Tổng hợp tinh dầu dạng nano từ một số cây thuộc chi cam chanh (citrus genus) có hoạt tính kháng vi sinh vật báo cáo tổng kết đề tài nghiên cứu khoa học cấp trường

Nhóm tác giả Sheng Jang Zhang và các cộng sự năm 2016 đã báo cáo phương pháp tổng hợp tinh dầu đinh hương và tinh dầu quế dạng nano với kích thước hạt 8,69 nm ứng dụng hiệu quả trong việ

BỘ CÔNG THƯƠNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC

KẾT QUẢ THỰC HIỆN ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP TRƯỜNG

Tên đề tài: Tổng hợp tinh dầu dạng nano từ một số cây thuộc chi cam chanh

(citrus genus) có hoạt tính kháng vi sinh vật

Mã số đề tài: 184.HH05

Chủ nhiệm đề tài: TS Đoàn Văn Đạt

Đơn vị thực hiện: Khoa Công nghệ Hoá học

Tp HCM - 2020

PHẦN I THÔNG TIN CHUNG

I Thông tin tổng quát

1.1 Tên đề tài: Tổng hợp tinh dầu dạng nano từ một số cây thuộc chi cam chanh (citrus genus) có hoạt tính kháng vi sinh vật

1.2 Mã số: 184.HH05

1.3 Danh sách chủ trì, thành viên tham gia thực hiện đề tài

(học hàm, học vị) Đơn vị công tác Vai trò thực hiện đề tài

TS Đoàn Văn Đạt Khoa Công nghệ Hóa học Chủ nhiệm đề tài

PGS.TS Nguyễn Văn Cường Khoa Công nghệ Hóa học Cố vấn đề tài

Th.S Phạm Hoàng Ái Lệ Khoa Công nghệ Hóa học Thực hiện đề tài

TS Phạm Tấn Việt Viện Công nghệ Sinh học

& Thực phẩm

Thực hiện đề tài

1.4 Đơn vị chủ trì: Khoa Công nghệ Hóa học

1.5 Thời gian thực hiện:

1.5.1 Theo hợp đồng: từ tháng 01 năm 2018 đến tháng 12 năm 2018

1.5.2 Gia hạn (nếu có): đến tháng 12 năm 2019

1.5.3 Thực hiện thực tế: từ tháng 03 năm 2018 đến tháng 4 năm 2019

1.6 Những thay đổi so với thuyết minh ban đầu (nếu có):

- Không có sự thay đổi trong quá trình thực hiện đề tài

1.7 Tổng kinh phí được phê duyệt của đề tài: 53,6 triệu đồng

II Kết quả nghiên cứu

1 Đặt vấn đề

Tinh dầu là những chất thơm hay chất mùi có trong một số bộ phận của cây cỏ (như hạt, rễ, củ, vỏ cây, hoa, lá, quả, dầu, nhựa cây) hay động vật (túi tinh dầu) Tinh dầu có trong các nguồn nguyên liệu trên với nồng độ rất khác nhau Khác với các loại dầu không bay hơi (glycerid, acid béo), tinh dầu tương đối dễ bay hơi [1]

Đa số thành phần chính của các loại tinh dầu đều là các hợp chất terpenoid được cấu tạo từ các đơn vị isopren (C5H8) nối với nhau theo quy tắc “đầu nối với đuôi” Terpenoid

đơn giản nhất được cấu tạo từ 2 đơn vị isopren được gọi là monoterpenoid Nếu có nhiều hơn 2 đơn vị isopren thì được gọi là sesquiterpenoid (ứng với 3 đơn vị isopren), diterpenoid (ứng với 4 đơn vị isopren), triterpenoid (ứng với 6 đơn vị isopren) [2-3]

Tinh dầu thường tồn tại thể lỏng ở nhiệt độ thường, có mùi thơm đặc trưng, ít có màu hoặc có màu rất nhạt (ngoại trừ tinh dầu aluzen có màu xanh) Tinh dầu thường có tỉ trọng thấp hơn so với nước (ngoại trừ Quế cây, Đinh Hương, ), có chỉ số khúc xạ cao Tinh dầu

dễ bay hơi, ít tan trong nước, tan trong cồn, ete, dung môi hữu cơ và các chất béo [4]

Tinh dầu được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực: Trong công nghệ thực phẩm, y học, công nghệ sản xuất mỹ phẩm Trong công nghệ thực phẩm, tinh dầu giữ vai trò quan trọng trong công nghệ sản xuất các loại bánh kẹo, thức uống Mặc dù sử dụng với lượng vô cùng nhỏ và dưới những dạng khác nhau, tinh dầu đã góp phần tạo hương cho các loại thức

ăn, đồ uống, làm cho chúng thêm phần hấp dẫn Gần đây, nhờ hoạt tính kháng vi sinh vật và khả năng chống oxi hóa ưu việt của nó, trong công n ghệ thực phẩm cũng đã xuất hiện xu hướng sử dụng tinh dầu như một chất bảo quản thực phẩm tự nhiên và an toàn thay cho các chất bảo quản tổng hợp [5-12]

Nguyên liệu để sản xuất tinh dầu trong nghiên cứu là trái của một số cây thuộc chi cam chanh như là: vỏ bưởi, vỏ cam, vỏ tắc, vỏ chanh

Cây cam tên khoa học: Citrus noboilis, thuộc họ Rutaceae Vỏ, lá và quả cây cam còn được dân gian dùng để trị bệnh các bệnh như: giải độc, thanh nhiệt, đau bụng, cầm máu… Trong lá và vỏ quả xanh có l-stachydrin, hesperdin, aurantin, acid aurantinic, tinh dầu Cam rụng (petitgrain) Vỏ quả chứa tinh dầu mà thành phần chính là d-limonen (90%), decyclicaldehyd tạo nên mùi thơm, các alcol như linalool, dl-terpineol, alcol nonylic, còn có acid butyric, authranilat metyl và este caprylic Thành phần hoạt tính nổi bật nhất trong dầu cam là limonen (khoảng 85-96 của chiết xuất) và myrcene (0.5-3) Limonene được xem

là chất chống oxy hoá mạnh mẽ chống lại các tổn thương gốc tự do và viêm nhiễm có thể dẫn đến nhiều bệnh khác nhau Các hợp chất này là một trong những thành phần dành để ăn kiêng và có hoạt tính chống khối u [13-14]

Tinh dầu vỏ quả tắc là chất lỏng trong suốt, có màu vàng nhạt, có mùi thơm đặc trưng rất dễ chịu Trong tinh dầu có chứa khoảng 25 thành phần, trong đó thành phần chủ yếu của tinh dầu là D – Limomen chiếm trên 85%, bên cạnh đó còn có một số chất khác như 1R-alpha-pinen, Beta-pinen, sabinen, limonen, b-ocimen, linalol Đặc biệt là ở tinh dầu vỏ tắc

có sự hiện diện của 7,7-dimethyl-2-methylen bicycle, heptan và 7-methyl-4-methylen-1- (methylethyl) naphthalen mà không phát hiện ở bốn loại tinh dầu cam, chanh, bưởi, quýt [15]

1,2,3,4a,5,6,8a-octahydro-Trong lá, hoa, vỏ quả Bưởi đều có chứa tinh dầu nhưng phần lớn tinh dầu thường tập

trung nhiều nhất trong vỏ bưởi Trong vỏ Bưởi tinh dầu sẽ được lưu trữ ở túi tiết tinh dầu Tinh dầu vỏ bưởi ở thể lỏng ở nhiệt độ thường, không màu hay có màu vàng rất nhạt, có mùi đặc trưng của vỏ bưởi, không tan trong nước, nhẹ hơn nước, dễ bay hơi, tan trong ete, dung môi hữu cơ và các chất béo Tinh dầu vỏ Bưởi chứa d-limonen, a- pinen, linalol, geraniol, citral còn có các alcol, pectin, acid citric Ngoài ra còn chứa các hợp chất Terpenoid (tức là các hydrocacbon không no) nên chúng dễ bị thủy phân (nhất là ở nhiệt độ cao) và bị phân hủy dưới ánh sáng thành các hợp chất khác Vì vậy, người ta thường bảo quản tinh dầu trong những lọ tối màu, có miệng nhỏ, đậy kín và nơi có nhiệt độ thấp [15-16]

Trong các công trình khoa học những năm gần đây, với sự phát triển vượt bậc của công nghệ nano, các nhà nghiên cứu đang dành mối quan tâm to lớn cho việc chuyển hóa tinh dầu trích ly từ thực vật sang dạng nano (nano EMULSION) Tinh dầu dạng nano có kích thước hạt dầu từ 1-100 nm được phân bố đều trong môi trường nước với sự giúp đỡ của chất ổn định Tinh dầu dạng nano với kích thước hạt siêu nhỏ so với kích thước hạt tinh dầu nên tinh dầu nano thể hiện sự kháng vi sinh vật vượt trội hơn so với tinh dầu thông thường Nhóm tác giả Sheng Jang Zhang và các cộng sự năm 2016 đã báo cáo phương pháp tổng hợp tinh dầu đinh hương và tinh dầu quế dạng nano với kích thước hạt 8,69 nm ứng

dụng hiệu quả trong việc kháng vi sinh vật: Escherichia Coli, Bacillus Subtilis, Salmonella Typhimurium, Staphylococus Aureus [17]

Nhóm tác giả Mohammad Hasan Shahavi và các cộng sự năm 2015 báo cáo phương pháp tối ưu dùng sóng siêu âm trong tổng hợp tinh dầu nano đinh hương Phương pháp này

đã cho hạt nano tinh dầu có kích thước nhỏ hơn 50 nm, phân bố ổn định bền vững trong môi trường nước [18] Nhóm tác giả Tahir Mehmood và cộng sự năm 2017 đã báo cáo phương pháp tối ưu tổng hợp tinh dầu oliu dạng nano, phương pháp này cho ra hạt nano tinh dầu có kích thước hạt 151,68 nm [19] Nhóm tác giả Balagopal Amrutha năm 2017 đã báo cáo phương pháp tổng hợp nano tinh dầu từ cây thì là (Cuminum Cynium) và cây hồ tiêu (Piper Nirgrum) sử dụng sóng siêu âm ứng dụng để ức chế hoạt động của vi khuẩn E coli và S enteria [20] Hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu bưởi được thể hiện ở những kết quả nghiên cứu như sau Hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu được khảo sát bằng các phương pháp sử dụng cho kháng sinh Khảo sát mang tính chất định tính Sử dụng phương pháp đĩa giấy để nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu vỏ bưởi Từ nhiều tài liệu trong và ngoài nước trước đó đã khảo sát tính kháng khuẩn trước đó và đều có chung kết quả là khả năng

kháng khuẩn của tinh dầu đối với 3 vi khuẩn: Staphylococcus, Shigella, Salmonella paratyphi A đều khá mạnh [21]

Nhóm tác giả Zaixiang Lou và các cộng sự năm 2017 đã báo cáo công trình nghiên cứu kháng khuẩn, kháng vi nấm của tinh dầu từ họ cam chanh Công trình nghiên cứu chỉ ra

rằng tinh dầu từ chi cam chanh có thể ức chế sự phát triển vi khuẩn S aureus và E coli [22]

Yuan Li và nhóm cộng sự đã kết hợp tinh dầu cam chanh với Chiosan tạo ra microcapsules sử dụng nhiều chất hoạt động bề mặt khác nhau bằng phương pháp nhũ tương ion gel cho ra hạt có kích thước lớn hơn 289,3 nm [23]

Tinh dầu nano chi cam chanh: phương pháp chuyển đổi từ dầu sang dạng nano chưa được nghiên cứu một cách rộng rãi Khả năng diệt khuẩn của tinh dầu dựa vào thành phần hóa học, tính không tan của tinh dầu trong nước và sự tiếp xúc tinh dầu với vi sinh vật Mặc

dù tinh dầu chi cam chanh có khả năng diệt một số loại vi khuẩn không có lợi như S aureus

và E coli, nhưng vì tinh dầu thông thường có diện tích bề mặt khá nhỏ, tiếp xúc với vi

khuẩn không nhiều nên hiệu quả diệt khuẩn còn hạn chế Đối với tinh dầu nano kích thước hạt thì rất bé khoảng từ 1- 100 nm, diện tích bề mặt thì rất lớn, khả năng tiếp xúc với vi khuẩn cao cho nên khả năng kháng vi sinh vật được tối ưu hóa Ngoài ra, việc sử dụng trực tiếp tinh dầu là khá đắt đỏ vì tốn nhiều nguyên liệu Trong khi đó, việc tạo ra nano tinh dầu chỉ cần một lượng nhỏ tinh dầu, mang lại sự hiệu quả về mặt kinh tế

Hạt nano tinh dầu vì kích thước nhỏ nên diện tích bề mặt lớn, năng lượng bề mặt lớn,

do đó hệ không bền về mặt nhiệt động Vì vậy, nano tinh dầu thường có xu hướng kết hợp lại với nhau tạo thành hạt có kích thước lớn hơn để giảm diện tích bề mặt, giảm năng lượng

bề mặt Để hạn chế vấn đề này và để tạo ra hệ nano bền vững người ta thường thêm vào chất

ổn định, giúp các hạt nano phân tán đều trong môi trường và không bị keo tụ theo thời gian Ngoài ra, trong thời gian qua, các hạt nano bạc (AgNPs) đã nhận được sự quan tâm rất lớn của các nhà nghiên cứu nhờ khả năng chống lại nhiều loại vi sinh vật có hại Các đặc tính đặc biệt của AgNPs được ứng dụng rộng rãi trong các lĩnh vực khác nhau như y sinh

học, dẫn truyền thuốc, xử lý nước, nông nghiệp Do vậy, nhóm tác giả đề xuất ý tưởng tổng

hợp nano tinh dầu từ vỏ trái cây thuộc chi cam chanh, sau đó kết hợp nano tinh dầu chi cam chanh với nano bạc để ứng dụng kháng vi sinh vật

2 Mục tiêu nghiên cứu

Tổng hợp nano tinh dầu từ vỏ từ vỏ quả cam sành và bưởi Năm Roi, sau đó kết hợp nano tinh dầu thu được với nano bạc ứng dụng kháng vi sinh vật

3 Phương pháp nghiên cứu

Tinh dầu từ vỏ quả cam và bưởi được trích ly bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước Thành phần hóa học trong mẫu tinh dầu cam và bưởi được x ác định bằng phương pháp sắc ký khí ghép khối phổ (GC/MS) Phân bố kích thước hạt nano nhũ tương được khảo sát bằng phương pháp tán xạ ánh sáng động học (DLS)

Nano bạc cũng được nghiên cứu thành công bằng phương pháp khử hóa học với chất khử natri citrat Đặc trưng của nano bạc được phân tích bằng các phương pháp phân tích hóa

lý hiện đại như DLS, TEM, UV-Vis

Nano nhũ tương trên nền tinh dầu trích ly từ vỏ quả cam và bưởi đã được tổng hợp bằng phương pháp rung siêu âm kết hợp khuấy cơ học

Tinh dầu cam, tinh dầu bưởi, nano bạc và các mẫu nano nhũ tương cũng được khảo sát khả năng kháng khuẩn bằng phương pháp khuếch tán đĩa thạch

4 Tổng kết về kết quả nghiên cứu

Trong đề tài này, tinh dầu cam và bưởi thuộc chi Citrus đã được tổng hợp thành dạng

nano bằng phương pháp rung siêu âm được sự hỗ trợ bằng khuấy cơ học Nano tinh dầu cam thu được có kích thước hạt 66,2 nm còn nano tinh dầu bưởi 71,1 nm

Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tổng hợp nano tinh dầu cho thấy Tween

80 nguyên chất là chất nhũ hoá phù hợp cho việc tổng hợp nano tinh dầu chi Citrus; tỉ lệ

tinh dầu, Tween 80 và nước cất là 1:1:50 (mL) là điều kiện thích hợp để tổng hợp hệ nano tinh dầu

Tổng hợp thành công nano bạc bằng phương pháp khử hóa học với chất khử là muối natri citrat và phân tích kích thước hạt, tính chất vật liệu bằng các phương pháp DLS, UV-Vis, TEM Nano bạc thu được có màu vàng nhạt và có kích thước hạt khoảng 42,7 nm Kết hợp nano tinh dầu cam và bưởi với nano bạc thu được hệ nhũ tương nano có kích thước hạt < 100 nm với điều kiện khảo sát được là 2,5 mL tinh dầu và 3,5 mL Tween 80 trong 50 mL dung dịch nano bạc để tổng hợp dung dịch nano nhũ tương tinh dầu kết hợp nano bạc

Khảo sát khả năng kháng khuẩn cho thấy tinh dầu cam và bưởi có khả năng kháng với

vi khuẩn Escherichia coli Nano bạc có khả năng kháng với các vi khuẩn: Escherichia coli, Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Salmonella enterica Nano tinh dầu cam có khả năng ức chế vi khuẩn Escherichia coli trong khi cùng điều kiện nano tinh dầu bưởi lại

không có Nano tinh dầu kết hợp với nano bạc kháng khuẩn tốt các vi khuẩn Escherichia coli, Bacillus subtilis

5 Đánh giá các kết quả đã đạt được và kết luận

Các nano tinh dầu cam và bưởi sau khi kết hợp với nano bạc đã cải thiện hoạt tính kháng khuẩn vượt trội hơn Kết quả nghiên cứu cho thấy nano nhũ tương từ tinh dầu vỏ cam

và bưởi kết hợp với nano bạc có thể trở thành vật liệu triển vọng ứng dụng trong các lĩnh vực thực phẩm, mỹ phẩm và kháng khuẩn

Do kinh phí eo hẹp, đa số các mẫu đều phải gửi phân tích ở các trung tâm bên ngoài nên mất rất nhiều thời gian, ảnh hưởng đến tiến độ nghiên cứu Vì thế chúng tôi chỉ khảo sát một số yếu tố chính ảnh hưởng đến khả năng tổng hợp nano tinh dầu cam và bưởi

Bên cạnh đó thì chúng tôi cũng có một số kiến nghị như sau:

− Khảo sát thêm các điều kiện pH, tốc độ khuấy, thời gian rung siêu âm ảnh hưởng đến kích thước hạt của hệ nano tinh dầu để tìm ra được quy luật chính xác hơn

− Khảo sát độ ổn định của hệ nhũ tương nano và ảnh hưởng của các chất hoạt động bề mặt lên hệ phân tán, nhằm tìm ra các thông số tối ưu nhất để sản phẩm có độ bền khi đưa vào ứng dụng trong đời sống

− Cần phân tích thêm để khẳng định các thành phần có trong nano tinh dầu và nano tinh dầu có gắn thêm nano bạc

− Nghiên cứu thêm cơ chế kết hợp nano tinh dầu với nano bạc

6 Tóm tắt kết quả (tiếng Việt và tiếng Anh)

Tóm tắt kết quả (tiếng Việt) Nano nhũ tương trên nền tinh dầu trích ly từ vỏ quả

cam sành và bưởi Năm Roi đã được tổng hợp thành công bằng phương pháp rung siêu âm kết hợp khuấy cơ học Thành phần hóa học trong mẫu tinh dầu cam và bưởi được xác định bằng phương pháp sắc ký khí ghép khối phổ (GC-MS) Phân bố kích thước hạt nano nhũ tương được khảo sát bằng phương pháp tán xạ ánh sáng động học (DLS) Các yếu tố kỹ thuật tổng hợp ảnh hưởng đến kích thước hạt nano nhũ tương cũng được khảo sát một cách chi tiết, như tỉ lệ hỗn hợp các chất hoạt động bề mặt gồm Tween 80 và Span 80, thể tích tinh dầu và ảnh hưởng của thể tích nước

Trong nghiên cứu này, nano bạc cũng được nghiên cứu thành công bằng phương pháp khử hóa học với chất khử natri citrat Đặc trưng của nano bạc được phân tích bằng các phương pháp hiện đại như DLS, TEM, UV-Vis

Tinh dầu cam, tinh dầu bưởi, nano bạc và các mẫu nano nhũ tương cũng được khảo sát khả năng kháng khuẩn bằng phương pháp khuếch tán đĩa thạch Kết quả cho thấy tinh dầu

cam và bưởi có khả năng kháng vi khuẩn Escherichia coli Nano bạc có khả năng kháng khuẩn tốt các vi khuẩn Escherichia coli, Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Salmonella enterica Nano tinh dầu cam có khả năng kháng vi khuẩn Escherichia coli Nano tinh dầu kết hợp với nano bạc kháng khuẩn tốt các vi khuẩn Escherichia coli, Bacillus subtilis

Tóm tắt kết quả (tiếng Anh) Nanoemulsion based on essential oil extracted from

King orange and Namroi grapefruit peels were successfully synthesized by ultrasonic vibration combined with mechanical stirring The chemical composition of the orange and grapefruit essential oil sample were determined by Gas Chromatography - Mass Spectrometry (GC/MS) method Particle size distribution of nanoemulsion was investigated

by Dynamic Light Scattering (DLS) method The most important technical factors affecting the size of nanoemulsion such as ratio of two types of emulsifiers including Tween 80 an d Span 80, the volume of essential oil and the effect of water volume were also investigated in detail In this study, silver nanoparticles were successfully synthesized by chemical reduction method with sodium citrate as a reducing agent Characteristics of silver nanoparticles were analyzed by modern methods such as DLS, TEM, UV-Vis Orange essential oil, grapefruit essential oil, silver nanoparticles and nanoemulsion samples were also applied to test antibacterial ability by disc diffusion method The results showed that

orange and grapefruit essential oil have good resistance to Escherichia coli Silver nanoparticles has good antibacterial properties against Escherichia coli, Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Salmonella enterica Nanoemulsion based on orange oil is resistant

to Escherichia coli bacteria Nanoemulsion based on essential oil combined with nanosilver

have good antibacterial ability against Escherichia coli and Bacillus subtilis

III Sản phẩm đề tài, công bố và kết quả đào tạo

3.1 Kết quả nghiên cứu (sản phẩm dạng 1,2,3)

Nguyễn Phát Hải 02/2018-08/2018 Tổng hợp và khảo sát khả năng

kháng vi sinh vật của nano tinh dầu trích ly từ một số cây thuộc chi cam chanh

tháng 10/2019 Sinh viên Đại học

IV Tình hình sử dụng kinh phí

T

Kinh phí được duyệt

(triệu đồng)

Kinh phí thực hiện

(triệu đồng)

Ghi chú

A Chi phí trực tiếp

V Kiến nghị (về phát triển các kết quả nghiên cứu của đề tài)

- Sản phẩm tổng hợp được có thể được thương mại hoá trên thị trường

VI Phụ lục sản phẩm (liệt kê minh chứng các sản phẩm nêu ở Phần III)

- 01 bài báo chấp nhận đăng trên Tạp chí Khoa học và Công nghệ trường Đại Học Công Nghiệp TP HCM với tựa đề “Tổng hợp nano nhũ tương từ tinh dầu vỏ cam sành ứng

dụng làm vật liệu kháng khuẩn”, tháng 12/2019

- 01 bài báo đã đăng trên tạp chí Indonesian Journal of Chemistry (Scopus Q3): Doan Van Dat, Nguyen Van Cuong, Pham Hoang Ai Le, Tran Thi Lan Anh, Pham Tan Viet, Nguyen Thi Lan Huong Orange Peel Essential Oil Nanoemulsions Supported by Nanosilver for Antibacterial Application Indonesian Journal of Chemistry, 2020, Vol 20, No2, pp 430-439 DOI: 10.22146/ijc.46042

Tp HCM, ngày 14 tháng 07 năm 2020

PHẦN II BÁO CÁO CHI TIẾT ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC

1 Đặt vấn đề

Tinh dầu là hỗn hợp các chất thơm được sử dụng rộng rãi trong ngành công nghiệp nước hoa, dược phẩm, thực phẩm, dẫn truyền thuốc và kháng khuẩn [1-4] Tinh dầu là hỗn hợp của hơn 200 hợp chất khác nhau, các hợp chất này chủ yếu được hình thành từ hydrocacbon monoterpene, sesquiterpene và các dẫn xuất oxy hoá của chúng như este, rượu, aldehyde aliphat và keton [5]

Việt Nam với điều kiện thiên nhiên rất thuận lợi cho việc hình thành và phát triển của

nhiều loài cây chứa tinh dầu có giá trị cao Trong đó, các cây thuộc chi Citrus: cam, chanh,

bưởi…tuy có tiềm năng lớn song chưa được khai thác và tận dụng nguồn tinh dầu đúng mức hầu như chỉ mới sử dụng múi Tinh dầu cam có một hương thơm dịu ngọt, mang lại cảm giác sảng khoái, dễ chịu làm cho tâm trạng của con người phấn chấn và vui vẻ Tinh dầu cam hỗ trợ điều trị bệnh khó tiêu, trị ho, cảm cúm hiệu quả; giảm đau nhức vùng cơ bắp mệt mỏi, giúp loại bỏ bã nhờn trên da, điều trị mụn, điều trị nám, mang lại làn da sáng và khỏe đẹp Tinh dầu cam còn có tính kháng khuẩn tự nhiên, vì thế chúng được sử dụng để giúp bảo quản các loại thực phẩm, giúp đảm bảo an toàn, sạch sẽ Tinh dầu cam còn được sử

dụng để ngăn chặn sự phát triển cũng như tiêu diệt vi khuẩn Escherichia coli, đây là một

loại vi khuẩn rất nguy hiểm Bên cạnh đó thì công dụng của tinh dầu vỏ cam còn được dùng

để ức chế sự lây lan và phát triển của loại vi khuẩn Salmonella, bởi có chứa các chất kháng

khuẩn mạnh mẽ, đặc biệt là monoterpen Nhóm tác giả Zaixiang Lou và các cộng sự năm

2017 đã báo cáo công trình nghiên cứu kháng khuẩn, kháng vi nấm của tinh dầu từ họ cam chanh Công trình nghiên cứu chỉ ra rằng tinh dầu từ họ cam chanh có thể ức chế sự phát

triển vi khuẩn Staphylococus aureus và Escherichia coli [6-7]

Trong những năm gần đây, với sự phát triển vượt bậc của công nghệ nano, các nhà khoa học trên thế giới đang dành mối quan tâm to lớn cho việc chuyển hóa tinh dầu trích ly

từ thực vật sang dạng nano (nanoemulsion - nano nhũ tương) Nano nhũ tương (có đường kính hạt trong khoảng 20 - 500 nm) là một hệ bền về mặt nhiệt động, bao gồm dầu, nước và các chất hoạt động bề mặt đóng vai trò nhũ hóa [7-8] Nhóm tác giả Mohammad Hasan Shahavi và các cộng sự năm 2016 báo cáo phương pháp tối ưu dùng sóng siêu âm trong tổng hợp tinh dầu nano đinh hương Phương pháp này đã cho hạt nano tinh dầu có kích thước nhỏ hơn 50 nm, phân bố ổn định bền vững trong môi trường nước [ 9] Cũng trong

năm 2016, nhóm tác giả Sheng Jang Zhang và các cộng sự đã báo cáo phương pháp tổng hợp tinh dầu đinh hương và tinh dầu quế dạng nano với kích thước hạt 8,69 nm ứng dụng

hiệu quả trong việc kháng vi sinh vật: Escherichia coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium, Staphylococus aureus [10] Nhóm tác giả Tahir Mehmood và cộng sự năm

2017 đã báo cáo phương pháp tối ưu tổng hợp tinh dầu oliu dạng nano, phương pháp này cho ra hạt nano tinh dầu có kích thước hạt 151,68 nm [11]

Thời gian qua các hạt nano bạc đã nhận được sự quan tâm rất lớn của các nhà nghiên cứu, nano bạc là vật liệu có diện tích bề mặt riêng rất lớn, có những đặc tính độc đáo như tính khử khuẩn, chống nấm, khử mùi, không có hại cho sức khỏe con người với liều lượng tương đối cao, có khả năng phân tán ổn định trong các loại dung môi khác nhau, độ bền hóa học cao, không bị biến đổi dưới tác dụng của ánh sáng và các tác nhân oxy hóa khử thông thường [12-14] Việc kết hợp nano tinh dầu với nano bạc là một hướng nghiên cứu mới nhằm nâng cao khả năng kháng vi sinh vật của tinh dầu

Do vậy, chúng tôi chọn đề tài: “Tổng hợp tinh dầu dạng nano từ một số cây thuộc

chi cam chanh (citrus genus) có hoạt tính kháng vi sinh vật”

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN VỀ LĨNH VỰC NGHIÊN CỨU

1.1 Giới thiệu sơ lược về chi Cam Chanh - họ Rutaceae

1.1.1 Nguồn gốc và phân loại

Họ Rutaceae còn gọi là họ cam – quýt hay cam – chanh, tên thường gọi của các loại

cây có múi Ở Việt Nam họ Rutaceae được tìm thấy khoảng 22 chi và 127 loài, chi Citrus khoảng 24 loài Khí hậu nước ta thích hợp cho chi Citrus phát triển nên được trồng rộng rãi khắp các vùng trên cả nước Ở miền Bắc, Citrus được trồng phổ biến ở Nam Đàn, Nghi Lộc,

Hải Dương, Hà Tĩnh, Yên Bái, Thanh Hoá…Ở miền Nam, được trồng phổ biến ở đồng bằng sông Cửu Long [15]

Một số loài thường gặp thuộc chi Citrus ở Việt Nam [16], [17]:

− Citrus aurantifolia (Christm & Panser) Swingle: chanh ta

− Citrus medica L: cam Thanh Yên

− Citrus nonilis Lour: cam sành

− Citrus grandis (L) Osbeck: bưởi da xanh

− Citrus reticulate Blanco: quýt đường

− Citrus latifolia Tanaka: chanh không hạt

− Citrus grandis (L.) Osb.: bưởi Năm Roi

1.1.2 Giới thiệu về tinh dầu chi Cam Chanh

Thành phần chủ yếu trong tinh dầu vỏ quả của hầu hết các loài thuộc chi Cam Chanh

là các hợp chất thuộc nhóm monoterpen (85 – 95%), tiếp đến là các hợp chất thuộc nhóm chức alcol (2 – 10%), còn các hợp chất thuộc nhóm sesquiterpen thường rất ít (1 – 2,5%)

Tinh dầu từ vỏ trái loài cam chanh (C Sinensis) chứa chủ yếu là decanal, citral a và b,

limonene và alcol octyl Thành phần chính của tinh dầu vỏ trái chanh ta lại là D-limonene,

α-pinen, β-phenlandren và γ-terpinen Trong vỏ trái quýt lại hầu như chỉ có D-limonene,

ngoài ra còn một lượng nhỏ linalool và citronelol [15]

Tinh dầu trong lá ở chi Citrus có thành phần chính là nhóm monoterpen, cùng một số

hợp chất khác thuộc nhóm sesquiterpene, trong tinh dầu của nhiều loài cam, chanh, quýt…còn có chứa một số hợp chất chứa oxygen (alcol, aldehyde, ester) Các hợp chất chứa

oxygen dễ hòa tan trong nước và rượu có nồng độ thấp, đồng thời có vị thơm mát dịu, hấp dẫn của hoa quả tươi

1.1.2.1 Tinh dầu vỏ cam

Cây cam tên khoa học: Citrus noboilis, thuộc họ Rutaceae Năm 2006, Thạc sĩ Nguyễn

Minh Hoàng đã khảo sát thành phần hóa học tinh dầu vỏ trái cam sành được trồng tại tỉnh Tiền Giang [18]; Marcos De Souza Gomes và các cộng sự năm 2013 cũng đã nghiên cứu thành phần hóa học vỏ trái của cam ngọt được trồng tại Brazil với kết quả được trình bày ở bảng 1.1 [19]

Bảng 1.1 Thành phần hóa học tinh dầu vỏ cam sành Tiền Giang và cam ngọt Brazil

1.1.2.2Tinh dầu vỏ bưởi

Trong lá, hoa, vỏ quả bưởi đều chứa tinh dầu nhưng phần lớn tinh dầu thường tập trung nhiều nhất trong vỏ bưởi Thành phần hóa học tinh dầu vỏ bưởi da xanh trồng tại Đồng Nai và bưởi Năm Roi trồng tại Vĩnh Long đã được nghiên cứu và kết quả được trình bày ở bảng 1.2 [20, 21]

Bảng 1.2 Thành phần hóa học tinh dầu vỏ bưởi da xanh và bưởi Năm Roi

Các hạt nano bạc thể hiện tác động rất mạnh đối với vi khuẩn Do ở kích thước nhỏ thì khả năng tác động và thâm nhập của hạt nano bạc qua lớp màng của vi khuẩn là rất tốt Vì thế, tác dụng diệt khuẩn ở bên trong cơ thể vi khuẩn là rất hiệu quả Đồng thời, ở kích thước nano thì diện tích bề mặt của hạt nano là lớn hơn rất nhiều so với khối hạt của nó Cho nên khả năng tương tác với vi khuẩn thông qua việc tiếp xúc bề mặt tăng lên Nếu kích thước của hạt nano bạc càng nhỏ thì càng tốt Bởi vì, kích thước càng nhỏ thì đặc tính diệt khuẩn

đã nêu trên là rất lớn

Các hạt nano bạc thường có dạng hình khối, số lượng các mặt hình khối cho thấy khả năng tác dụng với vi khuẩn ở mức độ cao hay thấp Số lượng mặt càng nhiều thì khả năng diệt khuẩn càng cao Đồng thời, trong quá trình sử dụng hạt nano bạc thường ở trong dung dịch phân tán, nơi mà một lượng nhỏ ion bạc đã được che dấu và đóng góp một phần cho khả năng diệt khuẩn của nano bạc

Chưa có một nghiên cứu nào chứng minh có sự vận chuyển của hạt nano bạc qua màng protein Tuy nhiên, đã có những dẫn chứng cho thấy các hạt nano bạc đã đi vào bên trong tế bào và điều này cho thấy chúng đã tương tác với màng protein Mặc dù, người ta vẫn chưa tìm ra luận điểm xác thực đầy đủ và hợp lý để giải thích hiện tượng này Tuy nhiên, từ những kết quả thực nghiệm của hàng loạt các công trình nghiên cứu đã cho thấy được hiệu quả diệt khuẩn của các hạt nano bạc là phụ thuộc rất nhiều vào kích thước của nó [12]

1.3 Giới thiệu về nano nhũ tương

Nano nhũ tương là hệ phân tán vi dị thể, có phân bố kích thước hạt nằm trong khoảng

từ 20 - 500 nm, được hình thành từ hai chất lỏng không đồng tan, trong đó một chất lỏng là pha phân tán (pha nội, pha không liên tục) được phân tán vào chất lỏng thứ hai là môi trường phân tán (pha ngoại, pha liên tục) được ổn định bằng chất hoạt động bề mặt [23]

Trong ngành công nghiệp thực phẩm và dược phẩm, hệ nano nhũ tương thường được sản xuất bằng cách sử dụng phương pháp nhũ tương năng lượng cao, chẳng hạn như đồng nhất áp lực cao, khuếch tán vi lỏng, và siêu âm cường độ cao Trong số này, việc sử dụng siêu âm để sản xuất hệ nano nhũ tương là một sự phát triển gần đây [24] Tiêu thụ năng lượng và chất ổn định bề mặt thấp hơn, kích thức hạt nhỏ hơn, độ phân tán thấp hơn, và sự

ổn định của hệ nano nhũ tương cao hơn là một trong những ưu điểm chính của kỹ thuật n ày

so với các phương pháp khác [25] Cần lưu ý rằng trong sản xuất hệ nano nhũ tương sử dụng siêu âm, một số yếu tố như biên độ, thời gian, cũng như nhiệt độ có thể ảnh hưởng đến đặc điểm của hệ nano nhũ tương Hơn nữa, loại và nồng độ của các thành phần của nhũ tương đóng vai trò quan trọng trong việc xác định đặc điểm của chúng Do đó, để cải thiện tính chất vật lý tính lưu biến và sự ổn định của hệ nano nhũ tương, chọn loại hợp chất và tỷ

lệ của chúng trong công thức là một vấn đề quan trọng Nước, pha dầu và chất tạo nhũ tạo thành cấu trúc cơ bản của các phản ứng nano [26] Về vấn đề này, loại và nồng độ chất nhũ hóa là yếu tố quan trọng nhất ảnh hưởng đến hệ nano nhũ tương Hiện nay thì người ta có xu hướng chọn Tween và Span làm chất nhũ hoá

Tween là ester của polyglycol và sorbic acid là một chất hoạt động bề mặt không ion

và không độc hại Tween có nhiều loại như Tween 20, Tween 40, Tween 60, Tween 80…nhưng trong thực tế người ta dùng Tween 20 và Tween 80 nhiều nhất Giá trị HLB của Tween 80 là 15,0 và của Tween 20 là 16,7

Chất nhũ hóa Span là hỗn hợp các este được hình thành từ acid lauric, acid béo và các polyol thu được từ sorbitol, bao gồm sorbitan và isosorbide Trong công nghiệp có rất nhiều loại như Span 20, Span 40, Span 60, Span 80 Nhưng trong công nghiệp vẫn hay sử dụng nhiều nhất đó là Span 20 và Span 80 Giá trị HLB của Span 80 là 4,25 và của Span 20 là 8,70

CHƯƠNG 2 THỰC NGHIỆM

2.1 Hóa chất, thiết bị và dụng cụ thí nghiệm

2.1.1 Hóa chất

Bảng 2.1 Hóa chất dùng trong thí nghiệm

2.2.1 Trích ly tinh dầu vỏ bưởi và cam

Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước trực tiếp để trích ly tinh dầu bưởi Năm Roi và cam sành Do phương pháp này thiết bị, máy móc trong quá trình trích ly dễ chuẩn bị, sử dụng và kiểm soát phù hợp với việc nghiên cứu trong phòng thí nghiệm

Hình 2.1 Sơ đồ quy trình trích ly tinh dầu cam và bưởi Các công đoạn cơ bản của quá trình chưng cất tinh dầu cam, bưởi

− Chuẩn bị nguyên liệu: vỏ cam, bưởi tươi được loại bỏ ruột và phần phao trắng và rửa sạch với nước Để ráo rồi cân 200 gam cho vào máy xay sinh tố Xay nhuyễn cùng với 300

mL dung dịch NaCl 10% nhằm mục đích giải phóng tinh dầu ra khỏi mô để khi chưng cất tinh dầu dễ thoát ra, từ đó rút ngắn thời gian chưng cất và đạt hiệu quả cao

− Ngâm nguyên liệu: nguyên liệu đã xay nhuyễn được ngâm vào dung dịch NaCl 10% trong 2,5 giờ Công đoạn này làm cho tinh dầu thẩm thấu đi từ túi tiết ra bên ngoài, giúp cho quá trình chưng cất tinh dầu được triệt để hơn

− Nạp liệu: nguyên liệu nạp vào thiết bị được chứa bởi hệ thống vỉ đỡ để ngăn cách với lớp nước bên dưới đáy nồi Nguyên liệu chứa trong thiết bị không vượt quá 85% dung tích thiết bị Không được nạp nguyên liệu chặt quá làm cho hơi khó phân phối đều trong toàn bộ khối nguyên liệu và không được quá lỏng, quá xốp sẽ làm cho hơi dễ dàng theo những chỗ rỗng đi ra mà không tiếp xúc với toàn khối nguyên liệu

− Chưng cất: khi bắt đầu chưng cất cần cung cấp nhiệt lượng lớn để làm sôi nước chưng cất Sau đó hạ nhiệt độ, duy trì nước ở nhiệt độ sôi vì khi ở nhiệt độ c ao tinh dầu dễ

Na2SO4 khan

dàng bị phân hủy Khi sôi, hơi nước kéo theo tinh dầu, hỗn hợp hơi này được dẫn vào hệ thống làm lạnh, ta sẽ thu được hỗn hợp nước, tinh dầu vào mộ t bình thủy tinh Cần điều chỉnh nhiệt độ dịch ngưng nằm trong khoảng 30 - 400C vì nếu dịch ngưng quá nóng sẽ làm bay hơi tinh dầu

− Tháo bã: sau khi chưng cất xong cần tắt bếp, để nguội 15 - 30 phút, mở nắp và tháo

bã, sau đó dùng nước sạch vệ sinh thiết bị

− Tách tinh dầu: do có tỉ trọng nhỏ hơn lúc này tinh dầu nhẹ hơn nước sẽ tách thành hai lớp, tinh dầu nỗi lên trên còn nước sẽ nằm dưới phễu chiết Ta tiến hành chiết bỏ phần nước

ở dưới Sau khi chiết trong tinh dầu vẫn còn lẫn nước, vì vậy ta s ử dụng Na2SO4 để làm khan và loại bỏ nước Tinh dầu cam, bưởi cần bảo quản trong các chai lọ có màu, tránh tiếp xúc trực tiếp với ánh sáng, không khí

2.2.2 Phương pháp tổng hợp nano bạc

Có rất nhiều phương pháp tổng hợp nano bạc, dựa vào điều kiện của phòng thí nghiệm thì phương pháp khử hóa học là thích hợp nhất Mỗi phương pháp khử để điều chế hạt nano bạc sẽ ứng với mỗi loại hóa chất Trong đề tài này chúng tôi sử dụng muối natri citrat (Na3C6H5O7) làm chất khử để tổng hợp nano bạc, vì muối natri citrate dễ tìm, giá thành rẻ, an toàn với môi trường, phương pháp tổng hợp đơn giản dễ thực hiện và cho kích thước nano bạc nằm trong khoảng 30 – 50 nm [27-28]

Hình 2.2 Sơ đồ quy trình tổng hợp nano bạc 100 ppm Thuyết minh sơ đồ quy trình:

− Chuẩn bị 50 mL dung dịch AgNO3 0,002M trong bình cầu đã được bọc kín bằng giấy bạc và 40 mL dung dịch Na3C6H5O7 0,005M trong becher 100 mL

− Đun cách thủy cùng lúc hai dung dịch này đến gần sôi khoảng 75 – 85oC Sau đó cho

từ từ dung dịch Na3C6H5O7 0,005M vào bình cầu chứa dung dịch AgNO3 0,002M

− Tiếp tục khuấy và đun cách thủy hỗn hợp trên bếp khuấy từ, duy trì nhiệt độ trong khoảng 75 – 85oC đến khi dung dịch chuyển sang màu vàng nhạt thì dừng lại, để nguội hỗn hợp về nhiệt độ phòng Chỉnh pH của dung dịch bằng HNO3 0,01M về pH = 6 – 7 và định mức dung dịch thành 100 mL

− Kết thúc quy trình ta thu được dung dịch nano bạc 100 ppm được bảo quản trong bình tối màu

Gia nhiệt lên 75 – 850C

50 mL AgNO3

0,002M

Khuấy duy trì nhiệt độ 75 – 850C

Dung dịch chuyển sang màu vàng

Ngưng gia nhiệt

2.2.3 Phương pháp tổng hợp nano tinh dầu cam và bưởi

Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng phương pháp rung siêu âm để tạo ra nano tinh dầu Hệ nanoemulsion tinh dầu cam và bưởi là một hệ kém bền về mặt nhiệt động nên cần phải sử dụng chất nhũ hoá để hổ trợ quá trình tạo nhũ cũng như giúp hệ nhũ bền hơn Việc lựa chọn hoá chất và khảo sát chỉ số HLB của chất nhũ hoá sao cho phù hợp với hệ nhũ nanoemulsion là cần thiết Chúng tôi đã lựa chọn 2 chất tạo nhũ là Tween 80 và Span

80 với chỉ số HLB lần lượt của chúng là 15 và 4,25

Hình 2.3 Sơ đồ quy trình tổng hợp nano tinh dầu cam và bưởi Nano tinh dầu cam và bưởi được tổng hợp theo các bước:

− Dùng pipet hút các chất ổn định bề mặt vào một becher, sau đó cho lượng tinh dầu cần khảo sát vào và dùng đũa thủy tinh khuấy đều hỗn hợp Đong lượng nước cất thích hợp

và cho từ từ vào hỗn hợp, vừa cho vào vừa khuấy đều

− Sau đó, tiến hành nhũ hóa pha dầu vào pha nước bằng cách đặt hỗn hợp vào bể đánh siêu âm

− Siêu âm 10 phút, rồi chuyển sang khuấy cơ 10 phút với tốc độ cao 1200 vòng/phút và tiếp tục đưa hỗn hợp vào bể đánh siêu âm trong 10 phút để phân tán hoàn toàn tinh dầu vào nước

Lúc này ta thu được hệ nhũ tương dầu trong nước và sử dụng phương pháp DLS để xác định kích thước các hạt tinh dầu trong dung dịch

2.2.2.1Khảo sát sự ảnh hưởng của tỉ lệ chất nhũ hóa lên kích thước hạt nano tinh dầu

Để tìm ra tỉ lệ và chất nhũ hoá thích hợp để tổng hợp tinh dầu cam hoặc bưởi dạng nano chúng tôi tiến hành bố trí thí nghiệm như bảng 2.2

Bảng 2.2 Các mẫu nano tinh dầu tổng hợp với tỉ lệ và chất tạo nhũ khác nhau

STT Tween 80 (mL) Span 80 (mL) Tinh dầu (mL) Nước cất (mL)

2.2.2.2Khảo sát sự ảnh hưởng của tỉ lệ tinh dầu

Để khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ tinh dầu đến quá trình tổng hợp nano tinh dầu cam và bưởi chúng tôi tiến hành thí nghiệm bằng cách cố định lượng nước sử dụng là 50 mL, chất nhũ hóa Tween 80 là 1 mLvà thay đổi tỉ lệ tinh dầu

Bảng 2.3 Các mẫu nano tinh dầu tổng hợp với tỉ lệ tinh dầu khác nhau

2.2.2.3 Khảo sát tỉ lệ nước trong hệ nhũ nano tinh dầu cam và bưởi

Chúng tôi tiến hành bố trí thí nghiệm bằng cách cố định tỉ lệ (1:1) chất tạo nhũ và tinh dầu Thay đổi thể tích nước cất sử dụng trong quá trình tổng hợp theo bảng 2.4

Bảng 2.4 Các mẫu nano tinh dầu tổng hợp với tỉ lệ nước cất khác nhau

3 1 1 75

2.2.3 Phương pháp kết hợp nano tinh dầu cam và bưởi với nano bạc

Sử dụng dung dịch nano bạc 100 ppm tổng hợp được làm môi trường phân tán cùng với nước để tổng hợp nanoemulsion tinh dầu kết hợp với nano bạc

Sau khi khảo sát tỉ lệ chất nhũ hoá phù hợp với hệ nanoemulsion tinh dầu cũng như có được chất nhũ hoá có chỉ số HLB phù hợp với hệ nhũ mà ta tổng hợp, chúng tôi sử dụng Tween 80 để tổng hợp nanoemulsion tinh dầu kết hợp với nano bạc

Hình 2.4 Sơ đồ quy trình tổng hợp nano tinh dầu cam và bưởi kết hợp nano bạc Nano tinh dầu cam hoặc bưởi kết hợp với nano bạc được tổng hợp theo các bước:

− Dùng pipet hút một lượng thể tích Tween 80 vào một becher, sau đó cho lượng tinh dầu vào và dùng đũa thủy tinh khuấy đều hỗn hợp

− Đong lượng nano bạc 100 ppm thích hợp cho từ từ vào hỗn hợp và thêm nước cất sao cho nồng độ nano bạc trong dung dịch là 50 ppm, tổng thể tích của hỗn hợp là 50 mL Dùng đũa thủy tinh khuấy đều hỗn hợp

Khuấy trộn sơ bộ Tween 80 80 Nano bạc Tinh dầu

− Sau đó, tiến hành nhũ hóa pha dầu vào pha nước bằng cách đặt hỗn hợp vào bể đánh siêu âm 10 phút, rồi chuyển sang khuấy cơ 10 phút với tốc độ cao 1200 vòng/phút và tiếp tục đưa hỗn hợp vào bể đánh siêu âm trong 10 phút để phân tán hoàn toàn tinh dầu vào dung dịch nano bạc Sử dụng phương pháp DLS để kiểm tra và đánh giá kích thước hạt trong hệ

và đưa ra kết luận

Khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ tinh dầu và Tween 80 sử dụng trong phương pháp kết hợp nano tinh dầu với dung dịch nano bạc theo bảng 2.5 để tìm điều kiện tối ưu

Bảng 2.5 Khảo sát tỉ lệ tinh dầu và Tween 80 sử dụng để kết hợp nano tinh dầu và nano bạc

STT Tween 80 (mL) Tinh dầu (mL) Dung dịch nano bạc 100

2.3.2 Phương pháp DLS xác định phân bố kính thước hạt và đo điện thế zeta

Kích thước và sự phân bố hạt nano được xác định bằng phương pháp DLS thực hiện trên thiết bị đo kích thước hạt nano SZ–100 tại Viện Công nghệ Hóa học – Viện Hàn Lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam – TP Hồ Chí Minh

2.3.3 Kính hiển vi điện tử truyền qua

Hình thái và kích thước hạt nano bạc được xác định từ ảnh TEM thực hiện trên máy JEM–1400 (Nhật Bản) tại Đại học Bách Khoa TP Hồ Chí Minh

2.3.4 Phương pháp UV–Vis

Phổ UV–Vis của nano bạc được xác định trên máy Evolution 300 của hãng Thermo Scientific tại khoa Công nghệ Hóa học, trường Đại học Công nghiệp TP Hồ Chí Minh

2.3.5 Phương pháp nghiên cứu khả năng kháng khuẩn

Phương pháp thử nghiệm khả năng kháng khuẩn áp dụng kỹ thuật khoanh giấy kháng sinh khuếch tán Quy trình thử nghiệm: cho vi khuẩn vào đĩa petri có chứa môi trường thạch

LB (Luria Bertani), sau đó dàn đều vi khuẩn ra hết bề mặt thạch Đĩa giấy 6 mm vô trùng đặt lên bề mặt thạch và thấm mẫu thử nghiệm lên, cho một mẫu kháng sinh (đối chứng dương) lên bề mặt thạch Bọc kín đĩa petri bằng giấy vô trùng, để ở điều kiện thường trong vòng 24h Quan sát các vòng vô khuẩn xung quang đĩa giấy và đánh giá kết quả

Các mẫu tinh dầu cam và bưởi, nano tinh dầu, nano bạc và nano tinh dầu kết hợp với nano bạc được xác định khả năng kháng khuẩn tại Viện Sinh học và Thực phẩm tại trường Đại học Công nghiệp TP Hồ Chí Minh

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

2.4 Kết quả GC-MS tinh dầu

2.4.1 Kết quả GC-MS tinh dầu cam

Thành phần trong tinh dầu cam sành trích ly được phân tích bằng phương pháp sắc ký khí ghép khối phổ

Hình 3.1 Sắc ký đồ GC của tinh dầu cam làm bay hơi ở 320oC Bảng 3.1 Thành phần tinh dầu cam bay hơi nhiệt độ 320oC

2.4.2 Kết quả GC-MS tinh dầu bưởi

Tinh dầu bưởi trích ly được cũng cho màu trong suốt và có mùi thơm đặc trưng của vỏ bưởi và có các thành phần tương tự như kết quả của nghiên cứu đã công bố Bảng 3.3 cho thấy phần lớn trong tinh dầu bưởi Năm Roi chứa nhiều các chất hydrocacbon thơm như: D-limonene, myrcene, terpinene, ocimene, caryophyllene và cũng là thành phần chính tạo nên mùi hương đặc trung cho tinh dầu bưởi

4 0 0 6 0 0 8 0 0 1 0 0 0 1 2 0 0 1 4 0 0 1 6 0 0 1 8 0 0 2 0 0 0 2 2 0 0 2 4 0 0 2 6 0 0 2 8 0 0 3 0 0 0 0

Hình 3.2 Sắc ký đồ GC của tinh dầu bưởi

Bảng 3.2 Thành phần tinh dầu bưởi trích ly được

STT Thời gian

Công thức phân tử Độ tương quan

STT Thời gian

Công thức phân tử Độ tương quan

425 nm Kết quả này trùng khớp với kết quả nghiên cứu của Arunas Ramanavicius et al,

2017 [24] Điều này cho thấy sự có mặt của bạc trong dung dịch

Hình 3.3 Phổ UV–Vis của dung dịch nano bạc khảo sát

Hình 3.4 Ảnh TEM của dung dịch nano bạc tổng hợp Kết quả phân tích từ ảnh TEM cho thấy các hạt nano bạc trong dung dịch có nhiều hình dạng khác nhau với kích thước hạt trung bình khoảng 50 nm

Hình 3.5 Kết quả DLS của dung dịch nano bạc

Với kết quả khảo sát UV-Vis cũng như kết quả TEM và DLS cho thấy quá trình tổng hợp nano bạc đã thành công và kích thước hạt trung bình của nano bạc là 42,7 nm

2.6 Kết quả tổng hợp nano tinh dầu cam và bưởi

2.6.1 Nano tinh dầu bưởi

2.6.1.1Kết quả khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ chất nhũ hoá đến kích thước hạt nano tinh dầu

bưởi

Bảng 3.3 Kết quả kích thước hạt phụ thuộc vào tỉ lệ của chất nhũ hoá

STT Kí hiệu mẫu Tween 80

(mL)

Span 80 (mL)

Tinh dầu bưởi (mL)

H 2 O (mL)

Chỉ số HLB

Kích thước hạt (nm)

Hình 3.6 Kết quả đo DLS các mẫu nano tinh dầu bưởi khảo sát tỉ lệ và chất nhũ hoá

Bảng 3.4 cho thấy phương pháp tổng hợp này đều cho các hạt có kích thước nano Kích thước hạt trung bình trong hệ nhũ có xu hướng giảm dần từ 245,1 nm đến 71,1 nm khi tăng dần % Tween 80 Kích thước nhỏ nhất là 71,1 nm (tương ứng mẫu B10) khi trong hệ nhũ chỉ sử dụng chất nhũ hoá là 100% Tween 80 và lớn nhất là 245,1 nm (tương ứng mẫu B06) khi sử dụng 100% Span 80 làm chất nhũ hoá

Vì hệ nhũ là dầu trong nước và dầu nhẹ hơn nước nên tinh dầu sẽ có xu hướng tập trung lên trên bề mặt của hệ Sau 60 ngày, thì mẫu mẫu B06, B07 bắt đầu có hiện tượng bị tách lớp, ở phần trên của lọ đựng mẫu ta có thể thấy nó đục hơn so với phần dưới của lọ Các mẫu khác vẫn chưa có hiện tượng tách lớp này Điều này cho thấy, chất nhũ hoá có chỉ

số HLB thấp đối với hệ nhũ này sẽ không bền so với chất nhũ hoá có chỉ số HLB cao

Kết quả này cho thấy sử dụng Tween 80 nguyên chất là chất nhũ hoá phù hợp cho việc tổng hợp nano tinh dầu bưởi

2.6.1.2Kết quả khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ tinh dầu bưởi đến kích thước hạt

Bảng 3.4 Kết quả sự ảnh hưởng của tỉ lệ tinh dầu bưởi đến kích thước hạt

STT Kí hiệu mẫu Tween 80

(mL)

Tinh dầu bưởi (mL)

H 2 O (mL)

Kích thước hạt (nm)

Hình 3.7 Kết quả đo DLS các mẫu nano tinh dầu bưởi khảo sát tỉ lệ tinh dầu

Bảng 3.5 cho ta thấy sử dụng 1 mL tinh dầu bưởi là thích hợp nhất khi cố định thể tích nước và Tween 80 Tất cả các mẫu đều có độ trong suốt cao và sau 60 ngày vẫn chưa có hiện tượng tách lớp

2.6.1.3 Kết quả khảo sát ảnh hưởng tỉ lệ nước trong hệ nhũ nano tinh dầu bưởi

Bảng 3.5 Kết quả sự ảnh hưởng của hàm lượng nước đến kích thước hạt

STT Kí hiệu mẫu Tween 80

(mL)

Tinh dầu bưởi (mL)

H 2 O (mL)

Kích thước hạt (nm)

Bảng 3.6 cho ta thấy khi cố định tỉ lệ giữa chất nhũ hoá và tinh dầu bưởi (1:1), sử dụng lượng nước 50 mL và 75 ml đã tổng hợp hệ nhũ tương có kích thước hạt nano (mẫu B10, B15) với kích thước hạt là 71,1 và 40 nm

Tuy nhiên ở mẫu B05 và B10 có hương thơm dịu nhẹ của tinh dầu bưởi, còn mẫu B15 thì không có hương thơm đặc trưng của tinh dầu bưởi Mẫu B10 có độ trong suốt cao hơn B05 và B15 Và sau 60 ngày vẫn chưa có hiện tượng tách lớp

Như vậy, lượng nước thích hợp để tổng hợp nano tinh dầu bưởi mà vẫn giữ được độ trong suốt cao cũng như mùi hương tự nhiên của tinh dầu là 50 mL

Từ các kết quả khảo sát trên cho thấy sử dụng Tween 80 làm chất nhũ hoá là thích hợp cho hệ nano nhũ tương tinh dầu, tỉ lệ giữa Tween 80:tinh dầu:nước cất là 1:1:50 (mL:mL:mL) Nano tinh dầu bưởi vẫn giữ được hương thơm tự nhiên của tinh dầu bưởi, hệ nhũ vẫn giữ được độ trong suốt sau một thời gian

Hình 3.8 Kết quả đo DLS các mẫu nano tinh dầu bưởi khảo sát tỉ lệ nước

2.6.2 Nano tinh dầu cam

2.6.2.1Kết quả khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ chất nhũ hoá đến kích thước hạt nano tinh dầu

Span 80 (mL)

Tinh dầu cam (mL)

H 2 O (mL)

Chỉ số HLB

Kích thước hạt (nm)

Hình 3.9 Kết quả đo DLS các mẫu nano tinh dầu cam khảo sát tỉ lệ và chất nhũ hoá

Bảng 3.7 cho thấy phương pháp tổng hợp này cũng đều cho các nano tinh dầu cam có kích thước hạt nano Kích thước các hạt trong hệ nhũ không có sự thay đổi nhiều khi tăng dần chỉ số HLB Kích thước hạt nhỏ nhất là 66,2 nm (mẫu B10) khi trong hệ nhũ chỉ sử dụng chất nhũ hoá là 100% Tween 80

35

Sau 60 ngày, thì mẫu B06, B07 bắt đầu có hiện tượng bị tách lớp, ở phần trên của lọ đựng mẫu ta có thể thấy nó đục hơn so với phần dưới của lọ Các mẫu khác vẫn chưa có hiện tượng tách lớp này

Như vậy, cũng giống như nano tinh dầu bưởi khi chỉ số HLB của chất nhũ là 15 thì nano tinh dầu cam có độ trong suốt cao, kích thước nhỏ và bền hơn so với các chất nhũ hoá

có HLB thấp hơn Kết quả này cho thấy Tween 80 nguyên ch ất là chất nhũ hoá phù hợp cho

việc tổng hợp nano tinh dầu chi Citrus

2.6.2.2 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ tinh dầu cam sử dụng

Bảng 3.7 Kết quả sự ảnh hưởng của tỉ lệ tinh dầu cam đến kích thước hạt

STT Kí hiệu mẫu Tween 80

(mL)

Tinh dầu cam (mL)

H 2 O (mL)

Kích thước hạt (nm)

Citrus

Hình 3.2 Kết quả đo DLS các mẫu nano tinh dầu cam khảo sát tỉ lệ nước

2.6.2.3Kết quả khảo sát ảnh hưởng tỉ lệ nước trong hệ nhũ nano tinh dầu cam

Bảng 3.8 Kết quả sự ảnh hưởng của hàm lượng nước đến kích thước hạt

STT Kí hiệu mẫu Tween 80

(mL)

Tinh dầu cam (mL)

H 2 O (mL)

Kích thước hạt (nm)

dầu, lượng nước sử dung 50 mL là thích hợp nhất để tổng hợp nano tinh dầu chi Citrus

Các mẫu nano tinh dầu cam và bưởi ở điều kiện tối ưu được đem đo thế điện động zeta, kết quả giá trị thế zeta của nano tinh dầu bưởi là - 40,2 mV và nano tinh dầu cam - 34,2 mV Theo tài liệu, giá trị tuyệt đối của thế điện động zeta lớn hơn 30 mV, cho thấy rằng các nano tinh dầu có sự ổn định

2.7 Kết quả kết hợp nano tinh dầu cam và bưởi với nano bạc

2.7.1 Kết quả kết hợp nano tinh dầu bưởi với nano bạc

Hình 3.3 Kết quả đo DLS các mẫu nano tinh dầu bưởi kết hợp với nano bạc

Bảng 3.9 Kết quả DLS của các mẫu nano tinh dầu bưởi kết hợp nano bạc

Mẫu Tween 80

(mL)

Tinh dầu bưởi (mL)

Nano bạc 100 ppm

(mL)

Nước cất (mL)

Kích thước hạt (nm)

2.7.2 Kết quả kết hợp nano tinh dầu cam với nano bạc

Hình 3.13 Kết quả đo DLS các mẫu nano tinh dầu cam kết hợp với nano bạc

Bảng 3.10 Kết quả DLS của các mẫu nano tinh dầu cam kết hợp nano bạc

Mẫu Tween 80

(mL)

Tinh dầu cam (mL)

Dung dịch nano bạc

100 ppm (mL)

Nước cất (mL)

Kích thước hạt (nm)

2.8 Kết quả khảo sát khả năng kháng khuẩn

2.8.1 Khả năng kháng khuẩn của nano tinh dầu cam và nano tinh dầu cam kết hợp với

nano bạc

Mỗi mẫu thử nghiệm được lấy 10 μl nhỏ lên đĩa giấy và đặt lên bề mặt thạch LB đã

dàn đều vi khuẩn Ở thí nghiệm này, sử dụng 5 loại vi khuẩn: Escherichia coli, Bacillus subtilis, Bacillus cereus, Staphylococcus aureus, Salmonella enterica để phân tích khả năng

kháng khuẩn của các mẫu

Các mẫu thử nghiệm được chuẩn bị như bảng 3.12 với P1, P2, P3, P4, P5, P6 là các mẫu nano tinh dầu cam với các hàm lượng tinh dầu cam khác nhau; mẫu D1, D2, D3, D4, D5, D6 là các mẫu nano tinh dầu cam kết hợp với nano bạc; mẫu TDC là mẫu tinh dầu cam nguyên chất, mẫu NB là mẫu nano bạc 50 ppm và (+) là mẫu kháng sinh đối chứng ampicillin (nồng độ 0,1 mg/ml)

Bảng 3.11 Mẫu thử nghiệm kháng khuẩn của nano tinh dầu cam