xây dựng quy trình phát hiện thịt trong thực phẩm chay bằng phương pháp pcr gen 16s ty thể

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG --- NGUYỄN THỊ MỸ DIỄM XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÁT HIỆN THỊT TRONG THỰC PHẨM CHAY BẰNG PHƯƠNG PHÁP PCR GEN 16S TY THỂ ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH CÔNG

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

-

NGUYỄN THỊ MỸ DIỄM

XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÁT HIỆN THỊT TRONG THỰC PHẨM

CHAY BẰNG PHƯƠNG PHÁP PCR GEN

16S TY THỂ

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: TS VŨ NGỌC BỘI ThS HỒ THỊ THANH THỦY

Nha Trang 2011

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

-

NGUYỄN THỊ MỸ DIỄM

XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÁT HIỆN THỊT TRONG THỰC PHẨM CHAY BẰNG PHƯƠNG PHÁP PCR GEN

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Để hoàn thành Đồ án này

Trước hết tôi xin gửi tới Ban Giám hiệu Trường Đại học Nha Trang, Ban Giám đốc Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường, Phòng Đào tạo Đại học và Sau đại học niềm kính trọng, sự tự hào được học tập tại trường trong những năm qua

Sự biết ơn sâu sắc nhất tôi xin được giành cho thầy: TS Vũ Ngọc Bội - Phó Giám đốc Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường - Trường Đại học Nha Trang, ThS Hồ Thị Thanh Thủy - Phó Giám đốc Công ty CPCN Việt Á và TS

Lê Huyền Ái Thúy - Khoa Công nghệ Sinh học - Trường Đại học Mở TP Hồ Chí Minh đã tận tình hướng dẫn và động viên tôi trong suốt quá trình thực hiện

đồ án tốt nghiệp này

Xin cám ơn: ThS Khúc Thị An - Quyền Trưởng Bộ môn Công nghệ Sinh học và các thầy cô phản biện đã cho tôi những lời khuyên quí báu để công trình nghiên cứu được hoàn thành có chất lượng

Đặc biệt xin được ghi nhớ tình cảm, sự giúp đỡ của: các thầy cô giáo trong

Bộ môn Công nghệ Sinh học - Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường - Trường Đại học Nha Trang, Ban lãnh đạo Công ty CPCN Việt Á đã giúp đỡ nhiệt tình và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian tôi thực hiện đồ

án này

Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình, người thân và các bạn bè đã tạo điều kiện, động viên khích lệ để tôi vượt qua mọi khó khăn trong quá trình học tập vừa qua

Người thực hiện NGUYỄN THỊ MỸ DIỄM

Trang

CÁC CHỮ VIẾT TẮT i

DANH MỤC CÁC BẢNG ii

DANH MỤC CÁC HÌNH iii

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

PHẦN I TỔNG QUAN 3

1 TỔNG QUAN VỀ THỰC PHẨM CHAY 4

1.1 Sơ lược về ăn chay 4

1.2 Tình hình thực phẩm chay nhiễm thịt trong và ngoài nước 4

2 TỔNG QUAN VỀ HỆ GEN TY THỂ 5

2.1 Cấu trúc hệ gen ty thể 5

2.2 Gen 16S rRNA trong phát hiện thịt động vật 8

3 PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN CÁC LOẠI THỊT KHÁC NHAU TRONG THỰC PHẨM 10

3.1 Phương pháp phát hiện thịt dựa trên phân tích protein 10

3.1.1 Phương pháp dựa trên kỹ thuật điện di 11

3.1.2 Phương pháp Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay (ELISA) 11

3.2 Phương pháp phát hiện thịt dựa trên phân tích DNA 12

3.2.1 Phương pháp lai phân tử (DNA hybridization) 12

3.2.2 Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) 13

3.2.3 Phương pháp Real time PCR 15

PHẦN II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 17

1 VẬT LIỆU VÀ THIẾT BỊ 18

1.1 Vật liệu- hóa chất 18

1.1.1 Mẫu thực phẩm 18

1.1.2 Mồi 18

1.1.3 Hóa chất .18

2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

2.1 Phương pháp xử lý mẫu 20

2.2 Phương pháp tách chiết DNA 20

2.2.1 Nguyên tắc 20

2.2.2 Tiến hành 21

2.3 Tiến hành phản ứng PCR 21

2.3.1 Thành phần 21

2.3.2 Chu trình nhiệt của phản ứng 21

2.3.3 Phương pháp tiến hành thí nghiệm 22

2.4 Điện di trên gel agarose 23

2.4.1 Nguyên tắc 23

2.4.2 Pha hóa chất 23

2.4.3 Tiến hành 23

2.5 Phương pháp thiết kế mồi .23

2.5.1 Tiêu chuẩn thiết kế mồi 23

2.5.2 Các phần mềm sử dụng 24

2.5.3 Phương pháp tiến hành 24

2.6 Phương pháp đánh giá mồi trên lí thuyết 25

2.7 Phương pháp đánh giá mồi trên thực nghiệm 25

2.7.1 Phương pháp đánh giá khả năng hoạt động của mồi 25

2.7.2 Phương pháp khảo sát nhiệt độ lai tối ưu của mồi 25

2.7.3 Phương pháp khảo sát độ đặc hiệu của mồi 25

2.7.4 Phương pháp khảo sát độ nhạy của phản ứng 26

PHẦN III KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 27

1 THIẾT KẾ MỒI 28

2 KHẢO SÁT CÁC ĐẶC TÍNH CỦA MỒI TRÊN LÝ THUYẾT 28

2.1 Khảo sát kích thước, %GC, nhiệt độ nóng chảy (Tm) .28

2.2 Khảo sát cấu trúc thứ cấp của mồi 29

3 KHẢO SÁT MỒI TRÊN THỰC NGHIỆM 35

3.1 Khảo sát sự hoạt động của mồi 35

3.2 Kết quả giải trình tự 36

3.3 Khảo sát nhiệt độ lai 39

3.4 Khảo sát độ đặc hiệu của mồi 40

3.5 Khảo sát độ nhạy của quy trình 41

4 ỨNG DỤNG QUY TRÌNH TRÊN MẪU THỰC PHẨM CHAY 42

PHẦN 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 45

1 KẾT LUẬN 45

2 KIẾN NGHỊ 45

TÀI LIỆU THAM KHẢO 46

CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DNA Deoxyribonucleic acid

dNTP Deoxynucleotide triphotphat

BLAST Basic Local Alignment Search Tool

EDTA Ethylen Diamine Tetraacetic Acid

ELISA Enzyme Link Immuno Sorbent Assay FDA Food and Drug Administration

IDT Intergrated DNA Technologies

IEF Isoelectric Focusing

mtDNA mitochondrial DNA

PCR Polymerase Chain Reaction

PAGE Polyacrylamide gel

SDS Sodium Dodecyl Sulphate

RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism rRNA ribosome ribonucleic acid

tRNA transport ribonucleic acid

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang

Bảng 1.1: Ribosome của các loài 9

Bảng 3.1: Trình tự mồi thiết kế 28

Bảng 3.2: Kết quả khảo sát kích thước, %GC, Tm của mồi 28

Bảng 3.3: Năng lượng tự do ΔG của các cấu trúc thứ cấp 29

Bảng 3.4a: Kết quả BLAST mồi xuôi trên NCBI 33

Bảng 3.4b: Kết quả BLAST mồi ngược trên NCBI 34

Bảng 3.5: Kết quả giải trình tự sản phẩm PCR từ chứng dương 36

Bảng 3.6: Kết quả tìm kiếm trình tự tương đồng với sản phẩm PCR trên GeneBank bằng phầm mềm BLAST 38

Bảng 3.7: Thống kê kết quả khảo sát 29 mẫu thực phẩm chay trên thị trường 43

DANH MỤC CÁC HÌNH VÀ SƠ ĐỒ

Trang Hình 1.1: Cấu trúc của ty thể 6

Hình 1.2: Cấu trúc hệ gene ty thể 8

Hình 1.3 Nguyên tắc trong phản ứng PCR 15

Hình 3.1: Cấu trúc selt-dimer của hai mồi (a, b: cấu trúc của mồi xuôi, c: cấu trúc của mồi ngược) 30

Hình 3.2: Dạng cấu trúc hetero-dimer 30

Hình 3.3: Kết quả kiểm tra khả năng bắt cặp của mồi bằng Annhyb 31

Hình 3.4a: Kết quả kiểm tra tính đặc hiệu của mồi xuôi trên ClustalX 32

Hình 3.4b: Kết quả kiểm tra tính đặc hiệu của mồi ngược trên ClustalX 32

Hình 3.5: Kết quả điện di sản phẩm PCR nhằm khảo sát sự hoạt động của mồi 35

Hình 3.6: Kết quả giải trình tự mẫu chứng dương DNA thịt heo 37

Hình 3.7: Kết quả kiểm tra độ tương đồng của sản phẩm PCR trên ClustalX 38

Hình 3.8: Kết quả điện di sản phẩm PCR nhằm khảo sát nhiệt độ lai 39

Hình 3.9: Kết quả điện di sản phẩm PCR nhằm khảo sát độ đặc hiệu của mồi 40

Hình 3.10: Kết quả điện di sản phẩm PCR nhằm khảo sát độ nhạy của quy trình 41

Hình 3.11: Kết quả ứng dụng quy trình phát hiện thịt trong thực phẩm chay 42

Sơ đồ : Quy trình tiến hành thí nghiệm 22

Âu Lạc, Kim Chi có ghi rõ đầy đủ thành phần nguyên liệu trên sản phẩm, trong khi đó sản phẩm của các cơ sở chế biến nhỏ, lẻ lại chưa được kiểm soát và rất thiếu thông tin

về thành phần nguyên liệu [30]

Một số nghiên cứu mới đây cho thấy những thành phần hương liệu mà các nhà sản xuất đưa vào sản xuất thực phẩm chay có chứa thịt hoặc nước xương hầm thịt vì vậy khiến cho những người ăn chay vô tình phá giới và làm cho thực phẩm ăn chay chưa đúng với tên gọi của nó Vấn đề đặt ra là làm sao để xác định được thành phần của sản phẩm chay có chứa thịt động vật hay hay không là một yêu cầu bức thiết Trên thế giới cũng như ở Việt Nam, một số nhà khoa học đã đưa ra một số phương pháp để nhận biết các loại thịt và xác định nguồn gốc của thịt nhưng vẫn chưa được các cấp quản lý thực phẩm quan tâm nhiều Các phương pháp phát hiện thịt chủ yếu là dựa vào phát hiện trình tự gen ty thể để phát hiện loài Bởi DNA ty thể có nhiều

ưu điểm thích hợp làm đối tượng nghiên cứu như: DNA ty thể có đặc điểm đơn bội, không tái tổ hợp, di truyền theo dòng mẹ; Số lượng bản sao lớn trong mỗi tế bào; trong khi tách chiết, DNA ty thể bền vững hơn DNA nhân do có cấu trúc dạng vòng, khó bị phá vỡ và dễ dàng tách chiết hơn[2] Đặc biệt, gen 16S ty thể là trình tự có những vùng

bảo tồn ở hầu hết các loài động vật nên có thể dựa vào đặc điểm này để xây dựng quy trình phát hiện DNA của động vật khi chúng có mặt trong thực phẩm chay

Vì những lí do trên, chúng tôi tiến hành đề tài “Xây dựng quy trình phát hiện thịt trong thực phẩm chay bằng phương pháp PCR gen 16S ty thể”

Mục đích của đồ án: đánh giá chính xác và nhận biết nhanh chóng sự có mặt của

thịt trong các sản phẩm chay

Nội dung:

1) Thiết kế mồi cho phản ứng PCR

2) Khảo sát các đặc tính của mồi đã thiết kế về mặt lý thuyết

3) Khảo sát khả năng hoạt động của mồi khi thực hiện phản ứng PCR

4) Thử nghiệm phát hiện thịt trong thực phẩm chay bằng phản ứng PCR gen 16S

ty thể

Về phương diện khoa học, đây là quy trình mới có thể nhận biết được sự có mặt của DNA các loài động vật nói chung Về mặt thực tiễn, phương pháp sẽ giúp cơ quan quản lý chất lượng thực phẩm kiểm soát được các mặt hàng thực phẩm chay trên thị trường, giúp người tiêu dùng an tâm hơn khi sử dụng các sản phẩm chay

PHẦN I

TỔNG QUAN

1 TỔNG QUAN VỀ THỰC PHẨM CHAY

1.1 Giới thiệu về thực phẩm chay

Thực phẩm chay là thực phẩm không chứa các thành phần động vật và những chất có nguồn gốc động vật

Thực phẩm chay giả mặn là những thực phẩm được chế biến chủ yếu từ tinh bột được tạo hình mô phỏng thành các món ăn mặn như tôm, mực, thịt heo, bò, cá

Thuật ngữ “ăn chay” được biết đến ở đạo Phật và một vài tôn giáo khác Ngày nay, ăn chay đang trở thành một trào lưu trên thế giới, nhất là trong giới tri thức và các chuyên gia Ở các nước phương Tây, theo thống kê chưa đầy đủ, có khoảng 5% dân số Anh và Mỹ cho biết họ ăn chay trường hay ăn chay thường xuyên [26] Rất nhiều nghiên cứu khoa học trong hơn 20 năm qua đã cho thấy ăn chay còn được xem như một liệu pháp để giảm bớt nguy cơ xảy ra nhiều loại bệnh tật nguy hiểm như tim mạch, cao huyết áp, đái tháo đường, ung thư, Trong một nghiên cứu trên 47.000 người Mỹ cho thấy nhóm người ăn chay có nguy cơ mắc bệnh tim mạch thấp hơn nhóm ăn mặn khoảng 20% Ăn chay và ăn nhiều rau quả còn giảm nguy cơ tai biến mạch máu não đến 22% Ngoài ra, ăn chay còn giảm nguy cơ mắc bệnh ung thư vú, ruột và phổi so

với ăn mặn Một nghiên cứu khác trên 26.000 người Mỹ cho thấy người ăn chay có tỉ

lệ mắc bệnh đái tháo đường thấp hơn người ăn mặn khoảng 25%[28] Hơn nữa, ăn chay được xem như một biện pháp bảo vệ môi trường Do đó, nhu cầu về thực phẩm chay trên thị trường hiện nay là rất lớn

1.2 Tình hình thực phẩm chay nhiễm thịt trong và ngoài nước

Cơ quan tiêu chuẩn chất lượng thực phẩm (FDA) tại Đài Bắc đã khám phá ra rằng

15 loại trong 21 loại thực phẩm chay giả thịt lấy từ các khu chợ có chứa DNA động vật, chiếm hơn 70%.[30] Theo các nghiên cứu này, DNA của các loài động vật thường được phát hiện trong thực phẩm chay như: động vật nuôi có sừng (trâu, bò,…), gia cầm (gà, vịt, đà điểu,…), heo và cá Ngày 1 tháng 7 năm 2009, Đài Loan đã ban hành các đạo luật về việc dán nhãn các thực phẩm chay với mục đích đảm bảo các thực phẩm

này là chay[31] Như vậy, trên thế giới, số sản phẩm chay bị nhiễm thịt tăng cao đến mức báo động

Ở Việt Nam, các sản phẩm chay giả mặn đang ngày càng thịnh hành trên thị trường từ các siêu thị, nhà hàng, quán ăn cho đến các chợ, quán tạp hoá lớn nhỏ trên khắp cả nước như: thịt bò chay, thịt heo chay, sườn non chay, bóng cá chay, tôm chay, cánh gà chay, đùi gà chay, cá thu chay, mực chay… Giá thành của các sản phẩm chay giả mặn thường cao hơn so với các sản phẩm mặn Theo khảo sát thị trường giá một số loại như sau: tôm chay 120.000đ/kg, mực chay cắt lát 50.000đ/kg, cá viên chay 30.000đ/kg, Sườn non chay: 65.000 đồng/kg, Chả lụa chay: 13.000 đồng/cây 400gr, Chà bông chay các loại: 112.000 đồng/kg, Thịt gà xé /bò xé kim chi: 8.000 đồng/gói 50gr, Bò viên/cá viên chay: 10.500 đồng/gói 180gr…

Thị trường thực phẩm chay tại các chợ lớn tại thành phố Hồ Chí Minh như chợ

An Đông, Bình Tây, Bến Thành…rất đáng ngờ vì các sản phẩm chủ yếu được nhập từ Đài Loan, Thái Lan, Trung Quốc không ghi rõ thành phần, nguồn gốc, hạn sử dụng nhưng được bày bán rất phổ biến Ngoài ra còn có những sản phẩm chay nội địa được sản xuất tại các cơ sở nhỏ lẻ tại địa phương với hình dáng và mùi vị rất giống với món mặn[32]

Vấn đề thực phẩm chay bị nhiễm thịt đang được nhiều người quan tâm nên việc tìm ra phương pháp để phát hiện thịt trong thực phẩm chay là rất cần thiết

2 GIỚI THIỆU VỀ HỆ GEN TY THỂ

2.1 Cấu trúc của hệ gen ty thể [2,4,6,7,12,13,16]

của các enzyme hô hấp Các lớp màng chia ty thể thành hai khoang riêng biệt: khoang chứa chất nền nằm bên trong ty thể và khoang gian màng nằm giữa hai lớp màng.[2]

Hình 1.1 Cấu trúc của ty thể

Ty thể là bào quan quan trọng, có mặt trong tất cả các tế bào hô hấp hiếu khí, giữ vai trò trung tâm trong việc sản sinh năng lượng, trao đổi amino acid, trao đổi chất béo, trao đổi steroid và chết theo chương trình của tế bào (apoptosis) Nhờ chứa chuỗi truyền điện tử, các enzyme của chu trình Krebs và phosphoryl hóa, ty thể thực hiện quá trình oxy hóa các carbohydrate, các acid béo, các amino acid… giải phóng ra năng lượng dưới dạng các liên kết phosphate cao năng trong phân tử ATP Đây là dạng năng lượng cần thiết cho mọi hoạt động sống của tế bào

 Cấu trúc hệ gen ty thể

Hệ gen ty thể là phân tử DNA trần, kép, mạch vòng, gồm hai chuỗi: chuỗi nặng (H strand) giàu guanine và chuỗi nhẹ (L strand) giàu cytosine Khác với DNA nhân, DNA ty thể không liên kết với protein histon do đó DNA ty thể rất giống với DNA vi khuẩn[4][16]

Ở động vật, ngoài hệ gen trong nhân còn có hệ gen tế bào chất nằm trong ty thể chiếm tỉ lệ từ 1 – 5% DNA của tế bào Kích thước của hệ gen ty thể (mtDNA) ở động vật vào khoảng 15 - 17kb[13]

DNA ty thể có các đặc điểm cơ bản sau:

- Tốc độ đột biến lớn gấp 5 - 10 lần so với hệ gen nhân

- Số lượng bản sao lớn

- Đơn bội, hầu như không có sự tái tổ hợp

- Di truyền theo dòng mẹ ở phần lớn các loài

MtDNA có đặc điểm đơn bội, không tái tổ hợp, di truyền theo dòng mẹ, điều đó

có nghĩa là mỗi phân tử cũng như toàn bộ mtDNA thường chỉ có một lịch sử phả hệ theo dòng mẹ Thêm vào đó mtDNA tồn tại với số lượng bản sao lớn trong mỗi tế bào Các đặc điểm trên cùng với việc mtDNA bền vững hơn DNA nhân trong khi tách chiết

do có cấu trúc dạng vòng, nên mtDNA được sử dụng như là một công cụ phân tử trong việc phân tích các mối quan hệ tiến hóa và biến đổi di truyền trong loài và giữa các loài

có nhiều thuận lợi

Tất cả genome ty thể động vật có chứa 37 gen, 2 rRNA, 22 tRNA và 13 mRNA Gen rRNA mã hóa cho các RNA ribosome[13]

Hình 1.2 Cấu trúc hệ gen ty thể 2.2 Gen 16S rRNA trong phát hiện thịt động vật [10,19,20,22]

 Đặc điểm cấu trúc và vai trò của ribosome RNA (rRNA)

Ribosome là một bào quan có mặt trong tất cả các tế bào của sinh vật sống, ribosome của vi khuẩn, sinh vật đơn bào và sinh vật đa bào tuy có sự khác nhau về cấu trúc nhưng đều có chức năng dịch thông tin di truyền được "mã hóa" bởi các phân tử DNA sang các phân tử protein (các đơn vị cấu tạo và thực hiện nhiều chức năng khác nhau của cơ thể sinh vật)

Ribosome được cấu tạo từ vài phân tử rRNA và hơn 50 protein, được tập hợp thành 2 tiểu phần (tiểu đơn vị) hoàn toàn thích hợp về cấu trúc và hoạt động Hai tiểu phần này hoạt động thống nhất để thực hiện quá trình dịch mã từ DNA sang chuỗi polypeptide gồm các axít amin trong quá trình tổng hợp protein Theo quy ước các tiểu đơn vị được đặt tên theo tốc độ lắng của chúng dưới lực ly tâm Đơn vị đo tốc độ lắng

là Svedberg và được viết tắt là “S” Ở các ribosome khác nhau có các rRNA khác nhau,

chúng cũng đặc trưng bởi hằng số lắng S, rRNA chiếm tỷ lệ cao trong tế bào có thể đến

75 % của tổng RNA

Ở vi khuẩn thực và vi khuẩn cổ không có ty thể Ở nấm chia thành 2 nhóm, nhóm

1 có ribosome ty thể 70S, tiểu phần lớn 24S, tiêu phần nhỏ 17S; nhóm 2 có ribosome ty thể 72S, tiểu phần lớn 21S và tiểu phần nhỏ 15S Ở thực vật, có ribosome ty thể 75S, tiểu phần lớn gồm 5S và 26S, tiểu phần nhỏ 18S Ở động vật, ribosome ty thể 55S, tiểu phần lớn 16S, tiểu phần nhỏ 12S (Bảng 1.1)

Bảng 1.1 Ribosome của các loài (R Kumar, The molecular biology of plant

5S, 5.8S, 26S 24S

17S 17S + Nấm men

- Tế bào chất

- Ty thể

80S 72S

5S, 5.8S, 25S 21S

18S 15S Thực vật

- Tế bào chất

- Lục lạp

- Ty thể

80S 70S 75S

5S, 5.8S, 25S 5S,(4.5S), 23S (5S), 26S

17S 16S 18S Động vật

- Tế bào chất

- Ty thể

80S 55S

5S, 5.8S, 28S 16S

18S 12S

 Cơ sở sử dụng gen 16S trong phát hiện thịt động vật

Trong hệ gen ty thể động vật chứa hai gen rRNA là 12S và 16S rRNA Gen 16S rRNA mã hóa cho phân tử rRNA trong tiểu phần lớn của ribosome ty thể, được sử dụng trong một số nghiên cứu phát hiện các loài động vật khác nhau như Gregory C

Booton, Jennifer R Carmichael, (2003); Scott Reaney, Trevor Conrad Martin, Jason Paul Sawyer, (2009) Trung bình mỗi tế bào động vật có khoảng 800- 1000 ty thể, mỗi

ty thể có chứa ít nhất 2- 6 phân tử DNA dạng vòng có kích thước 16.500 bp, mỗi phân

tử DNA có chứa 22 tRNA, 2 rRNA và 13 gen mã hóa protein (Garder & Snustad, 1984) Như vậy ít nhất trong mỗi tế bào có chứa 800x2 = 1.600 copies gen 16S rRNA

Vì vậy, sử dụng trình tự gen này nhạy hơn khi sử dụng các gen khác chỉ có một bản copy trong một tế bào

Theo Johanson (1993) có 5 đặc điểm quan trọng trong việc sử dụng gen rRNA làm phân tử đích trong việc chẩn đoán, đó là:

- Trong tế bào sinh vật số lượng ribosome là rất lớn Việc chẩn đoán sử dụng mẫu

dò rRNA sẽ có độ nhạy cao hơn so với các đoạn gen khác chỉ có 1 đoạn copy

- Sự có mặt của các vùng có sự biến đổi khác nhau trên rRNA cho phép xác định được mức độ đặc trưng cho loài, cho giống và cho lớp Khi xác định đoạn DNA ở vùng

S (vùng bán bảo tồn) thì cho phép xác định sự đặc hiệu theo nhóm

- Số lượng trình tự 16S rRNA được nghiên cứu khá chi tiết và khá nhiều trình tự của các loài, giống được giải mã và được công bố trên ngân hàng gen

- Các thủ tục tiêu chuẩn đã được xác lập để giải trình tự gen rRNA

- Sự tiến hoá và biến đổi của ribosome và cấu tạo của nó được xác định là rất thấp

và vì vậy sự ổn định trong chẩn đoán dựa trên rRNA là rất cao và có thể xác định được

cả những loài có quan hệ họ hàng gần gũi

3 PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN CÁC LOẠI THỊT KHÁC NHAU TRONG THỰC PHẨM

3.1 Phương pháp phát hiện thịt dựa trên phân tích protein

Có nhiều phương pháp dựa trên phân tích protein đã được ứng dụng để xác định các loại thịt và các thành phần từ động vật trong thực phẩm, bao gồm: sắc ký khí, điện

di SDS, các phương pháp miễn dịch, ELISA, phân tích hóa học Tuy nhiên, phần lớn các phương pháp này chỉ được ứng dụng để phát hiện thịt tươi hoặc thịt chưa bị thoái hóa (biến tính) và độ đặc hiệu của các phương pháp này tương đối thấp

3.1.1 Phương pháp dựa trên kỹ thuật điện di [14][25]

Phương pháp này dựa trên sự di chuyển của protein trong điện trường Sự di chuyển nhanh hay chậm tùy thuộc vào hình dạng và tỉ số điện tích/khối lượng, nhờ đó các chất khác nhau sẽ được tách ra thành những vết riêng và được phát hiện bằng nhiều cách khác nhau Quá trình điện di có thể thực hiện trên gel polyacrylamide, gel polyacrylamide có chứa yếu tố gây biến tính (sodium dodecyl sulfate) (SDS-PAGE) hoặc điện di tập trung điểm đẳng điện (isoelectric focusing-IEF)

Nghiên cứu của Parisi và Aguiari (1985) đã cho thấy rằng phương pháp PAGE có thể được sử dụng để xác định các loại thịt như: động vật có sừng, cừu, dê, nai, thỏ Trong phương pháp IEF, myoglobin được sử dụng như một chất chỉ thị cho loài Năm 1997, Hofmann đã nghiên cứu myoglobin của các loài động vật như: động vật có sừng, ngựa, lợn, cừu, nai, kang-ku-ru, lạc đà, gấu, thỏ, gà, vịt, đà điểu bằng phương pháp IEF Kết quả cho thấy tập hợp các băng myoglobin có những đặc tính riêng cho từng loài, và có thể xác định được loài động vật dựa vào dữ liệu myoglobin mẫu cho từng loài động vật khác nhau

SDS-Ưu điểm của các phương pháp này là đặc hiệu cho từng loài và có thể phát hiện chính xác nguồn gốc các loại thịt Tuy nhiên, phương pháp này không được dùng để phân tích các mẫu thực tế do giá thành cao, tốn nhiều thời gian, kỹ thuật rất phức tạp,

cần xây dựng cơ sở dữ liệu lớn (phương pháp IEF)

3.1.2 Phương pháp Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay (ELISA) [8][23][24]

Đây là kỹ thuật miễn dịch dựa trên liên kết kết đặc hiệu kháng nguyên-kháng thể

Kỹ thuật này bao gồm một enzyme (có bản chất protein có khả năng xúc tác phản ứng sinh hóa) để phát hiện sự có mặt của kháng nguyên (antigen) hay kháng thể (antibody) trong mẫu phân tích Có hai phương pháp ELISA thường được ứng dụng trong phát hiện các loại thịt khác nhau trong thực phẩm: ELISA gián tiếp (indirect ELISA) và Sandwich ELISA Phương pháp ELISA gián tiếp sử dụng hai kháng thể, kháng thể thứ nhất gắn đặc hiệu với kháng nguyên, kháng thể thứ hai gắn đặc hiệu với kháng thể thứ nhất và có gắn enzyme Do đó khi thêm cơ chất, enzyme sẽ biến đổi cơ chất để phát tín hiệu huỳnh quang hoặc tín hiệu hóa học Phương pháp Sandwich ELISA, kháng

nguyên có trong mẫu bị gắn giữa hai kháng thể: kháng thể thứ nhất đã được cố định trên giếng và kháng thể thứ hai có gắn enzyme để phát hiện sự có mặt của kháng nguyên trong mẫu

Ưu điểm của phương pháp này là: đặc hiệu cho loài, thao tác đơn giản, độ nhạy tương đối cao Do đó nó được sử dụng rộng rãi trong giám định các mẫu thịt tươi (Ayaz và các cộng sự, 2006; Kang’ethe và các cộng sự,1982; Patterson và Jones, 1985; Kang’ethe và Lindqvist, 1987) Tuy nhiên các kháng nguyên dễ bị biến tính bởi nhiệt

độ trong quá trình chế biến thực phẩm, làm phá vỡ cấu trúc bậc ba và làm thay đổi tính tan của chúng trong dung dịch, kết quả là không xảy ra phản ứng kháng nguyên-kháng thể Vì vậy, phương pháp này không có hiệu quả cao trong phân tích các mẫu đã qua quá trình chế biến ở nhiệt độ cao Ngoài ra, phương pháp này còn giới hạn về thời gian

và chỉ phát hiện được một đối tượng trong một lần thực hiện phản ứng

3.2 Phương pháp phát hiện thịt dựa trên phân tích DNA

3.2.1 Phương pháp lai phân tử (DNA hybridization) [15][26][28]

Khi một phân tử DNA mạch đôi được đun lên vượt quá “nhiệt độ nóng chảy” (Tm) thì hai mạch sẽ tách rời nhau, sự bắt cặp trở lại sẽ không xảy ra nếu nhiệt độ phản ứng hạ xuống đột ngột, lúc đó phân tử DNA sẽ tồn tại trong môi trường ở dạng mạch đơn Ngược lại, nếu sau khi hai mạch tách rời, nhiệt độ được làm giảm từ từ cộng với điều kiện thí nghiệm thích hợp hai mạch sẽ bắt cặp trở lại Hiện tượng này gọi là sự lai phân tử (molecular hybridization)

Hiện tượng liên kết như vậy cũng có thể xảy ra giữa hai mạch DNA với nhau, giữa hai mạch RNA hoặc giữa DNA và RNA Phân tử acid nucleic mới hình thành được gọi là phân tử lai và quá trình kết cặp giữa các bazơ thuộc hai mạch đơn acid nucleic có nguồn gốc khác nhau theo nguyên tắc bổ xung như vậy gọi là quá trình lai phân tử

Kỹ thuật lai phân tử được sử dụng rộng rãi trong các nghiên cứu các sản phẩm từ thịt sống hoặc đã qua chế biến Các đoạn dò (probes) DNA đã được thiết kế để phát hiện các loại thịt: heo (Buntjer, Lamine, Haagsma, & Lenstra, 1999; Buntjer, Lenstra,

& Haagsma, 1995; Ebbehøj & Thomsen, 1991b; Hunt, Parkes, & Lumley, 1997), cừu

(Hunt và các cộng sự, 1997), gà, bò, ngựa (Buntjer và các cộng sự, 1999) Tuy nhiên phương pháp này cũng có một số hạn chế là kỹ thuật phức tạp, giá thành cao và độ nhạy thấp hợn so với phương pháp PCR

3.2.2 Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) [5][18]

Phương pháp PCR có độ nhạy và độ đặc hiệu cao Trong phương pháp PCR để xác định các loại thịt khác nhau trong thực phẩm, DNA đích làm khuôn để nhân bản có thể là đoạn DNA thuộc gen cytochrome b, gen 12S rRNA, gen 16S rRNA

 Nguyên tắc: Các enzyme DNA polymerase có khả năng tổng hợp một mạch

mới từ khuôn (đoạn DNA đích ) nhờ một mồi (là trình tự nucleotic ngắn) bắt cặp bổ sung với trình tự trên DNA đích Độ dài của đoạn DNA mới tổng hợp được giới hạn

giữa hai đoạn mồi xuôi (sens primer) và mồi ngược (antisens primer)

 Các thành phần trong phản ứng PCR

- Enzyme Taq polymerase – là một DNA chịu nhiệt được tách chiết từ vi khuẩn

sống ở các suối nước nóng (Thermus aquaticus) Enzyme này không bị phá hủy ở nhiệt

độ biến tính và xúc tác sự tổng hợp từ đầu đến cuối quá trình phản ứng

- Dung dịch đệm (PCR buffer): có tác dụng cung cấp lực ion cần thiết cho phản

ứng xảy ra, tăng cường hiệu quả cho phản ứng PCR Nồng độ, pH của dung dịch đệm

cũng như nồng độ KCl tối ưu thường tùy thuộc vào nguồn DNA polymerase sử dụng

- MgCl 2 : đây là yếu tố ảnh hưởng mạnh đến phản ứng Mg2+ rất cần cho quá trình liên kết các dNTP, xúc tác cho enzyme Taq polymerase, làm tăng Tm của DNA mạch

kép Mg2+ là cofactor của Taq polymerase, nếu lượng Mg2+ quá thấp thì Taq polymerase sẽ không hoạt động bình thường trong giai đoạn kéo dài (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 1999), hạn chế quá trình kéo dài Ngược lại, nếu lượng Mg2+ quá cao dễ gây khuếch đại ký sinh Do đó, nồng độ MgCl2 sử dụng cần được tối ưu hóa cho từng phản ứng PCR Thông thường, MgCl2 được sử dụng ở nồng độ từ 1.5mM-4mM

- Nồng độ dNTPs : bốn loại nucleotide thường được sử dụng ở nồng độ là 20 –

200 µM/ mỗi loại nucleotide Nồng độ cao hơn dễ dẫn đến sự khuếch đại ký sinh, làm giảm hiệu quả phản ứng PCR, sự mất cân bằng trong thành phần các nucleotide làm

tăng lỗi sao chép của DNA polymerase

- Mồi (primer): nồng độ mồi sử dụng trong phản ứng PCR phải được tính toán

và tối ưu qua thực nghiệm Nếu nồng độ mồi quá cao dễ gây khuếch đại ký sinh, nếu quá thấp thì làm giảm hiệu quả khuếch đại của phản ứng Thông thường, nồng độ mồi

sử dụng nằm trong giới hạn từ 0.1 - 1.0 µM

- DNA mạch khuôn: được tách chiết từ tế bào động vật, thực vật, nấm hoặc vi

khuẩn, virus Phản ứng PCR cần lượng DNA ban đầu đưa vào thường không quá cao Thông thường, nồng độ DNA sử dụng tốt nhất ở khoảng 105/ phản ứng

- Các chất tăng cường: ngoài những thành phần cơ bản, đôi khi người ta còn bổ

sung thêm chất tăng cường với mong muốn phản ứng xảy ra hiệu quả hơn Các chất thường sử dụng như: betaine, DMSO (dimethylsulfoxide), glycerol… Tuy nhiên cần thận trọng khi sử dụng những chất này vì chúng có thể gây ức chế phản ứng PCR nếu nồng độ không thích hợp

– Bước 2 (giai đoạn bắt cặp- annealing): nhiệt độ được hạ thấp (thấp hơn Tm của các mồi) cho phép mồi bắt cặp với khuôn Nhiệt độ này giao động từ 55- 65oC tùy thuộc vào độ tương đồng của mồi với trình tự mục tiêu và cách thiết kế mồi

– Bước 3 (giai đoạn kéo dài- elongation): nhiệt độ được tăng lên 72o

C giúp cho DNA polymerase sử dụng vốn là polymerase chịu nhiệt hoạt động tổng hợp tốt nhất Thời gian kéo dài tùy thuộc độ dài của trình tự DNA cần khuếch đại, thường kéo dài từ

30 giây đến nhiều phút

Một chu kỳ gồm 3 bước trên sẽ được lặp đi lặp lại nhiều lần và mỗi lần làm tăng gấp đôi lượng mẫu lần trước Do đó phản ứng PCR có khả năng làm tăng số lượng bản mẫu theo 2n (n là số chu kỳ của phản ứng)

Hình 1.3 Nguyên tắc trong phản ứng PCR 3.2.3 Phương pháp Real time PCR [5][9]

Nguyên tắc Real-time PCR cũng dựa trên PCR thường, nhưng phương pháp này

có thể định lượng được hàm lượng DNA/RNA có trong mẫu nhờ các chất nhuộm phát

huỳnh quang (fluorescent dye)

Phương pháp này sử dụng một thiết bị quang học để theo dõi quá trình khuếch đại bằng cách đo lượng tín hiệu huỳnh quang phát ra Những tín hiệu này được tạo ra từ những chất phát huỳnh quang gắn trên những mẫu dò được thiết kế để bắt cặp với những trình tự mục tiêu cần khuếch đại Tuỳ từng loại mẫu dò mà cơ chế phát huỳnh

quang có sự khác nhau Một số mẫu dò thường được sử dụng để phát hiện đột biến là Taqman probe, Beacon probe, FRET probe

Nhược điểm của phương pháp là phức tạp, chi phí cao do đó giá thành cho việc thực hiện một phản ứng là rất lớn

PHẦN II

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

Cặp mồi sử dụng trong luận văn này được tổng hợp bởi hãng IDT, Hoa Kỳ, trình

tự cụ thể của mồi sẽ được trình bày ở phần kết quả

 Hóa chất dùng cho điện di

Sử dụng bộ điện di Acid Nucleic của công ty Cổ Phần Công Nghệ Việt Á (VA.A 92-005A) bao gồm các thành phần sau:

– Agarose 2%

– Ethidium bromide (10mg/ml)

– Dung dịch nạp mẫu 6X (bromophenol blue, glycerol)

– Dung dịch điện di TAE 1X (Tris acetate, EDTA pH 8.0)

– Thang DNA chuẩn 100bp

1.2 Dụng cụ thiết bị

– Máy tính và các phần mềm chuyên dụng để thiết kế và đánh giá mồi, thiết kế

phản ứng PCR

– Máy Vortex

– Máy ly tâm tốc độ 13000 vòng/phút dùng cho eppendorf

– Tủ tách chiết DNA/RNA vô trùng

2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

– Vortex kỹ và tiến hành tách chiết DNA

(Lưu ý: các dung cụ sử dụng để tách mẫu và xử lý mẫu đều được vô trùng bằng cách ngâm trong cồn và đốt trên ngọn lửa đèn cồn.)

2.2 Phương pháp tách chiết DNA

2.2.1 Nguyên tắc

Gồm ba bước chính như sau:

 Bước 1: Phá màng tế bào và màng nhân bằng các tác nhân vật lý hay hóa học

hoặc kết hợp nhiều tác nhân, giải phóng DNA ra môi trường

 Bước 2: Loại bỏ các thành phần không mong muốn trong mẫu (protein, lipid,

polysaccharide) Thường dùng hỗn hợp phenol-chloroform-isoamyl alcohol (25:24:1) làm biến tính protein Sau đó đem li tâm, protein biến tính sẽ tủa thành một lớp nằm giữa pha nước chứa nucleic acid và pha phenol-chloroform, thu nhận lại pha nước chứa nucleic acid