Nghiên cứu hoạt tính sinh học và thành phần hóa học từ cây cổ yếm lá bóng (Gynostemma Laxum (Wall.) Cogn] của Việt Nam

Nghiên cứu hoạt tính sinh học và thành phần hóa học từ cây cổ yếm lá bóng (Gynostemma Laxum (Wall.) Cogn] của Việt Nam

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

PHẠM THỊ NINH

NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH SINH HỌC VÀ THÀNH PHẦN

(WALL.) COGN.] CỦA VIỆT NAM

Chuyên ngành : Sinh học thực nghiệm

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các số liệu và kết quả nghiên cứu nêu trong luận văn là trung thực, được đồng tác giả cho phép sử dụng và chưa từng được công bố trong bất kỳ một công trình nào khác

Tác giả luận văn

Phạm Thị Ninh

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

Tôi xin trân trọng cảm ơn tập thể cán bộ khoa học Phòng Tổng hợp Hữu

cơ – Viện Hoá học – Viện Hàn lâm KH&CN Việt Nam đã tạo mọi điều kiện thuận lợi, giúp đỡ, hướng dẫn tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Tôi cũng xin được cảm ơn các cán bộ phòng Hóa sinh ứng dụng, phòng phổ IR, phổ NMR và phổ khối MS – Viện Hoá học đã thực hiện thử hoạt tính và

đo các loại phổ giúp tôi Xin được cảm ơn sự nhiệt tình giảng dạy của quý thầy

cô giáo trong suốt quá trình học tập

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến những người thân trong gia đình và bạn bè đã động viên giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu

Tác giả luận văn

Phạm Thị Ninh

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

Trang

1 Đặt vấn đề 1

2 Mục tiêu nghiên cứu 2

3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 2

4 Phương pháp nghiên cứu 2

4.1 Các phương pháp nghiên cứu lý thuyết 2

4.2 Các phương pháp nghiên cứu thực nghiệm 3

5 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 3

6 Bố cục của luận văn 3

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 4

1 Họ Cucurbitaceae và chi Gynostemma 4

1.1 Họ Cucurbitaceae 4

1.2 Chi Gynostemma 4

1.3 Cổ yếm lá bóng 4

1.3.1 Tên gọi 5

1.3.2 Môi trường sống 5

1.3.3 Tính vị và tác dụng 5

2 Hoạt tính sinh học của cây cổ yếm lá bóng 7

3 Thành phần hóa học 8

3.1 Các carotenoid 8

3.2 Các polysaccharid 9

3.3 Các sterol 9

3.4 Các flavonoid 10

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

3.5 Các saponin 11

CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19

2.1 XỬ LÝ MẪU THỰC VẬT VÀ CÁC PHƯƠNG PHÁP CHIẾT TÁCH PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC 19

2.1.1.Mẫu thực vật 19

2.1.2 Các phương pháp sắc ký để phân lập chất 20

2.1.3 Các phương pháp xác định cấu trúc hóa học 20

2.2 CÁC PHƯƠNG PHÁP THỬ HOẠT TÍNH 20

2.2.1 Thử hoạt tính chống oxy hóa 20

2.2.2 Thử hoạt tính chống ung thư 21

2.2.3 Thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định 21

CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM 22

3.1 HÓA CHẤT, THIẾT BỊ VÀ PHƯƠNG PHÁP 22

3.1.1 Hóa chất và thiết bị nghiên cứu 22

3.1.2 Phương pháp nghiên cứu 23

3.2 CHIẾT TÁCH VÀ TINH CHẾ CÁC CHẤT TỪ CÂY CỔ YẾM LÁ BÓNG GYNOSTEMMMA LAXUM (WALL.) COGN 27

3.2.1 Xử lý mẫu thực vật 27

3.2.2 Chiết tách các chất từ dịch chiết etyl acetat 28

3.2.3 Chiết tách các chất từ dịch chiết n-BuOH 30

3.3 THỬ HOẠT TÍNH SINH HỌC 32

3.3.1.Thử hoạt tính chống oxy hóa 32

3.3.2 Thử hoạt tính gây độc tế bào 32

3.3.3 Thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định 33

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

4.1 Giới thiệu 34

4.2 Kết quả thử hoạt tính sinh học 34

4.2.1 Hoạt tính chống oxy hóa 34

4.2.2 Hoạt tính gây độc tế bào 35

4.2.3 Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định 36

4.3 Xác định cấu trúc của các chất phân lập đƣợc 37

4.3.1 chất 43 (GCLB17): quercetin 37

4.3.2.Chất 44 (GCL14.2): ombuim 46

4.3.3.Chất 45 (GCLB.3N): ombuosid 53

4.3.4.Chất 46 (GCL2.2): 4,7- dimethoxy kaempferol 61

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 74

- KẾT LUẬN 74

- TÀI LIỆU THAM KHẢO 76

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT DÙNG TRONG LUẬN VĂN

HMBC : Heteronuclear multiple bond correlation

HMQC : Heteronuclear multiple quantum coherence

COSY : Correlation Spectroscopy

NMR : Nuclear magnetic resonance

ppm : Parts per million

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

VLDL: Very low density lipoprotein

HDL: High density lipoprotein

H và 13C-NMRcủa chất 43; 44; 45 và 46 38 4.5 Các chất phân lập từ cây Cổ yếm lá bóng 72

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

DANH MỤC CÁC HÌNH

Số hiệu

2.1 Ảnh Gynostemma laxum (Wall.) Cogn thu hái ở Hoà Bình 18

3.2.2 Sơ đồ chiết mẫu và tách chất từ dịch chiết EtOAc của cây cổ

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

1

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Việt Nam là nước có nguồn thực vật phong phú với khoảng 12.000 loài, trong

đó đã điều tra được 3.850 loài được sử dụng làm thuốc thuộc 309 họ Đa phần các cây mọc tự nhiên và chưa được nghiên cứu một cách đầy đủ, có hệ thống về mặt khoa học cũng như hoạt tính sinh học Từ nhiều năm qua, thảo dược luôn giữ vai trò quan trọng trong việc bảo vệ sức khỏe con người đã được các Lương Y và Đông Y sử dụng trong những bài thuốc gia truyền Ngày nay, người ta còn chiết xuất các hợp chất từ thảo dược để làm thuốc, thực phẩm chức năng nhằm để hỗ trợ và điều trị các bệnh như bệnh ung thư, tiểu đường, giảm cân, tăng cường hệ miễn dịch cơ thể, hạ huyết áp …

Ưu điểm của các loại thảo dược là có tác dụng tốt vào nhiều bộ phận cơ thể hơn là Âu dược, không gây nghiện và không gây tác dụng phụ

Trong số 2 loài thuộc chi Gynostemma Blume (họ Bí Cucurbitaceae) có mặt

tại Việt Nam, Giảo cổ lam là dược liệu quý đuợc nhóm nghiên cứu của Phạm Thanh

Kỳ phát hiện lần đầu tiên vào năm 1997 Từ đó cho tới nay, nhiều nghiên cứu trên loài dược liệu này đã được tiến hành, làm sáng tỏ thành phần hoá học, tác dụng dược

lý và từ đó, đưa vào khai thác và sử dụng nguồn dược liệu quý hiếm này phục vụ

chăm sóc sức khoẻ cộng đồng Trong số 2 loài còn lại, Gynostemma laxum (Wall.)

Cogn (hay còn gọi là cây Cổ yếm lá bóng) là dược liệu được người dân ở Trung Quốc sử dụng tương tự như Giảo cổ lam, với tác dụng điều trị viêm khí quản mạn tính, viêm gan truyền nhiễm, viêm thận, loét dạ dày hành tá tràng, phong thấp và đau nhức khớp, bệnh về tim, béo phì, điều trị chức năng thần kinh Tuy nhiên, cho tới nay,

ở Việt Nam chưa có nhiều nghiên cứu về hoạt tính sinh học và thành phần hoá học, tác dụng dược lý cũng như độc tính của loài này

Nhằm mục tiêu góp phần tạo cơ sở khoa học cho việc sử dụng Cổ yếm lá bóng

làm thuốc do đó đề tài: “Nghiên cứu hoạt tính sinh học và thành phần hóa học từ cây Cổ yếm lá bóng [Gynostemma laxum (Wall.) Cogn.] của Việt Nam ” được

thực hiện với các nội dung chính sau:

- Tạo dịch chiết bằng các dung môi có độ phân cực khác nhau

- Thử hoạt tính sinh học của các dịch chiết

- Phân lập và xác định cấu trúc hóa học của các chất từ dịch chiết

- Xác định các thành phần hóa học chính từ cây cổ yếm lá bóng

2 Mục tiêu nghiên cứu

- Nghiên cứu hoạt tính sinh học và thành phần hóa học của cổ yếm lá bóng

(Gynostemma laxum) của Việt Nam

3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

- Các dịch chiết của mẫu cây Cổ yếm lá bóng ở Việt Nam trong các dung môi

có độ phân cực khác nhau

- Thử hoạt tính sinh học của các dịch chiết

- Xác định cấu trúc hóa học các hợp chất phân lập được

4 Phương pháp nghiên cứu

4.1 Các phương pháp nghiên cứu lý thuyết

- Xử lý mẫu: nguyên liệu gồm thân, lá cây Cổ yếm lá bóng được thu tại Hòa Bình vào tháng 6 năm 2011, được rửa sạch, sấy khô và đem xay nhỏ

3

- Phương pháp nghiên cứu: Các phương pháp chiết, tách xác định thành phần

hóa học, tác dụng sinh học, ứng dụng của một số cây thuộc chi Gynostemma trong

nước và trên thế giới

- Tổng quan các tài liệu về đặc điểm hình thái thực vật, thành phần hoá học,

ứng dụng của một số cây thuộc chi Gynostemma

4.2 Các phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

-Gynostemma sẽ đóng góp vào kho tàng các hợp chất thiên nhiên

của Việt Nam và thế giới

Chương 1 – Tổng quan (14 trang)

Chương 2 – Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu (3 trang)

Chương 3 – Thực nghiệm (12 trang)

Chương 4 – Kết quả và thảo luận (43 trang)

Tài liệu tham khảo (3 trang)

CHƯƠNG I TỔNG QUAN

1 Họ Cucurbitaceae và chi Gynostemma [1, 2, 3, 10]

Theo các tài liệu về Thực vật và phân loại thực vật, Gynostemma laxum (Wall.) Cogn thuộc họ Bí (Cucurbitaceae), vị trí của G.laxum (Wall.) Cogn trong hệ thống phân loại thực vật được tóm tắt như sau:

Họ Cucurbitaceae được gọi là họ bầu bí là họ thực vật chứa một số loài được

biết đến nhiều như Lagenaria siceraria (bầu), Cucurbita (bí ngô), Luffa (mướp),

Citrullus vulgaris (dưa hấu), Cucumis melo (dưa vàng) và Cucumis sativus (dưa

huột) Họ Bầu bí là một trong những họ quan trọng nhất trong việc cung cấp thực phẩm cho người và gia súc

1.2 Chi Gynostemma

Chi Gynostemma cũng được gọi chung là giảo cổ lam Hiện nay trên thế giới

có khoảng 30 loài thuộc chi này với năm loài đã được tìm thấy ở Việt Nam trong đó

có G laxum (giảo cổ lam ba lá, cổ yếm lá bóng), G pubescens (giảo cổ lam bảy lá, thất diệp đởm), G pentaphyllum (giảo cổ lam năm lá, ngũ diệp sâm)

1.3 Cổ yếm lá bóng [1-10]

5

1.3.1 Tên gọi

Giảo cổ lam ba lá hay Cổ yếm lá bóng có tên khoa học là Gynostemma laxum

(Wall.) Cogn thuộc họ Bí (Cucurbitaceae)

1.3.2 Môi trường sống

Cổ yếm lá bóng là một loài cây thảo có thân mảnh, leo nhờ tua cuốn đơn ở nách lá Cây đực và cây cái riêng biệt Lá kép hình chân vịt Cổ yếm lá bóng (giảo cổ lam ba lá) mọc tự nhiên ở độ cao 300 – 3200 m tại các cánh rừng hoặc thung lũng hoặc trên các sườn núi, những nơi ẩm thấp như bên bờ suối, trong các bụi cây, phân

bố rộng rãi ở các quốc gia như Nhật Bản, Hàn Quốc, Trung Quốc, Ấn Độ, Nepal, Bangladesh, SriLanka, Lào, Myanmar và Việt Nam Giảo cổ lam lần đầu tiên được phát hiện vào năm 1976 tại Nhật Bản Tuy nhiên, giảo cổ lam đã được các bộ lạc sống trên núi cao sử dụng từ hơn 500 năm trước đó với mục đích kéo dài tuổi thọ Tuổi thọ bình quân của họ đạt được rất cao đến gần trăm tuổi Ở Việt Nam Phạm Thanh Kỳ nguyên hiệu trưởng trường đại học Dược Hà Nội, chủ nhiệm Bộ môn Dược liệu lần đầu tiên phát hiện thấy cây này trên núi Phanxipang (Lào Cai) vào những năm 1997, sau đó được Vũ Văn Chuyên xác định tên khoa học chính xác Hiện nay, Giảo cổ lam cũng đã được tìm thấy trên những vùng núi cao ở các tỉnh phía Bắc như Cao Bằng, Thái Nguyên, Yên Bái, Hà Giang, Hòa Bình

1.3.3 Tính vị và tác dụng

- Tính vị : Vị đắng, tính hàn, có tác dụng thanh nhiệt giải độc, ngừng ho, long

đờm, kiện tráng, cường tinh, chống lão suy, chống mệt mỏi, kháng ung thư

- Công dụng: Ở Vân Nam (Trung Quốc), cây được dùng điều trị viêm khí quản

mạn tính, viêm gan truyền nhiễm, viêm thận, loét dạ dày hành tá tràng, phong thấp và đau nhức khớp, bệnh về tim, béo phì, điều trị chức năng thần kinh Ngoài ra còn tăng sức đề kháng cho cơ thể, chống viêm và nhiễm trùng Tác dụng làm hạ mỡ máu, nhất

là giảm cholesterol toàn phần, ngăn ngừa các bệnh như xơ vữa mạch máu, chống huyết khối và bình ổn huyết áp, phòng ngừa các biến chứng tim mạch, não Chống lão hoá, giảm căng thẳng mệt mỏi, giúp tăng lực, tăng khả năng làm việc Tăng cường hệ miễn dịch, ngăn ngừa sự hình thành và phát triển của các khối u Giúp dễ ngủ và ngủ sâu giấc, tăng cường máu lên não, ngăn ngừa chứng mất trí nhớ ở người già Rất tốt cho tế bào gan, tăng cường chức năng giải độc của gan Điều chỉnh rối loạn chuyển

hoá mỡ nên làm giảm triệu chứng béo phì, nhất là béo bụng, béo đùi Hiện nay ở

Việt Nam, giảo cổ lam đã được sử dụng như một loại thực phẩm chức năng được bào

chế dưới các dạng trà túi lọc, viên nang, chai nước giải khát rất thuận tiện cho người

tiêu dùng

Cổ yếm lá bóng Giảo cổ lam 3 lá

(Gynostemma laxum)

Giảo cổ lam 5 lá Ngũ diệp sâm

(Gynostemma pentaphyllum)

Hình 1 Hình ảnh hai loài thuộc chi Gynostemma ở Việt Nam

2 Hoạt tính sinh học của cây Giảo cổ lam [7, 9, 11, 14, 22, 24, 26-28, 31]

Hoạt tính sinh học của cây giảo cổ lam chủ yếu là do thành phần saponin, vì

vậy, saponin đã trở thành đối tượng của rất nhiều những nghiên cứu về giảo cổ lam

trên thế giới Và cũng vì những tác dụng đa dạng mà cây giảo cổ lam còn được gọi là

cây trường sinh

Nhiều nghiên cứu đã cho thấy dịch chiết nước của giảo cổ lam có tác dụng làm

giảm nồng độ lipid và cholesterol trong máu của chuột Gynosaponin với liều 200

mg/kg làm giảm nồng độ cholesterol toàn phần, cũng như nồng độ LDL và VLDL

trên chuột, đồng thời làm tăng tỷ lệ HDL/LDL Những nghiên cứu lâm sàng cho thấy

G pentaphyllum có hiệu quả trong chữa trị lão hóa, chứng đau nửa đầu, hen suyễn

7 mãn tính, viêm gan B, đau dạ dày mãn tính Từ đó, cho thấy giảo cổ lam có khả năng cải thiện và điều hòa quá trình chuyển hóa lipid Giảo cổ lam cũng có tác dụng trên hệ tim mạch Gypenosid tổng tiêm nội phúc mạc trên thỏ với liều 100 mg/kg làm giảm nhồi máu cơ tim gây ra co thắt động mạch vành và ức chế sự tăng nồng độ acid béo tự

do sau nhồi máu cơ tim Gypenosid ở nồng độ 50, 100 và 200 mg/mL thể hiện hoạt

tính bảo vệ đối với tế bào cơ tim bằng cách ức chế tổn thương gây bởi glucose và sự thiếu hụt oxygen cũng như ức chế sự giải phóng creatin phosphokinase và lactat dehydrogenase Tiêm tĩnh mạch gypenosid (5 và 10 mg/kg) vào chó cũng làm tăng lưu lượng máu qua động mạch vành Các nghiên cứu gần đây cũng cho thấy gypenosid ức chế sự tổng hợp nitrit của đại thực bào RAW 264.7 kích thích bởi LPS

Nghiên cứu sâu hơn cho thấy gypenosid ức chế hoạt tính và sự sao chép gen iNOS

bằng cách giảm hoạt tính của NF-kB Sự ức chế sinh tổng hợp NO bằng cách ức chế

sự thể hiện gen của iNOS hoặc hoạt tính của nó là một mục tiêu quan trọng trong việc

điều khiển một số bệnh lý như viêm và xơ cứng động mạch Những kết quả này cho thấy tầm quan trọng của các gypenosid trong việc điều khiển sinh tổng hợp NO [28].

3 Thành phần hóa học của cây Giảo cổ lam [6-16, 28-38]

Chi Gynostemma nổi tiếng với thành phần saponin trong đó nhiều loại saponin

rất giống với thành phần saponin có trong nhân sâm, có tác dụng rất tốt cho sức khỏe

về phòng ngừa và chữa bệnh Khi so sánh hàm lượng saponin giữa một số loài cùng

chi, loài G pentaphyllum được biết đến với hàm lượng saponin cao nhất trong chi này, kế đến là G pubescens và thấp nhất là G longipes [15] .Thành phần hóa học chủ yếu của giảo cổ lam là saponin và flavonoid Các saponin trong cây giảo cổ lam (còn gọi là gypenosid hay gynosaponin) có cấu trúc triterpen khung dammaran, trong đó có nhiều hợp chất đã được xác định có trong thành phần saponin trong nhân sâm và tam thất Ngoài ra, giảo cổ lam còn chứa các carotenoid, polysaccharid, sterol, các acid amin tan trong nước, nhiều vitamin và các nguyên tố vi lượng như Zn, Fe, Se

3.1 Các carotenoid [11, 12]

Vai trò của các carotenoid đã được chứng minh có tác dụng ngăn ngừa các căn bệnh mãn tính Ví dụ như lutein làm giảm nguy cơ thoái hóa điểm vàng và nguy cơ

mắc các bệnh về tim mạch, lycopen và β-caroten ức chế sự tổng hợp các cholesterol,

do đó có khả năng làm tăng sự thoái biến các lipoprotein có phân tử lượng thấp Năm 2004, H L Liu và các cộng sự đã xác định một số carotenoid có trong cây giảo

cổ lam bằng phương pháp HPLC, trong đó nhiều nhất là trans-lutein, kế đến là lutein, các carotenoid như neochrom, neoxanthin, trans-α-caroten, auroxanthin, violaxanthin, luteoxanthin, β-cryptoxanthin, các đồng phân cis- và trans-β-caroten

ra còn có một lượng nhỏ ribose và fucose [14]

3.3 Các sterol [15, 16, 37]

Năm 1989, tác giả Marino và các cộng sự đã xác định trong cây giảo cổ lam có

sự hiện diện của các sterol thường gặp như ergostanol, sitosterol và stigmasterol với hàm lượng rất thấp (khoảng 0,0001%) [37] Các dẫn xuất thế 24,24-

9 dimetylcholestanol cũng đƣợc Akihisa tìm thấy vào năm 1986 trong các loại cây

thuộc họ Cucurbitaceae Chondrillasterol (2) và spinasterol (3), hai đồng phân lập thể

tại C-24, là hai sterol chính có trong cây này [15] Ngoài ra, các acetylen sterol đầu

tiên (4, 5, 6, 7) cũng đƣợc phân lập từ cây giảo cổ lam vào năm 1989 [19]

H H HO

H H

2:Chondrillasterol

H H HO

H H

3:Spinasterol

H HO

H

H

H H HO

H H

3.5 Các saponin [6-8, 17-29, 32-34]

Hàm lượng saponin trong cây giảo cổ lam khô vào khoảng 2,4% Hàm lượng này cao nhất là thời gian trước khi cây ra hoa Ngoài ra, khi thu hái cây này vào những thời điểm khác nhau hay tại những vùng đất khác nhau thì tổng hàm lượng saponin cũng sẽ khác nhau Từ năm 1976 đến nay các nhà khoa học trên thế giới, chủ yếu từ Nhật Bản và Trung Quốc, đã phân lập được trên 100 triterpen saponin từ cây giảo cổ lam Các saponin này được gọi là gypenosid (gypenosid I – LXXIX) hay gynosaponin Cấu trúc của các gypenosid chủ yếu có khung cacbon là dammaran cũng là khung chính của các saponin hiện diện trong nhân sâm Có tám ginsenosid của nhân sâm cũng được phân lập từ giảo cổ lam Đó là các triterpen saponin có khung protopanaxadiol ginsenosid Rb1, Rb3, Rd, F2, Rg3, malonyl-Rb1, malonyl-Rd

và một ginsenosid có khung protopanaxatriol là ginsenosid Rf Gypenosid XVII, IX

(cũng là notoginsenosid Fd) và XV cũng được tìm thấy trong cây tam thất P

notoginseng, trong khi gypenoside XVII và IX được tìm thấy trong cây sâm Mỹ P quinquefolium Các ginsenosid này chiếm khoảng 25% tổng saponin có trong cây giảo

cổ lam Khung triterpen dammaran của các aglycon saponin có trong cây giảo cổ lam

có thể có mạch nhánh hở (hình 4) hay mạch nhánh vòng (hình 5) Nhóm chức thường

gặp nhất là nhóm hydroxyl, thường thấy xuất hiện ở C-3, C-20, C-21 và C-25, ít gặp hơn là ở C-2, C-12, C-19 và C-24 Các nhóm chức khác như nối đôi ở C-23, C-24 và C-25, aldehid ở C-19 và keton ở C-12 cũng thấy xuất hiện trong một vài hợp chất Các đơn vị đường có trong các saponin này chủ yếu là β-D-glucopyranose, β -D-

CH2O-glu OH O

CH2OH b

OH c O-glycoside* d

O O

R6

J

l

O HO

Năm 1996, từ dịch chiết metanol của phần thân cây giảo cổ lam, tác giả

Lihong Hu và các cộng sự đã phân lập được ba triterpen saponin mới (10-12) cùng với một saponin đã được biết trước đó (13) Cấu trúc của các hợp chất này được

chứng minh bằng phương pháp hóa học và các phương pháp phổ Aglycon của hợp

chất 10 và 11 có khung 12-oxo-2α, 3β,20(S)-trihydroxydammar-24-en [19].

13

Vào năm 2004, từ phần thân cây giảo cổ lam, tác giả Xin Liu và các cộng sự đã phân lập được 5 saponin mới có mạch nhánh kiểu ocotillon đặt tên là gynosid A-E

(14-18) và 10 saponin khung dammaran khác Cấu trúc của các hợp chất mới được

xác định bằng phương pháp phân tích phổ NMR và thủy phân acid Riêng cấu trúc và

lập thể của gynosid A (14) được xác định bằng phương pháp nhiễu xạ tia X [20, 21]

O

HO O

R1

HO

HO

O O

OH

HO

OH 12 O

R2HO

23 24

HO

O O OH

HO

O

HO 26

27

24 O 12

18

3 OH

Năm 2004, tác giả Norberg A và các cộng sự, trong đó có các nhà khoa học

Việt Nam đã phân lập được 1 gypenosid mới, đặt tên là phanosid (19) Phanosid với

liều 500 μM kích thích tạo ra insulin (in vitro) ở mức gấp 10 lần khi lượng glucose là

33 mM và có khả năng kích tạo insulin ở mức gấp 4 lần khi mức glucose là 16.7 mM

Ở mức đường huyết trên 2 μM hoạt chất glibenclamid, một thuốc tân dược được sử

dụng trong điều trị tiểu đường, chỉ có khả năng kích thích tạo insulin gấp hai lần Khi cho chuột uống phanosid 40 và 80 mg/ml, khả năng hấp thụ glucose được cải thiện đáng kể và mức insulin huyết thanh cũng được tăng cường [22]

O O HO

HO

O

OH

O OH HO

O

OH HO HO

OH

20 21 22

23

19

HO

Cũng trong năm 2004, tác giả Yin F và các cộng sự đã phân lập được ba

gypenosid mới (20-22) cùng với ba hợp chất khác đã được công bố trước đó (23-25)

Cấu trúc của các hợp chất này được xác định bằng các phương pháp phổ nghiệm [17]

15

Năm 2005, tác giả Yin F và các cộng sự đã cô lập được 6 hợp chất triterpen

saponin mới (26-31) có khung 21,23-lacton từ dịch chiết metanol của phần thân cây

giảo cổ lam Cấu trúc của các hợp chất này được xác định bằng phương pháp hóa học

và các phương pháp phân tích phổ NMR [23]

Cùng năm 2005, tác giả Huang T H W và các cộng sự đã tìm ra được

gynosaponin TR1 (32) từ dịch chiết giảo cổ lam có khả năng hoạt hóa receptor X của

gan (LXR), một receptor đóng vai trò quan trọng trong việc điều hòa nồng độ cholesterol, mở ra triển vọng điều trị bệnh xơ vữa động mạch [24]

Năm 2006, tác giả Yin F và các cộng sự đã phân lập được 9 saponin mới

(33-41) có khung dammanran từ dịch chiết metanol của phần thân cây giảo cổ lam

mọc hoang ở Trung Quốc Cấu trúc của các hợp chất này được xác định bằng phương

pháp phân tích phổ NMR và phương pháp hóa học Đặc biệt, các hợp chất 38-41 là

những ví dụ đầu tiên của khung 21,24- cyclopentyldammaran, trong đó có liên kết

C-C giữa C-C-21 và C-C-24 thay vì liên kết ete giữa hai carbon này như 33-37 C-Các hợp chất

33, 36, và 40 có hoạt tính kháng các tế bào ung thư dạ dày SGC-7901 và tế bào ung

thư gan BEL-7402 [25]

17

Năm 2006, tác giả Huang T H W và các cộng sự đã chứng minh đƣợc rằng

dịch chiết của G pentaphyllum và thành phần chính của nó, gypenosid XLIX (42), có

tác dụng kháng viêm bằng cách ức chế sự hoạt hóa NF- kB do lipopolysaccarid (LPS)

trong đại thực bào của chuột [26].

O

O HO

HO O

O HO

HO

OH

O OH

O HO

OH HO

OH O

17 18 19 3

42

CHƯƠNG II NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 XỬ LÝ MẪU THỰC VẬT VÀ CÁC PHƯƠNG PHÁP CHIẾT TÁCH PHÂN LẬP

Ảnh Gynostemma laxum (Wall.) Cogn thu hái ở Hoà Bình

A Cành mang hoa B Quả

Hình 2.1: Ảnh Gynostemma laxum (Wall.) Cogn thu hái ở Hoà Bình

19 Mẫu được thu hái vào tháng 6/2011, tại Mai Châu, Hòa Bình Tên cây do cử nhân Ngô Văn Trại nguyên cán bộ phòng Tài nguyên, Viện Dược liệu xác định 2kg phần trên mặt đất của cây Cổ yếm lá bóng đã phơi khô, xay nhỏ được ngâm chiết bằng MeOH:H2O; (80:20) ở nhiệt độ phòng (x 4 lần) Dịch chiết được gộp lại và cất loại MeOH dưới áp suất giảm ở nhiệt độ 45°C thu được dịch cao tổng Dịch cao tổng

được chiết phân lớp lần lượt với các loại dung môi có độ phân cực tăng dần như :

n-hexan,EtOAc và n-BuOH và cất loại dung môi dưới áp suất giảm thu được 17g; 28g

và 20g cặn các dịch chiết tương ứng

2.1.2 Các phương pháp sắc ký để phân lập chất:

Phân lập các chất sạch từ các dịch chiết bằng các phương pháp sắc ký như:

sắc ký cột thường (SKC), sắc ký cột nhanh (SKCN) và sắc ký lớp mỏng điều chế (SKLMĐC) Các chất hấp phụ như silicagel pha thường hoặc pha đảo RP-18, Sephadex LH-20 được sử dụng để tách chất

2.1.3 Các phương pháp xác định cấu trúc hóa học

Cấu trúc hóa học của các chất phân lập được, được xác định bằng các phương pháp phổ hiện đại như: Phổ tử ngoại (UV), phổ hồng ngoại (FT-IR), phổ khối va chạm electron (EI-MS), và bụi điện tử (ESI-MS), và phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều (1

H-NMR, 13C-NMR, DEPT) và hai chiều 1H-1H-COSY, HMQC, HMBC)

2.2 CÁC PHƯƠNG PHÁP THỬ HOẠT TÍNH

2.2.1 Thử hoạt tính chống oxy hóa

Phương pháp thử hoạt tính chống oxy hóa được thực hiện với enzym

Peroxydaza máu người theo phương pháp của E.C Xavron [34] Peroxydaza là một

nhóm các enzym oxy hóa khử, có mặt trong nhiều bạch cầu hạt trong máu, làm xúc tác cho phản ứng oxy hóa các chất hữu cơ khi có hydroperoxid hay các peroxid khác Chất cho điện tử (dạng khử) + H2O2 chất cho điện tử đã bị oxy hóa + H2O

Phản ứng oxy hóa xảy ra trong cơ thể làm sinh ra các gốc tự do nội sinh có hại

cho cơ thể và gây ra nhiều bệnh khác nhau, trong đó có bệnh ung thư

2.2.2 Thử hoạt tính chống ung thư:

Tiến hành thử hoạt tính chống ung thư bằng việc thử nghiệm khả năng gây độc

tế bào ung thư Các dòng tế bào ung thư ở người được cung cấp bởi ATCC (bảo tàng giống chuẩn Hoa Kỳ) gồm: KB- ung thư biểu mô (CCL-17TM) là dòng luôn luôn được

sử dụng trong các phép thử độ độc tế bào; HepG2 - ung thư gan (HB-8065TM); và MCF7 - ung thư vú (HTB-22TM) Phương pháp thử độ độc tế bào in vitro được viện

ung thư quốc gia Hoa kỳ (NCI) xác nhận là phép thử độ độc tế bào chuẩn nhằm sàng lọc, phát hiện các chất có khả năng kìm hãm sự phát triển hoặc diệt tế bào ung thư ở

điều kiện in vitro

Các mẫu được tiến hành thử tại Phòng Hóa sinh ứng dụng - Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam theo phương pháp chuẩn của Viện

nghiên cứu ung thư Quốc gia Mỹ (NCI) [27]

Giá trị IC50 (nồng độ ức chế 50% số tế bào thử) được tính trên chương trình Table curve với giá trị logarit dựa trên giá trị dãy các thang nồng độ khác nhau của chất thử

và giá trị OD (mật độ quang) đo được trên máy

2.2.3 Thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định:

+ Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định được thử theo phương pháp pha loãng

nồng độ Hadacek F Greger H.- 2000 Chất đối chứng: Ampixilin đối với vi khuẩn Gram (+), Tetraxilin đối với vi khuẩn Gram (–), Nystatin đối với nấm sợi

21

CHƯƠNG III THỰC NGHIỆM 3.1 HÓA CHẤT, THIẾT BỊ VÀ PHƯƠNG PHÁP

3.1.1 Hóa chất, thiết bị nghiên cứu

● Hóa chất

Sắc kí lớp mỏng sử dụng bản mỏng nhôm tráng sẵn silicagen Merck 60GF254,

độ dày 0,2mm và bản mỏng ngược pha RP–18 Sắc ký cột thường: silicagen cỡ hạt

197 - 400 mesh (0,040 - 0,063mm) cho cột đầu Sắc ký cột nhanh: silicagen cỡ hạt 70

- 200 mesh cho cột tiếp theo Sắc kí cột pha đảo: RP–18 Sắc ký lọc gel: Sephadex LH

- 20 Merck Dung môi được cất lại qua cột Vigreux trước khi sử dụng

Phân lập các chất bằng phương pháp sắc kí cột với chất hấp phụ là silicagen cỡ hạt 0,040 - 0,063mm Merck và Sephadex LH - 20

Thuốc thử phun lên bản mỏng chủ yếu sử dụng Vanilin/ H2SO4 trong dung dịch metanol - H2SO4 đặc, sau đó sấy ở nhiệt độ khoảng 1100C

Dung môi dùng chạy cột và triển khai sắc kí lớp mỏng bao gồm n–hexan,

CH2Cl2, EtOAc và MeOH loại tinh khiết đã được cất lại qua cột Vigereux trước khi

- Phổ hồng ngoại (FT - IR) đo dưới dạng viên nén KBr trên trên máy quang phổ IMPACT 410 của hãng Nicolet, Hoa Kì tại Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

- Đèn tử ngoại (UV BIOBLOCK) bước sóng λ = 254nm và 365nm dùng để soi bản mỏng

- Phổ khối phân giải cao HR -ESI-MS được đo trên máy Qstar pulsar

(Applied Biosystems) tại Viện Hóa học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam

- Một số trang thiết bị khác như máy quay cất chân không, máy sấy, máy siêu

âm, tủ sấy và các dụng cụ thuỷ tinh, v.v

3.1.2 Phương pháp nghiên cứu:

● Phương pháp thăm dò hoạt tính sinh học

* Hoạt tính gây độc tế bào

Hoạt tính gây độc tế bào được thử theo phương pháp của Scudiero D.A và

cộng sự [29] Đây là phương pháp thử độ độc tế bào in vitro được viện Ung thư Quốc

gia (NCI) Maryland, Hoa kỳ xác nhận là phép thử độ độc tế bào chuẩn, nhằm sàng lọc, phát hiện các chất có khả năng kìm hãm sự phát triển hoặc diệt tế bào ung thư ở

điều kiện in vitro

Các dòng tế bào ung thư ở người được cung cấp bởi ATCC gồm có:

– Human epidemic carcinoma (KB): Ung thư biểu mô

– Heptatocellular carcinoma (Hep - G2): Ung thư gan

– Human lung carcinoma (LU): Ung thư phổi

– Human breast carcinoma (MCF - 7): Ung thư vú

Các dòng tế bào ung thư nghiên cứu được nuôi cấy trong các môi trường cấy phù hợp có bổ sung thêm 10% huyết thanh phôi bò (FBS) và các thành phần cần thiết khác ở điều kiện tiêu chuẩn (5% CO2; 37oC; độ ẩm 98%; vô trùng tuyệt đối) Tùy

23 thuộc vào đặc tính của từng dòng tế bào khác nhau, thời gian cấy chuyển cũng khác nhau Tế bào phát triển ở pha lỏng sẽ được sử dụng để thử độc tính

Quy trình thử độc tế bào: Cho 200 μg dung dịch tế bào pha loãng nồng độ ở

3 104 tế bào/ml vào mỗi giếng (đĩa 96 giếng) trong môi trường RPMI 1640 cho các dòng tế bào Hep - G2, MCF7, KB; môi trường DMEM cho dòng tế bào LU Mẫu thử được xử lý với tế bào ở các nồng độ pha loãng khác nhau sao cho đạt đến nồng độ cuối cùng là 128 μg/ml; 32 μg/ml; 8 μg/ml; 2 μg/ml; 0,5 μg/ml Ủ ở 37oC, 5% CO2 3 ngày Giếng điều khiển gồm 200 μl dung dịch tế bào nồng độ 3 104 tế bào/ml ủ ở

39oC, 5% CO2 3 ngày, thêm 50 μl MTT (1mg/ml pha trong môi trường nuôi cấy không huyết thanh), ủ ở 37oC trong 4 giờ, loại bỏ môi trường, thêm 100 μl DMSO, lắc đều, đọc kết quả ở bước sóng 540 nm trên máy spectro photometer Genios TECAN

Giá trị IC50 (nồng độ ức chế 50% số tế bào thử) được tính trên chương trình Table curve với giá trị logarit dựa trên giá trị dãy các thang nồng độ khác nhau của chất thử và giá trị OD (mật độ quang) đo được trên máy

* Phương pháp thử hoạt tính kháng oxi hóa

- Phương pháp kháng oxi hóa thông qua phản ứng bao vây gốc tự do (DPPH)

Phản ứng được tiến hành theo phương pháp của Shela G., M.B., Elena, K và cộng sự (2003) Dựa theo nguyên tắc chất 1,1- diphenyl - 2 - picrylhydratzyl (DPPH)

có khả năng tạo ra các gốc tự do bền trong dung dịch EtOH bão hòa Khi cho các chất thử nghiệm vào hỗn hợp này, nếu chất có khả năng trung hòa hoặc bao vây các gốc tự

do sẽ làm giảm cường độ hấp thụ ánh sáng của các gốc tự do DPPH Hoạt tính chống oxi hóa được đánh giá thông qua giá trị hấp thụ ánh sáng của dịch thí nghiệm so với đối chứng khi đọc trên máy Elisa ở bước sóng 515nm

Khả năng bẫy các gốc tự do SC% (Scavenging Capacity)

Giá trị trung bình của SC% ở các nồng độ mẫu được đưa vào chương trình xữ lí

số liệu Exel theo công thức:

n 1Các mẫu có biểu hiện hoạt tính (IC 50) sẽ được thử nghiệm bước 2 để tìm giá trị IC50

Giá trị IC50 ( g / ml)

Mẫu được pha theo 5 thang nồng độ Giá trị IC50 được xác định bằng chương trình table curve thông qua nồng độ chất thử và % hoạt động của chất thử mà ở đó 50

% các gốc tự do tạo bởi DPPH được trung hòa chất thử

- Phương pháp thử hoạt tính peroxydaza

Nguyên liệu: Máu tươi được chống đông bằng ADC Adenine dextrose citrate), pha loãng 10 - 20 lần bằng nước cất Chia thành các ống nhỏ 0,5 - 1 ml Dùng cho thí nghiệm cất trong tủ lạnh - 80oC Khi dùng pha loãng thêm 25 - 50 lần bằng RB H2O2(0,2N hoặc 2%)

Indigo: chuẩn bị dung dịch stock - 80oC: 0,1N, pha loãng 100 lần sẽ thu được dung dịch phản ứng 0,001N

25 + 50 l dung dịch đệm axetat natri pH 4,7 0,1N

+ 10 l chất thử pha trong DMSO và RB

+ 60 l enzym pha loãng 500 lần

* Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định

+ Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định được thử theo phương pháp pha loãng

nồng độ Hadacek F Greger H - 2000 Chất đối chứng : Ampixilin đối với vi khuẩn Gram (+), Tetraxilin đối với vi khuẩn Gram (–), Nystatin đối với nấm sợi

Trong khuôn khổ đề tài này, chúng tôi thực hiện thử hoạt tính sinh học của các dịch chiết từ cây Cổ yếm lá bóng tại Phòng Hóa sinh ứng dụng- Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

● Phương pháp chiết mẫu thực vật

Mẫu thực vật thường được chiết theo hai cách:

- Cách thứ nhất: Chiết mẫu với dung môi là MeOH hay EtOH ở nhiệt độ thường

hoặc có thể tăng nhiệt độ Thực hiện chiết mẫu lặp lại từ 3 đến 4 lần Dịch chiết thu được được cất loại dung môi dưới áp suất giảm bằng máy quay cất chân không Thu được cao chiết MeOH tổng Cao chiết tổng này được chế thêm nước và chiết phân lớp lần lượt với n–hexan, EtOAc và MeOH bằng phễu chiết Với mỗi loại dung môi cũng thực hiện chiết lặp lại từ 3 đến 4 lần Các dịch chiết được cất loại dung môi sẽ thu được các cao chiết tương ứng (cao: n–hexan; EtOAc; MeOH) để tiếp tục nghiên cứu

- Cách thứ hai: Mẫu thực vật khô được chiết lần lượt với từng loại dung môi có độ

phân cực tăng dần như: n-hexan, EtOAc và MeOH Với mỗi loại dung môi được chiết lặp lại từ ba đến bốn lần Cất loại dung môi dưới áp suất giảm bằng máy quay cất chân không sẽ thu được các cao chiết tương ứng để tiếp tục nghiên cứu

Trong khuôn khổ đề tài này chúng tôi thực hiện việc chiết mẫu theo cách thứ nhất

● Phương pháp tách và tinh chế chất

Các cao dịch chiết trong các dung môi khác nhau thu được, được tách và tinh chế bằng phương pháp sắc kí cột kết hợp với sắc kí lớp mỏng với các hệ dung môi thích hợp Sắc ký cột gồm sắc ký cột thường và sắc ký cột nhanh (flash chromatography) sử dụng silicagen Đối với các chất phân cực có thể sử dụng sephadex LH–20 hoặc ngược pha RP–18 Kiểm tra các phân đoạn và độ sạch của các chất cũng như theo dõi quá trình tách chất trên cột bằng sắc kí lớp mỏng với hệ dung môi thích hợp

● Phương pháp xác định cấu trúc hóa học của các chất

Việc xác định cấu trúc hóa học của các chất sạch được thực hiện thông qua việc kết hợp các phương pháp phổ hiện đại như phổ hồng ngoại (FT- IR), phổ khối (MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều và hai chiều (1D và 2D NMR) như 1H - NMR, 13

C-NMR, DEPT, COSY, HSQC, HMBC

3.2 CHIẾT TÁCH VÀ TINH CHẾ CÁC CHẤT TỪ CÂY CỔ YẾM LÁ BÓNG

GYNOSTEMMA LAXUM (WALL.) COGN

3.2.1 Xử lý mẫu thực vật

Mẫu Cổ yếm lá bóng thu hái vào tháng 6 năm 2011 tại Hòa Bình Tổng số 2

kg mẫu đã được sấy khô ở nhiệt độ 40ºC đến nhiệt độ không đổi Sau đó đem xay nhỏ chiết với hỗn hợp dung môi MeOH:H2O = 80:20 ở nhiệt độ phòng (chiết lặp lại 4 lần) lượng dung môi mỗi lần dùng để chiết 3 lít Thời gian mỗi lần ngâm chiết 4 giờ Dịch chiết được quay cất loại dung môi dưới áp suất giảm bằng máy quay cất chân không, thu được cặn dịch chiết MeOH (khoảng 300ml cặn dịch)

27

Từ 300 ml cặn dịch được pha loãng thêm bằng nước cất sau đó dùng các dung môi có độ phân cực khác nhau (n-hexan; ethylacetat; n-butanol) để chiết phân lớp Mỗi loại dung môi được chiết lặp lại 4 lần: các dịch chiết được cô quay cất loại dung môi dưới áp suất giảm bằng máy quay cất chân không, thu được các cặn dịch chiết tương ứng; n- hexan (17gam); ethylacetat (28gam) và n-butanol (20gam)

3.2.2 Chiết tách và tinh chế các chất từ dịch chiết etyl axetat

Từ 28 gam dịch chiết EtOAc được tách bằng sắc ký cột trên silicagen (đường kính cột d = 60mm; chiều dài lớp silicagen l = 600mm); với 500 gam chất hấp phụ silicagel Merck (cỡ hạt 0,043-0,063mm), rửa giải bằng hệ dung môi CH2Cl2:MeOH (98:2) Sau đó tăng dần đến tỉ lệ 95:5 và chạy cột tiếp đến tỉ lệ 1:1 Kiểm tra độ tinh khiết của các phân đoạn bằng sắc ký lớp mỏng (SKLM), hệ dung môi là

CH2Cl2:MeOH ở các tỉ lệ khác nhau; hiện hình bằng UV bước sóng λ =360nm Sau khi gộp các phân đoạn giống nhau lại thu được 15 nhóm phân đoạn các nhóm phân đoạn được ký hiệu từ E1 đến E15 Phân đoạn E2 dược kết tinh lại thu được chất sạch

E2.2 (18mg) ký hiệu là GCL2.2 (46) Qua phân tích các số liệu phổ và so sánh với tài liệu tham khảo cho biết chất GCL2.2 (46) là 4‟,7-dimethoxy kaempferol Gộp 4 nhóm

phân đoạn từ E12-E15 đặt tên là E14 (14g), từ 14 gam phân đoạn E14 được tách bằng sắc ký cột có kích thước (đường kính cột d= 30mm; chiều dài lớp silicagel l=600mm) với 200 gam chất hấp phụ silicagel Merck (cỡ hạt 0,043-0,063mm) rửa giải bằng hệ dung môi CH2Cl2:MeOH (100:2) sau đó tăng dần đến tỉ lệ 1:1 Kiểm tra các phân đoạn bằng sắc ký lớp mỏng (SKLM), hệ dung môi là CH2Cl2:MeOH 95:5 hiện hình bằng

UV bước sóng λ =360nm Sau khi gộp các phân đoạn giống nhau thu được 9 nhóm phân đoạn Các phân đoạn được ký hiệu là E14.1 đến E14.9 Phân đoạn E14.2 được tách lại qua sắc ký cột nhiều lần và tinh chế lại thu được chất sạch ký hiệu là GCl14.2

(44) Qua phân tích các số liệu phổ và so sánh với tài liệu tham khảo cho biết chất GClL4.2 (44) là 4‟,7-dimethoxy quercetin (còn có tên là Ombuin)

Sơ đồ chiết và tách chất từ dịch chiết EtOAc

SKC nhắc lại Cột silica gen, CH 2 Cl 2 :MeOH 100 : 1

Cột silicagen

Hệ dung môi: CH2Cl2 : MeOH 98 : 2 (Tăng dần MeOH)

Cô quay dung môi dưới áp suất giảm

Chiết phân lớp lần lượt với dung môi: n-hexan, EtOAc, n-BuOH (mỗi loại chiết 4 lần)

Cô quay dung môi dưới áp suất giảm Cặn chiết MeOH

28 gam cặn chiết EtOAc (E)

17 gam cặn chiết

n-hexan (H)

20 gam cặn chiết BuOH (B)

GCL 14.4 - 11mg

GCL14.5.4

- 8mg

E11 E10

SKC nhắc lại

SKC nhắc lại

29

3.2.3 Chiết tách và tinh chế các chất từ dịch chiết BuOH

Tử 20 gam cặn dịch chiết n-butanol, được tách bằng sắc ký cột đường kính cột d= 50mm; chiều dài lớp silicagen l = 600mm) với 350 gam silicagen Merck (cỡ hạt 0,043-0,063mm) rửa giải bằng hệ dung môi CH2Cl2:MeOH (95:5) sau đó tăng dần tỉ lệ CH2Cl2:MeOH 1:1 và cuối cùng chạy hoàn toàn bằng MeOH Kiểm tra các phân đoạn bằng sắc ký lớp mỏng (SKLM), hệ dung môi là CH2Cl2:MeOH 9:1 hiện hình bằng UV bước sóng λ =360nm Sau khi gộp các phân đoạn giống nhau thu được

9 nhóm phân đoạn Các phân đoạn được ký hiệu là B.1 đến B.9

- Phân đoạn B6 được tách trên cột sephadex LH-20 hệ dung môi rửa giải là MeOH

thu được chất sạch ký hiệu là GCL17(43) (50mg) Phân tích phổ 1

H và 13C-NMR cho thấy chất này chính là 3‟,4‟,5,7- tetrahydroxyflavonol hay còn gọi là quercetin

- Phân đoạn B8 được tách trên cột sephadex LH-20 (lặp lại nhiều lần ) hệ dung môi rửa giải là MeOH thu được 2 phân đoạn B8.1 và B8.2 Kết tinh lại phân đoạn B8.2

trong MeOH thu được 20mg chất sạch ký hiệu là GCLB.3N (45) Qua phân tích các

số liệu phổ cho thấy đây là 3,3‟,5- trihydroxy-4‟,7- dimethoxyflavone 3-O-rutinosid còn được gọi là ombuin rutinosid

Sơ đồ chiết và tách chất từ dịch chiết BuOH

Sắc ký cột silicagen lặp lại nhiều lần

- Chiết phân lớp(n-hexan;

EtOAc; n-BuOH) mỗi loại 4 lần

- Cô quay loại dung môi

Cặn chiết BuOH (20g)

Cặn chiết EtOAc (28g)

Cặn chiết n-hexan

(17g)

Sephadex LH-20 Dung môi tách MeOH

PĐB17 (50mg)

Sephadex LH-20 Dung môi tách MeOH

PĐB8.1

PĐB8.2

Kết tinh lại

PĐB3N