phép của Việt Nam [6] Ngược lại, hàm lượng AFB1 trung bình trong gạo và mè đều tương đối thấp, đáp ứng ML trong qui chuẩn Việt Nam của bộ y tế Các kết quả điều tra cho thấy,

378 mẫu ngô cho thấy có 204 mẫu (54%) và 141 mẫu (37,3%) nhiễm AFB1 lần lượt

ở ngưỡng bằng hoặc cao hơn 5 và 20 µg/kg Điều này cho thấy số lượng mẫu ngô vượt quá giới hạn cho phép (5 µg/kg) theo QCVN 8-1:2011/BYT là hơn 90% Bảng 1.3 Tổng hợp kết quả phân tích aflatoxin của một số công trình tại Việt Nam

Khu vực lượng mẫu phân tích) Đối tượng mẫu (số

Số mẫu nhiễm aflatoxin (tỷ

lệ %)

Khoảng nồng

độ, µg/kg µg/kg ML,

Tài liệu tham khảo

5

2

5 N.A

0 – 2 (< LOD) 4,086 (TB) 2,47 (TB) 4,033 (TB) 3,847 (TB) 3,382 (TB) 3,99 – 4,17 5,325 (TB) 1,8 – 2,8 1,85 – 3,18

5

2

2 N.A

N.A

N.A

2 N.A

N.A

5 N.A

11

Bên cạnh đó, một số khảo sát về tình hình nhiễm độc tố aflatoxin cũng đã được công bố tại các hội thảo khoa học Để đánh giá mức độ phát hiện của AFB1 trong thị trường, Viện Y tế công cộng TP.HCM đã tiến hành phân tích mẫu thực phẩm trên thị trường hoặc do các công ty và cơ sở chế biến mang tới đăng ký kiểm nghiệm Kết quả cho thấy trong 115 mẫu (gồm sản phẩm chế biến từ đậu phộng như đậu phộng da cá, kẹo đậu phộng v.v ; nước tương làm từ đậu nành [28]; đồ hộp chay làm từ các loại đậu và bột mì; cà phê; thức ăn gia súc) thì AFB1 phát hiện khoảng 68,2% mẫu đậu phộng và sản phẩm từ đậu phộng[29]

1.1.7 Tình hình nhiễm độc tố aflatoxin nước ngoài

Trong những năm gần đây, các nước đều không ngừng kiểm soát tình trạng an toàn thực phẩm nhằm bảo vệ sức khỏe người tiêu dùng, trong đó có aflatoxin Từ năm

2005 đến năm 2017, Mahato thống kê có đến 42 công trình nghiên cứu về aflatoxin trong 26 loại thực phẩm khác nhau từ 24 quốc gia (Bảng 1.4) Kết quả thống kê cho thấy một số nền mẫu nhiễm AF với hàm lượng cao như bột ớt (0,025 – 40,9 µg/kg, Thổ Nhĩ Kỳ), gạo (0,1 – 308 µg/kg, Ấn Độ), bo bo (0,4 – 25,1 µg/kg, Tunisia), hạt phỉ (0,07 – 43,6 µg/kg, Thổ Nhĩ Kỳ), ngô (48 - 383 µg/kg, Ấn Độ), đậu phộng (15 –

11900 µg/kg, Ethiopia), sản phẩm từ đậu phộng (0,2 – 513,4 µg/kg, Đài Loan) và hạt điều (0,6 – 31,5 µg/kg, Brazil) [30] Một số thực phẩm và thức ăn bị ảnh hưởng

AF nhiều nhất bao gồm đậu phộng, các loại hạt, quả sung, ngô, gạo, gia vị và trái cây khô [31] Từ kết quả tổng hợp của 89 bài báo với 18097 mẫu ngũ cốc, Andrade

và cộng sự kết luận có 37,6% mẫu nhiễm ít nhất một loại AF Gạo là loại thực phẩm

ít bị nhiễm aflatoxin, nhưng các nghiên cứu đã phát hiện thấy aflatoxin trong gạo tại các nước Trung Quốc, Ai Cập, Ấn Độ, Iran, Malaysia, Nepal, Pakistan, Philippines, Anh và Mỹ [32] Điều này cho thấy, nguy cơ con người đối mặt với ung thư do tiêu thu trực tiếp các sản phẩm có nhiễm AF Do đó, việc phân tích hàm lượng AF trong các loại thực phẩm luôn nằm trong kế hoạch đánh giá an toàn thực phẩm hàng năm của các nước, thể hiện qua số công trình khoa học được công bố [33]

12

Bảng 1.4 Tổng hợp kết quả nhiễm aflatoxin từ năm 2005 đến năm 2017 của các

nước trên thế giới

Quốc gia Nền mẫu Aflatoxin Nồng độ

(µg/kg)

Kỹ thuật phân tích

Đài Loan

Sản phẩm

từ đậu phộng

13

Quốc gia Nền mẫu Aflatoxin Nồng độ

(µg/kg)

Kỹ thuật phân tích

Năm công

bố

Phương pháp sắc ký lỏng cao áp-đầu dò huỳnh quang (HPLC-FLD) [34]: Hệ thống phân tích HPLC tương đối đắt tiền, chọn lọc, dùng định lượng aflatoxin Phương pháp này dựa trên hấp thụ chùm tia UV rồi sau đó ngay lập tức phát ra bức xạ có bước sóng dài hơn (huỳnh quang) và xác định cường độ huỳnh quang Mẫu phân tích được tách bằng dung môi chloroform: H2O Ly tâm và làm sạch mẫu bằng cách cho qua cột silicagel pha thường sử dụng cột nhồi silicagel 0,5µl và pha động là

Tác giả Ly trích Làm sạch Điều kiện sắc ký

Thiết

bị

Năm công

bố

Giới hạn phát hiện (LOD)/ định lượng (LOQ)

Nguyễn Thị

Hải [33]

Bắp, đậu phông, gạo Chiết bằng Chloroform

Cô quay mẫu

Qua cột chiết pha rắn SPE - Silicagel

Pha động:

H2O/MeCN/MeOH (55/22,5/22)

LOD AFB1: 0,3 µg/kg AFB2: 0,1 µg/kg AFG1: 0,2 µg/kg AFG2: 0,1 µg/kg

TCVN

9522:2012[26]

Ngũ cốc cho trẻ sơ sinh

Dung dịch đệm phosphat (PBS)

Dẫn xuất sau cột với brom hóa bằng pyridinium hydrobromua perbromua (PBPB)

Qua cột IAC

Mp:

MeOH/MeCN/H2O (2/2/6)

Cột HPLC RP C18

LOD AFB1: 0,05 µg/kg

Dẫn xuất sau cột bằng iod

Qua cột IAC

Mp:

MeOH/MeCN/H2O (2/2/6)

Cột HPLC RP C18

LOD Total aflatoxin lớn hơn

- Chiết bằng chloroform

Qua cột chiết pha rắn SPE -Silicagel

N.A

Sắc ký bản mỏng qua đèn chiếu

UV (TLC)

2015 -

Đối với sản phẩm đậu phộng và đậu phộng, ngũ cốc và đậu

- Chiết bằng aceton / H2O (85/15)

Whatman filter paper No

4

N.A

Sắc ký cột qua đèn chiếu

UV (Mini column)

2015 -

Ngô và bột đậu

phộng/Bơ

-Chiết bằng MeOH/ 0,1M HCl

-Dẫn xuất trước cột bằng trifluoroacetic acid trong hexane

Qua cột chiết pha rắn SPE - Silicagel

Mp: MeOH/MeCN/

H2O (170/170/700)

LOD (µg/kg) AFB1: 0,3 AFB2: 0,3 AFG1: 0,3 AFG2: 0,3

16

Gia vị, trà, cà phê, hạt nhục đậu khấu và gạo

-Chiết MeOH/ H2O

Qua cột IAC

Mp A: 10mM Ammonium acetate 0.1% formic acid

Mp B:

Methanol/Acetonitril (V/V 50:50) 0.1%

formic acid

MS/MS 2015 -

LC-Ngô, hạt bông, đậu phộng, và Bơ đậu phộng -Chiết MeOH/H2O

Filters- Whatman

MultiSep number

228 cartridge column

Mp A: 10mM ammonium acetate

Mp B: Methanol

MS/MS 2008

LC-LOD (µg/kg) AFB1: 0,02 AFB2: 0,025 AFG1: 0,02 AFG2: 0,025

Spanjer và

cộng sự [37]

đậu phộng, lúa mì, ngô, bông ngô, nho khô

Chiết MeCN/H2O (8/2)

Qua cột IAC

Mp A: 0.1% formic acid

Mp B: Acetonitril 0,1% formic acid

MS/MS 2011

LC-LOD (µg/kg)-ngũ cốc AFB1: 0,5 AFB2: 0,5 AFG1: 0,5 AFG2: 0,5

Shen Han và

cộng sự [38]

Ngũ cốc Chiết MeOH/

H2O (75/25)

Qua cột IAC

Mp A: 0.1% formic acid

Mp B: Acetonitril 0,1% formic acid

MS/MS 2011

LC-LOQ (µg/kg) AFB1: 0,1 AFB2: 0,2 AFG1: 0,1

17

1.2 Đánh giá kết quả các công trình nghiên cứu đã công bố

1.2.1 Một số kết quả nghiên cứu phương pháp xác định aflatoxin trong thực

phẩm trong và ngoài nước

Bảng 1.5 Tóm tắt một số phương pháp phân tích aflatoxins ở trong nước và quốc tế

1.2.2 Ưu điểm và hạn chế các kết quả nghiên cứu

Một số phương pháp phân tích aflatoxin được công bố ở trên đều có các ưu và nhược điểm nhất định, cụ thể như sau:

 Tác giả Nguyễn Thị Hải với đề tài “Nghiên cứu sử dụng thiết bị sắc ký lỏng HPLC 1200 để phân tích hàm lượng aflatoxin trong một số loại nông sản thực phẩm”[33] quy trình xác định aflatoxin trên một số nông sản Việt Nam, mẫu được ly trích 100 ml chloroform, lắc 30 phút, lọc cho vào cô quay, sau đó hòa tan cắn bằng 10 ml dicloromethan, làm sạch cột silicagel, hoạt hóa và rửa tạp bằng dung môi hexane-dichloromethane (3:1), rửa giải bằng chloroform-aceton, định mức lại MeOH qua siêu lọc trước khi tiêm vào hệ HPLC-FLD

Ưu điểm của phương pháp là không sử dụng dẫn xuất trước và sau cột, giới hạn phát hiện của phương pháp (LOD) đối với AFB1, B2, G1, và G2 lần lượt là 0,3; 0,1; 0,2 và 0,1 µg/kg, đáp ứng yêu cầu ML của QCVN 8-1:2011/BYT

Hạn chế của đề tài là sử dụng dung môi độc hại như chloroform, hexane và dichloromethane; quy trình xử lý mẫu phức tạp, tốn nhiều thời gian

AFG2: 0,3

Marl E

Benvenuti và

cộng sự [39]

Ngũ cốc -Chiết bằng MeOH/H2O -Không dẫn xuất

Qua cột IAC

Mp:

MeOH/MeCN/H2O (64/18/18)

LOD Total aflatoxin lớn hơn

20 µg/kg

18

 Nhóm tác giả Masahiko Takino và Toshitsugu Tanaka [34] đã công bố phương pháp phân tích AFs trong thực phẩm bằng phương pháp LC-MS/MS Phương pháp sử dụng dung môi ly trích MeCN/H2O (9/1), sau đó dịch lọc được làm sạch bằng cartrige 228, thổi khô dịch thu được, định mức bằng MeOH/H2O (4/6), 10mM ammonium acetate trước khi tiêm vào hệ thống sắc ký lỏng ghép khối phổ LC-MS/MS

Ưu điểm: phương pháp định lượng chính xác từng aflatoxin trong mẫu, sử dụng quy trình xử lý mẫu đơn giản

Hạn chế: chi phí đầu tư cho hệ thống sắc ký lỏng ghép khối phổ quá cao, thêm vào

đó kỹ thuật vận hành thiết bị rất phức tạp

 Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 7930:2008 áp dụng cho các nền mẫu ngũ cốc, quả

có vỏ và sản phẩm của chúng để phân tích aflatoxin [35] Theo đó, mẫu thử nghiệm được chiết với hỗn hợp methanol và nước Sau đó dịch chiết được lọc, pha loãng với nước và sử dụng cột ái lực chứa kháng thể đặc hiệu đối với aflatoxin B1, B2, G1 và G2 Các aflatoxin được rửa giải với methanol Hàm lượng aflatoxin được xác định bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) đầu dò huỳnh quang và dẫn xuất sau cột với iod

Ưu điểm: phương pháp định lượng chính xác hàm lượng aflatoxin tổng và từng aflatoxin trên nền mẫu cụ thể với hàm lượng aflatoxin lớn hơn 8 mg/kg

Nhược điểm: Phạm vi áp dụng không đáp ứng yêu cầu mức giới hạn cho phép nhiễm độc tố của QCVN 8-1:2011/BYT, phương pháp dùng dẫn xuất sau cột bằng iod, tốn kém, phức tạp

 Tiêu chuẩn của Ủy ban an toàn thực phẩm và tiêu chuẩn của Ấn Độ [36] đưa ra nhiều quy trình phân tích aflatoxin trên một số mẫu khác nhau

 Sản phẩm đậu phộng và đậu phộng, ngũ cốc và đậu: mẫu được ly trích bằng hỗn hợp dung môi aceton/H2O (85/15), lắc 45 phút Dịch lọc được lắc với dung môi cloroform, lấy lớp chloroform đi thổi khô, định mức lại bằng 2 ml chloroform, chuyển vào minicolumn (chứa CaSO4, florisil, silica gel), thêm 3 mL hỗn hợp

Hạn chế: không định lượng chính xác từng aflatoxin trong mẫu, sử dụng dung môi

ly trích chloroform, aceton độc

 Đối với ngô, hạt bông, đậu phộng, và bơ đậu phộng: mẫu được ly trích bằng hỗn hợp dung môi MeOH/H2O (8/2), dịch lọc được pha loãng với hỗn hợp dung môi

ly trích, sau đó được xác định bằng bộ kit elisa

Ưu điểm: phương pháp test nhanh xác định tổng aflatoxin trong mẫu, không cần đầu tư thiết bị đắt tiền

Hạn chế: không xác định được từng aflatoxin trong mẫu và dễ bị dương tính giả

 Spanijer và cộng sự đã sử dụng phương pháp LC-MS/MS để định lượng AFs trên một số nền mẫu như đậu phộng, lúa mì, ngô, bông ngô và nho khô [37] Mẫu được ly trích bằng hỗn hợp MeCN/H2O (8/2), sau đó được làm sạch bằng cột ái lực miễn dịch, trước khi tiêm vào hệ thống sắc ký

Ưu điểm: định lượng chính xác từng AF trong mẫu, sử dụng quy trình xử lý mẫu đơn giản

Hạn chế: chi phí đầu tư cho hệ thống sắc ký lỏng ghép khối phổ cao, thêm vào

đó kỹ thuật vận hành thiết bị rất phức tạp

Tổng kết lại, các phương pháp phân tích aflatoxin của các tác giả trong và ngoài nước có những ưu điểm và hạn chế sau:

 Đối với các phương pháp sử dụng sắc ký bản mỏng TLC, cột mini column, kit elisa thường dùng định tính tổng hàm lượng 4 aflatoxin B1, B2, G1, G2, phương pháp nhanh nhưng dễ bị dương tính giả và khó khăn trong việc định lượng chính xác từng aflatoxin trong mẫu

20

 Phương pháp sử dụng sắc ký lỏng đầu dò huỳnh quang là phương pháp định lượng và cho kết quả chính xác, đáp ứng yêu cầu khắt khe mức cho phép độc tố aflatoxin trong thực phẩm của của Bộ y tế và các nước trên thế giới Tuy nhiên, các phương pháp trên sử dụng dung môi ly trích như chloroform, benzene và sử dụng các dẫn xuất sau cột và trước cột độc hại và gây ảnh hưởng xấu đến môi trường [40]

 Phương pháp sử dụng sắc ký lỏng đầu dò khối phổ cũng là một trong những phương pháp định lượng và cho kết quả chính xác cao, tuy nhiên giá thành đầu

tư cao rất nhiều so với sắc ký lỏng đầu dò huỳnh quang, thêm vào đó kỹ thuật vận hành thiết bị rất phức tạp

1.3 Nội dung

1.3.1 Tổng quan về cây đậu phộng

1.3.1.1 Nguồn gốc và giá trị sử dụng cây đậu phộng

Cây đậu phộng (tên khoa học Arachis hypogeae) xuất phát từ Nam Mỹ, sau đó phân

bố khắp Châu Âu, Châu Phi, Châu Á rồi Trung Mỹ và Bắc Mỹ Đậu phộng phù hợp

với khí hậu nhiệt đới và cận nhiệt đới Đậu phộng thuộc họ Leguminoseae, họ phụ Papilionaceae, giống Arachis Loài trồng trọt có tên khoa học Arachis hypogeae [41]

Thành phần trong nhân hạt đậu phộng là các chất béo chiếm 40 – 50% Dầu đậu phộng chứa các glycerid của nhiều acid béo bão hòa: acid arachidic (C20) và acid lignoxeric (C24) - Đây là hai acid béo bão hòa dạng cis nên không gây nguy hiểm cho tim mạch, thành phần dinh dưỡng thay đổi tùy theo từng vùng canh tác và chất lượng nông sản Dầu đậu phộng chứa các vitamin tan trong dầu, trong đó nhiều nhất

là vitamin E Hai acid bão hòa có trong dầu đậu phộng là acid arachidic (C20) và acid lignoxeric (C24) Đây là hai acid béo bão hòa dạng cis nên không gây nguy hiểm cho tim mạch

21

1.3.1.2 Tình hình trồng đậu phộng trên thế giới và trong nước

Trên thế giới: Tổng diện tích trồng đậu phộng năm 2000 gần 24 triệu ha ở trên 100 quốc gia, Châu Á trồng nhiều đậu phộng nhất, chiếm 65% diện tích của thế giới, đứng đầu là Ấn Độ, Trung Quốc, Thái Lan, Việt Nam…

Sản lượng đậu phộng trên thế giới đạt khoảng 29 triệu tấn/năm Ấn Độ là nước sản xuất nhiều đậu phộng nhiều nhất, đứng thứ hai là Trung Quốc, Mỹ là nước sản xuất lớn thứ ba thế giới, Đậu phộng là cây trồng có giá trị canh tác trên một tỷ đô la Mỹ Người Mỹ ăn nhiều hơn 2,7 kg/năm các sản phẩm đậu phộng Xuất khẩu đậu phộng khoảng 1,25 triệu tấn mỗi năm [42]

Tổng sản lượng đậu phộng trên thế giới khoảng 35 triệu tấn vào năm 2000 Trung Quốc là nước có năng suất đậu phộng cao nhất, trung bình trên 3 tấn/ha Hiện nay nhiều nước đang tập trung phát triển cây trồng này: Ấn Độ, Mỹ, Indonesia, Myanma, Braxin, Nigeria…

Nước ta đậu phộng được trồng nhiều ở Bắc Trung Bộ (74.000 ha) và miền Đông Nam Bộ (42.000 ha) Ở ĐBSCL, đậu phộng trồng nhiều trên đất phù sa và có địa hình cao, thoát nước tốt nên đạt năng suất rất cao

- Dùng làm kẹo, bánh: Kẹo và nhân bánh đậu phộng

- Các loại thực phẩm khác: bơ đậu phộng, bột đậu phộng, sữa đậu phộng, dầu đậu phộng dùng làm thực phẩm

22

1.3.1.4 Bảo quản

Hạt đậu nành dễ bị mất sức nẩy mầm, vỏ hạt và tử diệp chuyển sang màu sậm Độ bóng bên ngoài vỏ giảm, hạt dễ bị mốc Thời hạn cho phép bảo quản phụ thuộc vào đặc tính giống, công nghệ trước thu hoạch, nhiệt độ và ẩm độ không khí của kho bảo quản Trong đó, nhiệt độ và ẩm độ không khí là yếu tố quan trọng quyết định chất lượng đậu phộng sau bảo quản Độ ẩm càng thấp thì bảo quản được lâu hơn Bảo quản trong điều kiện thoáng mát, cao ráo Thường xuyên kiểm tra sản phẩm (định kì 1 - 2 tháng) để kịp thời phát hiện sâu mọt, nấm mốc

1.3.2 Lý thuyết về sắc ký

1.3.2.1 Sắc ký lỏng hiệu năng cao

Sắc ký là kỹ thuật tách hỗn hợp các chất phân tích thành các cấu tử riêng biệt dựa trên ái lực không giống nhau của các cấu tử này giữa 2 pha không trộn lẫn, trong đó một pha cố định gọi là pha tĩnh và một pha còn lại là pha động Trong sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo, pha động là chất lỏng còn pha tĩnh chứa trong cột là chất rắn

ở dạng hạt có kích thước xác định hoặc một chất lỏng đã phủ lên một chất mang rắn hay là một chất mang đã được biến đổi bằng liên kết hóa học với các nhóm chức hữu cơ Quá trình sắc ký lỏng dựa trên cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion hay phân loại theo kích cỡ (rây phân tử)

Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography) được sử dụng phổ biến để phân tích các hợp chất khó bay hơi hoặc dễ bị phân hủy nhiệt, được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu khoa học, công nghiệp, nông nghiệp và phân tích thủy sản… Những hợp chất có thể được phân tích bằng sắc ký lỏng tương đối nhiều như: amino acid, protein, nucleic acid, hydrocarbon, carbohydrate, kháng sinh, các hợp chất terpenoid, thuốc trừ sâu, chất hoạt động bề mặt, steroid [43]…

1.3.2.2 Đầu dò huỳnh quang (fluorescence detector)

Nhiều hợp chất có khả năng hấp thụ chùm tia UV rồi sau đó ngay lập tức phát ra bức xạ có bước sóng dài hơn (huỳnh quang) hoặc sau một sự trễ thời gian (lân

23

quang – phosphorescence) Thường phần năng lượng bị hấp thụ sau đó phát xạ trở lại là tương đối thấp nên không thể phát huỳnh quang nhưng có một vài hợp chất phần phát xạ trở lại có thể từ 0,1-1 nên thích hợp với đầu dò tìm huỳnh quang Những hợp chất như vậy thường có vòng liên hợp như các hợp chất vòng thơm có nhiều nhân Nhiều hợp chất không có phổ huỳnh quang có thể tiến hành dẫn xuất những thuốc thử thích hợp để tạo ra sản phẩm có khả năng phát huỳnh quang

Nguyên lý hoạt động: Nguồn kích thích của Cary Eclipse là đèn Xenon flash có thể phát bước sóng từ 200 đến 1000nm, nguồn sáng từ đèn xenon đi qua một máy đơn sắc để chọn bước sóng đơn sắc kích thích Ánh sáng đơn sắc này được đưa vào buồng mẫu và hội tụ lên mẫu đo Tín hiệu huỳnh quang phát ra từ mẫu được hội tụ vào máy đơn sắc thứ hai và thu nhận ở lối ra bằng đầu thu quang điện Một phần của ánh sáng kích thích được trích ra đưa vào đầu thu quang điện thứ hai để đồng bộ với tín hiệu thu

Hình 1.2 Nguyên lý hoạt động của đầu dò huỳnh quang

24

1.3.2.3 Phương pháp sắc ký lỏng ghép nối đầu dò khối phổ (LC-MS)

Sơ lượt về phương pháp LC-MS

Trước khi các kỹ thuật cho phép ghép nối sắc ký lỏng có tốc độ dung môi rửa giải khá cao với đầu dò MS hoạt động ở môi trường chân không ra đời, LC kết hợp với các đầu dò như huỳnh quang, DAD và UV đã được sử dụng rộng rãi Các đầu dò này không thể sử dụng trong phân tích đồng thời đa dư lượng Từ khi các giao diện ghép nối LC với MS ra đời, đặc biệt là các kỹ thuật ion hóa ở áp suất khí quyển, LC-MS là phương pháp được sử dụng phổ biến nhất trong phân tích tầm soát dư lượng ở các phòng thí nghiệm Ngày nay, với sự phát triển không ngừng của sắc ký lỏng, kỹ thuật ion hóa và kỹ thuật khối phổ, LC-MS càng đóng vai trò quan trọng Trong hầu hết các ứng dụng LC-MS phân tích dư lượng, cột pha đảo không phân cực C18 hoặc ít phân cực C8 là cột được sử dụng phổ biến nhất Pha động được lựa chọn dựa trên khả năng rửa giải chọn lọc và hiệu quả ion hóa chất phân tích trong nguồn ion hóa MeCN và MeOH là hai dung môi hữu cơ được sử dụng phổ biến nhất trong các nghiên cứu, trong đó MeOH cho hiệu quả cao hơn MeCN vì thành phần hữu cơ trong pha động giúp tăng hiệu quả ion hóa, độ mạnh của MeOH nhỏ hơn MeCN, khi sử dụng MeOH chất phân tích được rửa giải tại thời điểm pha động

có hàm lượng hữu cơ cao hơn khi sử dụng MeCN [44] Một số acid, muối hữu cơ cũng được thêm vào pha động nhằm mục đích tăng hiệu quả ion hóa chất phân tích như: Acetic acid, formic acid, ammonium hydroxide, ammonium acetate, và ammoniumformate

Những năm gần đây sắc ký lỏng siêu hiệu năng (UPLC) ra đời đã thu hút nhiều sự quan tâm UPLC sử dụng cột với hạt nhồi có kích thước nhỏ (~ 2 µm) cho phép tăng số đĩa lý thuyết, peak thu được nhọn nâng cao độ nhạy Thời gian phân tích với UPLC giảm hơn so với khi sử dụng HPLC, lượng pha động sử dụng cũng thấp hơn góp phần nâng cao hiệu suất phân tích và giảm chi phí

Trong LC ghép khối phổ, sau khi ra khỏi cột LC chất phân tích sẽ được ion hóa trong nguồn ion hóa Các nguồn ion hóa thường được sử dụng trong phương pháp

25

này là: phun electron (ESI), ion hóa hóa học ở áp suất khí quyển (APCI), ion hóa quang học ở áp suất khí quyển (APPI) ESI là kỹ thuật ion hóa được sử dụng phổ biến nhất, thường dùng cho phân tích các hợp chất có tính phân cực từ trung bình đến cao, các hợp chất ion với khối lượng phân tử trong khoảng 100 – 150000 Da, APCI thường dùng cho các hợp chất không phân cực hoặc phân cực trung bình với khối lượng trong khoảng 100 – 2000 Da APCI cho độ nhạy cao hơn ESI khi sử dụng tốc độ pha động lớn, ngoài ra APCI cũng ít bị ảnh hưởng bởi nền mẫu hơn ESI, vì quá trình ion hóa chất phân tích diễn ra trong pha hơi APPI là nguồn ion hóa với cơ chế hoạt động gần giống APCI, trong đó bộ phận phóng điện corona được thay thế bằng nguồn UV APPI thường ứng dụng cho các hợp chất mà ESI và APCI cho hiệu quả ion hóa kém

Chất phân tích sau khi được ion hóa tại nguồn ion hóa sẽ di chuyển vào bộ tách khối trước khi đến detector LC có thể sử dụng các thiết bị tách khối như: hệ một tứ cực, hệ ba tứ cực (QqQ), thời gian bay (TOF), bẫy ion (IT) hoặc sự kết hợp của các thiết bị trên: QTOF; QqLIT

LC-MS với hệ đơn tứ cực, (kể cả hệ bẫy ion hoạt động ở chế độ SIM) không được

sử dụng phổ biến do cường độ tín hiệu nền cao gây bởi nền mẫu và dung môi, độ nhạy thấp khi sử dụng chế độ full scan, thiếu thông tin về cấu trúc khi sử dụng chế độ SIM [44] Hiện tượng này có thể được giảm thiểu đáng kể khi sử dụng hệ MS hai lần, chính vậy vậy, ngày nay LC-MS/MS là lựa chọn phổ biến trong phân tích

đa dư lượng, đặc biệt là hệ LC-QqQ-MS/MS, do tính đơn giản, độ nhạy, độ chọn lọc và độ bền cao [44] Ngoài ra tốc độ quét của QqQ chậm, vì vậy cần thực hiện chia nhiều phân đoạn để tăng độ nhạy cũng như tăng số điểm dữ liệu thu được cho mỗi peak Tuy nhiên, hiện nay nhờ sự hỗ trợ của các phần mềm khối phổ, việc chia phân đoạn (segment) để quét ion đã đơn giản hơn rất nhiều dựa vào kỹ thuật thời gian lưu Với kỹ thuật này, chất phân tích sẽ được giám sát xung quanh khoảng thời gian lưu nhằm đảm bảo đầu dò khối phổ thu được đầy đủ dữ liệu của tất cả các chất Nguyên lý ứng dụng LC-QqQ-MS/MS trong phân tích định lượng