phân lập và tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic sinh bacteriocin từ nước dưa lên men truyền thống nhằm bảo quản thực phẩm

Hiện nay trên thế giới, các nhà khoa học đã tìm được một phương pháp bảo quản thực phẩm bằng sinh học nhưng còn khá mới mẻ ở nước ta – chính là sử dụng bacteriocin làm chất bảo quản sinh

LỜI CẢM ƠN

Trước tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất đến TS Nguyễn Văn Duy, Bộ môn Công nghệ sinh học, Viện Công nghệ sinh học và Môi trường, Trường Đại học Nha Trang đã tận tình hướng dẫn, dạy bảo và tạo mọi điều kiện cho tôi hoàn thành đồ án tốt nghiệp này

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Ban Giám đốc Viện Công nghệ sinh học và Môi trường, Trường Đại học Nha Trang và các thầy cô trong Bộ môn Công nghệ sinh học đã tạo môi trường thuận lợi cho tôi trong quá trình thực hiện đề tài Trong thời gian qua, tôi đã nhận được sự giúp đỡ tận tình của cô Nguyễn Thị Hải Thanh, chị Nguyễn Minh Nhật và một số bạn sinh viên lớp 49, 50 SH Tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ quý báu đó

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

MỤC LỤC ii

DANH MỤC BẢNG vi

DANH MỤC HÌNH vii

LỜI NÓI ĐẦU 1

Chương I TỔNG QUAN 2

1.1 Tình hình bảo quản nguyên liệu thực phẩm 2

1.1.1 Trên thế giới 2

1.1.2 Ở Việt Nam 6

1.2 Tổng quan về bacteriocin 8

1.2.1 Đặc điểm chung về bacteriocin 8

1.2.2 Phân loại bacteriocin 9

1.2.3 Một số tính chất của bacteriocin 11

1.2.3.1 Độ bền nhiệt 11

1.2.3.2 Độ bền pH 11

1.2.3.3 Độ bền với các enzyme 11

1.3 Tổng quan về vi khuẩn lactic 13

1.3.1 Đặc điểm chung của vi khuẩn lactic 13

1.3.2 Phân loại vi khuẩn lactic 13

1.3.3 Đặc điểm sinh trưởng 15

1.3.4 Ứng dụng 16

1.4 Tình hình nghiên cứu vi khuẩn lactic sinh bacteriocin 18

1.4.1 Trên thế giới 18

1.4.2 Ở Việt Nam 21

Chương II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23

2.1 Vật liệu 23

2.1.1 Mẫu 23

2.1.2 Chủng vi khuẩn chỉ thị 23

2.1.3 Thiết bị chuyên dụng 24

2.1.4 Hóa chất, môi trường và thuốc thử 24

2.2 Phương pháp nguyên cứu 28

2.3 Phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn lactic từ mẫu nước dưa lên men truyền thống có khả năng sinh bacteriocin 29

2.3.1 Phân lập vi khuẩn 29

2.3.2 Nuôi cấy và bảo quản chủng vi khuẩn 31

2.3.3 Xác định hoạt tính kháng khuẩn của vi khuẩn lactic 32

2.3.4 Thử với enzym proteinase K và α-chymotrypsin 34

2.3.5 Xác định độ bền nhiệt của dịch bacteriocin 35

2.3.6 Xác định độ bền pH đối với dịch bacteriocin thô 36

2.3.7 Xác định đặc điểm hình thái tế bào vi khuẩn lactic sinh bacteriocin 36

Chương III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 38

3.1.Phân lập vi khuẩn lactic từ nước dưa muối lên men truyền thống 38

3.2.Tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic sinh bacteriocin 38

3.2.1 Hoạt tính kháng khuẩn của các chủng vi khuẩn lactic 38

3.2.2 Kết quả kiểm tra với enzym proteinase K và α-chymotrypsin 41

3.3 Một số tính chất của dịch bacteriocin thô 42

3.3.1 Độ bền nhiệt của dịch bacteriocin thô 43

3.3.2 Độ bền pH của dịch bacteriocin thô 44

3.4 Một số đặc điểm sinh học và phân loại của vi khuẩn lactic sinh bacteriocin 45

3.5 Đặc điểm của các chủng vi khuẩn sinh bacteriocin được phân lập bổ sung từ ruột cá giò 47

3.5.1 Phân lập chủng vi khuẩn sinh bacteriocin từ ruột cá giò 47

3.5.2 Hoạt tính kháng khuẩn của vi khuẩn từ mẫu ruột cá giò 48

3.5.3 Kết quả kiểm tra với enzym proteinase K và α-chymotrypsin 50

3.5.4 Một số tính chất của dịch bacteriocin thô của chủng CT 1.1 51 3.5.5 Một số đặc điểm sinh học và phân loại của vi khuẩn phân lập từ mẫu ruột cá

giò sinh bacteriocin 53

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 55 TÀI LIỆU THAM KHẢO 56

DANH MỤC TỪ, KÍ TỰ VIẾT TẮT

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1 Bảng phân loại bacteriocin 10

Bảng 2 Tính chất hóa lý của một số bacteriocin của vi khuẩn Gram dương 12

Bảng 3 Bảng lấy mẫu phân lập vi khuẩn lactic 23

Bảng 4 Số chủng vi khuẩn phân lập được từ nước dưa, ruột cá giò 38

Bảng 5 Bảng khảo sát khả năng kháng khuẩn của dịch ngoại bào từ vi khuẩn lactic 39

Bảng 6 Đường kính vòng kháng Bacillus B1.1 của dịch bacteriocin từ các chủng T8 và T13 sau khi xử lý nhiệt và pH……… 43

Bảng 7 Bảng khảo sát khả năng kháng khuẩn của dịch ngoại bào của các chủng vi khuẩn được phân lập từ ruột cá giò……… 46

Bảng 8 Đường kính vòng kháng Bacillus B1.1 của dịch bacteriocin từ chủng CT 1.1 sau khi xử lý nhiệt và pH ……….49

DANH MỤC HÌNH

Hình 1 Cấu trúc của nisin 8

Hình 2 Cấu trúc của colicin 9

Hình 3 Kiểu hoạt động của bacteriocin của vi khuẩn lactic (LAB) 11

Hình 4 Một số chủng vi khuẩn lactic 15

Hình 5 Pho mát chứa loại vi khuẩn có thể làm ra loại thuốc kháng sinh có khả năng chống nhờn thuốc 21

Hình 6 Sơ đồ cách tiếp cận các nội dung nghiên cứu của đề tài 29

Hình 7 Sơ đồ pha loãng mẫu 30

Hình 8 Quy trình thử hoạt tính kháng khuẩn của dịch bacteriocin thô với các chủng chỉ thị… 33

Hình 9 Các chủng vi khuẩn lactic phân lập từ nước dưa thể hiện tính kháng với chủng chỉ thị Salmonella Sal 1 trên môi trường XLD 40

Hình 10 Các chủng vi khuẩn lactic phân lập từ nước dưa thể hiện tính kháng với chủng chỉ thị Bacillus B1.1 trên môi trường TSA……… 40

Hình 11 Kết quả kiểm tra dịch bacteriocin thô của chủng vi khuẩn T13 (A) và T8 (B) với enzym proteinase K trên môi trường TSA với chủng chỉ thị Bacillus B1.1 41 Hình 12 Kết quả kiểm tra dịch bacteriocin thô của chủng vi khuẩn T8 (A) và T13 (B) với enzym α-chymotrypsin trên môi trường TSA với chủng chỉ thị Bacillus B1.1 42

Hình 13 Vòng kháng Bacillus B1.1 của dịch bacteriocin từ chủng T13 sau khi xử lý các nhiệt độ khác nhau 43

Hình 14 Vòng kháng Bacillus B1.1 của dịch bacteriocin từ chủng T8 sau khi xử lý ở pH 2-12 ……….44

Hình 15 Vòng kháng Bacillus B1.1 của dịch bacteriocin từ chủng T13 sau khi xử lý ở pH 2-12 45

Hình 16 Khuẩn lạc chủng T8 sau 24 giờ nuôi trên môi trường thạch MRS ở pH 6,5

và nhiệt độ 40O

C 46 Hình 17 Tế bào của chủng vi khuẩn lactic T8 sau khi nhuộm Gram được quan sát dưới kính hiển vi ở độ phóng đại X-100 46 Hình 18 Tế bào của chủng vi khuẩn lactic T13 sau khi nhuộm Gram được quan sát dưới kính hiển vi ở độ phóng đại X-100 47 Hình 19 Khuẩn lạc chủng CT 1.1 được nuôi cấy trên môi trường thạch TSA, pH 7,5 và ở nhiệt độ 400C 48Hình 20 Các chủng vi khuẩn phân lập từ ruột cá giò thể hiện hoạt tính kháng với

chủng Vibrio C1 trên môi trường thạch TSA ở 400C……….49 Hình 21 Các chủng vi khuẩn phân lập từ ruột cá giò thể hiện tính kháng với chủng

Bacillus B 1.1 trên môi trường thạch TSA, ở 400C 50 Hình 22 Kết quả kiểm tra dịch bacteriocin thô của vi khuẩn CT 1.1 với enzym

proteinase K trên môi trường TSA với chủng chỉ thị Vibrio C1 50

Hình 23 Kết quả kiểm tra dịch bacteriocin thô của vi khuẩn CT 1.1 với enzym

α-chymotrypsin trên môi trường TSA với chủng chỉ thị Vibrio C1 51 Hình 24 Vòng kháng Vibrio C1 của dịch bacteriocin từ chủng CT 1.1 sau khi xử lý

các nhiệt độ khác nhau 52

Hình 25 Vòng kháng Vibrio C1 của dịch bacteriocin từ chủng CT 1.1 sau khi xử lý

ở pH 2-12 53 Hình 26 Khuẩn lạc chủng CT 1.1 phân lập từ ruột cá giò được nuôi cấy trên môi trường thạch TSA sau 7 ngày nuôi ở 400C 53 Hình 27 Tế bào của chủng vi khuẩn CT 1.1 sau khi nhuộm Gram được quan sát dưới kính hiển vi ở độ phóng đại X-100 54

LỜI NÓI ĐẦU

Thực phẩm là một trong những nhu yếu phẩm không thể thiếu trong đời sống hằng ngày của mỗi người Thực phẩm phải tươi, ngon theo đúng nghĩa của nó mà không bị mất đi giá trị dinh dưỡng ban đầu, không gây ảnh hưởng đến sức khỏe con người Những yêu cầu trên cũng chính là đòi hỏi hàng đầu của các phương pháp bảo quản thực phẩm Vì hầu hết các loại nông sản thực phẩm tươi sống ở nước ta thường được bảo quản bằng các chất hóa học Tuy nhiên, phương pháp này chưa đáp ứng được yêu cầu về an toàn thực phẩm Hiện nay trên thế giới, các nhà khoa học đã tìm được một phương pháp bảo quản thực phẩm bằng sinh học nhưng còn khá mới mẻ ở nước ta – chính là sử dụng bacteriocin làm chất bảo quản sinh học an toàn Mặc dù có một vài phương pháp khác bacteriocin, nó có thời gian bảo quản lâu hơn nhưng ngày nay con người càng ý thức nhiều về sức khỏe nên họ tránh dùng những thực phẩm được bảo quản bằng chất hóa học

Chính vì vậy, việc thực hiện đề tài:

―Phân lập và tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic sinh bacteriocin từ nước dưa lên men truyền thống nhằm bảo quản thực phẩm‖ là rất cấp thiết

Đề tài này được tiến hành với các mục tiêu sau:

+ Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn lactic sinh bacteriocin từ nước dưa muối lên men truyền thống

+ Xác định một số tính chất của dịch bacteriocin thô từ các chủng tuyển chọn được

+ Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của các chủng vi khuẩn sinh bacteriocin

Chương I TỔNG QUAN

1.1 Tình hình bảo quản nguyên liệu thực phẩm

1.1.1 Trên thế giới

Trong suốt chiều dài lịch sử, con người đã thích ăn thực phẩm còn tươi hơn

là các dạng thực phẩm khác như bị ươn, thực phẩm dạng sấy khô… Tuy nhiên, do thực phẩm hư hỏng rất nhanh nên từ lâu loài người đã phải phát triển những phương pháp để bảo quản nguyên liệu thực phẩm

Có rất nhiều phương pháp bảo quản thực phẩm trên thế giới, song nhìn chung các phương pháp đều tuân thủ theo ba nguyên tắc Bioza, Abiosis và Anabioza Thực chất các nguyên tắc này như sau:

Theo nguyên tắc Bioza (Bios = sự sống) thì thực phẩm được cất giữ ở điều kiện vệ sinh tốt, với môi trường vô trùng tuyệt đối để luôn luôn giữ nguyên trạng thái tươi sống ban đầu của nguyên liệu Ví dụ, thịt lợn, thịt bò tươi trong phòng mát, vô trùng luôn được giữ ở nhiệt độ 00

C – 100C Tuy nhiên, các phương pháp này không thích hợp ở điều kiện nhiệt đới, lại đòi hỏi thiết bị đắt tiền, do vậy ở Việt Nam rất ít ứng dụng

Còn theo nguyên tắc Abioza (Abiosis = không sống), người ta dùng những biện pháp đình chỉ hoàn toàn sự sống của vi sinh vật gây nhiễm Dưới tác dụng của các yếu tố diệt khuẩn như vậy thì bản thân khối nguyên liệu được bảo quản cũng thay đổi trạng thái, không còn tươi sống nữa Thuộc nguyên tắc này có ba phương pháp được sử dụng như thanh trùng ở nhiệt độ cao, chiếu xạ và siêu âm, dùng hóa chất bảo quản Thanh trùng ở nhiệt độ cao còn gọi là sử dụng quá trình nhiệt nóng

Vì là dưới tác dụng của nhiệt, hoặc do chính các tế bào vi sinh vật bị tiêu diệt, hay

do chính các enzym quan trọng của chúng bị bất hoạt, do vậy không gây nhiễm được Cũng tùy vào loại thực phẩm người ta có thể thực hiện việc khử trùng nguyên liệu ở ba khoảng nhiệt độ khác nhau, kéo dài trong những khoảng thời gian nhất định Ví dụ như đối với loại thực phẩm có nhiều đường bột dễ cháy cần duy trì ở

800C–900C trong 30–45 phút, những nguyên liệu dạng đạm duy trì ở 900C–1000C

trong 45–60 phút còn với những nguyên liệu dạng đồ hộp hoặc vỏ giáp cứng có thể duy trì ở 110 –1500C ở áp suất 1,2 -1,5at

Phương pháp chiếu xạ và siêu âm sử dụng các tia hồng ngoại, tia bức xạ dạng α, β, γ …gây oxi hóa hoặc ion hóa ; do đó tạo ra một trong những hiệu quả dưới đây đối với vi sinh vật: thay đổi thành phần cấu trúc tế bào, phá vỡ màng, bất hoạt hệ enzym và song siêu âm với tần số trên 20000 Hz phá vỡ màng tế bào Trên thế giới, 37 quốc gia đã có luật cho phép chiếu xạ thực phẩm và có hơn 30 nhà máy chiếu xạ thực phẩm đã được xây dựng Ở Mỹ cho đến nay Cục quản lý thực phẩm

và thuốc của Mỹ đã cấp phép cho các loại thực phẩm: lúa mì, bột mì, khoai tây, thịt lợn, hoa quả, rau, gia vị, gia cầm, thức ăn gia súc, thịt đỏ, trứng, sò Đối với thực phẩm đã chế biến và hải sản đang được xem xét để cấp phép Tuy nhiên, hạn chế lớn của phương pháp này là giá thành rất cao và đôi khi không an toàn cho người thực hiện cũng như người tiêu dùng do thiếu hiểu biết về cách thức sử dụng, do đó

ít được sử dụng ở các nước kém phát triển

Phương pháp sử dụng hóa chất để bảo quản có tác dụng sát trùng bằng các loại hợp chất vô cơ cũng như hữu cơ Cơ chế tác dụng của nó thể hiện qua nhiều phương thức khác nhau như: phá hủy thành phần cấu trúc tế bào, ngăn ngừa sự sinh tổng hợp enzym và các protein cấu trúc khác (theo cơ chế cảm ứng hoặc ức chế), gây rối loạn quá trình thẩm thấu qua màng tế bào Các loại hóa chất thường dùng gồm:

Các hợp chất sulfit và bisulfit như K2SO3, Na2SO3, Na2HSO3, KHSO3, Ca(HSO3)2 Các hợp chất này thường dùng với nồng độ dưới 3% Tác dụng của nó

ức chế quá trình sinh tổng hợp protein có chứa S (theo cơ chế cảm ứng) Điều cần lưu ý là những hợp chất này là những hợp chất trên đều gây độc hại cho người tiêu dùng, do vậy không được dùng quá liều quy định

Ngoài các hợp chất nói trên người ta còn sử dụng một số vài loại kháng sinh

có hoạt tính kháng khuẩn mạnh như Tyrozin, Biomycine… những chất này có tác dụng tốt với vi khuẩn nhưng ít hiệu quả với nấm mốc

Cuối cùng là nguyên tắc Anabioza (= giảm sức sống) (Anabiosis = dạng sống

ngầm = sống tiềm sinh), người ta áp dụng những biện pháp nhằm hạn chế sự phát triển của vi sinh vật và hạn chế các hoạt tính của các enzym nhưng không giết chết hoặc đình chỉ hoàn toàn Thuộc nguyên tắc này có 5 biện pháp chính thường được

và phát triển của vi sinh vật tạm ngừng, hoạt động của các enzym bị đình chỉ, các quá trình sinh hóa trong thực phẩm bị ức chế, nhưng nếu đem khối nguyên liệu trở

về nhiệt độ thường thì mọi hoạt động có thể được phục hồi, bởi lẽ vi sinh vật không

bị giết chết ( nhất là nấm mốc), nó chỉ giữ ở trạng thái tiềm sinh mà thôi Do vậy thực phẩm đông lạnh sau khi lấy ra khỏi nơi bảo quản cần được sử dụng sớm, trước khi khối nguyên liệu tan giá

Bảo quản thực phẩm bằng cách phơi hay sấy khô cũng là một biện pháp để bảo quản thực phẩm Phần lớn vi khuẩn chỉ sinh trưởng và phát triển được trong điều kiện tối thiểu là 15% Khi đem phơi hoặc sấy khô thực phẩm tức là làm cho độ

ẩm tối thiểu 15% Khi đem phơi hay sấy khô thực phẩm ,tức là làm cho độ ẩm của nguyên liệu nhỏ hơn độ ẩm tối thiểu, khiến cho các vi sinh vật gây nhiễm không thể phát triển được Nếu sấy hoặc phơi không kỹ, hoặc sau khi phơi, sấy bao gói không tốt để nguyên liệu bị ẩm trở lại thì thực phẩm sẽ bị hư hỏng Biện pháp này thường được áp dụng đối với các loại hải sản và nấm ăn

Bảo quản thực phẩm bằng cách tạo áp suất thẩm thấu và áp suất nén cao

phương pháp dựa trên nguyên tắc chênh lệch áp suất Cụ thể tạo áp suất thẩm thấu cao là khi môi trường bên ngoài có áp suất cao hơn bên trong tế bào vi sinh vật sẽ xảy ra hiện tượng ―co nguyên sinh‖ có nghĩa là nước trong tế bào vi sinh vật bị rút

ra ngoài, nguyên sinh chất bị đông đặc rồi tách khỏi màng tế bào dần dần chết đi

Để tạo áp suất thẩm thấu cao cho môi trường cần chú ý chọn những tác nhân không gây độc, bởi vì phải sử dụng một nồng độ khá cao mới đủ ngưỡng bảo quản Thường thường người ta dùng muối ăn (NaCl) và đường kính (saccharose) Ngoài

ra hiện nay ở Mỹ, người ta đang nói nhiều về loại nước cam, sau 12 tuần giữ lạnh vẫn có hương vị như nước cam tươi, hay chuối không bị thâm đen sau một thời gian dài Bí quyết đằng sau những sản phẩm này chính là công nghệ bảo quản áp suất cao Thực phẩm đóng gói chân không sẽ được nhúng vào trong các thùng nước Sau

đó các thùng này sẽ được đóng kín lại và bơm thêm nước vào Khi áp suất của nước tăng lên, thực phẩm sẽ bị nén lại Quá trình này sẽ giúp tiêu diệt các loại vi khuẩn, enzym và nấm mốc bằng cách bẻ gãy các cấu trúc phân tử và làm vỡ thành tế bào của chúng Sau khi dừng nén áp suất, thực phẩm sẽ quay trở lại kích thước và hình dạng ban đầu Công nghệ này thực sự góp phần cải thiện chất lượng mùi vị của thực phẩm chế biến Qua nhiều cuộc kiểm tra, các chuyên gia thẩm định mùi vị đều đánh giá thực phẩm bảo quản bằng cao áp có mùi vị ngon hơn so với bảo quản bằng phụ gia Hạn chế của công nghệ này là chi phí quá cao và sản phẩm sau xử lý vẫn cần phải giữ lạnh Ngoài ra, công nghệ này không đạt hiệu quả cao đối với các sản phẩm rau và nó có thể làm phai màu thực phẩm nếu áp suất quá cao Vì thế, hiện nay các nhà chế biến chỉ ứng dụng công nghệ này đối với các thực phẩm đắt tiền như thịt gà tây, hàu và đồ ăn sẵn như thịt gà nướng

Người ta còn bảo quản thực phẩm bằng acid vì đa số các loại vi sinh vật gây nhiễm cho thực phẩm đều hoạt động tốt ở khoảng pH trên 4,5 , khi pH hại xuống mức này chúng ngừng phát triển Ngâm thực phẩm vào acid tức là tạo ra xung quanh khối nguyên liệu một môi trường có pH thấp dưới 4,5 Loại axit thường dùng nhất là axit acetic Biện pháp này được dùng để ngâm chua các loại củ quả ăn thay rau (dưa chuột, su hào, củ cải, nấm mỡ…) Riêng đối với các dạng nguyên liệu có hàm lượng cellulose cao người ta thường dùng hai loại axit khác là axit tractic và

axit lactic

Một trong những nguyên nhân gây hư hỏng thực phẩm là do tác dụng của oxy

có trong không khí, khi phân tử O2 tiếp xúc với nguyên liệu sẽ tham gia vào các phản ứng oxy hóa khử làm cho một số thành phần có trong nguyên liệu bị phân giải

và biến tính Để khắc phục tình trạng này người ta tìm ra biện pháp bảo quản thực phẩm bằng khí trơ và khí cacbonic, tức là ngăn cách khối nguyên liệu với không khí bằng cách dùng một khối lượng khí trơ N2 được hóa lỏng ở -1270C Cũng có thể dùng một biện pháp thứ hai là điều chỉnh tỷ lệ của bầu không khí trong kho chứa thực phẩm bằng cách giảm thấp lượng O2 và tăng lượng CO2 Khi hạ tỷ lệ O2/ CO2

đã cùng lúc tạo ra hai hiệu quả là tránh hiện tượng phân hủy nguyên liệu và ức chế

sự sinh trưởng và sự phát triển của bọn vi sinh vật hiếu khí

Cùng với các biện pháp bảo quản thực phẩm khác còn sử dụng cách bảo quản thực phẩm bằng cách tạo điều kiện cho một quá trình lên men có lợi Biện pháp này đơn giản, rẻ tiền vì không tốn nhiên liệu để sấy, không cần đến các hoá chất đắt tiền

và đặc biệt là không gây hại đối với người tiêu dùng, do vậy đang được áp dụng rộng rãi để bảo quản rau, quả, nấm ăn, thịt động vật

Mới nhất hiện nay, các nhà nghiên cứu trên thế giới đã tìm ra một phương pháp sinh học an toàn, đó là sử dụng bacteriocin để bảo quản thực phẩm Phương pháp này giải quyết được khá nhiều nhược điểm của các phương pháp đã được trình bày ở trên ở chỗ: dễ sử dụng, tiết kiệm chi phí bảo quản, không làm biến đổi tính chất của thực phẩm và đặc biệt là không ảnh hưởng đến sức khỏe của người tiêu dùng thực phẩm đó Then chốt của phương pháp sinh học này là việc ứng dụng của một số protein có ở vi khuẩn cụ thể là bacteriocin được sản xuất và phân lập từ nhiều nguồn khác nhau cụ thể là vi khuẩn lactic với khả năng ức chế và tiêu diệt những loại vi khuẩn gây bệnh có trong thực phẩm

1.1.2 Ở Việt Nam

Ở nước ta hiện nay ngoài các phương pháp bảo quản thông thường như vận chuyển thực phẩm tươi, làm lạnh, lên men thực phẩm nhưng vẫn nổi trội hơn cả là phương pháp bảo quản bằng hóa chất đang được người dân và các nhà sản xuất

dùng rất phổ biến Nhu cầu thực phẩm công nghệ ngày càng tăng Để các loại thực phẩm lâu hư, các nhà sản xuất đều phải dùng chất bảo quản (nằm trong danh mục cho phép của Bộ y tế) Tuy nhiên, đây vẫn là chất hóa học và việc sử dụng vượt mức cho phép đều độc hại, ảnh hưởng xấu đến sức khỏe người dùng Việc sử dụng các hóa chất và phụ gia trong xử lý, chế biến thực phẩm đã và đang trở thành một vấn đề đáng chú ý Sức khỏe và thực phẩm có mối quan hệ gắn bó hữu cơ mật thiết với nhau, và chất lượng thực phẩm cũng ảnh hưởng rất lớn đến sức khỏe của con người Trước những vấn đề bất cập như vậy, trong nước ta hiện nay cũng đang phát triển một số nghiên cứu và đang dần triển khai những phương pháp bảo quản mới như sử dụng phương pháp chiếu xạ ở Trung tâm chiếu xạ - Viện Năng lượng Nguyên tử Việt Nam (ở phía Bắc) và Trung tâm Nghiên cứu và triển khai công nghệ bức xạ (ở phía Nam) thực hiện việc chiếu xạ thực phẩm, tại Trung tâm Nghiên cứu và Triển khai Công nghệ bức xạ Mỗi năm, có khoảng 5.000 tấn thực phẩm và 2.000 mét khối dụng cụ y tế các loại đã được đưa vào để chiếu phóng xạ với liều lượng cho phép để diệt khuẩn, hay sử dụng màng sinh học để bảo quản thực phẩm, nghiên cứu các phương pháp sinh học mới mà thế giới đang quan tâm đó là sử dụng bacteriocin Theo báo cáo khoa học công nghệ mới đây thì các nhà nghiên cứu thuộc Viện Công nghệ sinh học (Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam) vừa hoàn thiện quy trình sản xuất và sử dụng chất diệt khuẩn sinh học nisin và enterocin để ứng dụng trong bảo quản nông sản thực phẩm vừa cho hiệu quả bảo quản cao, lại an toàn cho người sử dụng Đây là chính là hướng nghiên cứu mới hiện nay mà trên thế giới đang nghiên cứu để bảo quản thực phẩm tốt hơn Bacteriocin được sử dụng trong thực phẩm lên men từ vi khuẩn trong những thế kỷ qua để giữ gìn giá trị dinh dưỡng của thức ăn và thức uống qua một thời gian bảo quản lâu (Deegan v.v…, 2006) Mặc dù có một vài phương pháp khác bacteriocin, nó có thời gian bảo quản lâu hơn và khả năng diệt khuẩn cao hơn, nhưng ngày nay con người càng ý thức nhiều về sức khỏe nên họ tránh dùng những thức ăn được bảo quản bằng chất hóa học Bacteriocin của vi khuẩn lactic không gây ảnh hưởng đến hiệu suất lên men, những vi khuẩn sinh ra nó, người sử dụng thực phẩm và có ý nghĩa lớn về mặt kinh

tế

1.2 Tổng quan về bacteriocin

1.2.1 Đặc điểm chung về bacteriocin

Để hạn chế sử dụng quá nhiều thuốc kháng sinh hóa học trong thực phẩm trong quá trình bảo quản thực phẩm và thức ăn chăn nuôi, một sự lựa chọn hợp lý là ứng dụng một số protein của vi khuẩn như thuốc kháng sinh Trong số đó, sự sản xuất bacteriocin từ vi khuẩn lactic đã thu hút nhiều sự cố ý

Bacteriocin bản chất là peptid kháng khuẩn sinh ra bởi vi khuẩn để chống lại

vi khuẩn khác Như vậy, loại vi khuẩn tạo ra bacteriocin nào thì có khả năng kháng lại chính bacteriocin đó Ngoài ra không gây ra phản ứng dị ứng trong con người và vấn đề về sức khỏe, bị phân hủy nhanh bởi enzym protease, lipase

Bacteriocin được Gratia tìm thấy đầu tiên năm 1925 trong quá trình nghiên cứu tìm cách tiêu diệt vi khuẩn, kết quả của công trình này đã thúc đẩy sự nghiên cứu về chất kháng sinh và chất kháng khuẩn sinh ra từ vi khuẩn Ông gọi chất phát

hiện ra đầu tiên là colicin vì nó có khả năng tiêu diệt E.coli

Hình 1 Cấu trúc của nisin

Hiện nay có nhiều tài liệu ghi bacteriocin chính là antibiotic (modern food microbiology – sixth edition, James) hoặc xếp nó vào peptid antibiotic vì nó có bản chất là polypeptide, có khả năng kháng khuẩn Gần đây, những nghiên cứu về bacteriocin chủ yếu tập trung vào vi khuẩn Gram âm, trong đó điển hình là colicin Tuy nhiên, những nghiên cứu về bacteriocin được tổng hợp bởi vi khuẩn Gram

dương cũng đang được tiến hành nghiên cứu trong đó có vi khuẩn lactic

1.2.2 Phân loại bacteriocin

Có một lượng lớn những bacteriocin được sản xuất từ vi khuẩn lactic và được phân loại theo những đặc tính hóa sinh và di truyền học Chia chúng thành 4 nhóm trong đó nhóm III, IV chưa được nghiên cứu nhiều, chủ yếu là nhắc đến các ứng dụng của nhóm I, II

Nhóm I lantibiotic nhỏ(<5 kDa) là những peptid ổn định nhiệt, hoạt động theo những cấu trúc màng tế bào Lantibiotic bacteriocin thì thoạt nhiên được chia cắt vào trong hai lớp phụ được dựa vào những sự giống nhau cấu trúc Lớp phụ Ia bao gồm một cách tương đối hình thon dài, nói chung nó hoạt động bằng việc tạo những

lỗ trong màng tế bào chất của các loài nhạy cảm Nisin cũng thuộc vào nhóm này Lớp phụ Ib là những peptid đặc trưng hình cầu, chúng thường hoạt động trong những phản ứng lên men quan trọng của vi khuẩn nhạy cảm(Deegan v.v…,2006)

Hình 2 Cấu trúc của colicin

Nhóm II non – lantibiotic có trọng lượng phân tử biến thiên nhưng thông thường nhỏ(<10 kDa), ổn định nhiệt, chứa những amino acid thông thường Nhóm này được chia cắt vào trong ba nhóm nhỏ Nhóm IIa là những peptid thường kháng

Listeria, đặc trưng là Leucocin A, PA-1 pediocin(Venema v.v…,1997) và sakacin

Nhóm IIb hình thành bởi một phức chất của hai peptid riêng biệt Những peptid này

có ít hoặc không có hoạt động nào và nó không có sự giống nhau giữa các peptid bổ sung Trong nhóm này điển hình là lactococcin G, plantaricin EF và plantaricin JK

Nhóm IIc bao gồm các peptid nhỏ, ổn định nhiệt Trong lớp phụ này được tìm thấy

ở những bacteriocin divergicin A và acidocin B

Nhóm III là các peptid lớn, với trọng lượng phân tử quá 30 kDa Đại diện cho lớp này là helveticin J (Joerger và Klaenhammer, 1986) và helveticin V (Vaugham v.v…,1992), acidofilicin A và lactacin A,B

Ngoài ra đối với bacteriocin của vi khuẩn lactic (LAB) có thể chia theo nhóm dựa vào cấu trúc, cũng có thể dựa vào kiểu hoạt động Một vài bacteriocin của lớp I như nisin, nó có hai kiểu hoạt động, chúng có thể kết hợp với lớp lipid I như xe chuyên chở peptidoglycan subunits từ tế bào chất vào thành tế bào, vì thế ngăn cản

- Kém bền nhiệt

- Có cấu trúc domain

- Dạng vòng

- Kém bền nhiệt

- Có cấu trúc domain

Ngoài ra, chúng có thể sử dụng lớp lipid II như cắt phân tử để bắt đầu quá trình gắn vào màng và hình thành kênh dẫn đến chết tế bào nhanh chóng Lantibiotic có hai chuỗi peptid như lacticin 3147, chúng có thể có hai hoạt động này

do cả hai peptid tham gia

Nhưng ngược lại, mersacidin có duy nhất một hoạt động gắn vào lipid II nhưng không hình thành kênh Thông thường những peptid lớp II có cấu trúc

amphiphilic helical được cài vào tế bào gốc của màng dẫn đến sự khử cực và chết Bacteriocin của nhóm III như lysostaphin có thể tác động trực tiếp vào thành tế bào

vi khuẩn Gram dương dẫn đến chết và làm tan tế bào gốc

Hình 3 Kiểu hoạt động của bacteriocin của vi khuẩn lactic (LAB) 1.2.3 Một số tính chất của bacteriocin

1.2.3.1 Độ bền nhiệt

Hiện nay, một số nghiên cứu cho thấy các loại bacteriocin của những loài khác nhau thì khả năng chịu nhiệt cũng khác nhau Mỗi loài có khả năng chịu nhiệt

ở một khoảng nhất định nhưng chủ yếu chúng thuộc nhóm I, II Chủng ST28MS và

ST26MS được sản xuất bởi Lactobaccillus plantarum không giảm khả năng hoạt

động chống vi khuẩn sau 90 phút tại 1000C hay 20 phút tại 1210

C (Torodov and Dicks, 2005) Hay đặc điểm tính chịu nhiệt có thể liên quan đến cấu trúc phân tử của bacteriocin

1.2.3.2 Độ bền pH

Cũng như độ bền nhiệt, một số bacteriocin có thể hoạt động tốt dưới những khoảng pH nhất định Chủng ST28MS và ST26MS (Torodov and Dicks, 2005) ngoài có độ bền nhiệt cao, chúng lại có thể hoạt động ổn định trong 2 giờ tại những giá trị pH từ 2-12 Những đặc tính này đều dựa vào bản chất thành phần cấu trúc của bacteriocin đó Độ bền nhiệt độ và pH rất quan trọng trong quá trình bảo quản nguyên liệu thực phẩm Tùy vào trạng thái, nhiệt độ thực phẩm mà chúng ta có thể lựa chọn loại bacteriocin bổ sung vào sao cho phù hợp với mục đích sản xuất

1.2.3.3 Độ bền với các enzym

Bảng 2 Tính chất hóa lý của một số bacteriocin của vi khuẩn Gram dương

(Torodov and Dicks, 2005)

Tên bacteriocin Nhiệt độ cho

phép

Khoảng pH bền

Enzym thủy phân

1 1 Megacin A-216 600C/30 phút 2-7 Chymotrypsin,

Pepsin, Trypsin

2 Clostocin A 1000C/30 phút 4-9 Trypsin,

Chymotrypsin, Pronase P, Rnase, Dnase

6 Boticin E-S5 1000C/10 phút 1,1-9,5 Trypsin, Chymotrypsin,

Pepsin, Pronase P, Rnase,

Dnase

7 Boticin P 600C/30 phút 6,5-7,5 Trypsin, Rnase, Dnase,

Alkaline phosphotase, Phospholipases C,D

chịu sự phân cắt đặc hiệu của các enzym khác nhau, thích hợp với nó Khi bị phân cắt bởi các enzym này sẽ khiến bacteriocin mất đi hoạt tính kháng khuẩn Đồng thời đây cũng là dấu hiệu giúp ta nhận biết được đó có phải là bacteriocin không (bảng 2)

1.3 Tổng quan về vi khuẩn lactic

1.3.1 Đặc điểm chung của vi khuẩn lactic

Axit lactic đầu tiên được phát hiện ra từ sữa bò lên men chua bởi nhà toán học Thụy Điển Carl Scheelle năm 1780 và được gọi là axit sữa Năm 1857, Louis Pasteur lần đầu tiên đã chứng minh rằng việc làm ra sữa chua bò là do nhóm vi sinh vật đặc biệt gọi là vi khuẩn lactic Năm 1878, Josph Lister lần đầu tiên phân lập

được một loại vi khuẩn lactic đặt tên là Bacterium lactic ( hiện nay gọi là Streptococcus lactic) Từ đó đến nay nhiều loài vi khuẩn lactic khác nhau đã được

phân lập và nghiên cứu

Vi khuẩn lactic thuộc vi khuẩn Gram dương, không sinh bào tử, hầu hết không di động, có khả năng lên men đường để tạo axit lactic Chúng thu nhận năng lượng nhờ phân giải hydrocacbon và tiết ra axit lactic Nhóm vi khuẩn lactic được

xếp chung vào họ Lactobacteriace và được xếp vào bốn chi: Streptococcus, Pediococcus, Lactobacillus và Leuconostoc Ngày nay người ta còn bổ sung vào nhóm vi khuẩn lactic những chủng thuộc giống Bifidobacterium

Nhóm vi khuẩn này có rất nhiều hình dạng khác nhau như hình trực khuẩn ngắn, dài ở dạng đơn, đôi hoặc xếp thành dạng chuỗi; hình cầu hoặc cầu trực khuẩn

ở dạng đơn, đôi, đám hoặc xếp thành dạng chuỗi Ngoài ra, vi khuẩn lactic còn có dạng hình que Khuẩn lạc tròn nhỏ, trong bong, có màu môi trường, màu trắng đục hoặc màu vàng kem hay khuẩn lạc có kích thước to hơn tròn lồi trắng đục Đặc biệt khuẩn lạc tỏa ra mùi chua của acid, khuẩn lạc dạng S

1.3.2 Phân loại vi khuẩn lactic

Người ta thường dựa vào quá trình lên men chia vi khuẩn lactic thành hai loại: vi khuẩn lactic lên men đồng hình và dị hình

Vi khuẩn lactic lên men đồng hình bao gồm:

Lactobacterium casei là những trực khuẩn rất ngắn, gây chua sữa tự nhiên

Yếm khí tùy tiện, lên men tốt glucose, maltose, lactose tạo ra môi trường có từ 1% axit lactic Ở điều bình thường, chúng gây chua sữa trong vòng 10-12 giờ Nguồn nitơ của vi khuẩn này là pepton Nhiệt độ tối thiểu cho chúng phát triển là

0,8-100C, tối ưu là 350C và tối đa là 450C Chúng thủy phân casein và gelatin rất yếu

Streptococcus cremoris thường tạo thành chuỗi dài, thường phát triển ở nhiệt

độ thấp hơn Lactobacterium casei, tối ưu từ 250C-300C, lên men đường glucose, galactose

Lactobacterium bulgaricus có dạng trực khuẩn rất dài, nhiệt độ phát triển tối

ưu là 200C, có khả năng lên men glucose, lactose Chúng có khả năng tạo độ acid cao (3,7% acid lactic)

Lactobacterium delbruckii thường gặp trên hạt đại mạch, đây là trực khuẩn

lớn Trong quá trình phát triển của mình chúng có khả năng tạo sợi Nhiệt độ tối ưu của chúng phát triển từ 450C-500C, khác với các loài khác chúng không có khả năng lên men đường lactose vì vậy chúng không được dùng trong chế biến sữa

Lactobacterium cueumeris fermenti thường tìm thấy chúng trong sữa ủ chua

Chúng là trực khuẩn, không chuyển động, thường tạo thành tế bào đơn và có khi tạo thành chuỗi Thường chúng tạo thành chuỗi trong quá trình lên men, khả năng tạo acid tối đa trong môi trường từ 0,9-1,2 %

Vi khuẩn lactic lên men dị hình bao gồm:

Streptobacterium hassice fermentatae thường thấy chúng trong dịch lên men

chua rau cải Chúng tồn tại từng tế bào riêng biệt hoặc ghép thành từng đôi hoặc chuỗi ngắn có khi ghép thành chuỗi dài hình sợi Khi lên men rau cải chua tạo thành axit lactic, axit acetic, rượu etylic và CO2 Lên men đường saccarose tốt hơn lên men đường lactose

Lactobacterium lycopersici là trực khuẩn gram dương, sinh hơi, tế bào tạo

thành chuỗi hay đơn, có khi ghép thành đôi một Khi lên men chúng tạo thành acid lactic, rượu etylic, acid acetic và CO2 Chúng có khả năng tạo bào tử, tế bào sinh dưỡng thường chết ở nhiệt độ 800

C

Lactobacillus casei Streptococcus Cremoris Lactobacillus bulgaricus

Hình 4 Một số chủng vi khuẩn lactic 1.3.3 Đặc điểm sinh trưởng

Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn lactic khác nhau, đặc biệt nhu cầu về

vitamin và nitơ Vi khuẩn lactic có thể sử dụng được rất nhiều loại hydratcacbon từ các loại hexose, các đường đôi cho đến các polysaccharide Một vài loại vi khuẩn lên men dị hình, phân lập được từ các sản phẩm thực phẩm, trong quá trình trao đổi chất chúng tạo ra CO2, axit acetic và axit lactic Do chủ yếu các vi khuẩn lên men lactic trong thực phẩm là vi khuẩn lên men lactic dị hình Phương trình tạo thành axit lactic:

C6H12O6 —> CH3COOH + CO2 + C2H5COOH

Một số lớn vi khuẩn lactic không thể sinh được các hợp chất hữu cơ phức tạp

có chứa nitơ Vì vậy để đảm bảo cho sự phát triển của mình chúng phải sử dụng nguồn nitơ có sẵn trong môi trường Chỉ một số ít loài vi khuẩn lactic có khả năng sinh tổng hợp các chất hữu cơ từ nguồn nitơ vô cơ Vì vậy để sinh trưởng và phát triển bình thường ngoài nitơ dưới dạng hỗn hợp các acid amin, vi khuẩn lactic còn cần những hợp chất hữu cơ phức tạp như chứa nitơ như các sản phẩm thủy phân protein từ thịt, casein, pepton…

Các vi khuẩn lactic rất cần vitamin cho sự phát triển Thường phải bổ sung vào môi trường các chất vitamin như khoai tây, cà rốt, dịch tự phân nấm men và nhiều chất khác Vitamin đóng vai trò là coenzym trong quá trình trao đổi chất của

tế bào Rất ít vi khuẩn lactic có khả năng sinh tổng hợp được vitamin

Để đảm bảo sinh trưởng và phát triển đầy đủ, vi khuẩn lactic cần rất nhiều các hợp chất vô cơ như đồng, sắt, natri, kali, lưu huỳnh, mangan Đặc biệt là

mangan vì mangan ngăn cản sự tự phân của tế bào và nó cần thiết cho quá trình sống bình thường của của vi khuẩn sau này Mặt khác một vài enzym có sự tham gia của các ion kim loại như Fe2+, Mg2+, Mn2 trong cấu trúc của trung tâm hoạt động

Ngoài axit amin và vitamin, vi khuẩn lactic còn có nhu cầu rất lớn về các hợp chất hữu cơ khác cho sự phát triển của chúng như: axit hữu cơ (axit acetic…) có tác động đến sự sinh trưởng của tế bào, các bazơ nitơ như adenine, guanine, urasin, thimin…sẽ thúc đẩy sự phát triển nhất định của vi khuẩn Axit amin như L-asparagin, L-glutamin

Nhiệt độ, pH là một trong những nhân tố quan trọng nhất ảnh hưởng tới sinh trưởng của vi khuẩn lactic Tùy thuộc vào nhiệt độ tối ưu cho lên men và cho sự sinh trưởng, vi khuẩn lactic được chia làm hai loại : loại ưa nhiệt và loại ưu ấm

Loại ưu nhiệt gồm có: Lactobaterium bulgaricus, L.thermophilus, L.delbruckii…phát triển tốt ở 45-620C Loại ưa ấm gồm có: L.causasicus, L.lactic, L.helveticus, L.acidophilus, L.bifidus phát triển tốt ở 370C-450C, L.casein, L.plantarum, L.leichmanii, L.brevis, L.buchneri, L.pastorianus phát triển tốt ở 28-

ưu cho quá trình lên men lactic là 500C Trong quá trình lên men lactic có nhiều vi

khuẩn tham gia vì vậy sản phẩm thu được ngoài acid lactic còn có CO2 và một số sản phẩm phụ khác

Trong ngành công nghiệp nhẹ, axit lactic là dung môi cho công nghiệp sản xuất sơn, vecni, nhuộm Trong công nghiệp sản xuất rượu, axit lactic được dùng dưới dạng muối của canxi

Ứng dụng trong công nghiệp sản xuất các sản phẩm từ sữa, vi khuẩn lactic được sử dụng rất nhiều giống khác nhau tùy theo mục đích sản xuất Vi khuẩn lactic đồng hình giúp lên men nhanh, làm giảm pH, vi khuẩn lactic lên men dị hình lên men chậm và tạo mùi thơm đặc trưng là nguyên tắc làm sữa chua Sữa từ dạng lỏng chuyển sang dạng keo sệt và có mùi vị thơm ngon

Ngoài ra để sản xuất phomat người ta dùng enzym đông kết tủa casein trong sữa, sau đó tiếp tục cho lên men lactic với nồng độ muối loãng Tùy loại phomat mà trong quá trình ủ chín người ta sử dụng các loài vi sinh vật khác nhau Các loại vi sinh vật thường được sử dụng để làm chín phomat là vi khuẩn propionic, nấm mốc…

Vi khuẩn lactic còn được ứng dụng trong việc muối chua rau quả Muối chua rau quả nhằm hai mục đích cơ bản: bảo quản nguyên liệu và làm tăng giá trị dinh dưỡng, giá trị cảm quan của rau quả Nguyên tắc để muối chua rau quả là tạo điều kiện để phát triển vi khuẩn lactic đồng thời hạn chế tác dụng của vi khuẩn gây thối rữa

Một ứng dụng khác mà từ lâu người ta đã biết sử dụng quá trình lên men lactic để ủ chua thức ăn gia súc Phương pháp ủ chua thức ăn gia súc Phương pháp

ủ chua thức ăn gia súc đặc biệt cần thiết đối với các trại chăn nuôi gia súc Nguyên liệu dùng làm thức ăn cho gia súc nếu đem phơi khô sẽ làm giảm 50% giá trị của chúng Nhưng nếu ta đem ủ chua thì chỉ giảm khoảng 10% giá trị Đặc biệt bằng phương pháp ủ chua sẽ tăng nhiều chỉ số dinh dưỡng khác của thức ăn

Hiện nay vi khuẩn lactic còn được quan tâm nhiều do chúng có khả năng sinh bacteriocin, một loại protein có khả năng tiêu diệt các vi khuẩn khác do sự tạo thành các kênh làm thay đổi tính thấm của màng tế bào, nhiều loại bacteriocin còn

có khả năng phân giải DNA, RNA và tấn công vào lớp peptidoglycan để làm suy yếu thành tế bào Vì vậy, bacteriocin được dùng nhiều trong bảo quản thực phẩm sữa tươi, nước giải khát, xử lý môi trường, chế biến thức ăn chăn nuôi và đặc biệt là bảo quản thủy sản

1.4 Tình hình nghiên cứu vi khuẩn lactic sinh bacteriocin

1.4.1 Trên thế giới

Hiện nay việc nghiên cứu, ứng dụng bacteriocin do vi khuẩn lactic sinh tổng hợp nên đang là một hướng nghiên cứu được nhiều nhà khoa học quan tâm Và cũng có nhiều công trình nghiên cứu và ứng dụng thành công, góp phần vào việc nâng cao chất lượng cuộc sống của nhân loại Bacteriocin là một chất kháng khuẩn

có khả năng ức chế một số vi khuẩn gây bệnh, nhờ khả năng này mà việc ứng dụng của vi khuẩn lactic đa dạng và phong phú hơn

Năm 1970, nhóm tác giả Kekessy và Piguet thuộc viện Vệ sinh và An toàn thực phẩm – Thụy Sĩ đã nghiên cứu một phương pháp mới trong việc phát hiện ra bacteriocin Chủng vi sinh vật đối kháng được nuôi ủ trên đĩa môi trường thạch dinh dưỡng, sau đó tạo giếng có đường kính 0.5 mm bằng cách khoét bỏ agar trên đĩa Cho một lượng vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp bacteriocin vào giếng, sau thời gian nuôi ủ vòng kháng khuẩn sẽ xuất hiện, thể hiện bởi một vòng kháng rõ quanh giếng

Sáu năm sau, nhóm tác giả Tagg, Dajani và Wannamaker thuộc Khoa vi sinh- trường đại học Otago, New Zealand, trường đại học Dược Minnesota, Minnesota đã nghiên cứu về những loại bacteriocin của vi khuẩn gram dương và cho ra nhiều kết quả có giá trị Nghiên cứu đã cho biết được tính đối kháng của bacteriocin, cách đặt tên và phân loại bacteriocin, chiết tách và tinh sạch bacteriocin, phân tích hoạt tính bacteriocin

Năm 1992, nhóm tác giả Yang, Joshnon và Ray thuộc Đại học Wyoming, Laramie đã nghiên cứu một phương pháp mới để chiết tách một lượng lớn bacteriocin từ vi khuẩn lactic với tên đề tài : ‗Novel method to extract large amounts of bacteriocin from lactic acid bacteria‘ Phương pháp này dùng môi

trường pediocin AcH, nisin, sakacin A, leuconocin Lcm1 làm tăng hiệu quả chiết tách và thu được một lượng bacteriocin nhiều hơn quá trình phân lập

Các tác giả Callewaert và De Vuyst thuộc Khoa công nghệ sinh học ứng dụng -Đại học Brussel, Bỉ, 1999 đã nghiên cứu việc sinh tổng hợp bacteriocin của

Lactobacillus amylovorus DCE 471 và có ứng dụng cải tiến và làm ổn định các sản

phẩm lên men Việc sinh tổng hợp thu nhận bacteriocin bị ức chế bởi nồng độ của nguồn nitrogen

Cùng năm đó, nhóm tác giả Khalid, Siddiqi và Mojgani thuộc Khoa vi sinh Trường đại học Karachi-Pakistan đã nghiên cứu tìm ra một loại bacteriocin mới có

-tên lactocin LC-09 Lactocin LC-09 được phân lập từ chủng vi khuẩn Lactobacillus

có trong một mẫu bệnh Loại này ức chế được một số loại Lactobacillus và vi khuẩn Gram dương khác như Listeria ivanovii, Streptococcus agalactii và Streptococcus peyogenes Đặc tính của Lactocin LC-09 là chịu nhiệt (4 giờ ở 100oC) và thích hợp với môi trường có pH axit Loại bacteriocin này bị khử hoạt tính bằng cách sử dụng enzym protease Có thể dùng acridine orange, ethidium bromide để gây đột biến trong việc sản sinh ra loại bacteriocin này

Năm 2002, Soore cùng cộng sự đã nghiên cứu việc tạo ra một chất kháng khuẩn đặc biệt của vi khuẩn lactic gọi là bacteriocin Bacteriocin được sử dụng như một chất bảo quản thực phẩm tự nhiên có khả năng thay thế các loại hoá chất bảo quản khác Bacteriocin có bản chất là protein nên rất an toàn đối với sức khoẻ con người

Năm 2004, nhóm tác giả Todorov, Van và Dicks thuộc khoa vi sinh, đại học Stellenbosch- Nam Phi đã nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp bacteriocin của chủng

Lactobacillus Plantarum ST13BR , một chủng được phân lập từ bia Barley Bacteriocin được sinh tổng hợp bởi vi khuẩn Lactobacillus plantarum được phân

lập từ bia barley (kích thước phân tử 10kDa) ức chế sự phát triển của vi khuẩn

Lactobacillus casein, Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus faecalis, Klebsiella pneumoniae và Escherichia coli Nghiên cứu đã đưa ra được các loại môi trường có

ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp bacteriocin và hỗn hợp các loại môi trường

mà việc sinh tổng hợp bacteriocin là lớn nhất

Năm 2006, 50 chủng vi khuẩn lactic được tìm thấy từ sản phẩm lên men truyền thống suan-tsai của Đài Loan Với các chủng sau khi phân lập tiếp tục nghiên cứu các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hoá và khả năng sinh tổng hợp bacteriocin Năm 2006, Marcinowski, giám đốc điều hành nghiên cứu tại BASF cho biết

kẹo cao su có chứa các chủng vi khuẩn có lợi Lactobacillus do công ty hoá chất

BASF của Đức phát triển Đây là sản phẩm giúp người dùng loại trừ các bệnh về

răng miệng Chủng Lactobacillus mới có tên là L anti-caries có khả năng sinh

bacteriocin làm cho vi khuẩn gây sâu răng kết thành khối không thẻ dính trên bề mặt răng và bị loại bỏ dễ dàng khi súc miệng

Tháng 3/2007 nhóm tác giả Todorov và Dicks KM thuộc khoa vi sinh, đại học Stellenbosch- Nam Phi đã nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp bacteriocin của

chủng Lactobacillus pentosus ST712BZ được phân lập từ boza Bacteriocin ST712BZ (kích thước 14kDa) ức chế sự phát triển của Lactobacillus casei, E.coli, Pseudomonas aeruginosa, Enterococus faecalis, Klebsiella pneumoniae và Lactobacillus curvatus Sự phát triển của chủng ST712BZ trên môi trường BHI,

M17, sữa đậu nành và mật đường tương tự như trên môi trường MRS với việc sinh tổng hợp bacteriocin cực đại (12800AU/ml) được ghi nhận trên môi trường MRS sau 24h Nghiên cứu đã đưa ra được các loại môi trường, nhiệt độ và pH có ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp bacteriocin và thành phần hỗn hợp các loại môi trường mà việc sinh tổng hợp bacteriocin là lớn nhất

Các nhà nghiên cứu Csiro để tìm ra một vài bacteriocin và sử dụng chúng để tiêu diệt những con vi khuẩn gây bệnh giống trong gà và lợn Bộ gen cho phân tử bacteriocin sẽ được chèn vào gen vi khuẩn không gây bệnh hoặc vi rút mà có thể sinh sản và tiết ra bacteriocin Lợi ích chính của việc sử dụng bacteriocin là nó sẽ giảm mầm bệnh nguy hiểm của con người chống cự lại thuốc kháng sinh

Các nhà nghiên cứu thuộc Đại học Tổng hợp Klemson vừa phát hiện ra một loại thuốc chống vi khuẩn mới không gây tính lờn thuốc từ chính những vi khuẩn tạo ra loại pho mát Thụy Sĩ Những vi khuẩn này tiết ra một loại protein có tên bacteriocin, tạo nên tính chất của pho mát Các thử nghiệm sơ bộ cho thấy chúng có tác dụng chống lại hơn 150 loại vi khuẩn thường gặp

Hình 5 Pho mát chứa loại vi khuẩn có thể làm ra loại thuốc kháng sinh có

khả năng chống nhờn thuốc 1.4.2 Ở Việt Nam

Hiện nay ở nước ta việc nghiên cứu về bacteriocin do vi khuẩn lactic sinh tổng hợp nên đã và đang được nhiều nhà khoa học quan tâm Tuy nhiên các nghiên cứu về ứng dụng của bacteriocin còn ít và chưa thu được những kết quả khả quan

Theo nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp bacteriocin của chủng Lactobacillus plantarum L24 của Nguyễn Thị Hoài Hà và cộng sự tại Trung tâm Công nghệ sinh

học Đại học Quốc gia Hà Nội đã phân lập từ nước dưa Chủng vi khuẩn lactic vừa

có khả năng sinh axit lactic, vừa có khả năng sinh bacteriocin II , protein kháng khuẩn có trọng lượng phân tử 10-30 kDa

Năm 2002 , tác giả Lê Thanh Mai đã thành công trong việc nghiên cứu quy trình muối chua cây nha đam Các thí nghiệm tiến hành dựa trên 2 phương pháp: lên

men có bổ sung giống Lactobacillus plantarum và lên men không bổ sung giống

Kết quả cho thấy muối chua có bổ sung giống cho thành phẩm có chất lượng tốt hơn

và đồng đều hơn

Năm 2004, các tác giả Tăng Thị Chính, Đặng Đình Kim thuộc Viện công nghệ môi trường -Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã nghiên cứu ứng dụng

vi sinh vật làm chế phẩm trong nuôi tôm cao sản Một trong những loại vi sinh vật

được dùng là Lactobacillus Chế phẩm có tác dụng làm tăng tính ngon miệng, giúp

tiêu hoá các chất dinh dưỡng có trong thức ăn, tăng cường sức đề kháng, phòng

ngừa các bệnh đường ruột như nhiễm E.coli, ức chế sự phát triển của các vi khuẩn

có hại Do đó nâng cao năng suất nuôi tôm

Ngoài ra còn rất nhiều các nghiên cứu ứng dụng của vi khuẩn lactic vào các sản phẩm thực phẩm làm cho thực phẩm có tính ổn định và về mặt cảm quan có nhiều ưu việt hơn là sản phẩm thực phẩm lên men lactic tự nhiên Có được ưu điểm này là do ngoài những tính chất ưu việt vi khuẩn lactic còn có khả năng sinh tổng hợp bacteriocin, một chất bảo quản thực phẩm

Bên cạnh đó, ở nước ta đã sử dụng bacteriocin trong quá trình làm nem chua Kết quả đã kéo thời gian bảo quản tránh tình trạng bị chảy nước và góp phần tạo hương vị cho nem chua

Đặc biệt cũng có một số nghiên cứu ứng dụng bacteriocin trong lĩnh vực thủy sản như bổ sung vào thức ăn cho cá, bảo quản tôm trong dung dịch muối NaCl

3-6% có bổ sung nisin ở nhiệt độ thấp để tiêu diệt Listeria monocytogene trong sản

phẩm tôm đông lạnh Khi so sánh dùng phương pháp bảo quản này với các phương pháp khác thì thấy thời gian bảo quản bằng với thời gian khi dùng benzoate hay sorbate để bảo quản nhưng ngoài ra phương pháp bảo quản này rất an toàn, đảm bảo chất lượng cho sức khỏe người tiêu dùng Còn với mảng bảo quản các loại cá hiện nay còn khá ít nguyên cứu về nó

Chương II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu

2.1.1 Mẫu

Mẫu để phân lập vi khuẩn lactic sinh bacteriocin được lấy từ nguồn nước dưa chua, nem chua Ninh Hòa được mua tại chợ Vĩnh Hải và các địa điểm ở khu vực quanh trường đại học Nha Trang Mẫu phân lập vi khuẩn từ ruột cá giò lấy từ cá giò tươi được thu mua ở đìa nuôi Lương Sơn – Nha Trang – Khánh Hòa

Bảng 3 Bảng lấy mẫu phân lập vi khuẩn lactic

Các chủng Chủng Salmonella Sal 1, Bacillus B1.1 và Vibrio C1 được lấy từ

bộ sưu tập vi sinh vật của phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học, trường Đại học Nha Trang

Chủng Salmonella Sal 1 được nuôi cấy trên môi trường RV, pH 5,2 – 5,7,

nuôi trong tủ ấm ở 370C trong 7-10 giờ

Chủng Bacillus B1.1 được nuôi cấy trên môi trường TSB, pH 7,3 ± 0,2, lắc

180 vòng/phút trong 7 – 8 giờ

Chủng Vibrio C1 được nuôi cấy tương tự như chủng Bacillus B1.1 nhưng

đem lắc 150 vòng/ phút

Sau khi nuôi dịch đủ thời gian thích hợp thì hút 700 µl vi khuẩn để giữ trong dung dịch glycerol 30%, nhằm mục đích bảo quản để sử dụng trong thời gian dài ở -800C

Cần chuẩn bị chủng chỉ thị trước khi thử đối kháng bằng cách lấy 1 ống giống từ tủ bảo quản chủng, sau đó hút 1 ml dịch vi khuẩn đem nuôi cấy ở những điều kiện thích hợp trên môi trường nuôi trong vòng 16 – 18 giờ

2.1.3 Thiết bị chuyên dụng

- Máy ly tâm ( Eppendorf Centrifuge 5417R, Mỹ)

- Tủ lạnh (NANO Silver, Việt Nam)

- Kính hiển vi 3 mắt ngắm có camera và máy tính (Motic BA 300, Mỹ)

- Máy định lượng protein bằng quang phổ hấp thụ phân tử (UV/VIS) (Carry

2.1.4 Hóa chất, môi trường và thuốc thử

a) Môi trường tăng sinh: Alkaline Peptone Water (APW)

Pepton : 10 g Natri clorua (NaCl) : 30 g

Nước cất : 1 lít pH = 8,5 ± 0,2

Hòa tan các thành phần, chỉnh pH theo yêu cầu rồi chia vào các bình tam giác dung tích 100 ml, mỗi bình 20 ml Đậy nút bông, giấy bạc rồi đem hấp ở 1210C trong 10 phút Việc bao gói phải thật kín và cẩn thận để sau khi khử trùng không bị bật nút rất dễ nhiễm vi sinh vật, tránh mất nước và làm pH thay đổi

b) Môi trường phân lập: Lactobaccillus MRS Broth (MRS Broth)

Thành phần môi trường tổng hợp MRS Broth

Hòa tan 55.15 g môi trường MRS Broth tổng hợp với 1000 ml nước cất,