Nghiên cứu thiết kế mô hình kiểm soát nhiệt độ và ph trong nuôi cấy vi sinh vật ở điều kiện phòng thí nghiệm tại viện khcnql môi trường báo cáo tổng kết đề tài nghiên cứu khoa học cấp trường

Mặt khác, từ nhu cầu nghiên cứu ứng dụng vi sinh vật trong xử lý môi trường của sinh viên ngành Kỹ thuật môi trường, Quản lý tài nguyên môi trường khi thực hiện đồ án tốt nghiệp, đề tài

BỘ CÔNG THƯƠNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC

KẾT QUẢ THỰC HIỆN ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌCCẤP TRƯỜNG

Chủ nhiệm đề tài: ThS Nguyễn Hoàng Mỹ

Đơn vị thực hiện: Viện KHCN&QL Môi trường

Tp Hồ Chí Minh, tháng 4 năm 2022

LỜI CÁM ƠN

Trong công tác giảng dạy môn Vi sinh vật học và Vi sinh môi trường tại Viện Khoa học công nghệ và Quản lý Môi trường, nhóm giảng viên phụ trách nhận thấy cần có một mô hình nuôi cấy vi sinh vật để giảng dạy, nâng cao khả năng thực hành cho sinh viên Mặt khác, từ nhu cầu nghiên cứu ứng dụng vi sinh vật trong xử lý môi trường của sinh viên ngành Kỹ thuật môi trường, Quản lý tài nguyên môi trường khi thực hiện đồ án tốt nghiệp, đề tài khoa học cấp trường “Nghiên cứu thiết kế mô hình kiểm soát nhiệt độ và pH trong nuôi cấy vi sinh vật ở điều kiện phòng thí nghiệm tại Viện KHCN&QL Môi trường” được hình thành nhằm phục vụ cho các mục tiêu trên

Đề tài đã hoàn thành một mô hình nuôi cấy vi sinh vật dung tích 10Lit có thể kiểm soát nhiệt độ, pH và điều kiển qua phần mềm ứng dụng trên điện thoại thông minh Nhóm nghiên cứu chân thành cảm ơn sự hỗ trợ hợp tác từ các phòng ban của Nhà trường trong thời gian thực hiện: sự hỗ trợ kinh phí từ phía Nhà trường, sự hướng dẫn về thủ tục của Phòng Quản lý khoa học và hợp tác quốc tế, sự giúp đỡ của Ban lãnh đạo Viện khoa học công nghệ và sự hợp tác tốt đẹp với Trung tâm nghiên cứu đào tạo thuộc khu Công nghệ cao TpHCM Mô hình sẽ được sử dụng trong giảng dạy và nghiên cứu cho sinh viên Viện KHCN&QL Môi trường tại trường ĐH Công nghiệp TpHCM

PHẦN I THÔNG TIN CHUNG

I Thông tin tổng quát

1.1 Tên đề tài: Nghiên cứu thiết kế mô hình kiểm soát nhiệt độ và pH trong nuôi cấy

vi sinh vật ở điều kiện phòng thí nghiệm tại Viện KHCN&QL Môi trường

1.2 Mã số: 171.4011

1.3 Danh sách chủ trì, thành viên tham gia thực hiện đề tài

TT Họ và tên Đơn vị công tác Vai trò thực hiện đề tài

1 ThS Nguyễn Hoàng Mỹ Viện KHCN&QL Môi Trường Chủ nhiệm đề tài

2 ThS Đỗ Tân Khoa Trung tâm đào tạo thuộc Khu

công nghệ cao Tp.HCM Thành viên chính

3 Hồ Đức Linh Viện KHCN&QL Môi Trường Thành viên

4 Phan Thị Xuân Linh Viện KHCN&QL Môi Trường Thành viên

5 Nguyễn Chí Thành Viện KHCN&QL Môi Trường Thành viên

1.4 Đơn vị chủ trì:

1.5 Thời gian thực hiện:

1.5.1 Theo hợp đồng: từ tháng 04 năm 2017 đến tháng 03 năm 2018

1.5.2 Gia hạn (nếu có): đến tháng 09 năm 2018

1.5.3 Thực hiện thực tế: từ tháng 04 năm 2017 đến tháng 09 năm 2018

1.6 Những thay đổi so với thuyết minh ban đầu (nếu có):

- Tên bài báo đăng ký theo thuyết minh: Tối ưu hóa quy trình nuôi cấy thu nhận sinh khối Bacillus trong hệ thống bioreactor dung tích 5 lít

- Tên bài báo công bố: Thiết kế mô hình kiểm soát nhiệt độ và pH trong nuôi cấy vi sinh vật

ở điều kiện phòng thí nghiệm tại Viện KHCN&QL Môi Trường, ĐH Công nghiệp TpHCM

- Lý do: thay đổi tên bài báo để thể hiện được các nội dung trong nghiên cứu.

1.7 Tổng kinh phí được phê duyệt của đề tài: 55 triệu đồng

II Kết quả nghiên cứu

1 Đặt vấn đề

Bioreactor hay còn gọi là hệ thống lên men về cơ bản như là một nồi phản ứng sinh học trong đó sử dụng một thùng chứa để nuôi giữ các tế bào nhằm khai thác các quá trình sinh hóa, thu nhận sinh khối hoặc các sản phẩm chuyển hóa thứ cấp Hệ thống cung cấp môi trường dinh dưỡng và các điều kiện nuôi cấy có kiểm soát để tế bào phát triển theo đúng mục đích khai thác Bioreactor có thể sử dụng để nuôi cấy các tế bào vi sinh vật, động vật, thực vật … liên tục hoặc theo mẻ, trong điều kiện hiếu khí hoặc kỵ khí Vật liệu thiết kế có thể bằng inox, thép không gỉ, hợp kim kháng khuẩn, thủy tinh chịu lực …Kích thước hệ thống có thể ở quy mô phòng thí nghiệm từ 1 đến 50 lít, quy mô pilot từ 0,3 đến 10m3 hoặc quy mô công nghiệp từ 2 đến 500m3 thường có tỷ lệ chiều cao trên đường kính của thùng lên men hoặc là 2/1 hoặc là 3/1

Hình 1 Cấu tạo của một hệ thống lên men cơ bản

Các điều kiện trong quá trình nuôi cấy có thể được kiểm soát tự động hoặc bán tự động thông qua các bộ điều khiển Trong điều kiện nuôi cấy lỏng, cần kiểm soát việc pha trộn các thành phần trong dung dich và tế bào, nhằm đảm bảo sự chuyển khối của các chất dinh dưỡng đến bề mặt tế bào một cách tốt nhất Cường độ pha trộn tùy thuộc loại cánh khuấy và tốc độ khuấy Tuy nhiên, sử dụng cánh khuấy có thể tác động đến cấu trúc làm phá vỡ tế bào Ở trường hợp hệ lên men hiếu khí, một bộ phun lỗ đơn hoặc một bộ phun vòng thường được sử dụng để sục khí cho hệ lên men Với thể tích nhỏ, việc sục khí có thể thay thế cho cánh khuấy để phối trộn tế bào và môi trường dinh dưỡng Độ pH trong hệ lên men có thể

được duy trì bằng cách dùng dung dịch đệm hoặc bộ điều chỉnh pH Đầu dò pH có thể gắn trong hệ thống hoặc rời bên ngoài Nhiệt độ được điều chỉnh bằng hệ thống gia nhiệt đặt dưới đáy hoặc gia nhiệt qua thành Phương pháp gia nhiệt qua thành kết hợp với dòng dung dịch bên trong giúp quá trình kiểm soát nhiệt độ nhanh và chính xác hơn, đồng thời ít ảnh hưởng đến các tế bào tiếp xúc gần với vị trí gia nhiệt

Trong điều kiện nuôi cấy theo mẻ, tế bào vi sinh vật phát triển theo các giai đoạn tiền phát, logarit, cân bằng và suy vong Trong điều kiện nuôi cấy liên tục, tế bào vi sinh vật được cung cấp dinh dưỡng sẽ tiếp tục duy trì ở pha cân bằng Pha logarit là giai đoạn tế bào phân chia làm gia tăng sinh khối nhanh nhất, đồng thời cũng là pha tiêu tốn nhiều dinh dưỡng của môi trường nuôi cấy Pha cân bằng thường gia tăng các sản phẩm phụ thứ cấp, các chất trao đổi giữa tế bào và môi trường làm ảnh hưởng nhiều đến thành phần môi trường Cuối pha logarit, đầu pha cân bằng thường là giai đoạn tốt nhất cho việc thu nhận sinh khối tế bào Pha cân bằng là giai đoạn tốt nhất cho việc thu nhận sản phẩm chuyển hóa thứ cấp Tùy vào mục đích nuôi cấy để lựa chọn hình thức và thời điểm thích hợp để hiệu suất nuôi cấy tối đa

Trong các công trình xử lý nước thải, việc sử dụng sinh khối vi sinh vật cho giai đoạn khởi động hoặc bổ sung sau tái tuần hoàn bùn là một vấn đề bắt buộc Sinh khối này có thể ở dạng đông khô hoặc dạng nước, được thu nhận sau quá trình nuôi cấy trong các bioreactor công nghiệp Các chủng vi sinh vật này phải được nghiên cứu khả năng thích nghi với nguồn dinh dưỡng và các điều kiện lý hóa đặc trưng của từng loại nước thải, từ đó đánh giá khả năng làm giảm chất hữu cơ như nitơ, carbon, phospho … Sau đó, các chủng vi sinh vật được tuyển chọn phải qua giai đoạn thử nghiệm pilot trong phòng thí nghiệm trên các mô hình xử lý nước thải mô phỏng các hệ thống thực tế Tại Viện Khoa học công nghệ và quản

lý môi trường, các mô hình được thiết kế có khả năng xử lý từ 50 – 100 lít nước thải, tùy theo công nghệ và phương pháp sử dụng Tương ứng với thể tích nước thải trên, nếu vi sinh vật có mật độ 106 – 109 tế bào/ml thì cần sử dụng từ 2 đến 10 lít sản phẩm dung dịch sau nuôi cấy Thể tích cụ thể phải được tính toán dựa trên hàm lượng chất rắn lơ lửng trong hỗn hợp dễ bay hơi (MLVSS - đại diện cho mật độ vi sinh vật có trong bùn hoạt tính), tỷ số F/M (thức ăn/vi sinh vật) và mức độ ô nhiễm của nước thải Thông thường, các chủng vi sinh vật tiềm năng sẽ được nuôi cấy trong các bình tam giác trên máy lắc Lắc nhẹ bình tam giác rất hiệu quả để tạo ra dịch huyền phù tế bào, tăng cường sự oxy hóa thông qua bề mặt chất lỏng

và trợ giúp sự chuyển khối của các chất dinh dưỡng mà không gây nguy hiểm cho cấu trúc

tế bào Tuy nhiên phương pháp này có hiệu quả không cao và khó kiểm soát các điều kiện nuôi cấy Mặc khác, dung tích bình tam giác không đủ cho việc thu nhận một thể tích sản phẩm cho các mô hình thực nghiệm xử lý nước thải Vì vậy, cần thiết phải có một hệ thống

mô phỏng bioreactor trong công nghiệp, nhưng với thể tích phù hợp, vận hành đơn giản để phục vụ giảng dạy và các nghiên cứu ứng dụng của sinh viên và giảng viên

2 Mục tiêu

- Thiết kế mô hình nuôi cấy thu nhận sinh khối vi sinh vật trong điều kiện vô trùng, kiểm soát được về nhiệt độ và pH

- Viết phần mềm giám sát nhiệt độ, pH cho quá trình nuôi cấy

3 Phương pháp nghiên cứu

3.1 Phương pháp nghiên cứu thiết kế

- Sử dụng phần mềm Autocad 2D và solidwork để thiết kế và vẽ mô hình với các yêu cầu: (1) thể tích từ 2 đến 10 lít, (2) gia nhiệt trong khoảng 30 đến 80OC, (3) điều chỉnh pH trong khoảng 1 đến14, (4) có khả năng sục khí, tiệt trùng, (5) có thể bổ sung dung dịch dinh dưỡng hoặc thu nhận sản phẩm theo từng mẻ, (6) dễ vận hành và kiểm soát trong quá trình giảng dạy, thực hiện nghiên cứu

- Từ bản vẽ, tiến hành gia công trên vật liệu inox 304 Đây là chất liệu inox chống ăn mòn cao, chịu nhiệt tốt, dễ tạo hình, gia công được bằng tất cả phương pháp hản, không có

từ tính, có khả năng đàn hồi cao, giá thành hợp lý cho việc gia công thiết kế Mặc khác, sử dụng hệ thống bằng vật liệu inox trong quá trình giảng dạy, nghiên cứu sẽ đảm bảo về mặt

an toàn cho sinh viên so với chất liệu thủy tinh

- Nâng cao khả năng giám sát hệ thống bằng phần mềm kết nối với điện thoại thông minh qua Bluetooth: dễ dàng cài đặt và sử dụng trên các điện thoại Android, có thể hiển thị

số liệu và điều khiển trực tiếp từ điện thoại

3.2 Phương pháp đánh giá vận hành hệ thống

3.2.1 Thí nghiệm vận hành đánh giá khả năng ổn định nhiệt độ, pH và thời gian nuôi cấy theo mẻ

- Sau khi tiệt trùng hệ thống bằng đèn UV trong 30 phút, tiến hành các thí nghiệm:

- Thí nghiệm 1: Sử dụng giống vi khuẩn Bacillus cho vào hệ thống cùng môi trường cao thịt peptone đã tiệt trùng và điều chỉnh ở pH7 Gia nhiệt ở 3 khoảng nhiệt độ là 30OC,

40OC, 50OC Mỗi khoảng nhiệt độ cài đặt trong 24 giờ Đánh giá hiệu quả nuôi cấy thông qua mật độ vi khuẩn

- Thí nghiệm 2: Sử dụng giống vi khuẩn Bacillus cho vào hệ thống cùng môi trường cao thịt peptone đã tiệt trùng Cài đặt nhiệt độ ở 30OC Điều chỉnh pH với các giá trị pH 5,

6, 7, 8 Mỗi khoảng pH ổn định trong 24h Đánh giá hiệu quả nuôi cấy thông qua mật độ vi khuẩn

- Thí nghiệm 3: Sử dụng giống vi khuẩn Bacillus cho vào hệ thống cùng môi trường cao thịt peptone đã tiệt trùng Cài đặt nhiệt độ 30OC, pH 7, đánh giá hiệu quả nuôi cấy thông qua mật độ vi khuẩn vào thời điểm từ 6 giờ đến 48 giờ

Trong đó, Thí nghiệm 1 đánh giá khả năng ổn định nhiệt độ của bộ gia nhiệt Thí nghiệm 2 đánh giá khả năng ổn định pH của đầu dò Thí nghiệm 3 đánh giá sự ổn định của hệ thống sau khoảng thời gian dài nuôi cấy Mỗi thí nghiệm lặp lại 3 lần và tiến hành ở hai mức thể tích 3 lít và 8 lít nhằm đánh giá khả năng ổn định của hệ thống ở tất cả các vị trí bên trong lòng ngăn chứa dịch nuôi cấy Đồng thời kiểm tra khả năng pha trộn dung dịch của hệ thống sục khí ở các mức thể tích thấp và cao

3.2.2 Thí nghiệm vận hành đánh giá khả năng ổn định của hệ thống khi nuôi cấy liên tục Sau khi tiệt trùng hệ thống bằng đèn UV trong 30 phút, sử dụng giống vi khuẩn Bacillus cho vào hệ thống cùng 5 lít môi trường cao thịt peptone đã tiệt trùng Cài đặt nhiệt độ 30OC, pH

7 Sau mỗi 5 giờ, mở van xả thu nhận 1 lít sản phẩm sau nuôi cấy và đồng thời mở van nạp

để bổ sung vào 1 lít môi trường mới Tiến hành 4 lần Đánh giá hiệu quả thông qua mật độ

vi khuẩn thu nhận được trong sản phẩm

4 Tổng kết về kết quả nghiên cứu

4.1 Kết quả thiết kế hệ thống bioreactor

Theo các tính toán trên phần mềm thiết kế, để đạt được thể tích mong muốn từ 2 đến 10 lít

và tỷ lệ chiều cao trên đường kính của thùng lên men hợp lý, hệ thống bioreactor lựa chọn thông số chiều dài 530cm, chiều rộng 280cm, chiều cao 700cm bao gồm 2 ngăn nối liền với nhau Ngăn 1 là tủ điện, nơi lưu thông khí để tản nhiệt vào xung quanh thành của ngăn 2 Phía trên là hệ thống điều khiển có màn hình thể hiện ngày giờ, nhiệt độ, pH, công tắc đèn

UV, van điều chỉnh lưu lượng khí Bộ phận gia nhiệt được đặt bên dưới cùng quạt làm mát

Ngăn 2 là nơi chứa dịch nuôi cấy, có ống dẫn khí, van xả bên dưới; van bổ sung dinh dưỡng bên hông (hình 2)

Hình 2 Bản vẽ hệ thống bioreactor Đối tượng sử dụng chính của hệ thống bioreactor là các chủng vi khuẩn hiếu khí Để đảm bảo quá trình nuôi cấy thu nhận được đúng chủng vi khuẩn mục tiêu, hệ thống đèn UV được

bố trí ở nắp đậy của ngăn 2, công tắc ở bộ điều khiển của ngăn 1

Lựa chọn phương pháp gia nhiệt qua thành để giảm thiểu sự ảnh hưởng đến tế bào, nên bộ phận gia nhiệt được đặt bên dưới ngăn 1, cùng với hệ thống quạt làm mát, lưu thông không khí để tản nhiệt vào ngăn 2 Cảm biến nhiệt PT100 (dòng sản phẩm TF101U2) sử dụng trong hệ thống là một đầu dò chuyển đổi nhiệt độ tại khu vực đo được thành tín hiệu điện ở đầu ra Đầu dò nhiệt độ có điện trở làm bằng bạch kim (platinum) có độ chính xác cao, chịu được áp lực, chống rung, thích hợp sử dụng trong các dung dịch lỏng có khuấy trộn Bao bọc bên ngoài là vỏ thép không rỉ V4A cùng lớp bảo vệ IP66 Đối với pH, hệ thống dùng đầu dò của hãng Atlas Scientific biên độ đo 0-14 đặt dưới đáy của ngăn 2 Đầu dò được bọc một lớp màng mỏng bằng thủy tinh cho phép ghi nhận sự khác biệt nồng độ ion H+ bên trong và ngoài màng Từ sự khác biệt đó, đầu dò xác định giá trị pH tương quan (Hình 3)

Hình 3 Cảm biến nhiệt độ và đầu dò pH sử dụng trong hệ thống

Với thể tích nhỏ nên hệ thống không sử dụng cánh khuấy mà tận dụng quá trình sục khí để tạo dòng pha trộn dung dịch với tế bào nuôi cấy Ống sục khí được đặt dưới đáy ngăn 2 có van điều chỉnh tốc độ sục khí Ngoài ra, còn có van nạp để bổ sung nguyên liệu, dung dịch dinh dưỡng từ phía hông và van xả để lấy bớt sản phẩm sau nuôi cấy được đặt phía dưới ngăn 2 Cả hai van này thông trực tiếp vào dung dịch nuôi cấy bên trong ngăn 2, phục vụ cho quá trình nuôi cấy theo mẻ mà không cần mở nắp ngăn

Sau khi so sánh giữa 3 loại vật liệu là thủy tinh, inox 304 và inox 316, nghiên cứu lựa chọn inox 304 cho thiết kế Inox 304 hay còn gọi là thép không gỉ có thành phần chủ yếu là Crom (Cr), Niken (Ni), có độ cứng, độ bền cao, bề mặt sáng bóng, không gỉ sét, có khả năng chống ăn mòn và chiu nhiệt tốt Ngoài ra, giá thành phù hợp và dễ thiết kế các hệ thống van, ống dẫn dọc theo thành ống Quá trình được thực hiện tại Trung tâm đào tạo công nghệ cao Thành phố Hồ Chí Minh Sau đó, hệ thống bioreactor được vận chuyển về phòng thí nghiệm sinh học môi trường, Viện KHCN&QL Môi trường cho các thử nghiệm đánh giá tiếp theo (Hình 4)

Hình 4 Hệ thống bioreactor được thiết kế với vật liệu inxo 304

Để tăng thêm hiệu quả và thuận tiện trong quá trình sử dụng, phần mềm Bioreactor HC-06 dùng điều khiển hệ thống thông qua kết nối bluetooth với điện thoại thông minh Phần mềm

có cài đặt chế độ tự động (AUTO) cho hệ thống hoặc chế độ điều khiển bằng tay (MANUAL) Chế độ tự động cho phép cài đặt nhiệt độ và thời gian Chế độ điều khiển bằng tay cho phép cài đặt và điều chỉnh thêm chức năng sục khí, quạt và đèn UV (Hình 5)

Hình 5 Màn hình ứng dụng Bioreactor HC-06

Ưu điểm của phần mềm Bioreactor HC-06 là dễ dàng cài đặt trên tất cả điện thoại thông minh android, thao tác dễ sử dụng Nhược điểm là chỉ có thể kết nối với hệ thống bioreactor thông qua Bluetooth Điều này làm giới hạn khoảng cách kiểm soát cho người dùng

Các bước vận hành như sau:

Bước 1: Bật đèn UV trong 30 phút để khử trùng hệ thống

Bước 2: Cho môi trường dinh dưỡng và giống vi sinh vật

Bước 3: Bật Bluetooth trên điện thoại  Chọn thiết

bị kết nối “choose a devide”  chọn CONNECT 06)

(HC-Bước 4: Chọn chế độ AUTO hoặc MANUAL Bước 5: Cài nhiệt độ muốn nuôi cấy – set temperature Bước 6: Cài thời gian nuôi cấy – Alam Time (phút) Bước 7: Chạy mô hình – RUN

Hình 6 Màn hình trên bộ điều khiển hệ thống khi được cài đặt

4.2 Kết quả đánh giá vận hành hệ thống

4.2.1 Kết quả thí nghiệm vận hành đánh giá khả năng ổn định nhiệt độ, pH và thời gian nuôi cấy theo mẻ

Mỗi tế bào vi sinh vật có một khoảng nhiệt độ và pH tối thích cho sự phát triển, vì vậy, đây

là hai thông số cần ổn định chính xác trong suốt thời gian nuôi cấy [7] Đối với nuôi cấy vi khuẩn, thông thường nhiệt độ tối ưu từ 25 – 35OC Một số nhóm ưa nhiệt có thể cần ở nhiệt

độ cao hơn từ 50 – 80OC [5] Hệ thống được thiết kế theo phương pháp gia nhiệt qua thành nên thời gian để nhiệt độ phân tán đều cho toàn bộ dung dịch trong môi trường tương đối chậm Tuy nhiên, điều này làm giảm sự tác động đột ngột của nhiệt độ đến tế bào và giúp cho sự phân tác nhiệt trong dung dịch đều đặn ổn định hơn [6]

Trong quá trình nuôi cấy, giá trị pH được theo dõi liên tục để giữ môi trường trong phạm vi tối ưu cho vi sinh vật phát triển Thông thường, pH tối ưu cho các vi khuẩn hiếu khí là 6-7, tuy nhiên, giá trị pH thường giảm trong quá trình vi sinh vật phát triển Khi đó, dung dịch NaOH được sử dụng để cân bằng lại pH được thiết lập ban đầu [7]

Ở thí nghiệm 1, sinh khối thu nhận được ở nhiệt độ 30OC là cao nhất, trung bình là 3,11x108

tế bào/ml ở thể tích nuôi cấy 3 lít và 3,45x108 tế bào/ml ở thể tích nuôi cấy 8 lít Ở nhiệt độ

50OC, sinh khối giảm đáng kể, còn 1,19 đến 1,22x108 tế bào/ml ở cả 2 mức thể tích Ở thí nghiệm 2, sinh khối cao nhất thu nhận được ở pH 7 là 8,43 và 8,47x109 tế bào/ml ở mức thể tích tương ứng 3 lít và 8 lít pH 5 có lượng sinh khối thấp nhất, dưới 1x109 tế bào/ml Ở cả hai thí nghiệm, các kết quả thu được không có sự khác biệt đáng kể ở hai mức thể tích 3 lít

và 8 lít (Hình 7) Tuy nhiên, trong quá trình vận hành, nhận thấy ở mức thể tích 3 lít, thời gian gia nhiệt của hệ thống đến nhiệt độ cài đặt từ 10 đến 15 phút Ở mức thể tích 8 lít, thời gian gia nhiệt từ 30 đến 40 phút Các mẫu dịch sau nuối cấy ở nhiệt 50OC và pH 5, khi quan sát dưới kính hiển vi quang học có sự xuất hiện của tế bào mang bào tử Bacillus Nhiều nghiên cứu về sinh trưởng phát triển của Bacillus đều cho thấy trong điều kiện nuôi cấy lỏng, vi khuẩn Bacillus tăng trưởng tối ưu ở nhiệt độ 37OC, pH 7, tốc độ phân chia tối đa của Bacillus sau 40-50 phút Ở nhiệt độ cao, giá trị pH bất lợi, hoặc điều kiện dinh dưỡng thấp, Bacillus có khả năng tạo bào tử nên vẫn tồn tại trong dịch nuôi cấy nhưng không có sự gia tăng sinh khối [1,4,15]

Hình 7 Kết quả Kết quả vận hành đánh giá khả năng ổn định nhiệt độ và pH

Hình 8 Kết quả vận hành đánh giá khả năng ổn định thời gian nuôi cấy theo mẻ

Trong thời gian 96 giờ được cài đặt ở nhiệt độ 30OC, pH 7, bộ gia nhiệt hoạt động khá ổn định, biên độ dao động trong khoảng 1OC Riêng giá trị pH có nhiều biến động, thời điểm

24 giờ, pH tăng đến 7,4, sau thời điểm 48 giờ, pH giảm còn 6,5 Điều này có thể do sự thay đổi về các sản phẩm chuyển hóa mà tế bào trao đổi với môi trường nuôi cấy

4.2.2 Kết quả vận hành đánh giá khả năng ổn định của hệ thống khi nuôi cấy liên tục

Đối với tất cả các quá trình lên men, yêu cầu quan trọng nhất là phải đảm bảo sao cho mỗi

tế bào tham gia đều được đặt trong điều kiện lý hóa giống nhau Các thông số nhiệt độ, pH, hàm lượng O2, CO2 hòa tan… thường được kiểm soát một cách trực tiếp thông qua các sensor đặt trong nồi lên men Các thông số về hàm lượng enzyme, sinh khối, protein … được kiểm soát giám tiếp bằng cách lấy mẫu và đem phân tích [8,9,13]

Trong quá trình nuôi cấy liên tục, tế bào không có pha suy vong mà được duy trì ở pha cân bằng Để quá trình thu nhận sản phầm sinh khối không làm thay đổi đột ngột trạng thái của

tế bào cần đảm bảo quá trình nạp môi trường dinh dưỡng mới vào và quá trình rút dịch sản phẩm ra phải tương đương nhau về thể tích [11,14] Trong thiết kế của hệ thống bioreactor, van nạp đặt ở bên hông, phía trên còn van xả đặt ở bên dưới của ngăn 2 Quá trình bổ sung được tiến hành ngay sau quá trình rút chiết Trong quá trình thực hiện, nhận thấy có sự dao động về nhiệt độ và pH khi bổ sung môi trường dinh dưỡng mới Nhiệt độ giảm 2-5OCvà pH tăng 0,3-0,5 Bảng điều khiển hiển thị giá trị có sự thay đổi và phần mềm bioreactor_HC06 trên điện thoại cũng báo rung Hệ thống mất khoảng 3-5 phút cho việc điều chỉnh nhiệt độ

và pH quay lại giá trị cài đặt ban đầu Kết quả mật độ sinh khối ở lần bồ sung dinh dưỡng thứ 3 vào thời điểm 10 giờ là cao nhất (3,21x108 tế bào/ml), thấp nhất là vào thời điểm 0 giờ (2,11x108 tế bào/ml) Quan sát dưới kính hiển vi, các sản phẩm thu nhận được sau các thời điểm đều không có sự xuất hiện bào tử vi khuẩn Bacillus Điều này chứng tỏ các tế bào đang ở giai đoạn tốt nhất cho quá trình trao đổi chất [2,15]

5 Đánh giá các kết quả đã đạt được và kết luận

Nhiệt độ và pH là hai thông số quan trọng trước nhất để kiểm soát quá trình nuôi cấy tế bào

vi sinh vật Trong giới hạn nhiệt độ từ 30-50OC, giới hạn pH từ 5 đến 8, hệ thống bioreactor cho thấy khả năng duy trì ổn định các thông số cài đặt trong suốt 96 giờ nuôi cấy Với đối tượng thử nghiệm là Bacillus, đại diện cho nhóm các vi khuẩn hiếu khí sử dụng trong xử lý nước thải, quá trình nuôi cấy liên tục hoặc theo mẻ trong hệ thống đều cho kết quả tốt, sinh khối thu được luôn ở mức 108 tế bào/ml Tốc độ gia nhiệt và điều chỉnh pH dao động từ 15 đến 40 phút tùy vào thể tích dung dịch nuôi cấy, nhưng khả năng tự ổn định về thông số cài đặt chỉ khoảng 3 đến 5 phút Mặc khác, việc sử dụng phương pháp gia nhiệt qua thành cho thấy hiệu quả tốt trong việc giảm các tế bào chết do tiếp xúc gần với vị trí gia nhiệt Bên cạnh màn hình hiển thị các thông số, phần mềm Bioreactor HC06 dễ dàng cài đặt và sử dụng trên điện thoại cũng hỗ trợ cho quá trình vận hành kiểm soát hệ thống được tốt hơn Với các thiết kế đơn giản bước đầu, hệ thống bioreactor cho thấy tiềm năng sử dụng trên đối tượng vi khuẩn hiếu khí với thể tích phù hợp cho các nghiên cứu ứng dụng quy mô pilot tại Viện Khoa học công nghệ và Quản lý môi trường, Đại học Công nghiệp TpHCM Ngoài nhiệt độ và pH, hệ thống có thể cải tiến bổ sung đầu dò xác định thông số các khí hòa tan hoặc kiểm soát lưu lượng khí nạp vào một cách chính xác hơn, giúp cho quá trình nuôi cấy đạt hiệu suất cao hơn nữa

6 Tóm tắt kết quả (tiếng Việt và tiếng Anh)

Bioreactor là hệ thống nuôi cấy nhằm thu nhận sinh khối hoặc sản phẩm vi sinh vật Trong lĩnh vực môi trường, sinh khối được bổ sung vào các hệ thống xử lý giúp gia tăng quần thể vi sinh vật có lợi trong nước thải Hệ thống được thiết kế trên vật liệu inox 304 có dung tích nuôi cấy từ 2 đến 10 lít phù hợp cho các nghiên cứu ứng dụng quy mô pilot Hệ thống sử dụng phương pháp gia nhiệt qua thành với cảm biến nhiệt PT100, điều chỉnh nhiệt độ trong khoảng 30-80OC; đầu dò pH của hãng Atlas Scientific biên độ đo 0-14; có đèn UV để tiệt trùng, màn hình hiển thị các thông số cài đặt, van điều khiển lưu lượng khí; có thể nuôi cấy theo

mẻ hoặc nuôi cấy liên tục nhờ van nạp và van xả Hệ thống có thể điều khiển bằng tay hoặc bằng phần mềm Bioreactor HC06 cài đặt trên điện thoại thông minh kết nối qua Bluetooth Bioreactor is a culture equipment for capturing biomass or microbial products In the field

of environment, biomass is added to treatment systems to increase the beneficial microbial population in wastewater The bioreactor is designed on 304 stainless steel with culture

capacity from 2 to 10 liters suitable for pilot scale applications The system uses the method

of heating through the wall with PT100 temperature sensor, adjusting the temperature in the range of 30-80OC; the Atlas Scientific pH probe measuring range 0-14; with the UV light for sterilization, the screen to display of setting parameters, the air-flow-control valve The system can be used for for batch culture or continuous culture through intake and exhaust valves The system can be controlled manually or by software Bioreactor HC06 installed on

a smartphone connected via Bluetooth

III Sản phẩm đề tài, công bố và kết quả đào tạo

3.1 Kết quả nghiên cứu (sản phẩm dạng 1,2,3)

Hệ thống nuôi cấy vi sinh

vật có kiểm soát nhiệt độ

và pH quy mô 5 lít

Hệ thống nuôi cấy vi sinh thể tích 5 lít có thể:

- Điều khiển, giám sát nhiệt độ trong bình: 10-

80OC sai lệch ±1O

- Điều khiển, giám sát

từ pH 114 sai lệch

Độ nhạy: ±0,01pH Độ trôi: 0,03pH / 24h

Hệ thống nuôi cấy vi sinh thể tích 5 lít có thể:

- Điều khiển, giám sát nhiệt độ trong bình: 10-

80OC sai lệch ±1O

- Điều khiển, giám sát từ

pH 1-14 sai lệch - Độ nhạy: ±0,01pH Độ trôi: 0,03pH / 24h

2

Phần mềm kiểm soát thông

số sử dụng trên điện thoại

thông minh

Phần mềm ứng dụng cài đặt được trên điện thoại thông minh, điều khiển và nhận các thông số từ thiết bị lên men

Phần mềm ứng dụng cài đặt được trên điện thoại thông minh, điều khiển

và nhận các thông số từ thiết bị lên men

3 Bài báo Tạp chí ĐH Công

nghiệp TpHCM

“Thiết kế mô hình kiểm soát nhiệt độ và pH trong nuôi cấy vi sinh vật ở điều kiện phòng thí nghiệm tại Viện

KHCN&QL Môi Trường, ĐH Công nghiệp TpHCM” - Tạp chí ĐH Công nghiệp TpHCM 3.2 Kết quả đào tạo

TT Họ và tên Thời gian

thực hiện đề tài Tên đề tài Đã bảo vệ Sinh viên đại học

1 Hồ Đức Linh

1/12/2017 đến 30/6/2018

Nghiên cứu thiết kế mô hình kiểm soát nhiệt độ và pH trong nuôi cấy vi sinh vật ở điều kiện phòng thí nghiệm tại Viện KHCN&QL Môi Trường

Kinh phí thực hiện (triệu đồng)

Ghi chú

A Chi phí trực tiếp

2 Nguyên, nhiên vật liệu, cây con 31 31

B Chi phí gián tiếp

3 sinh viên đại học ngành Kỹ thuật môi trường tốt nghiệp tháng 6 năm 2018 với đề tài: Nghiên cứu thiết kế mô hình kiểm soát nhiệt độ và pH trong nuôi cấy vi sinh vật ở điều kiện phòng thí nghiệm tại Viện KHCN&QL Môi Trường

Tp HCM, ngày tháng năm Chủ nhiệm đề tài Phòng QLKH&HTQT (ĐƠN VỊ)

Trưởng (đơn vị) (Họ tên, chữ ký)

PHẦN II BÁO CÁO CHI TIẾT ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC

MỤC LỤC NỘI DUNG

DANH SÁCH BẢNG 18

DANH SÁCH HÌNH 18

Chương 1 TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU 19

Chương 2 CƠ SỞ LÝ LUẬN 21

2.1 Tổng quan về bioreactor 21

2.1.1 Khái niệm bioreactor 21

2.1.2 Các hệ thống bioreactor cơ bản 22

2.1.3 Thuận lợi và khó khăn trong mô hình nuôi cấy Bioreactor 25

2.1.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy trong Bioreactor 25

2.2 Tổng quan về nuôi cấy vi sinh vật 26

2.2.1 Khái niệm 26

2.2.2 Quá trình tăng trưởng của quần thể vi sinh vật trong quá trình nuôi cấy 27

2.3 Ứng dụng vi sinh vật trong lĩnh vực môi trường 31

2.3.1 Vi sinh vật trong xử lý rác thải 31

2.3.2 Vi sinh vật trong xử lý nước thải 33

Chương 3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 35

3.1 Thời gian và địa điểm 35

3.2 Vật liệu và phương pháp thiết kế hệ thống bioreactor 35

3.3 Phương pháp đánh giá vận hành hệ thống 36

3.3.1 Môi trường và hóa chất 36

3.3.2 Phương pháp xác định mật độ tế bào 36

3.3.3 Thí nghiệm vận hành đánh giá khả năng ổn định nhiệt độ, pH và thời gian nuôi cấy theo mẻ 38

3.3.4 Thí nghiệm vận hành đánh giá khả năng ổn định của hệ thống khi nuôi cấy liên tục 38

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 39

4.1 Kết quả thiết kế hệ thống bioreactor 39

4.2 Kết quả đánh giá vận hành hệ thống 43

4.2.1 Kết quả chuẩn bị giống 43

4.2.2 Kết quả thí nghiệm vận hành đánh giá khả năng ổn định nhiệt độ, pH và thời gian

nuôi cấy theo mẻ 44

4.2.3 Kết quả vận hành đánh giá khả năng ổn định của hệ thống khi nuôi cấy liên tục48 Chương 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 49

TÀI LIỆU THAM KHẢO 51

DANH SÁCH BẢNG Bảng 2.1 Thời gian thể hệ của một số vi sinh vật 31

Bảng 4.1 Kết quả vận hành đánh giá khả năng ổn định nhiệt độ 45

Bảng 4.2 Kết quả vận hành đánh giá khả năng ổn định pH 46

Bảng 4.3 Kết quả vận hành đánh giá khả năng ổn định thời gian nuôi cấy theo mẻ 47

DANH SÁCH HÌNH Hình 1.1 Một số hệ thống bioreactor trên thị trường 20

Hình 2.1 Cấu tạo cơ bản của một hệ thống bioreactor 22

Hình 2.2 Các dạng bioreactor thường gặp 24

Hình 2.3 Quy trình xản suất chể phẩm sinh học từ thiết bị lên men bioreactor 27

Hình 2.4 Các giai đoạn phát triển của vi sinh vật trong hệ thống nuôi cấy theo mẻ 28

Hình 3.1 Buồng đếm Neubauer 37

Hình 4.1Bản vẽ hệ thống bioreactor 39

Hình 4.2 Cảm biến nhiệt độ và đầu dò pH sử dụng trong hệ thống 40

Hình 4.3 Bioreactor bằng thủy tinh và inox 41

Hình 4.4 Hệ thống bioreactor thiết kế với vật liệu inox 304 41

Hình 4.5 Màn hình ứng dụng Bioreactor HC-06 42

Hình 4.6 Màn hình trên bộ điều khiển hệ thống khi được cài đặt 42

Hình 4.7 Giống Bacillus trên môi trường cao thịt peptone 43

Hình 4.8 Kết quả vận hành đánh giá khả năng ổn định nhiệt độ 45

Hình 4.9 Kết quả vận hành đánh giá khả năng ổn định pH 46

Hình 4.10 Kết quả vận hành đánh giá khả năng ổn định thời gian nuôi cấy theo mẻ 47

Hình 4.11 Sinh khối thu được sau 4 lần bổ sung môi trường dinh dưỡng 48

Chương 1 TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU

Trong các công trình xử lý nước thải, việc sử dụng sinh khối vi sinh vật cho giai đoạn khởi động hoặc bổ sung sau tái tuần hoàn bùn là một vấn đề bắt buộc Sinh khối này có thể ở dạng đông khô hoặc dạng nước, được thu nhận sau quá trình nuôi cấy trong các bioreactor công nghiệp [6] Các chủng vi sinh vật này phải được nghiên cứu khả năng thích nghi với nguồn dinh dưỡng và các điều kiện lý hóa đặc trưng của từng loại nước thải, từ đó đánh giá khả năng làm giảm chất hữu cơ như nitơ, carbon, phospho … Sau đó, các chủng vi sinh vật được tuyển chọn phải qua giai đoạn thử nghiệm pilot trong phòng thí nghiệm trên các mô hình xử lý nước thải mô phỏng các hệ thống thực tế [8] Tại Viện Khoa học công nghệ và quản lý môi trường, các mô hình được thiết kế có khả năng xử lý từ 50 – 100 lít nước thải, tùy theo công nghệ và phương pháp sử dụng Tương ứng với thể tích nước thải trên, nếu vi sinh vật có mật độ 106 – 109 tế bào/ml thì cần sử dụng từ 2 đến 10 lít sản phẩm dung dịch sau nuôi cấy Thể tích cụ thể phải được tính toán dựa trên hàm lượng chất rắn lơ lửng trong hỗn hợp dễ bay hơi (MLVSS - đại diện cho mật độ vi sinh vật có trong bùn hoạt tính), tỷ số F/M (thức ăn/vi sinh vật) và mức độ ô nhiễm của nước thải Thông thường, các chủng vi sinh vật tiềm năng sẽ được nuôi cấy trong các bình tam giác trên máy lắc Lắc nhẹ bình tam giác rất hiệu quả để tạo ra dịch huyền phù tế bào, tăng cường sự oxy hóa thông qua bề mặt chất lỏng và trợ giúp sự chuyển khối của các chất dinh dưỡng mà không gây nguy hiểm cho cấu trúc tế bào Tuy nhiên phương pháp này có hiệu quả không cao và khó kiểm soát các điều kiện nuôi cấy Mặc khác, dung tích bình tam giác không đủ cho việc thu nhận một thể tích sản phẩm cho các mô hình thực nghiệm xử lý nước thải [9]

Với từ khóa “bioreactor” trên internet sẽ dễ dàng tìm được các công ty sản xuất và bán sản phẩm này như Shanghai Bailun Biotechnology, Weihai Borui Chemical Machinery, Wenzhou Kosun Fluid Equipment, Shanghai Taoyu Biochemical … Tại Việt Nam, các công ty thường nhập khẩu về phân phối lại chứ không sản xuất Các hệ thống này rất đa dạng về mẫu mã, vật liệu thiết kế bằng inox, thép không gỉ, hợp kim kháng khuẩn, thủy tinh chịu lực … các thông số về tốc độ khuấy dao động từ 40 – 800 rpm, pH 2-12, có khả năng chống tạo bọt, gia nhiệt thủ công hoặc tự động, làm mát bằng hệ thống bơm tuần hoàn hoặc thông gió… [14] Tuy nhiên, dung tích tối thiểu cho đặt hàng là 30 lít, trong công nghiệp có thể lên đến 30000 lít, giá thành cũng dao động từ 10.000 đến 200.000 USD (Hình 1.1) Với thể tích này sẽ bất lợi cho sinh viên, học viên khi nghiên cứu, vì khi thử nghiệm quy mô pilot không cần một thể tích quá lớn dịch vi sinh vật sau nuôi cấy Thể tích lớn sẽ tiêu tốn

nguồn dinh dưỡng, các yếu tố kiểm soát, đồng thời cũng không có khả năng thực hiện khi giảng viên dạy môn thực hành [7]

Hình 1.1 Một số hệ thống bioreactor trên thị trường

Có rất nhiều đề tài nghiên cứu dành cho sinh viên hệ đại học, học viên cao học liên quan đến lĩnh vực này được thực hiện tại Viện môi trường Hệ đại học khóa 7 có 5 đề tài khóa luận, hệ đại học khóa 8 có 6 đề tài khóa luận, bên cạnh đó là các đề tài đồ án, bài tập lớn … liên quan đến vi sinh vật trong môi trường cũng thường xuyên được giảng viên hướng dẫn cho sinh viên thực hiện Ví dụ như các đề tài của ĐHMT khóa 7 như “Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường và nhiệt độ đến mật độ các vi khuẩn gây bệnh trong quá trình ủ hiếu khí rác thải sinh hoạt” – sinh viên Võ Thị Mỹ Linh; đề tài “Nghiên cứu tuyển chọn các chủng nấm có khả năng phân giải cellulose ứng dụng xử lý chất thải rắn bằng phương pháp sinh học” - sinh viên Cù Thị Li Na; đề tài của ĐHMT8 như “Phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn có hoạt tính protease mạnh ứng dụng trong xử lý nước thải thủy sản” – sinh viên Phan Thị Bé Tuyết; đề tài “Tối ưu hóa các điều kiện nuôi cấy Nitrosomonas và Nitrobacter trong phòng thí nghiệm (quy mô pilot)” – sinh viên Phạm Thị Khánh Đoan … Hoặc như các đề tài đang triển khai cho sinh viên đại học khóa 9 như “Phân lập tuyển chọn các chủng vi khuẩn chịu mặn ứng dụng xử lý nước thải nuôi trồng thủy sản” – sinh viên Nguyễn Công Huấn; “Thử nghiệm xử lý nước thải nhiễm mặn của một số chủng vi khuẩn ở quy mô pilot” – sinh viên Nguyễn Thanh Nam”…Trong hầu hết các đề tài này khi tiến hành đến giai đoạn nuôi cấy tăng sinh, người nghiên cứu sẽ phải tiến hành trong các erlen dung tích nhỏ (1000ml) nhiều lần, hoặc các bể nhựa, thủy tinh (dung tích 5 lít) chỉ tiệt trùng bằng cồn, hoặc phải thuê mướn các thiết bị nuôi cấy bên ngoài Từ đó dẫn đến nhiều bất tiện hoặc tốn kém chi phí cho đề tài nghiên cứu Mặt khác, sinh khối thu được sau thời gian nuôi cấy

không cao và dễ bị tạp nhiễm Bên cạnh đó, trong chương trình môn học Thực hành vi sinh môi trường, sinh viên được giới thiệu, giải thích về quá trình nuôi cấy vi sinh vật này, nhưng chỉ được thao tác ở mức độ nhân giống và nuôi cấy tăng sinh quy mô nhỏ (50 - 100ml) trong erlen, sinh viên chưa được tiếp xúc, vận hành thử một hệ thống nuôi cấy sinh khối vi sinh vật thực tế nào phù hợp với khả năng

Việc có một hệ thống nuôi cấy sinh khối vi sinh vật vô trùng, kiểm soát được các chỉ tiêu cơ bản sẽ giúp sinh viên, học viên thực hiện đề tài nghiên cứu dễ dàng hơn, đỡ tốn kém hơn, giảng viên mô hình và thiết bị hướng dẫn sinh viên thao tác trực tiếp khi dạy thực hành Đồng thời hệ thống này có thể chuyển giao công nghệ cho các phòng thí nghiệm nhỏ, không yêu cầu dung tích nuôi cấy quy mô lớn

Trong các chỉ tiêu cơ bản cần kiểm soát khi nuôi cấy vi sinh vật, nhiệt độ và pH là hai chỉ tiêu đầu tiên được quan tâm Chính vì vậy, bước đầu, đề tài đề xuất trong hệ thống phải kiểm soát được hai chỉ tiêu này trước tiên thông qua bộ gia nhiệt và đầu dò kiểm soát pH Các thiết bị này dễ dàng trang bị cho hệ thống với giá tiền vừa phải, đủ tiêu chí phục vụ cho giảng dạy và nghiên cứu cấp cơ sở

Chương 2 CƠ SỞ LÝ LUẬN

2.1 Tổng quan về bioreactor

2.1.1 Khái niệm bioreactor

Bioreactor hay còn gọi là hệ thống lên men về cơ bản như là một nồi phản ứng sinh học trong đó sử dụng một thùng chứa để nuôi giữ các tế bào nhằm khai thác các quá trình sinh hóa, thu nhận sinh khối hoặc các sản phẩm chuyển hóa thứ cấp Hệ thống cung cấp môi trường dinh dưỡng và các điều kiện nuôi cấy có kiểm soát để tế bào phát triển theo đúng mục đích khai thác [10, 13] Bioreactor có thể sử dụng để nuôi cấy các tế bào vi sinh vật, động vật, thực vật … liên tục hoặc theo mẻ, trong điều kiện hiếu khí hoặc kỵ khí Vật liệu thiết kế có thể bằng inox, thép không gỉ, hợp kim kháng khuẩn, thủy tinh chịu lực …Kích thước hệ thống có thể ở quy mô phòng thí nghiệm từ 1 đến 50 lít, quy mô pilot từ 0,3 đến 10m3 hoặc quy mô công nghiệp từ 2 đến 500m3 thường có tỷ lệ chiều cao trên đường kính của thùng lên men hoặc là 2/1 hoặc là 3/1 [8,9]

không cao và dễ bị tạp nhiễm Bên cạnh đó, trong chương trình môn học Thực hành vi sinh môi trường, sinh viên được giới thiệu, giải thích về quá trình nuôi cấy vi sinh vật này, nhưng chỉ được thao tác ở mức độ nhân giống và nuôi cấy tăng sinh quy mô nhỏ (50 - 100ml) trong erlen, sinh viên chưa được tiếp xúc, vận hành thử một hệ thống nuôi cấy sinh khối vi sinh vật thực tế nào phù hợp với khả năng

Việc có một hệ thống nuôi cấy sinh khối vi sinh vật vô trùng, kiểm soát được các chỉ tiêu cơ bản sẽ giúp sinh viên, học viên thực hiện đề tài nghiên cứu dễ dàng hơn, đỡ tốn kém hơn, giảng viên mô hình và thiết bị hướng dẫn sinh viên thao tác trực tiếp khi dạy thực hành Đồng thời hệ thống này có thể chuyển giao công nghệ cho các phòng thí nghiệm nhỏ, không yêu cầu dung tích nuôi cấy quy mô lớn

Trong các chỉ tiêu cơ bản cần kiểm soát khi nuôi cấy vi sinh vật, nhiệt độ và pH là hai chỉ tiêu đầu tiên được quan tâm Chính vì vậy, bước đầu, đề tài đề xuất trong hệ thống phải kiểm soát được hai chỉ tiêu này trước tiên thông qua bộ gia nhiệt và đầu dò kiểm soát pH Các thiết bị này dễ dàng trang bị cho hệ thống với giá tiền vừa phải, đủ tiêu chí phục vụ cho giảng dạy và nghiên cứu cấp cơ sở

Chương 2 CƠ SỞ LÝ LUẬN

2.1 Tổng quan về bioreactor

2.1.1 Khái niệm bioreactor

Bioreactor hay còn gọi là hệ thống lên men về cơ bản như là một nồi phản ứng sinh học trong đó sử dụng một thùng chứa để nuôi giữ các tế bào nhằm khai thác các quá trình sinh hóa, thu nhận sinh khối hoặc các sản phẩm chuyển hóa thứ cấp Hệ thống cung cấp môi trường dinh dưỡng và các điều kiện nuôi cấy có kiểm soát để tế bào phát triển theo đúng mục đích khai thác [10, 13] Bioreactor có thể sử dụng để nuôi cấy các tế bào vi sinh vật, động vật, thực vật … liên tục hoặc theo mẻ, trong điều kiện hiếu khí hoặc kỵ khí Vật liệu thiết kế có thể bằng inox, thép không gỉ, hợp kim kháng khuẩn, thủy tinh chịu lực …Kích thước hệ thống có thể ở quy mô phòng thí nghiệm từ 1 đến 50 lít, quy mô pilot từ 0,3 đến 10m3 hoặc quy mô công nghiệp từ 2 đến 500m3 thường có tỷ lệ chiều cao trên đường kính của thùng lên men hoặc là 2/1 hoặc là 3/1 [8,9]

Hình 2.1 Cấu tạo cơ bản của một hệ thống bioreactor

Các điều kiện trong quá trình nuôi cấy có thể được kiểm soát tự động hoặc bán tự động thông qua các bộ điều khiển Trong điều kiện nuôi cấy lỏng, cần kiểm soát việc pha trộn các thành phần trong dung dich và tế bào, nhằm đảm bảo sự chuyển khối của các chất dinh dưỡng đến bề mặt tế bào một cách tốt nhất Cường độ pha trộn tùy thuộc loại cánh khuấy và tốc độ khuấy Tuy nhiên, sử dụng cánh khuấy có thể tác động đến cấu trúc làm phá vỡ tế bào Ở trường hợp hệ lên men hiếu khí, một bộ phun lỗ đơn hoặc một bộ phun vòng thường được sử dụng để sục khí cho hệ lên men [2] Với thể tích nhỏ, việc sục khí có thể thay thế cho cánh khuấy để phối trộn tế bào và môi trường dinh dưỡng Độ pH trong hệ lên men có thể được duy trì bằng cách dùng dung dịch đệm hoặc bộ điều chỉnh pH Đầu dò pH có thể gắn trong hệ thống hoặc rời bên ngoài Nhiệt độ được điều chỉnh bằng hệ thống gia nhiệt đặt dưới đáy hoặc gia nhiệt qua thành Phương pháp gia nhiệt qua thành kết hợp với dòng dung dịch bên trong giúp quá trình kiểm soát nhiệt độ nhanh và chính xác hơn, đồng thời ít ảnh hưởng đến các tế bào tiếp xúc gần với vị trí gia nhiệt [6,13]

2.1.2 Các hệ thống bioreactor cơ bản

 Bioreactor khuấy thoáng khí: Kiểu bioreactor này thường được đề cập dưới dạng những bình phản ứng khuấy trộn (stirred tank bioreactors – STRs) có cánh khuấy chẳng hạn

như: tua-bin, chân vịt, mái chèo hay ruy-băng xoắn ốc Mặc dù STRs có ý nghĩa trong nuôi cấy tạo huyền phù nhưng nó cũng gây ra những lực khuấy mạnh Tuy nhiên, gần đây STRs

đã được cải tiến nhằm khắc phục các bất lợi trên Kiểu cánh khuấy ruy-băng xoắn ốc được xem là có hiệu quả đối với nuôi cấy huyền phù tế bào vi sinh vậtcó mật độ cao Nói chung thì bioreactor dạng này thường được sử dụng trong nuôi cấy tạo phôi Nhưng hiện nay vẫn còn quá ít các nghiên cứu tiến hành so sánh hiệu quả giữa các kiểu bioreactor khác nhau

 Bioreactor hình trống quay: Kiểu bioreactor này gồm có một bình chứa có dạng hình trống được gắn trên một trục quay, trục này có nhiệm vụ nâng đỡ và quay bình chứa Bình được quay với tốc độ khoảng 2 – 6 vòng/phút nhằm hạn chế tối đa lực xé làm tổn thương tế bào

 Bioreactor màng lọc xoay: Kiểu bioreactor này có một màng lọc xoay có nhiệm vụ hòa trộn huyền phù nuôi cấy và đồng thời lấy đi môi trường đã sử dụng và bổ sung môi trường mới vào Các màng lọc xoay khuấy trộn môi trường không làm xé rách màng tế bào chính là nhờ vào việc tạo ra được những đường khuấy mỏng Để có thể duy trì được lâu sự tăng trưởng liên tục của vi sinh vậtvà sự phát triển của giống đạt được sự nhân nhanh, người

ta đã thiết kế một bioreactor có hai màng lọc cùng quay Một chiến lược nhằm nuôi cấy hiệu quả hơn đó là trong giai đoạn tăng sinh tế bào, người ta tiến hành nuôi cấy liên tục Nhằm tạo sự đồng nhất, ổn định điều kiện nuôi cấy cho các tế bào và duy trì được nhóm tế bào đang tăng trưởng phù hợp cho sự phát triển vi sinh vật Giai đoạn thứ hai của bioreactor là tạo giống theo chu kỳ Sự phát triển của giống có thể được điều khiển thông qua nguồn dinh dưỡng thiết yếu hoặc các thành phần khí

 Bioreactor có khuấy và không khuấy bằng nén khí: Đây là kiểu bioreactor đơn giản, được thiết kế với một bộ phận sủi bọt khí ở phía dưới đáy bình, nó có nhiệm vụ là khuấy trộn môi trường và cung cấp oxygen (đối với bioreactor sục khí đơn giản, bioreactor tạo bọt dạng hình cột) Trong một số trường hợp, bình nuôi cấy có thể gắn thêm các ống thông (đối với bioreactor air-lift)

 Bioreactor air-lift: kiểu bioreactor này cũng tương tự với bioreactor được khuấy trộn bằng dòng xoáy-STRs (nhưng ở đây thì không có cánh khuấy): Bioreactor air-lift khắc phục được hai nhược điểm của bioreactor khuấy bằng cánh khuấy đó là: ít tốn năng lượng cho việc khuấy trộn môi trường và ít gây ra lực xé rách các tế bào, nhờ những dòng khí nhỏ di chuyển nhẹ nhàng từ phía dưới lên Sự hòa trộn dòng khí vào trong pha lỏng trở nên có hiệu quả hơn do có sự lưu trú các bong bóng khí trong môi trường Để có thể tạo được các bọt

khí nhỏ mịn thì dòng khí phải được thổi qua một màng lọc với những lỗ có kích thước rất nhỏ 0,01 – 0,1 mm Thường sử dụng màng ceramic Chính nhờ sự nhỏ mịn của các bong bóng khí đã làm cho các tế bào giảm đáng kể sự cọ sát nên ít bị tổn thương, nhất là đối với những tế bào có độ nhạy cảm cao

 Bioreactor sủi bọt dạng trụ: Bioreactor dạng này có hình trụ đáy hình nón có gắn cổng thu sản phẩm và có nắp ở trên đỉnh Ở đầu của bình có một khóa hình chữ Y có nhiệm

vụ châm thêm môi trường Bằng việc sử dụng một thiết bị sủi bọt với các lỗ đồng tâm đặt đáy bình, điều này đã làm cho lượng bọt được giảm Ngoài ra, trên nắp bình còn có gắn thêm các thiết bị đo pH, tia UV khử trùng Những bioreactor dạng này được sử dụng trong tăng sinh khối tế bào vi sinh vật

Hình 2.2 Các dạng bioreactor thường gặp

 Bioreactor thổi khí trên bề mặt: Dạng bioreactor này thổi khí từ trên bề mặt xuống dung dịch lỏng và đôi khi kết hợp với sục khí nhẹ nhưng hệ số oxy hòa tan khá thấp (nhỏ hơn 1) Kiểu bioreactor này được báo cáo là chưa thành công lắm trong nuôi cấy

 Bioreactor ngập chìm gián đoạn tự động: Hệ thống ngập chìm tự động này đã được thương mại dưới tên gọi là “RITA” do Teisson và Alvard thiết kế (1995) Hệ thống bioreactor này gồm hai bình chứa, một bình dùng cho sự tăng sinh khối cho vi sinh vật, một bình dùng để chứa môi trường lỏng Hai bình này được nối với nhau bằng ống silicon và thủy tinh Không khí nén từ một thiết bị bơm khí sẽ đẩy môi trường lỏng từ bình chứa thứ nhất sang bình chứa thứ hai Sau đó thì khí sẽ rút khỏi bình chứa môi trường Trong mỗi trường hợp như vậy thì không khí được thổi qua một màng lọc vô trùng với kích thước lỗ 0,2 mm Một thiết bị điều khiển có thể hẹn giờ được dùng để ấn định khoảng thời gian cho

một chu trình Có một hệ thống van 3 cổng dạng so-le được dùng trong trường hợp điều khiển đóng mở này [3]

2.1.3 Thuận lợi và khó khăn trong mô hình nuôi cấy Bioreactor

 Thuận lợi của nuôi cấy bằng bioreactor

Theo Takayama và Akita (1994) thì một số thuận lợi chính của bioreactor trong nuôi sinh khối vi sinh vật là [6]:

- Sự tiếp xúc tốt hơn giữa sinh khối vi sinh vật với môi trường

- Không có sự hạn chế về trao đổi khí

- Có thể điều khiển sinh khối vi sinh vậttùy theo thể tích môi trường

- Tiết kiệm được thời gian và nhân công trong việc nuôi cấy chuyền

- Dễ dàng cho nhân giống số lượng lớn tạo nhiều sinh khối

- Dễ dàng điều khiển được thành phần môi trường và điều kiện nhiệt độ, pH, sục khí trong nuôi cấy

- Tốc độ sinh trưởng và phát triển tăng

- Mẫu cấy được tiếp xúc đầy đủ hơn với môi trường dinh dưỡng nên làm cho tốc độ sinh trưởng và phát triển được tăng nhanh

- Môi trường nuôi được khử trùng tuyệt đối, tránh xuất hiện nhiều vi sinh vật gây bệnh

 Khó khăn của nuôi cấy bằng bioreactor

Mặc dù phương pháp nuôi cấy lỏng lắc và bioreactor đã tỏ ra vượt trội hơn so với các phương pháp nuôi cấy trên môi trường nhưng bên cạnh đó nó vẫn còn có những hạn chế nhất định Tuỳ vào từng đối tượng mà thiết kế một kiểu bioreactor thích hợp, khó áp dụng đồng loạt cho nhiều trường hợp khác nhau

2.1.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy trong Bioreactor

Tất cả các bioreactor đều xử lý các hệ thống không đồng nhất liên quan đến hai hoặc nhiều pha, ví dụ như chất lỏng, khí, chất rắn Do đó, các điều kiện tối ưu cho quá trình lên men đòi

hỏi sự chuyển giao hiệu quả khối lượng, nhiệt độ và từ giai đoạn này sang giai đoạn khác Các nguyên lý kỹ thuật hóa học được sử dụng để thiết kế và vận hành bioreactor

Một bioreactor cần được đảm bảo những yếu tố sau:

- Bộ phận chuyển động (để trộn tế bào và môi trường)

- Sục khí cho O2 cung cấp vào mô hình

- Các yếu tố môi trường được kiểm soát thường xuyên bao gồm nhiệt độ, nồng độ oxy,

pH, khối lượng tế bào, mức chất dinh dưỡng quan trọng và nồng độ sản phẩm

- Khử trùng và duy trì sự vô trùng

- Rút các tế bào / môi trường (phân tích kết quả sinh khối của vi sinh vật)

- Sử dụng máy vi tính: Tích hợp máy tính vào các hệ thống lên men dựa trên khả năng của máy tính để theo dõi quá trình, thu thập dữ liệu, lưu trữ dữ liệu và phát hiện lỗi Một số chức năng phân tích dữ liệu trực tuyến thông thường bao gồm các phép đo thu thập, xác minh dữ liệu, lọc, chuyển đổi đơn vị, tính toán các phép đo gián tiếp, tính toán phân tích các biến ước lượng, giảm dữ liệu, sắp xếp các kết quả, trình bày đồ họa các kết quả, kích thích quá trình và lưu trữ dữ liệu

Đối với tất cả quá trình nuôi cấy vi sinh vật, quan trọng nhất là đảm bảo sao cho mọi thành phần tham gia phải được đặt trong điều kiện giống nhau được kiểm soát chặt chẽ các thông

số lý hóa Để kiểm soát được điều này, cần hiểu được trạng thái của quá trình và khả năng đáp ứng của vi sinh vật đối với các điều kiện khác nhau của môi trường Các thông số này

có thể được kiểm soát trực tiếp hoặc gián tiếp Kiểm soát trực tiếp thông qua các sensor đặt trong hệ thống bioreacrot, thường áp dụng với thông số nhiệt độ, pH, hàm lượng khí hòa tan… Kiểm soát gián tiếp được thực hiện bằng cách lấy mẫu trong quá trình nuôi cấy và đem phân tích, thường áp dụng đo hàm lượng DNA, RNA, enzyme và sinh khối

2.2 Tổng quan về nuôi cấy vi sinh vật

2.2.1 Khái niệm

Nuôi cấy vi sinh vật hay lên men là quá trình để tạo ra sinh khối (tăng sinh) hoặc thúc đẩy vi sinh vật tạo ra sản phẩm trao đổi chất (các hợp chất sinh hóa) Lên men cũng được sử dụng rộng rãi hơn trong sự tăng sinh khối của vi sinh vật trên môi trường sinh trưởng, sự tích lũy các sản phẩm trao đổi chất hữu ích cho con người trong quá trình nuôi cấy vi sinh vật