nghiên cứu phân lập một số chủng vi khuẩn có hoạt tính protease sống bám trên cá chim vây vàng

Xuất phát từ thực tế trên, em được Viện Nghiên cứu Công nghệ Sinh học giao thực hiện đề tài “Nghiên cứu phân lập một số chủng vi khuẩn có hoạt tính protease sống bám trên cá chim vây và

NHẬN XÉT CỦA GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN

NHẬN XÉT CỦA GIÁO VIÊN PHẢN BIỆN

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG I 3

TỔNG QUAN VỀ TÀI LIỆU 3

1.1 GIỚI THIỆU VỀ CÁ CHIM VÂY VÀNG 3

1.2 GIỚI THIỆU VỀ PROBIOTICS 4

CHƯƠNG II 10

NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 10

2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU 10

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12

2.2.1 Cách tiếp cận vấn đề nghiên cứu 12

2.2.2 Phương pháp phân lập vi sinh vật 13

2.2.3 Phương pháp tuyển chọn chủng vi khuẩn sinh protease mạnh nhất: được đánh giá qua hoạt tính sinh protease 15

2.2.4 Phương pháp xác định khả năng sinh trưởng 16

2.2.5 Phương pháp định danh chủng vi khuẩn (theo phương pháp truyền thống) 17

2.2.6 Phương pháp xác định điều kiện nuôi cấy thích hợp 19

2.2.7 Phương pháp nuôi cấy và thu canh trường chứa enzyme của chủng đã phân lập trên môi trường nhân giống cấp 2 22

2.3 PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU 25

CHƯƠNG III 26

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 26

3.1 PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG SINH PROTEASE CAO SỐNG

BÁM TRÊN CÁ CHIM VÂY VÀNG 26

3.2 ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI CỦA CÁC CHỦNG VI KHUẨN PHÂN LẬP 28

3.3 ĐẶC ĐIỀM SINH HÓA CỦA CÁC CHỦNG VI KHUẨN PHÂN LẬP 29

3.3.1 Khả năng lên men các loại đường 29

3.3.2 Khả năng sinh hơi 31

3.3.3 Khả năng chịu muối 32

3.3.4 Khả năng di động 32

3.4 XÁC ĐỊNH MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN HOẠT TÍNH PROTEASE CỦA CHỦNG R2.1.5 PHÂN LẬP ĐƯỢC 33

3.4.1 Thời gian nuôi cấy thích hợp 33

3.4.2 Nhiệt độ nuôi cấy thích hợp 35

3.4.3 pH thích hợp 36

3.5 THỬ NGHIỆM NUÔI CẤY CHỦNG R2.1.5 TRÊN MÔI TRƯỜNG NHÂN GIỐNG CẤP 2 37

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 40

TÀI LIỆU THAM KHẢO 41

DANH MỤC BẢNG

Trang

Bảng 3.1 Hoạt tính protease của các chủng vi khuẩn phân lập được 26

Bảng 3.2 Hoạt tính protease của 5 chủng vi khuẩn cao nhất phân lập được 27

Bảng 3.3 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc và tế bào của vi khuẩn tuyển chọn 28

Bảng 3.4 Khả năng lên men các loại đường của các chủng vi khuẩn phân lập 30

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Cá chim vây vàng (Trachinotus blochii) 4

Hình 2.1 Cách thức tiếp cận vấn đề nghiên cứu 13

Hình 2.2 Quá trình phân lập vi sinh vật 15

Hình 2.3 Quá trình tuyển chọn vi khuẩn sinh protease 16

Hình 2.4 Sơ đồ bố trí thí nghiệm định danh vi khuẩn theo phương pháp truyền thống 17

Hình 2.5: Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định điều kiện nuôi cấy tối ưu 19

Hình 2.6 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định thời gian nuôi cấy tối ưu 20

Hình 2.7 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định nhiệt độ nuôi cấy tối ưu 21

Hình 2.8 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định pH nuôi cấy tối ưu 22

Hình 2.9 Sơ đồ quy trình sản xuất protease từ chủng đã phân lập trên môi trường nhân giống cấp 2 24

Hình 3.1 Hoạt tính protease của các chủng tuyển chọn được 28

Hình 3.2 Hình thái khuẩn lạc và tế bào chủng R2.1.5 dưới độ phóng đại X-100 29

Hình 3.3 Một số hình ảnh về khả năng lên men đường của các chủng vi khuẩn được tuyển chọn 31

Hình 3.4 Khả năng sinh hơi của các chủng vi khuẩn tuyển chọn 31

Hình 3.5 Khả năng chịu muối của các chủng vi khuẩn 32

Hình 3.6 Khả năng di động của các chủng vi khuẩn 33

Hình 3.7 Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh trưởng và hoạt tính enzyme của chủng R2.1.5 34

Hình 3.8 Sự thay đổi họat tính sinh enzyme của chủng vi khuẩn R2.1.5 khi nuôi ở của nhiệt độ môi trường khác nhau 36 Hình 3.9 Sự thay đổi họat tính sinh enzyme của chủng vi khuẩn R2.1.5 khi nuôi ở các

pH môi trường khác nhau 37 Hình 3.10 Canh trường nuôi chứa enzyme protease của chủng R2.1.5 sau 18h nuôi cấy 38 Hình 3.11 Chế phẩm chứa chủng R2.1.5 sau khi đóng gói 38 Hình 3.12 Xác định hoạt độ protease theo phương pháp Gross & Fuld 39

MỞ ĐẦU

Việt Nam có bờ biển dài trên 3000km và vùng thềm lục địa hàng triệu km2 là điều kiện thuận lới để phát triển ngành thủy sản Với truyền thống lao động cần cù sáng tạo của con người Việt Nam đồng thời với sự định hướng đúng đắn của Đảng và Nhà nước, ngành Thủy sản đã phá triển mạnh mẽ vươn lên trở thành ngành có kim ngạch xuất khẩu đứng hàng thứ 3 chỉ sau dệt may và dầu khí Năm 2010, sản lượng khai thác thủy sản là 2.450,8 ngàn tấn, kim ngạch xuất khẩu thủy sản đạt 4,94 tỷ USD; sản lượng nuôi trồng thủy sản năm 2010 lên 2.706,8 ngàn tấn đã đưa Việt Nam đứng thứ 6 trong

số 10 nhà xuất khẩu thủy sản hàng đầu của thế giới và đứng thứ 5 trong khu vực châu

Á sau Trung Quốc, Ấn Độ, Indonesia và Philippines

Để đẩy mạnh phát triển ngành thủy sản và khẳng định chủ quyền biển đảo, Chính phủ đã định hướng phải tăng cường khai thác đánh bắt xa bờ và đẩy mạnh phát triển nuôi các loài cá biển có giá trị kinh tế, trong đó có cá chim vây vàng - đối tượng nuôi mới, có giá trị kinh tế cao Tuy vậy muốn phát triển nuôi bền vững các đối tượng này cần phải sản xuất thức ăn có chứa các chế phẩm vi sinh vật hữu ích (probiotics) giúp tăng sức đề kháng, tăng khả năng tiêu hóa của cá trong điều kiện nuôi công nghiệp và hạn chế ô nhiễm môi trường Song hiện tại Việt Nam việc nghiên cứu chưa nghiên cứu

về chế phẩm probiotics dùng cho nuôi thủy sản còn rất hạn chế Đặc biệt đối với cá chim vây vàng, hiện chưa có chế phẩm dạng này Xuất phát từ thực tế trên, em được

Viện Nghiên cứu Công nghệ Sinh học giao thực hiện đề tài “Nghiên cứu phân lập một

số chủng vi khuẩn có hoạt tính protease sống bám trên cá chim vây vàng”, với mục

đích phân lập, tuyển chọn một số chủng vi sinh vật có hoạt tính enzyme protease ứng dụng trong nghiên cứu sản xuất chế phẩm probiotics dùng trong sản xuất thức ăn cho

cá chim vây vàng

Nội dung của đề tài:

1) Phân lập và tuyển chọn một số chủng vi khuẩn sinh protease cao sống bám trên cá chim vây vàng,

2) Xác định một số đặc tính của chủng có hoạt tính sinh protease cao,

3) Xác định một số yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh protease của chủng phân lập được

Do thời gian và kinh phí có hạn nên báo cáo này chắc hẳn sẽ còn c ó các hạn chế, em kính mong nhận đƣợc các ý kiến góp ý của quý thầy cô và bạn bè đồng nghiệp

để cho các nghiên cứu thêm hoàn thiện Em xin chân thành cảm ơn!

CHƯƠNG I

TỔNG QUAN VỀ TÀI LIỆU

1.1 GIỚI THIỆU VỀ CÁ CHIM VÂY VÀNG

Cá chim trắng vây vàng là loài cá biển có giá trị kinh tế cao, được nuôi nhiều ở Đài Loan, Trung Quốc, Singapore và tiêu thụ mạnh trên thị trường thế giới Tuy nhiên ở nước ta, cá chim trắng vây vàng là đối tượng khá mới mẻ Với đường bờ biển dài, diện tích mặt nước biển lớn, ngành nuôi cá biển đang trên đà phát triển mạnh Đặc biệt, điều kiện biển tự nhiên ở nước ta rất thích hợp với loài cá chim trắng vây vàng Vì môi trường sống của loại cá này là vùng biển ấm, vị trí rất thích hợp, những vùng vịnh, đầm phá, eo biển, biển nội địa ít sóng gió Bên cạnh đó, là chất lượng nước tốt, độ mặn nước biển tương đối ổn định Nguồn thức ăn cho cá có tự nhiên, thức ăn tổng hợp đơn giản và giá thành không quá đắt

Cá chim vây vàng còn có một tên gọi khác là cá sòng mũi hếch hay cá chim trứng Là loài cá ăn tạp, thiên về động vật, cá có thể kiếm thức ăn ở trong cát, cá trưởng thành có thể bắt những động vật vỏ cứng như: ngao, cua, ốc Giai đoạn cá giống thức

ăn là động vật phù du và động vật đáy, chủ yếu là luân trùng, nauplius của Artemia Cá con ăn tôm cá nhỏ, hai mảnh vỏ nhỏ Thức ăn chính của cá trưởng thành là các loại tôm

cá nhỏ.Trong điều kiện ương nuôi cá dài 2 cm thức ăn là cá tạp xay nhỏ, tôm tép băm nhỏ, thức ăn tổng hợp Cá trưởng thành ăn tôm nhỏ và thức ăn công nghiệp hoặc hoàn toàn thức ăn công nghiệp trong nuôi thương phẩm Sau đây là hệ thống phân loại của

Theo Borut Forlan (2004) cá chim vây vàng sống ở vùng biển hở và được tìm thấy ở Thái Bình Dương, Đại Tây Dương, Ấn Độ Dương Ở châu Á, cá chim vây vàng phân bố ở miền Nam Nhật Bản, Indonesia, Trung Quốc (Hoàng Hải, Đông Hải, Quảng Đông, Phúc Kiến, Hải Nam), Đài Loan Ở Việt Nam, cá chim vây vàng được tìm thấy trên vịnh Bắc Bộ, miền Trung và Nam Bộ

Hình 1.1 Cá chim vây vàng (Trachinotus blochii)

1.2 GIỚI THIỆU VỀ PROBIOTICS

Thuật ngữ “probiotic” được Lilly và Stiwell đề xuất năm 1965 để mô tả những chất sản sinh bởi vi sinh vật làm tăng trưởng một vi sinh vật (hoặc sinh vật) khác Năm

1989, Parker lại định nghĩa thêm cho rõ:”Probiotic là những vi sinh vật (chủ yếu là vi

khuẩn) có khả năng cộng sinh (hoặc hợp sinh) trong đường ruột có tác dụng cân bằng

hệ vi sinh vật trong đó có một số tác dụng hữu ích cho vật chủ” (Parker, 1989) Nghiên

cứu ứng dụng probiotic mới được chú ý trong 20 năm trở lại đây, nhưng tác dụng của

nó đã được nhận thấy từ lâu Elie Metnhicoff là người đầu tiên đặt nền móng cho việc

sử dụng probiotic (Metnhicoff, 1908) Năm 1908, ông đề nghị sử dụng vi khuẩn lactic

(Lactobacterium delbruekii spp bulgaricus) để kéo dài tuổi thọ con người Ngày nay

chế phẩm probiotic được sử dụng khá hiệu quả trong chăn nuôi đặc biệt là trong nuôi tôm, trồng trọt, trong bảo vệ sức khỏe con người và bảo vệ môi trường Tuy nhiên việc dùng chế phẩm này vào nuôi trồng thủy sản (tôm, cua, cá, nhuyễn thể…) mới bắt đầu trong hơn thập kỷ gần đây

Sử dụng probiotic trong nuôi trồng thủy sản giúp phân hủy các chất hữu cơ trong nước (chất hữu cơ là một trong nhiều nguyên nhân làm môi trường nước bị ô nhiễm), hấp thu xác tảo chết và làm giảm sự gia tăng của lớp bùn đáy, giảm các độc tố trong môi trường nước (do các chất khí: NH3, H2S… phát sinh), do đó sẽ làm giảm mùi hôi trong nước, giúp tôm cá phát triển tốt, nâng cao khả năng miễn dịch của tôm cá (do kích thích tôm, cá sản sinh ra kháng thể) Hơn nữa chế phẩm probiotic sẽ ức chế sự hoạt động và phát triển của vi sinh vật có hại (do các loài vi sinh vật có lợi sẽ cạnh tranh thức ăn và tranh giành vị trí bám với vi sinh vật có hại) Trong môi trường nước, nếu vi sinh vật có lợi phát triển nhiều sẽ kìm hãm, ức chế, lấn át sự phát triển của vi sinh vật có hại, do đó sẽ hạn chế được mầm bệnh phát triển để gây bệnh cho tôm cá Đồng thời chế phẩm probiotic giúp ổn định độ pH của nước, ổn định màu nước do probiotic hấp thu chất dinh dưỡng hòa tan trong nước nên hạn chế tảo phát triển nhiều

Thành phần chế phẩm probiotic thường có những nhóm vi sinh vật sau:

- Các nhóm vi sinh vật cơ bản: Vi khuẩn lactic, Vi khuẩn Bacillus, Vi khuẩn

quang dưỡng khử H2S – vi khuẩn tía lưu huỳnh, Nấm men (men rượu Saccharomyses)

- Các nhóm vi sinh vật phụ: Nhóm vi khuẩn nitrat (Nitrosomonas và

Nitrobacter), Nhóm xạ khuẩn, Nhóm nấm mốc

1.2.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Tại Nhật Bản, chế phẩm probiotic có tên gọi là E.M (các vi sinh vật hữu hiệu) do giáo sư, tiến sỹ Teruo Higa, Trường đại học Ryukyus, Okinawa, Nhật Bản đề xuất năm

1980 đã được sử dụng nhiều trong chăn nuôi, trồng trọt cũng như bảo vệ môi trường đều cho kết quả khả quan (Higa, 1980) Đến nay chế phẩm này được hơn 80 nước và vùng lãnh thổ sử dụng, đặc biệt là khu vực Châu Á và Thái Bình Dương trong đó có Trung Quốc, Hàn Quốc, Thái Lan và Việt Nam

Griffith (1995) thông báo nhờ việc đưa probiotic vào nuôi tôm giống ở Ecuador trong năm 1992, mà các trại nuôi tôm giống giảm thời gian nghỉ để làm vệ sinh ở các

bể nuôi từ 7 ngày trong một tháng đến 21 ngày trong một năm, sản lượng tôm giống tăng 35%, và giảm sử dụng các chất diệt khuẩn đến 94%

Ở Châu Á đã có nhiều nghiên cứu sử dụng các chế phẩm vi sinh trong nuôi tôm,

đặc biệt ở Thái Lan Jiravanichpaisal & cộng sự (1997) đã sử dụng Lactobacillus sp

trong nuôi tôm sú (P monodon Fabrius) Ở Trung Quốc, nghiên cứu probiotic trong nuôi thủy sản được tập trung vào vi khuẩn quang hợp Qiao Zhenguo & cộng sự (1992) nghiên cứu 3 chủng vi khuẩn quang hợp sử dụng cho tôm (P chinensis) bằng cách cho vào thức ăn hoặc cho và nước nuôi tôm cho thấy có sự gia tăng khả năng phát triển của tôm, loại trừ nhanh chóng NH3-N, H2S, acid hữu cơ và những chất có hại, cải thiện chất lượng nước, cân bằng độ pH

Ngày nay probiotics được sử dụng rộng rãi và rất hiệu quả trong việc phòng bệnh cho động vật thủy sản và con người Hiện có khoảng 500 loại chế phẩm sinh học đang lưu thông trên thị trường, trong đó có khoảng 430 loại dùng để xử lý môi trường và trên 60 loại dùng để trộn vào thức ăn nhằm mục đích kích thích tăng trưởng, tăng sức

đề kháng…nhưng chủ yếu vẫn tập trung vào xử lý môi trường Các loại chế phẩm này

có nguồn gốc từ nhiều nước: Trung Quốc, Indonesia, Đài Loan, Anh, Mỹ, Ấn Độ, Hàn Quốc, Úc, Đức, và Thái Lan (Aditya et al., 2008; Wang et al., 2008)

Để tạo thành các chế phẩm hoàn chỉnh, các probiotics có thể được sử dụng kết hợp với các chất có hoạt tính sinh học khác Chẳng hạn, chế phẩm De-Odorase của hãng Bayer sử dụng hoạt chất chính được chiết xuất từ thực vật (từ cây Yucca) kết hợp với nấm men và vi khuẩn Chế phẩm này giúp loại bỏ các khí độc trong ao ương nuôi tôm cá như khí: NH3, H2S, NO2… do đó giảm ô nhiễm môi trường nuôi Tuy nhiên, chế phẩm này có nhược điểm là không khống chế được vi khuẩn, nấm, nguyên sinh động vật trong ao Chế phẩm BZT (BZT Aquaculture và BZT Waster digester) là sự kết hợp giữa các vi khuẩn và enzyme, giúp xử lý lớp bùn đáy ao ô nhiễm và làm sạch

môi trường Các vi khuẩn có lợi trong chế phẩm này bao gồm Lactobaccilus spp.,

Nitromonas spp., Nitrobacter spp., Bacillus spp., và Clostridium spp

Những nghiên cứu về việc sử dụng chế phẩm probiotics trong lĩnh vực thủy sản chỉ ra rằng các probiotics có một số lợi ích sau: làm ổn định chất lượng nước và nền đáy trong ao nuôi tôm cá, nâng cao sức khoẻ và sức đề kháng cho tôm, cá nuôi, giảm thiểu ô nhiễm môi trường ao nuôi và xung quanh do nuôi trồng thuỷ sản gây nên và nâng cao hiệu quả sử dụng thức ăn (Verschuere et al., 2000) Các đánh giá về hiệu quả môi trường của chế phẩm sinh học chỉ ra rằng các chủng vi sinh vật trong các chế phẩm probiotics có khả năng phân giải nhanh xác tảo tàn, thức ăn thừa, hoặc có tác dụng xử lý các chất hữu cơ lơ lửng, cạnh tranh và làm giảm vi khuẩn gây bệnh trong nước, xử lý ô nhiễm bùn đáy ao nuôi (Zhou et al., 2009)

Một số công trình nghiên cứu trên thế giới đã công bố cho thấy sử dụng các chế phẩm probiotics trong thức ăn nuôi trồng thuỷ sản còn có các lợi ích như sau:

- Giúp làm giảm stress cho tôm cá qua đó cải thiện sức khỏe của động vật nuôi đồng thời làm giảm tác động có hại của thức ăn thừa đến môi trường

- Do quy luật cạnh tranh và loại trừ vi khuẩn gây bệnh, các vi sinh vật có lợi trong chế phẩm probiotics sẽ cạnh tranh và làm giảm sự phát triển cũng như độc tính của vi khuẩn gây bệnh Vì thế chế phẩm probiotics sẽ giúp cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột

và giảm thiểu vi sinh vật gây bệnh trong đường ruột của vật nuôi

- Mặt khác, một số lọai vi khuẩn có lợi trong chế phẩm probiotics như Bacillus subtilis, nấm men còn là nguồn cung cấp dinh dưỡng protein, vitamin, nhất là sản xuất

ra các enzyme tiêu hóa như protease, amylase, Vì thế khi bổ sung chế phẩm probiotics

có khả năng sinh enzyme vào thức ăn nuôi động vật thủy sản nhất là nuôi tôm nói chung và thức ăn nuôi tôm hùm nói riêng sẽ làm tăng cường quá trình tiêu hóa thức ăn trong đường ruột của tôm và giảm chi phí thức ăn

- Quan trọng hơn, các vi sinh vật có lợi trong chế phẩm probiotics như các lọai vi khuẩn lactic còn kích thích tăng cường hệ miễn dịch của động vật thủy sản chống lại vi sinh vật gây bệnh nên nguy cơ dịch bệnh ở vật nuôi sẽ được giảm thiểu Do vậy khi sử dụng chế phẩm probiotics trong thức ăn nuôi động vật thủy sản nói chung và cá chim

vây vàng nói riêng sẽ giúp hạn chế dịch bệnh và ngăn chặn việc lạm dụng kháng sinh trong nuôi trồng

1.2.2 Tình hình nghiên cứu trong nước

Hiện đã có một số chế phẩm probiotics được đưa vào sử dụng trong nuôi trồng thuỷ sản ở Việt Nam từ đầu những năm 1995, chủ yếu là các chế phẩm nhập ngoại từ

Mỹ và Nhật Bản Một số chế phẩm được sản xuất trong nước Các chế phẩm được biết đến nhiều nhất thuộc nhóm EM (“Effective Microorganisms™”) có nguồn gốc từ Nhật Bản Một số chế phẩm khác như: ACTIVE CARE, ACTIVE CLEANER, GEM-P … được sử dụng để bổ sung vào ao nuôi nhằm cải thiện chất lượng nước và làm giảm stress cho động vật thuỷ sản, đã mang lại những hiệu quả đáng khích lệ và góp phần đáng kể vào việc phát triển của ngành nuôi trồng thuỷ sản

Một số nghiên cứu trong nước ở lĩnh vực sản xuất các chế phẩm probiotics ứng dụng trong nuôi trồng thuỷ sản đã được tiến hành và cho một số kết quả bước đầu đáng chú ý Khuất Hữu Thanh (2009) đã công bố nghiên cứu ứng dụng công nghệ sinh học

để hoàn thiện chế phẩm BIO-TS3 có khả năng tăng sức đề kháng của tôm trong nuôi tôm sú thâm canh và thu được nhiều kết quả đáng khích lệ là chế phẩm này có khả năng cải thiện chất lượng ao nuôi (Khuất Hữu Thanh (2009), Nghiên cứu ứng dụng công nghệ sinh học hoàn thiện chế phẩm BIO-TS3 có khả năng tăng sức đề kháng của tôm trong nuôi tôm sú thâm canh, Hội thảo đánh giá kết quả thực hiện đề tài dự án CNSH Nông nghiệp, Thủy sản giai đoạn 2007-2008)

Trong năm 2009, Chi cục Quản lý chất lượng nông lâm sản và thủy sản tỉnh Đồng Tháp đã triển khai mô hình “Qui trình ương cá tra giống trên ao có sử dụng chế phẩm sinh học” Mô hình tiến hành trên 2 ao diện tích 4.000 m2 và 2 ao diện tích 6.000 m2 Kết quả nghiên cứu cho thấy sử dụng chế phẩm sinh học làm giảm nồng độ N-NH4,

NO2, H2S, số lượng vi khuẩn Aeromonas và Pseudomonas trong ao nuôi cá tra Hơn nữa, ở ao dùng chế phẩm sinh học, tình trạng cá khỏe và không có biểu hiện nhiễm bệnh Trong ao không sử dụng chế phẩm sinh học, cá bị nhiễm ký sinh trùng (15 – 20

con/10x10) và có biểu hiện bệnh nhiễm khuẩn từ ngày thứ 20-25, sau khi điều trị thì cá

bị hao hụt, tỷ lệ sống giảm và tăng trưởng không đều Cuối cùng, sử dụng chế phẩm sinh học còn làm tăng tỉ lệ sống đạt 33,26% so với ao đối chứng không sử dụng chế phẩm là 26% và làm giảm hệ số chuyển hóa thức ăn là 0,6 so với đối chứng là 0,8

Sử dụng probiotics có tác dụng trên nhiều mặt và có nhiều triển vọng Tuy nhiên, tại Việt Nam chưa có những nghiên cứu đầy đủ về vai trò của vi sinh vật, đặc biệt là chưa có các nghiên cứu bổ sung chúng vào thành phần thức ăn viên cho nuôi cá chim vây vàng

Do vậy việc “Nghiên cứu phân lập một số chủng vi khuẩn có hoạt tính protease

sống bám trên cá chim vây vàng” với mục đích sử dụng cho sản xuất probiotics làm

thức ăn cho cá chim vây vàng là một hướng nghiên cứu cần thiết

CHƯƠNG II NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU

2.1.1 Mẫu phân lập vi sinh

Mẫu cá chim vây vàng được thu tại Trại thực nghiệm nuôi cá chim vây vàng của Khoa Nuôi trồng Thủy sản - Ba Làng - Nha Trang

2.1.2 Môi trường nuôi vi sinh vật, hóa chất và thuốc thử

Môi trường phân lập vi khuẩn

Môi trường lên men đường (Môi trường cơ bản)

Pepton : 10 g

NaCl : 30 g;

Cao thịt bò : 3 g;

Hòa tan 1 g tím violet vào trong 10 ml cồn (dung dịch 1)

Hòa tan 2 g phenol tinh thể vào 10 ml nước cất (dung dịch 2)

Trộn chung dung dịch 1 và dung dịch 2 lại với nhau ta có dung dịch thuốc nhuộm tím violet

Thuốc nhuộm Liugol

Iod tinh thể : 1 g

KI : 2 g

Nước cất : 200 ml

Pha chế: Hòa tan iod vào nước cất, sau đó cho KI vào, bảo quản trong lọ tối màu

Thuốc nhuộm Fuschin

Hòa tan Fuschin vào trong 10 ml cồn 95% (dung dịch 1)

Hòa tan phenol tinh thể vào 100 ml nước cất (dung dịch 2)

Trộn đều dung dịch 1 và dung dịch 2 đem lọc, ta có thuốc nhuộm Fuschin

Dung dịch xanh methylen

Rượu ethylic: 300 ml

Xanh methylen: 25 g

Hòa tan xanh methylen vào rượu rồi lọc (dung dịch 1)

Dịch lọc 1 thêm 1 ml KOH 1% và 1000 ml nước cất

Dung dịch nước muối sinh lý

Hoà tan 8,5 g NaCl trong 1 lít nước cất Hấp khử trùng ở nhiệt độ 1210C trong 15 phút rồi để nguội

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Cách tiếp cận vấn đề nghiên cứu

Đề tài sử dụng cách tiếp cận kế thừa và chọn lọc các phương pháp phân lập tuyển chọn các chủng probiotics có khả năng sinh enzyme protease theo sơ đồ:

Hình2.1 Cách thức tiếp cận vấn đề nghiên cứu 2.2.2 Phương pháp phân lập vi sinh vật

Mục tiêu của thí nghiệm là tuyển chọn được chủng vi khuẩn sinh protease mạnh nhất Thí nghiệm được thực hiện theo các bước sau:

Xử lý mẫu

Phân lập

• Phân lập vi khuẩn tổng số trên môi trường TSB

• Tuyển chọn chủng vi khuẩn có hoạt tính protease

Thử nghiệm nuôi cấy và

thu sinh khối trên môi

trường nhân giống cấp 1

Thu lấy phần nội tạng (ruột, gan) và máu của cá cho vào túi PE vô trùng Tùy vào khối lượng của từng mẫu thêm vào dung dịch APW với thể tích thích hợp theo tỉ lệ 1:9 Chuẩn bị mẫu xong, cho vào túi PE có chứa mẫu và APW, đem đi đồng nhất mẫu bằng máy dập mẫu Thời gian đồng nhất mỗi mẫu từ 90 đến 120 giây Ủ mẫu đã dập với APW ở 370C trong thời gian 6-8 giờ trong tủ ấm

độ pha loãng mẫu 10-2

, tiếp tục làm tương tự, ta có các ống nghiệm có độ pha loãng mẫu 10-3, 10-4, 10-5, 10-6,10-7, 10-8

- Môi trường TSB được chuẩn bị, hấp khử trùng và phân phối vào các đĩa petri, mỗi đĩa 10-15ml Dùng pipet man hút 0.1 ml dịch đã pha loãng nhỏ vào đĩa thạch đã ghi tên mẫu, nồng độ và ngày phân lập Dùng que cấy tran trang đều dịch mẫu trên mặt thạch Sau đó cất và nuôi cấy mẫu phân lập ở 370C Sau khoảng 48h vi khuẩn đã phát triển trên đĩa thạch tiến hành quan sát, tách và thuần khiết khuẩn lạc

- Tách và thuần khiết khuẩn lạc: Chọn những khuẩn lạc riêng rẽ trên đĩa peptri cấy rồi cấy vào ống nghiệm, mỗi khuẩn lạc cấy vào một ống (ghi kí hiệu đầy đủ để cho các bước nghiên cứu tiếp theo), đặt vào tủ ấm 370C Sau các khoảng thời gian thích hợp cấy ziczac ra đĩa petri để tinh sạch các chủng VSV, tiến hành tinh sạch nhiều lần Kiểm tra độ thuần khiết của giống bằng cách kiểm tra vết cấy, kiểm tra độ thuần chủng của các khuẩn lạc và kiểm tra tế bào dưới kính hiển vi Khi được khuẩn lạc thuần nhất

và tách rời trên đĩa thạch thì cấy vào ống nghiệm giữ giống

- Phương pháp giữ giống và cấy chuyền: Sau khi tinh sạch xong ta chọn khuẩn lạc mọc riêng rẽ cấy vào ống nghiệm thạch nghiêng Tiến hành cấy ziczac trên ống thạch

trường thạch nghiêng đặc hiệu để vào tủ ấm 370C Sau 10-14 ngày khi vi sinh vật đã mọc tốt, các ống giống được bảo quản trong tủ lạnh ở 4-60C Sau 2-3 tháng cấy chuyền lại một lần Để bảo quản giống được lâu từ 6 tháng đến 2 năm có thể giữ giống trong paraffin lỏng vô trùng hay giữ lạnh sâu trong glycerin hoặc đông khô

Hình 2.2 Quá trình phân lập vi sinh vật 2.2.3 Phương pháp tuyển chọn chủng vi khuẩn sinh protease mạnh nhất:

được đánh giá qua hoạt tính sinh protease

Phương pháp xác định hoạt tính sinh protease: theo phương pháp đo đường

kính phân giải casein

Vi khuẩn được nuôi cấy lắc 180 vòng/phút ở 300C trong môi trường dịch thể, sau 24h tiến hành ly tâm dịch nuôi cấy với tốc độ 8000 vòng/phút trong 15 phút, thu dịch enzyme nhỏ vào lỗ thạch đã khoan trên đĩa petri chứa môi trường cơ chất Để vào tủ

ấm 300

C sau 24h xác định vòng phân giải

Sử dụng thuốc thử Liugol, thuốc thử không bắt màu với phần cơ chất bị phân giải, tạo ra vòng phân giải

Tủ ấm 370C

Hoạt tính enzyme được xác định theo công thức:H D d

Trong đó D: đường kính vòng phân giải + đường kính lỗ khoan

Nguyên tắc: Khi pha lỏng có chứa nhiều phần tử không tan thì sẽ hình thành một hệ huyền phù và có độ đục bởi các phần tử hiện diện trong môi trường lỏng cản ánh sáng, làm phân tán chùm ánh sáng tới Tế bào vi sinh vật là một thực thể nên khi hiện diện trong môi trường cũng làm môi trường trở nên đục Giá trị OD (optical density, mật độ quang) càng cao thì độ đục càng cao, chứng tỏ vi khuẩn sinh trưởng càng mạnh Vì vậy có thể xác định khả năng sinh trưởng của vi khuẩn thông qua đo độ đục bằng máy so màu

Cách tiến hành: Đo độ đục của dịch nuôi cấy vi khuẩn bằng máy quang phổ Cho môi trường vào cuvet số 1 làm đối chứng, cho vào máy đo OD ở 540nm, đưa về

Dịch vi

khuẩnsau li

tâm

Nhỏ vào đĩa thạch đã được đục lỗ

Đo đường kính vòng phân giải

kết quả hiện trên màn hình

2.2.5 Phương pháp định danh chủng vi khuẩn (theo phương pháp truyền thống)

Phương pháp định danh chủng vi khuẩn theo phương pháp truyền thống là phương pháp định danh dựa trên các đặc điểm về hình thái, đặc điểm sinh lý, sinh hóa Dựa vào đó, ta có thể phân loại chúng Thí nghiệm được bố trí theo sơ đồ sau:

Hình 2.4 Sơ đồ bố trí thí nghiệm định danh vi khuẩn theo phương pháp truyền

thống Phương pháp nhuộm gram

- Nguyên tắc của phương pháp: Vi khuẩn Gram (-) bắt màu hồng của thuốc nhuộm fuchsin, vi khuẩn Gram (+) bắt màu tím của violet

- Cách tiến hành:

Dùng que cấy vô trùng lấy một ít vi khuẩn từ thạch hòa vào một giọt nước cất trên phiến kính, để khô tự nhiên Sau đó cố định mẫu trên ngọn lửa đèn cồn Tiến hành nhuộm bằng crystal violet trong 1 phút, rửa với nước cất Tiếp tục nhỏ dung dịch Liugol, để một phút rồi lại rửa bằng nước cất, thấm khô Tẩy cồn trong 15 – 20 giây và

Nuôi cấy vi khuẩn được tuyển

chọn

Định danh vi khuẩn

rửa lại bằng nước cất sau đó phủ dung dịch fuchsin lên lam kính trong 30 giây, đổ bỏ dung dịch và rửa qua nước Dùng giấy thấm để thấm hoặc để khô tự nhiên Khảo sát hình thái tế bào và tính chất bắt màu của vi khuẩn dưới kính hiển vi với vật kính dầu

X -100

Phương pháp xác định khả năng chịu muối

Cấy vi khuẩn lên đĩa petri chứa môi trường thạch thường với các nồng độ muối khác nhau từ 1-12%, giữ trong tủ ấm Sau 24h, quan sát nếu vi khuẩn vẫn phát triển chứng tỏ chúng có khả năng chịu muối

Phương pháp xác định khả năng lên men đường

- Rót 5 ml môi trường cơ bản vào các ống nghiệm Thêm 0,5 ml dung dịch từng loại đường vào từng ống nghiệm tương ứng sao cho môi trường cuối cùng có nồng độ carbonhydrate là 5%

- Đậy nút bông và giấy bạc lại ở mỗi ống nghiệm cho kín

- Dùng que cấy vô trùng thu sinh khối khuẩn lạc các chủng, cấy vào các ống nghiệm môi trường chứa các loại đường

- Ủ các ống nghiệm đã cấy trong tủ ấm 37OC Quan sát từng ngày trong 5 ngày

- Phản ứng dương tính khi môi trường chuyển từ màu đỏ sang màu vàng và ngược lại; VSV có khả năng sinh hơi khi có bọt khí trong ống duhaml

Phương pháp xác định khả năng di đông

Môi trường thạch mềm được rót vào ống nghiệm sau đó hấp khử trùng Dùng kim cấy thẳng khuẩn lạc vào tâm môi trường trong ống nghiệm Ủ các ống nghiệm đã cấy trong tủ ấm ở 37oC Sau 24h quan sát kết quả

Xác định hoạt tính catalase

Cấy vi khuẩn vào ống nghiệm chứa 5ml môi trường thạch thường dịch thể, đặt ở

30oC Sau 1 ngày nhỏ 2 giọt H2O2 30% vào dịch nuôi cấy, nếu sủi bọt ta kết luận có hoạt tính protease, ngược lại không có

2.2.6 Phương pháp xác định điều kiện nuôi cấy thích hợp

Phương pháp xác định thời gian nuôi cấy

Thời gian nuôi cấy vi khuẩn có ảnh hưởng rất lớn đến khả năng thu sinh khối Thời gian nuôi cấy tối ưu là thời gian tại đó thu được enzyme có hiệu suất tối ưu và hoạt tính enzyme mạnh nhất Vi khuẩn được nuôi cấy lắc 180 vòng/phút ở 300C Để xác định thời gian nuôi cấy thích hợp, lấy mẫu xác định hoạt tính enzyme và đo khả năng sinh trưởng OD sau 0; 2; 4; 6; 8;12; 14; 16; 18; 20; 22 và 24h Sơ đồ bố trí thí nghiệm như sau:

Hình 2.5: Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định điều kiện nuôi cấy tối ưu

Xác định hoạt tính enzyme

và khả năng sinh trưởng OD

Chọn vi khuẩn có hoạt tính mạnh nhất và xác định điều kiện nuôi

cấy vi khuẩn sau tuyển chọn

Hình 2.6 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định thời gian nuôi cấy tối ưu

Phương pháp xác định nhiệt độ nuôi cấy

Hoạt động trao đổi chất của vi sinh vật có thể coi là kết quả của các phản ứng hóa học Các phản ứng hóa học lại phụ thuộc chặt chẽ vào nhiệt độ vì thế yếu tố nhiệt độ ảnh hưởng sâu sắc đến quá trình sống của tế bào Mỗi loài vi sinh vật chỉ có thể tồn tại trong giới hạn nhiệt độ nhất định Để nuôi cấy vi sinh vật thì việc nghiên cứu tìm ra nhiệt độ tối ưu nhất có ý nghĩa vô cùng quan trọng Vi khuẩn nuôi cấy lắc 180 vòng/ phút ở các nhiệt độ 30; 35; 40; 45oC Sau 2 ngày đem xác định hoạt tính enzyme và khả

Xác định hoạt tính enzyme và khả năng sinh trưởng OD

Chọn thời gian thích hợp Nuôi cấy vi khuẩn được tuyển chọn ở các thời gian

năng sinh trưởng OD

Hình 2.7 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định nhiệt độ nuôi cấy tối ưu

Phương pháp xác định pH nuôi cấy

pH môi trường có ý nghĩa quyết định đến sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật, một biến đổi nhỏ của pH cũng ảnh hưởng rất mạnh đến tế bào vi sinh vật Do đó, việc xác định pH nuôi cấy là rất cần thiết Vi khuẩn được nuôi cấy lắc 180 vòng/phút ở

350C Để xác định pH nuôi cấy thích hợp, tiến hành nuôi cấy ở pH lần lượt là 5, 6, 7, 8 Sau đó lấy mẫu xác định hoạt tính enzyme và đo khả năng sinh trưởng OD

Nuôi cấy vi khuẩn được tuyển chọn ở

các nhiệt độ

Chọn nhiệt độ thích hợp Xác định hoạt tính enzyme và khả năng sinh trưởng OD

Nuôi cấy vi khuẩn được tuyển chọn ở các pH

Chọn pH thích hợp

Xác định hoạt tính enzyme và khả năng sinh trưởng OD

Hình 2.8 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định pH nuôi cấy tối ưu

121oC trong 15 - 20 phút, làm nguội đến 370C sau đó bắt đầu cấy giống Lượng giống

sử dụng ở môi trường nhân giống cấp 2 là 10%, với độ ẩm 70%, pH =6 Sau thời gian

18 giờ nuôi bắt đầu thu hoạch sau đó đem sản phẩm này kiểm tra hoạt độ enzyme protease Chế phẩm enzyme sau khi thu hoạch được sấy khô, hút chân không và đem đi bảo quản Hoạt tính protease của chế phẩm được xác định bằng phương pháp Gross và Fuld (phụ lục 3) Sơ đồ bố trí thí nghiệm như sau:

Đóng gói và bảo quản

Hình 2.9 Sơ đồ quy trình sản xuất protease từ chủng đã phân lập trên

2.3 PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU

Xử lý số liệu nghiên cứu theo phương pháp thống kê sinh học Mỗi thí nghiệm đều tiến hành 3 lần, mỗi lần 3 mẫu và kết quả là trung bình cộng của các lần thí nghiệm

Số liệu được xử lý được vẽ trên phần mềm Ecxel với hệ số tương quan R ≥ 0,95

2.4 DỤNG CỤ THÍ NGHIỆM

Sử dụng các thiết bị hiện đại có tại phòng thí nghiệm CNSH: thiết bị ly tâm (Eppendorf Centrifuge 5417R - Mỹ), máy vortex (máy trộn mẫu BE34), tủ lạnh (NANO Silver, Việt Nam), kính hiển vi 3 mắt ngắm có camera và máy tính (Motic BA

300 - Mỹ), máy lắc (GFL 3005 - Đức), tủ cấy (Telstar AV 100 - Tây Ban Nha), tủ sấy (Binder - Đức), tủ ấm Memmert - Đức,

CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG SINH PROTEASE CAO SỐNG BÁM TRÊN CÁ CHIM VÂY VÀNG

Tiến hành lấy mẫu nội tạng của cá, các vị trí lấy mẫu được kí hiệu lần lượt như sau: Gan: G; Máu: M; Ruột: R Từ các mẫu thu được qua quá trình phân lập và nuôi cấy trên môi trường TSB đã thu được 40 chủng vi khuẩn Qua sơ bộ tuyển chọn bằng phương pháp đục lỗ thạch trên môi trường chứa cơ chất casein và xác định hoạt tính enzyme protease bằng phương pháp đo đường kính vòng phân giải đã tuyển chọn được

23 chủng vi khuẩn có hoạt tính protease Kết quả được trình bày ở bảng 3.1, 3.2 và hình 3.1

Bảng 3.1 Hoạt tính protease của các chủng vi khuẩn phân lập được