phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn biển sinh bacteriocin từ tu hài (lutraria philippinarum)

Mỗi khi trong ao động vật thủy sản bị bệnh, không thể chữa từng con mà phải chữa bệnh theo quần đàn, thuốc dùng phải tính cho tổng số cá thể trong ao nuôi nên tốn kém nhiều, các loại thu

VŨ THỊ XUÂN

PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG

VI KHUẨN BIỂN SINH BACTERIOCIN

TỪ TU HÀI (Lutraria philippinarum)

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Nha Trang, tháng 07 năm 2012

VŨ THỊ XUÂN

PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG

VI KHUẨN BIỂN SINH BACTERIOCIN

TỪ TU HÀI (Lutraria philippinarum)

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Hướng dẫn khoa học:

TS NGUYỄN VĂN DUY

Nha Trang, tháng 07 năm 2012

LỜI CẢM ƠN

Trước tiên, tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo Viện Công nghệ sinh học và Môi trường, Trường Đại học Nha Trang đã luôn quan tâm, chỉ bảo và giảng dạy nhiệt tình, giúp cho tôi có được những kiến thức quý báu trong suốt thời gian học tập tại trường

Tôi xin dành lời cảm ơn sâu sắc nhất đến thầy Nguyễn Văn Duy, Bộ môn Công nghệ sinh học, Viện Công nghệ sinh học và Môi trường, đã định hướng, dìu dắt và tận tình hướng dẫn tôi trong suốt thời gian tôi thực hiện đồ án tốt nghiệp này

Tôi xin chân thành cảm ơn đến chị Nguyễn Minh Nhật, cán bộ quản lý phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học, đã tạo mọi điều kiện về thời gian để tôi hoàn thành

đề tài

Cuối cùng, tôi bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến gia đình, bạn bè, những người luôn quan tâm giúp đỡ, động viên, đồng thời là chỗ dựa tinh thần rất lớn giúp tôi hoàn thành tốt mọi công việc được giao trong suốt thời gian học tập và thực hiện đồ án vừa qua

Nha Trang, tháng 7 năm 2012

Sinh viên

Vũ Thị Xuân

MỤC LỤC

Trang

LỜI CẢM ƠN i

MỤC LỤC ii

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vi

LỜI MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 3

1.1.Tình hình dịch bệnh trong nuôi trồng thủy sản 3

1.1.1.Tình hình dịch bệnh 3

1.1.2.Các biện pháp phòng trừ 7

1.2.Tình hình nuôi trồng và đặc điểm sinh học của tu hài 8

1.2.1.Tình hình nuôi tu hài 9

1.2.2.Đặc điểm sinh học 9

1.3.Tổng quan về bacteriocin 11

1.3.1.Đặc điểm chung của bacteriocin 11

1.3.2.Phân loại bacteriocin 12

1.3.2.1.Bacterioin của vi khuẩn Gram âm 14

1.3.2.2.Bacteriocin của vi khuẩn Gram dương 15

1.3.2.3.Bacteriocin của cổ khuẩn 16

1.3.3.Di truyền bacteriocin 16

1.3.4.Sinh tổng hợp bacteriocin 19

1.4.Tình hình nghiên cứu về vi khuẩn biển sinh bacteriocin 20

1.5.Tiềm năng ứng dụng của bacteriocin biển 23

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26

2.1 Vật liệu 26

2.1.1 Mẫu tu hài 26

2.1.2 Chủng vi sinh vật chỉ thị 26

2.1.3 Môi trường và hóa chất chuyên dụng 27

2.1.4 Thiết bị chuyên dụng 27

2.2 Phương pháp nghiên cứu 28

2.2.1 Phân lập vi khuẩn biển 28

2.2.2 Xác định đặc điểm hình thái 29

2.2.2.1 Hình thái khuẩn lạc 29

2.2.2.2 Nhuộm Gram 30

2.2.3 Xác định hoạt tính kháng khuẩn của vi khuẩn 32

2.2.3.1 Thu dịch chiết tế bào 32

2.2.3.2 Khảo sát sơ bộ khả năng sinh chất kháng khuẩn 32

2.2.4 Xác định hoạt tính sinh bacteriocin 33

2.2.5 Định danh vi khuẩn 34

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 36

3.1 Phân lập tổng số vi khuẩn hiếu khí từ tu hài 36

3.2 Sàng lọc vi khuẩn có hoạt tính kháng khuẩn 37

3.3 Tuyển chọn chủng vi khuẩn biển sinh bacteriocin 38

3.4 Một số đặc điểm sinh học của các chủng vi khuẩn biển sinh bacteriocin 42

3.4.1 Hình thái khuẩn lạc 42

3.4.2 Nhuộm Gram 45

3.5 Định danh vi khuẩn 47

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 50

Kết luận

Kiến nghị

TÀI LIỆU THAM KHẢO

DANH MỤC BẢNG

Trang Bảng 1.1 Bacteriocin của vi khuẩn và cổ khuẩn 13 Bảng 2.1 Thu mẫu Tu hài phân lập vi khuẩn biển 26 Bảng 3.1 Kết quả phân lập các chủng vi khuẩn biển từ tu hài 37 Bảng 3.2 Hoạt tính kháng một số vi khuẩn chỉ thị của các chủng vi khuẩn biển 37 Bảng 3.3 Hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết tế bào hai chủng X1.4 và X1.5 tương ứng bằng đường kính vòng kháng khuẩn đối với chủng chỉ thị B1.1 41

DANH MỤC HÌNH

Trang

Hình 1.1 Tu hài Lutraria philippinarum 10

Hình 1.2.Tổ chức di truyền của bacteriocin 17

Hình 1.3 Số lượng bài báo nghiên cứu về bacteriocin trong mỗi thời kỳ 10 năm từ 1950-2010 được trích dẫn trên Pubmed 20

Hình 2.1 Mẫu tu hài được dùng để phân lập vi khuẩn biển 26

Hình 2.2 Trình tự pha loãng mẫu phân lập 29

Hình 2.3 Phương pháp cố định phiến vết 30

Hình 2.4 Phương pháp nhuộm Gram 31

Hình 2.5 Minh họa vùng kháng khuẩn của bacteriocin trên đĩa thạch 33

Hình 3.1 Vi khuẩn biển phân lập từ tu hài ở nồng độ pha loãng 10-7 sau 24 giờ nuôi cấy ở 370 C 36

Hình 3.2 Hoạt tính kháng vi khuẩn chỉ thị B1.1 của các chủng vi khuẩn biển 38

Hình 3.3 Khả năng kháng của dịch chiết tế bào của chủng X1.5 và X1.4 trước và sau khi trung hòa pH 39

Hình 3.4 Xác định bản chất protein của chất kháng khuẩn trong dịch chiết tế bào cuả chủng X1.5 và X1.4 40

Hình 3.5 Kiểm tra độ bền nhiệt của dịch bacteriocin thô cuả chủng X1.5 và X1.4 42

Hình 3.6 Hình thái khuẩn lạc chủng X1.4 cấy ria và điểm 43

Hình 3.7 Hình thái khuẩn lạc chủng X1.5 cấy ria và điểm 43

Hình 3.8 Hình thái khuẩn lạc chủng X1.9 cấy ria và điểm 44

Hình 3.9 Hình thái khuẩn lạc chủng X1.11 cấy ria và điểm 44

Hình 3.10 Tế bào của chủng chủng X1.4 sau khi nhuộm Gram 45

Hình 3.11 Tế bào của chủng chủng X1.5 sau khi nhuộm Gram 46

Hình 3.12 Tế bào của chủng chủng X1.9 sau khi nhuộm Gram 46

Hình 3.13 Tế bào của chủng chủng X1.11 sau khi nhuộm Gram 47

Hình 3.14 Trình tự đoạn gen 16S rDNA của chủng X1.5 48

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

1 BLIS Bacteriocin-Like Inhibitory Substance

2 CFU Colony Forming Unit (Đơn vị hình thành khuẩn lạc)

3 FAO Food and Agriculture Organization of the United Nations

4 IHHNV Infectious Hypodermal and Hematopoietic Necrosis

5 IHN Infectious Hematopoietic Necrosis

6 NCBI National Center for Bioinformatic Information

7 OD Optical Density (Mật độ quang)

8 RSIV Red Seabream Iridovirus

9 TSA Trypticase Soy Agar

10 TSB Trypticase Soy Broth

11 TSV Taura Sydrome in Penaeus Vannamei

12 VHS Viral Haemorrhagis Septicamia

13 VNN Viral Nervous Necrosis

14 WSSV White Spot Syndrome Virus

15 YHV Yellow Head Disease

LỜI MỞ ĐẦU

Việt Nam có bờ biển dài hơn 3.260 km, với diện tích vùng biển rộng hơn 1 triệu km2, gấp 3 lần diện tích đất liền Nuôi trồng thủy sản hiện là một trong những lĩnh vực sản xuất thực phẩm phát triển mạnh nhất ở nước ta Hoạt động nuôi trồng thủy sản đang tạo ra nguồn thu nhập chính cho ngư dân các vùng ven biển nước ta nhờ có điều kiện tự nhiên phù hợp cho nuôi trồng một số loài hải sản chủ lực và nhờ

có nguồn thu lớn từ xuất khẩu Tuy nhiên, dịch bệnh thường xuyên xảy ra đã gây thiệt hại kinh tế hàng triệu đô la Mỹ mỗi năm Trong số các tác nhân gây bệnh thì vi

khuẩn điển hình là các loài Vibrio, được coi là một trong những nguyên nhân chính

Hơn nữa, cùng với hiện tượng biến đổi khí hậu toàn cầu, những quan ngại đối các vi khuẩn gây bệnh ngày càng tăng lên, bởi vì ở nhiệt độ cao hơn thì khả năng gây bệnh

và truyền nhiễm cũng tăng theo

Để giải quyết vấn đề này, ngư dân thường xuyên sử dụng các chất kháng sinh để điều trị các bệnh do vi khuẩn (Cabello, 2006) Tuy nhiên chất kháng sinh dường như đã mất hiệu quả trong nuôi trồng thủy sản do việc lạm dụng quá mức Việc sử dụng các chất kháng sinh không chỉ làm tăng khả năng kháng bệnh của vi khuẩn, phá vỡ hệ vi sinh bình thường và gây ra hiện tượng mất cân bằng vi sinh (microdysbiosis) mà còn làm tích lũy các gốc kháng sinh trong sản phẩm thủy sản

có hại cho sức khỏe người tiêu dùng Vì vậy, các giải pháp thay thế thân thiện với con người và môi trường đang được quan tâm nghiên cứu và ứng dụng như sử dụng vaccine Nhưng việc sử dụng vaccine thường tốn chi phí sản xuất, chi phí nhân công và gây stress mạnh cho động vật nuôi (Corripio-Myar et al, 2007; Smith, 2007) Hơn nữa vẫn chưa có vaccine ngừa bệnh cho tôm và nhuyễn thể (Subasinghe, 2009)

Vấn đề đặt ra là cần tìm một chất kháng sinh thế hệ mới có hiệu quả tốt trong phòng và trị bệnh, an toàn, thân thiện với sức khỏe con người và môi trường Những nghiên cứu gần đây cho thấy bacteriocin là chất kháng sinh thế hệ mới đáp ứng đủ các yêu cầu mong muốn do bản chất là protein an toàn và thân thiện với môi trường, phổ kháng khuẩn hẹp giúp hạn chế sự kháng thuốc của vi khuẩn Tuy nhiên

các nghiên cứu gần đây mới chỉ tập trung nghiên cứu về bacteriocin của vi khuẩn lactic nhằm ứng dụng bảo quản thực phẩm

Hệ vi sinh vật biển đa dạng và phong phú là tiềm năng lớn cho các nghiên cứu các hoạt chất sinh học đặc biệt là các hợp chất kháng khuẩn Tuy nhiên, các nghiên cứu về vi sinh vật biển sản xuất bacteriocin hoặc các hợp chất tương tự bacteriocin (Bacteriocin-Like Inhibitory Substances, BLIS) đặc biệt là các vi sinh vật biển sống bám trên động vật biển lại rất ít Cho đến nay, những nghiên cứu như vậy vẫn hoàn toàn bỏ ngỏ ở Việt Nam

Vì những lý do trên chúng tôi thực hiện đề tài: “Phân lập và tuyển chọn các

chủng vi khuẩn biển sinh bacteriocin từ tu hài (Lutraria philippinarum)” với các

nội dung chính:

- Phân lập vi khuẩn biển từ tu hài

- Sàng lọc vi khuẩn có khả năng kháng khuẩn

- Xác định hoạt tính bacteriocin của các chủng phân lập

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Tình hình dịch bệnh trong nuôi trồng thủy sản

Theo Tổ chức Lương thực và Nông nghiệp Liên hợp quốc, nuôi trồng thủy sản đang phát triển nhanh chóng hơn so với tất cả các ngành sản xuất thực phẩm động vật khác (Romero et al, 2012) Đóng góp vào nguồn cung toàn cầu của một số loài cá, động vật giáp xác và động vật thân mềm đã tăng từ 3,9% tổng sản lượng tính theo trọng lượng trong 1970 đến 33% trong năm 2005 Ước tính ngành thủy sản và nuôi trồng thủy sản cung cấp cho thế giới với khoảng 110 triệu tấn thủy sản mỗi năm(FAO, State of World Fisheries and Aquaculture 2010), tính trên bình quân đầu người là tương đương 16,7 kg trên một người Cung cấp này, 47% có nguồn gốc từ sản xuất nuôi trồng thủy sản Tuy nhiên, sản xuất nuôi trồng thủy sản đã và đang gặp khó khăn bởi tình hình dịch bệnh diễn ra rất phức tạp và không thể đoán trước tỉ lệ chết của thủy sản nuôi (Romero et al, 2012)

1.1.1 Tình hình dịch bệnh

Nuôi trồng thủy sản đang trở thành một ngành công nghiệp tập trung, với số lượng ít hơn, nhưng quy mô lớn hơn nhiều các trang trại nuôi thủy sản Các bệnh truyền nhiễm gây nguy hiểm và có thể gây thiệt hại nặng nề cho người nuôi và các vấn đề nghiêm trọng đến sức khỏe vật nuôi thủy sản Hơn nữa, cùng với hiện tượng biến đổi khí hậu toàn cầu, những quan ngại đối các dịch bệnh trên quy mô lớn ngày càng tăng lên, bởi vì ở nhiệt độ cao hơn thì khả năng gây bệnh và truyền nhiễm cũng tăng theo Dịch bệnh trong nuôi trồng thủy sản bao gồm: dịch bệnh do nấm và

ký sinh trùng, bệnh do virus và bệnh do vi khuẩn

Nấm là nguyên nhân gây nên nhiều bệnh ở cá như: Bệnh nấm thủy mi – gây

ra do do 4 giống nấm Leptolegnia, Aphanomyces, Saprolegnia và Achlya; Bệnh nấm mang - gây ra bởi Branchiomyces Các loại nấm gây hại nhiều đối với nhiều

loại cá nuôi giai đoạn cá con, cá thịt và trứng cá Nấm gây bệnh trên cá làm cho cá

bị ngứa ngáy, lở loét, kém ăn

Ký sinh trùng cũng là tác nhân gây bệnh trên cá biển nuôi Nguyễn Thị Muội

và Đỗ Thị Hòa (1978 -1980) đã phát hiện được 80 loài ký sinh trùng ký sinh trên cá biển. Nhiều loại ký sinh trùng như: ký sinh trùng đơn bào (Amyloodinium), ký sinh trùng bánh xe (Trichodiniosis), và các loại sán lá đơn chủ (Monogeneansis,

Neobenedenia girellae, Benedenia epinepheli và Benedenia sp.) cũng là nguyên

nhân gây ra một số bệnh ở cá nuôi Mặc dù không gây tổn thất lớn nhưng nó làm cho cá chậm lớn, giảm chất lượng thịt cá, tạo cơ hội cho vi khuẩn và virus tấn công

(Đỗ Thị Hòa et al, 2004)

Virus là tác nhân gây bệnh nguy hiểm trên cá biển nuôi lồng bè Các tác nhân virus gây bệnh thường gặp chủ yếu ở tôm nuôi như bệnh đốm trắng (WSSV), bệnh đầu vàng (YHV), bệnh hoại tử cơ quan tạo máu (IHHNV), hội chứng Taura (TSV)… Ở trên cá biển nuôi, tác nhân virus gây bệnh được ghi nhận nhiều là virus gây bệnh tử hoại thần kinh (VNN) Bệnh này gây ra trên nhiều loài cá biển và phân

bố rộng rãi ở nhiều vùng địa lý khác nhau (Takana et al, 2003) Bệnh này đã được

phát hiện trên các loại cá mú (Epinephelus spp.) cá chẽm (Lates calcarifer) và cá bớp (Rachycentron canadum) nuôi ở Khánh Hòa, Việt Nam (Trần Vĩ Hích et al,

2008) Một số bệnh do virus cũng gây thiệt hại đáng kể cho nghề nuôi cá biển trên

thế giới như virus IHN gây hoại tử cơ quan tạo máu ở cá hồi vân, iridovirus gây ra

hiện tượng hoại tử mang và da ở cá tầm trắng Ngoài ra, một số bệnh khác do virus cũng đã được ghi nhận ở các loài cá khác như bệnh nhiễm trùng xuất huyết do vi rút

do virus VHS gây nên ở cá hồi, cá trích, cá bơn; bệnh do RSIV ở cá vược, cá tráp

và cá mú song

Hiện nay, bệnh do vi khuẩn gây thiệt hại rất lớn cho nghề ương nuôi cá thương phẩm Nhiều bệnh trên cá nuôi lồng bè trên biển do vi khuẩn đã được ghi

nhận như: bệnh đốm trắng ở thận trên cá giò nuôi thương phẩm, bệnh Vibriosis,

bệnh mòn vây cụt đuôi và bệnh xuất huyết nhiễm trùng máu ở cá mú, cá giò, cá

chẽm (Đỗ Thị Hòa et al, 2008) Theo thống kê Ở Khánh Hòa, có khoảng 30% hộ

nuôi cá biển bị chịu tác hại của bệnh do vi khuẩn Bệnh có thể xảy ra ở nhiều loài cá biển nuôi như cá mú, cá chẽm, cá hồng, đặc biệt giai đoạn cá nhỏ (5 - 20cm), cá

nuôi lồng thường chịu tác hại nặng hơn giai đoạn cá lớn với tỷ lệ chết có thể đạt 100%, đây là bệnh không có mùa vụ rõ ràng (Đỗ Thị Hòa, 2008) Các vi khuẩn gây

50-bệnh trên cá biển đã được biết như : Vibrio spp., Aeromonas spp., Flexibacter sp.,

Pseudomonas fluorescents, Pseudomonas putida, Photobacterium damsela, (Đỗ Thị

Hòa, 2008) Trong đó, nhóm vi khuẩn Vibrio spp gây bệnh đang được chú ý hơn cả

vì tốc độ lây lan và mức độ ảnh hưởng nghiêm trọng của chúng trong nghề nuôi trồng thủy sản hiện nay

Vibrio – vi khuẩn gây bệnh điển hình ở động vật thủy sản Bệnh vibriosis

là tên gọi chung cho các bệnh khác nhau ở động vật thủy sản do vi khuẩn Vibrio spp gây ra Trong bệnh vibriosis, vi khuẩn Vibrio có thể là tác nhân sơ cấp hoặc

tác nhân thứ cấp (tác nhân cơ hội, ký sinh trùng ký sinh hay các tác động môi trường như cơ học, hóa học) có thể đóng các vai trò quan trọng trong các dịch

bệnh vibriosis ở động vật thủy sản (Đỗ Thị Hòa et al, 2004) Vibrio là tác nhân gây bệnh nguy hiểm đối với động vật thủy sản V anguillarum, V.salmonicida,

và V.vulnificus là ba trong số những loài gây bệnh chính cho vài loài cá Số lượng chết gây ra bởi Vibrio trên cá và các loài sò hến là rất phổ biến trong giai

đoạn ấu trùng sớm và có thể xuất hiện đột ngột, đôi khi dẫn đến chết toàn bộ (Thompson et al, 2004)

Trong những năm gần đây, nghề nuôi cá lồng trên biển phát triển mạnh, bệnh vibiosis đã trở thành các bệnh thường gặp và gây nhiều tác hại cho nghề nuôi thủy

sản (Đỗ Thị Hòa et al, 2004) Bệnh do Vibrio gây ra có thể quan sát được ở khắp

mọi nơi có nghề nuôi động vật thủy sản nước lợ và nước mặn, sự phân bố của bệnh này rộng khắp thế giới, tập trung ở châu Á, Phi và Mỹ

Nhiều loài cá biển có giá trị kinh tế cao đang được nuôi phổ biến ở nhiều

quốc gia châu Á, như cá mú (Epinephelus spp.), cá chẽm (Lates calcarifer) thường

bị bệnh này, đặc biệt là hình thức nuôi lồng bè trên biển Bệnh thường thể hiện các dấu hiệu: trên thân xuất hiện các đốm đỏ nhỏ, tại đó vẩy cá bị tróc và rụng đi, sau một thời gian tạo nên các vết loét nhỏ, sâu Giải phẫu bên trong cho thấy hiện tượng xuất huyết nội tạng, và xuất huyết trong cơ của cá Cá bị bệnh có thể gây chết hàng

loạt khi bị cấp tính, gây chết rải rác khi ở các thể thứ cấp tính (Đỗ Thị Hòa et al, 2004) Từ cá bệnh ở Việt Nam người ta đã phân lập được một số loài vi khuẩn như

Vibrio parahaemolyticus, V alginolyticus, và V anguillarum (Phan Thị Vân et al,

2000) Ngoài ra có những báo cáo khác về bệnh do Vibrio ở cá như vi khuẩn V

anguillarum, V vulnificus gây bệnh nhiễm khuẩn máu ở cá trình, V salmonicida

gây bệnh ở cá vùng nước lạnh (Đỗ Thị et al, 2004)

Nghiên cứu bệnh ở động vật thân mềm cho đến nay còn rất hạn chế, chưa có nhiều nghiên cứu về lĩnh vực này Bệnh và địch hại đối với động vật thân mềm được quan tâm ở hai giai đoạn: Ấu trùng và trưởng thành trong quá trình ương nuôi

Ký sinh trùng là đối tượng rất nguy hiểm, ngoài ra Vi khuẩn cũng gây bệnh cho ấu trùng động vật thân mềm Nghiên cứu của Davis (1954) phát hiện ra loại vi khuẩn

Sirolpidium zoophhorum gây hại cho giai đoạn ấu trùng động vật nhuyễn thể

Nghiên cứu của Gaillo (1954) cho thấy, hai loại vi khuẩn của Vibrio và một loại giả đơn bào khuẩn que Pseudomonas trong quá trình đồng hoá và dị hoá chúng tiết ra

chất độc, khi hàm lượng chất độc đạt tới nồng độ cao nhất Sẽ làm ấu trùng nhuyễn thể hai mảnh vỏ ngừng sinh trưởng thậm chí làm ấu trùng chết hàng loạt (Đào Minh Đông, 2004)

Địch hại của Tu hài là một số loài cua biển và cá sống ở tầng đáy Chúng tấn công và ăn Tu hài rất mạnh Trong quá trình nuôi thương phẩm Tu hài nếu không sử dụng các biện pháp để bảo vệ Tu hài thì tỷ lệ thu hồi sẽ thấp

Trong sản xuất giống nhân tạo qua quan sát trên kính hiển vi thấy ấu trùng

Tu hài thường gặp phải một số bệnh: nguyên sinh động vật và bệnh nấm Nguyên sinh động vật chúng tấn công vào trong cơ thể ấu trùng và gây chết hàng loạt, nhất

là giai đoạn ấu trùng Spat Trong quá trình ương nếu bể ương không thay nước thường xuyên và kịp thời thì nấm phát triển rất nhanh, làm bẩn môi trường nước và làm ấu trùng chết hàng loạt (Lê Xân, 2001)

Thời gian gần đây từ tháng 8 năm 2011 đến nay, theo thu nhận từ người dân nuôi tu hài cho thấy tu hài mắc bệnh không co được vòi, vòi bị sưng, rìa vỏ bị thâm đen, tu hài chết ở các độ tuổi và kích cỡ khác nhau Theo kết quả xét nghiệm của

Trung tân chẩn đoán thú y Trung ương ngày 30/5/2012 thì tất cả các mẫu xét

nghiệm đều dương tính với vi khuẩn Vibrio spp và nội ký sinh Perkinsus spp

1.1.2 Các biện pháp phòng trừ

Động vật thủy sản sống trong nước nên vấn đề phòng và trị bệnh không giống gia súc trên cạn Mỗi khi trong ao động vật thủy sản bị bệnh, không thể chữa từng con mà phải chữa bệnh theo quần đàn, thuốc dùng phải tính cho tổng số cá thể trong ao nuôi nên tốn kém nhiều, các loại thuốc chữa bệnh ngoài da cho động vật thủy sản thường phun trực tiếp xuống nước, nên chỉ áp dụng với ao có diện tích nhỏ, còn các thủy vực có diện tích mặt nước lớn không sử dụng được phương pháp này Các thuốc chữa bệnh bên trong cơ thể động vật thủy sản phải trộn vào thức ăn, nhưng những con bị bệnh lại không ăn, những con khỏe lại ăn rất nhiều, nên dù có

sử dụng loại thuốc đúng nhưng hiệu quả cũng không cao và những con khỏe mạnh cũng phải dùng thuốc làm ảnh hưởng tới sinh trưởng của chúng Có một số thuốc khi chữa bệnh cho động vật thủy sản có thể tiêu diệt được nguyên nhân gây bệnh (vi khuẩn, nấm, ký sinh trùng) nhưng kèm theo phản ứng phụ nặng nề với động vật nuôi và môi trường nuôi Vì vậy các nhà nuôi trồng thủy sản luôn đặt vấn đề phòng bệnh cho động vật thủy sản lên hàng đầu và nguyên tắc là: ”phòng bệnh là chính, chữa bệnh khi cần thiết” (Đỗ Thị Hòa, 2004)

Các biện pháp phòng trừ đang được áp dụng trong nuôi trồng thủy sản như ngăn chặn sự xâm nhập và kìm hãm sự phát triển của tác nhân gây bệnh, quản lý môi trường nuôi thích hợp và nâng cao sức đề kháng của động vật thủy sản nuôi (Đỗ Thị Hòa, 2004)

Biện pháp phòng và trị bệnh do nấm hiện nay thường dùng muối ăn (NaCl) nồng độ 2 - 3%, sulfate đồng (CuSO4) nồng độ 0,5g/m3

nước để tắm cho cá nuôi Biện pháp phòng ngừa các bệnh do ký sinh trùng thường là giữ vệ sinh ao cá nhất là ao ương, cải tạo ao nuôi kỹ càng, thả cá với mật độ vừa phải và tẩy giun sán định kỳ cho cá nuôi bằng thuốc

Hiện nay chưa có biện pháp chữa trị cho bệnh bởi virus trên cá nuôi nên để giảm thiểu nguy cơ mắc bệnh virus thì phải đảm bảo nguồn giống sạch virus và hạn chế nhập, xuất khẩu các loại cá có nguy cơ nhiễm virus đã biết

Vấn đề cấp bách hiên nay đối với người nuôi là thâm canh nuôi trồng thủy sản đã dẫn đến ngày càng tăng các vấn đề với bệnh do vi khuẩn Các bệnh chủ yếu

do Aeromonas, Vibrio, Cytophaga, Streptococcus, Pasteurella, Mycobacterium, và Edwardsiella chi (Bảng 1.1) Để giải quyết vấn đề này, nông dân thường xuyên sử dụng các chất kháng sinh để điều trị các bệnh do vi khuẩn (Cabello, 2006) Tuy nhiên chất kháng sinh dường như đã mất hiệu quả trong nuôi trồng thủy sản do việc lạm dụng quá mức Việc sử dụng các chất kháng sinh không chỉ làm tăng khả năng kháng bệnh của vi khuẩn, phá vỡ hệ vi sinh bình thường và gây ra hiện tượng mất cân bằng vi sinh (microdysbiosis) mà còn làm tích lũy các gốc kháng sinh trong sản phẩm thủy sản có hại cho sức khỏe người tiêu dùng Vì vậy, các giải pháp thay thế thân thiện với môi trường như sử dụng vaccine Nhưng việc sử dụng vaccine thường tốn chi phí sản xuất, chi phí nhân công và gây stress mạnh cho động vật nuôi (Corripio-Myar et al, 2007; Smith, 2007) Hơn nữa vẫn chưa có vaccine ngừa bệnh cho tôm và nhuyễn thể (Subasinghe, 2009) Do vậy, sử dụng các vi khuẩn sinh bacteriocin có thể là giải pháp thay thế rất phù hợp với vai trò kép bởi vì bacteriocin

sẽ là một chất kháng sinh thế hệ mới an toàn và thân thiện với sức khỏe con người

và môi trường, trong khi đó các vi khuẩn đóng vai trò của probiotic

1.2 Tình hình nuôi trồng và đặc điểm sinh học của tu hài

Việt Nam có bờ biển kéo dài hơn 3200km, có khoảng 112 cửa sông và 1,7 triệu

ha mặt nước nuôi trồng thủy sản Trong đó diện tích bãi triều khoảng 666,00ha (Phạm Thược, 2005) tạo nên tiềm năng lớn cho nghề nuôi các đối tượng hải sản,

đặc biệt là loài động vật thân mềm hai mảnh vỏ (Bivalvia) Nhuyễn thể hai mảnh vỏ đang trở thành ngành có tiềm năng kinh tế, với giá trị xuất khẩu đứng thứ ba trong ngành thủy sản Việt Nam.Trong những năm gần đây nghề nuôi thương phẩm tu hài

(Lutraria philippinarum) - một loài nhuyễn thể hai mảnh vỏ đặc sản – đang phát

triển mạnh đem lại lợi ích kinh tế cao cho hộ nuôi

1.2.1 Tình hình nuôi tu hài

Tu hài phân bố chủ yếu ở vùng biển Hải Phòng-Quảng Ninh như các vùng Vạn Bội, vịnh Lan Hạ, Cát Dứa, Lão Vọng, Cống Kê, Cáp Quan, Vạn Dong, Soi Gianh, Đầu Bê, Cửa Vạn và Lạch Miều Hai khu vực tập trung chủ yếu là từ đông đảo Cát Bà đến Hòn Đá Mài và từ Đảo Cống Tây đến Cây Khế Đông (Phạm Thược, 2005) Năm 2001, Phòng Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn huyện Cát Hải đã phối hợp với ngư dân thử nghiệm nuôi thương phẩm Tu hài ở hai địa điểm: Vụng Chùa Đá thuộc đảo Trà Bản và đảo Đồng Chén thuộc xã đảo Bản Sen – Vân Đồn Thử nghiệm nuôi thương phẩm với hình thức nuôi trên bãi triều tự nhiên và nuôi khay Kết quả sau thời gian nuôi 120 ngày với cỡ giống thả ban đầu 2,5 – 3cm tăng lên 4,5 – 5cm với khối lượng đạt 20 – 25g/con, tỷ lệ sống đạt 80% (Đào Minh Đông, 2004) Dần dần mô hình này được nhân rộng ra và trở thành đối tượng nuôi chủ lực, chuyển đổi cơ cấu sản xuất và góp phần xoá đói giảm nghèo cho ngư dân ven biển, tạo điều kiện đẩy mạnh kinh tế vùng Năm 2007 cả hai vùng có trên 250

hộ nuôi Tu hài sử dụng trên 550,20ha diện tích mặt nước, trong đó khu vực Cát Bà

có diện tích khoảng 33ha Cả hai vùng có khoảng 12.424 ô lồng nuôi cá, có thể nuôi treo kết hợp với đối tượng nhuyễn thể trong đó có Tu hài Ở Cát Bà có khoảng 476

bè nuôi cá với 6724 ô lồng (Sở thuỷ sản Hải Phòng, 2007) Việc ngư dân nuôi kết hợp cá lồng và treo nhuyễn thể là hướng đi đúng nhằm tận dụng diện tích mặt nước, tăng thu nhập cho người nuôi đồng thời bảo vệ được môi trường sinh thái Tu hài đã được di giống vào nuôi và phát triển nguồn lợi tại Trong 2 năm 2004 và 2005 tu hài

đã được di giống vào nuôi tại khu bảo tồn biển vịnh Nha Trang (Phạm Thược, 2005) Cho đến nay thì tu hài đã được mở rộng vùng nuôi tại Khánh Hòa ra cả vịnh Cam Ranh và vịnh Vân Phong

1.2.2 Đặc điểm sinh học

Tu hài (Lutraria philippinarum) là loài nhuyễn thể hai mảnh vỏ có khối

lượng cá thể có thể đạt đến 150 – 160 g/con, vỏ mỏng, tỷ lệ phần “thịt” lớn, thơm ngon Tu hài phân bố ở vùng biển ấm như Philippin, Ôxtrâylia, Việt Nam,… nhưng

cũng chỉ ở một số phạm vi rất hẹp Tu hài có giá trị kinh tế cao so với tất cả các loài nhuyễn thể hai vỏ và nhiều loài hải sản khác phân bố ở Việt Nam Thịt tu hài chứa tới 11,63% đạm, 0,42% đường, 1,22% muối khoáng, đặc biệt có tới 18 loại axit amin không thay thế Thịt tu hài thơm ngon nhất vào mùa sinh sản từ tháng 12 đến tháng 2 (Lê Xân et al, 2001)

Tu hài là đối tượng thân mềm hai mảnh vỏ có vị trí phân loại như sau:

Hình 1.1 Tu hài Lutraria philippinarum

Tu hài có cơ thể được bảo vệ bởi hai tấm vỏ khá đều nhau, chiều dài thân dài hơn chiều dài cơ thể, hai vỏ dính liền nhau ở phần lưng bởi dây nề Vỏ được cấu tạo bằng đá vôi, màu sắc thay đổi theo môi trường sống Vỏ không có khả năng khép chặt như vỏ trai, hầu, vẹm Các gờ sinh trưởng khá rõ nét, vết màng áo sâu và rõ Màng áo ngoài gồm 2 tấm giáp liền với vỏ và bao phủ toàn bộ cơ thể, mở ra ở phần

bụng Phần cuối phát triển tạo thành 2 vòi ống hút và xả Mép màng áo dày có khả năng vận chuyển cát khi đào hang Ống xiphông khá phát triển – do đặc điểm sống đáy, tu hài đào hang sống vùi dưới đáy cát, cát sỏi hoặc mảnh vụn vỏ hầu, hà, san

hô Vì vậy mọi trao đổi chất của Tu hài đều thông qua 2 ống xiphông này

Tu hài đào hang sâu tới 40 – 50cm, di chuyển theo chiều sâu của hang, chỉ thò hai ống xiphông lên lấy thức ăn và hô hấp Chất đáy cho tu hài cư trú là đáy cát sỏi lẫn vỏ hầu, hà không thấy Tu hài sống ở đáy bùn hoặc thuần cát

Tu hài là loài ưa độ muối cao và ổn định (từ 24 – 33 0

/00), thích hợp nhất là từ

29 – 32 0/00 Tu hài sống chủ yếu ở nơi có nền đáy là cát thô, lẫn sỏi, đá nhỏ, vùng rạn san hô và một vài nơi có nền đáy là cát pha bùn Tu hài phân bố tập trung thành bãi ở đới trung, hạ triều cho tới vùng ngập nước dưới triều độ sâu tới 10m Chúng sống vùi trong nền đáy ở độ sâu 20 – 50cm (Nguyễn Xuân Dục, 2005) Khi điều kiện môi trường thay đổi, đặc biệt ở những vùng chịu ảnh hưởng của nước ngọt, Tu hài sẽ trồi lên mặt bãi và di chuyển bằng cách: 2 ống xiphông căng duỗi ra phía trước, chân thò ra uốn cong và bật mạnh xuống nền đáy đẩy mạnh Tu hài lên khỏi mặt bãi Nhờ dòng nước chúng di chuyển đến nơi ở mới

Cũng giống như các loài động vật nhuyễn thể khác, Tu hài là loài mang tấm

ăn lọc Tu hài không có khả năng lựa chọn thức ăn theo mùi vị và chất lượng, nước cùng với thức ăn theo ống xiphông hút vào xoang màng áo qua các kẽ mang, thức

ăn có kích thước thích hợp được giữ lại nhờ các tấm mang Sau đó thức ăn được chuyển xuống xúc biện và đưa xuống dạ dày Phần thức ăn không tiêu hóa, được tống ra ngoài qua hậu môn vào xoang áo và thoát ra ngoài qua ống xiphông thoát Thức ăn là các loài tảo phù du, trong đó chủ yếu là các loài tảo Silic như:

Coscinodicus, Navicula, Nitszchia, Cyclotella ., các mảnh vụn hữu cơ và các vi

sinh vật khác (Nguyễn Xuân Dục, 2005)

1.3 Tổng quan về bacteriocin

1.3.1 Đặc điểm chung của bacteriocin

Bacteriocin đã được phát hiện cách đây gần trăm năm từ nghiên cứu của

Gratia về khả năng của Escherichia coli kháng lại E.coli có tên gọi là colicin để xác

định được loài vi khuẩn đã sinh ra (Gratia, 1925) Thuật ngữ bacteriocin không xuất hiện cho đến những năm 1950 (Desriac et al, 2010).

Bacteriocin là những hợp chất có bản chất protein do vi khuẩn sinh tổng hợp

và có khả năng ức chế sự phát triển của các giống vi khuẩn khác có liên hệ gần với giống sản xuất (Tagg, 1976) Bacteriocin được sản xuất ở hầu hết các dòng vi khuẩn

và có thể là tất cả các thành viên của cổ khuẩn (Bakkal, 2012) Một họ bacteriocin rất đa dạng về kích thước protein, vi khuẩn kháng mục tiêu, phương thức hoạt động,

sự phóng thích, cơ chế miễn dịch và có thể được chia thành hai nhóm chính: nhóm sản xuất bởi vi khuẩn Gram âm và Gram dương (Heng et al 2007) Hơn nữa một số nhỏ bacteriocin từ các loại cổ khuẩn cũng đang được nghiên cứu đặc điểm (Suphan Bakkal, 2012) Một số loài vi khuẩn sản xuất độc tố có thể biểu hiện nhiều tính năng giống như bacteriocin, nhưng chưa được đầy đủ đặc trưng, những độc tố này được gọi là các chất ức chế giống như bacteriocin hoặc BLIS (Messi et al, 2003)

Bacteriocin khác biệt với kháng sinh truyền thống ở những điểm chủ yếu như bacteriocin được tổng hợp nhờ ribosome, phổ kháng khuẩn hẹp thường chỉ có khả năng tiêu diệt những chủng vi khuẩn có liên hệ gần với chủng sản xuất (Riley và Wertz, 2002b), tế bào chủ miễn dịch với chúng (Trần Thị Tưởng An, 2007)

1.3.2 Phân loại bacteriocin

Đến nay, khoảng 200 bacteriocin đã được nghiên cứu về các đặc điểm (Bactibase, 2007) Phân loại bacteriocin vẫn chưa được thống nhất và đang là vấn

đề gây tranh cãi Mặc dù đến những năm 1993, phân loại bacteriocin được xác định bởi Klaenhammer vẫn được sử dụng nhiều nhất (Klaenhammer, 1993) Năm 2005, Cotter et al đề xuất sửa đổi (Cotter, 2005) và tranh luận bởi Heng và Tagg trong năm 2006 (Tagg, 2006) Theo cập nhật mới nhất của Bakkal và cộng sự (2012) thì bacteriocin được chia thành ba nhóm chính là nhóm sinh ra từ vi khuẩn Gram âm, nhóm sinh ra từ vi khuẩn Gram dương và nhóm sinh từ cổ khuẩn (Bakkal, 2012) Dưới đây là miêu tả ngắn về những lớp bacteriocin từ vi khuẩn và cổ khuẩn và những loại bacteriocin của mỗi lớp (Bảng 1.1)

Bảng 1.1 Bacteriocin của vi khuẩn và cổ khuẩn

Bacteriocin Loại/Lớp

Trọng lƣợng phân

tử (kDa)

Ví dụ Tài liệu tham khảo

Nuclease Colicin E2, E3 Giống

colicin

Chƣa biết 20-80 S-pyocin

Klebicin Giống đuôi

phage

Chƣa biết > 80 R và F pyocin

Microcin Biến đổi sau dịch mã < 10 Microcin C7

Không biến đổi Microcin B17

Type B-hình cầu, tích điện âm hoặc không tích điện

Mersacidin

Type C-hỗn hợp Lacticin 3147 Lớp II Class IIa-kháng Listeria < 10 Pediocin PA1

Class IIb-hỗn hợp Carnobacteriocin B2 Lớp III Type IIIa-enzyme phân

Ellen et al (2011) Sun et al (2005)

Protein halocin > 10 Halocin H1, H4 Sulfolobicin Chƣa biết ~20 Sulfolobicin

(Nguồn: Bakkal, 2012)

1.3.2.1 Bacterioin của vi khuẩn Gram âm

Bacteriocin của vi khuẩn Gram âm được chia làm 4 loại: colicin, bacteriocin giống colicin, bacteriocin giống đuôi phage và microcin (Bảng 1.1)

Các loại colicin từ E coli được nghiên cứu nhiều nhất Hơn nữa, chúng đang

được sử dụng như một hệ thống mẫu để nghiên cứu cấu trúc, chức năng và tiến hóa của bacteriocin (Riley & Wertz, 2002a, 2002b) Nhìn chung các loại colicin nhạy cảm với protease, nhiệt có trọng lượng phân tử từ 25 – 90 kDa (Pugsley & Oudega, 1987) Có hai loại colicin chính dựa trên kiểu giết của chúng là tạo lỗ màng và nuclease Những loại colicin tạo lỗ màng (colicin A, B, E1, Ia, Ib, K, E1, 5) giết các dòng nhạy cảm nhờ tạo lỗ trên màng Những loại colicin nuclease (colicin E2, E3, E4, E5, E6, E7, E8, E9) giết bằng hoạt động của các DNase, RNase hoặc tRNAse (Gillor et al., 2004)

Những loại bacteriocin có bản chất protein sản xuất bởi các loài vi khuẩn Gram âm khác được nhóm bacteriocin giống colicin do có đặc tính tương tự colicin

về cấu trúc và chức năng (Bảng1.1).Giống như colicin, chúng có thể có nuclease (pyocin S1, S2) và các lỗ màng (pyocin S5) (Michel-Briand & Baysse, 2002)

Klebicin của loài Klebsiella, S-pyocin của Pseudomonas aeruginosa, và alveicin của loài Hafnia alvei là một trong những bacteriocin giống colicin được nghiên cứu

nhiều nhất

Các loại bacteriocin giống đuôi phage là những cấu trúc lớn hơn nhưng giống như đuôi của thực khuẩn Một số nghiên cứu thậm chí còn cho rằng chúng là

khiếm khuyết các hạt thực khuẩn thể (Bradley, 1967) Pyocin R và F của P

aeruginosa là một số nghiên cứu kỹ lưỡng nhất về bacteriocin giống đuôi thể thực

khuẩn Chúng được mã hóa trong một nhóm gen lớn, trải dài một khu vực DNA lớn hơn 40 kb Có 44 khung đọc mở liên kết với kiểu hình R2/F2, trong đó bao gồm gen điều chỉnh, gen ly giải, và các gen độc Pyocin R2 và F2 cho thấy các trình tự tương

tự như gen sợi đuôi của P2 và thể thực khuẩn lambda (Nakayama et al., 2000)

Cuối cùng, các vi khuẩn Gram âm sản xuất các bacteriocin peptide rất nhỏ (<10 kDa) được gọi là microcin Microcin có thể được chia thành hai lớp: microcin

sửa đổi sau dịch mã (microcins B17, C7, J25, và D93) và microcin không sửa đổi (microcins E492, V, L, H47, và 24) (Bảng 1.1) Microcin được mã hóa trên nhiễm sắc thể (Gillor et al, 2004)

1.3.2.2 Bacteriocin của vi khuẩn Gram dương

Bacteriocin của các vi khuẩn Gram dương thường được chia thành bốn lớp dựa trên kích thước, hình thái học, đặc điểm vật lý và hóa học

Lớp I bao gồm các bacteriocin lantibiotic là các peptide kích thước nhỏ (<5 kDa) (Field et al., 2007) Chúng là những biến đổi trong quá trình dịch mã, kết hợp với các acid amin phi truyền thống (non-traditional) như là dehydroalanine, dehydrobutyrine, methyl-lanthione, and lantionine (Cleveland et al., 2001) Lớp này được chia thành loại A, B và C Loại A là những peptide thẳng dài tích điện dương, trong khi loại B là peptide hình cầu hoặc là trung hòa hoặc tích điện âm Các bacteriocin thuộc loại C thì là bacteriocin hoạt động phối hợp của hai peptide hoạt động Nisin và lacticin là các bacteriocin thuộc loại C đã được nghiên cứu (McAuliffe et al, 2001)

Lớp II là các bacteriocin nhỏ (<10 kDa), bền nhiệt và không bị biến đổi trong quá trình dịch mã (Heng et al, 2007) Lớp II cũng được chia thành hai nhóm Lớp

IIa các peptide giống pediocin hoặc loại kháng Listeria, có chứa trình tự bảo tồn

N-terminal (YGNGVxCxxxxCxV) Lớp IIb là các bacteriocin có hoạt động phối hợp của hai peptide hoạt động (Nissen-Meyer et al, 1992)

Lớp III là các peptid không bền nhiệt khá lớn (> 10 kDa), được chia thành hai phân nhóm Loại IIIa là các bacteriolysin là các enzyme phân giải Lysostaphin

là bacteriocin nghiên cứu nhiều nhất trong phân nhóm này Loại IIIb là bacteriocin

không phân giải.Helveticin J (37 kDa) sản xuất bởi Lactobacillus helveticus thuộc

loại này (Joerger & Klaenhammer, 1986)

Cuối cùng, lớp IV là các bacteriocin có đặc điểm cấu trúc độc đáo Axit amin đầu tiên và cuối cùng các bacteriocin được liên kết cộng hóa trị với nhau, do đó

chúng có cấu trúc vòng Enterocin AS-48 được sản xuất bởi Enterococcus faecalis

subsp.liquefaciens S-48 là bacteriocin đặc trưng đầu tiên thuộc lớp này (Maqueda et

al, 2004)

1.3.2.3 Bacteriocin của cổ khuẩn

Cổ khuẩn cũng tạo ra các chất kháng khuẩn giống như bacteriocin gọi là archaeocin (Shand & Leyva, 2007) Chúng ít được nghiên cứu hơn so với các loại bacteriocin của vi khuẩn Như vậy đến nay, hai loại chính của archaeocin đã được

xác định bao gồm halocin của Halobacteria và sulfolobicin của loài Sulfolobus

Halocin có thể là peptide (<10 kDa) và / hoặc protein (> 10 kDa) (Shand & Leyva, 2007) Theo Torreblanca và Meseguer (1994), Sản xuất halocin là một đặc tính phổ

biến của Halobacteria Halocin nằm trên plasmid lớn (hoặc nhiễm sắc thể nhỏ)

Halocin H4 và S8 được định vị tương ứng trong khoảng ~ 300 kbp và ~ 200 kbp của plasmid Hoạt động của chúng thường được phát hiện vào cuối pha tăng trưởng

và đầu pha cân bằng (Cheung et al., 1997) Chưa có nhiều nghiên cứu về

sulfolobicin Prangishvili và cộng sự (2000) đã tuyển chọn các chủng Sulfolobus

islandicus phân lập từ miệng núi lửa ở Iceland có sản sinh sulfolobicin Nghiên cứu

này dự đoán rằng sulfolobicin hoạt động liên quan đến màng và không được tiết từ

tế bào Sulfolobicin cũng liên quan với lỗ màng kích thước đường kính dao động từ

90 đến 180 nm (Prangishvili et al, 2000) Sulfolobicin rất giống bacteriocin, chịu nhiệt và nhạy cảm khi xử lý protease Phương hành động của chúng vẫn còn chưa biết (Ellen et al, 2011)

1.3.3 Di truyền bacteriocin

Bacteriocin có thể được mã hóa trên nhiễm sắc thể, plasmid hoặc các gen

nhảy Ví dụ, colicin của E coli và halocin H4 là mã hóa trên plasmid trong khi pyocin của P aeruginosa là nhiễm sắc thể (Cheung et al, 1997) Lacticin 481 đã

được chứng minh là nằm trên gen nhảy Tn5721 (Dufour et al, 2000) và một số loài

vi khuẩn như Serratia marcescens có bacteriocin mã hóa trên cả plasmid và nhiễm

sắc thế (Riley & Wertz, 2002b) Sự khác biệt về chức năng của các bacteriocin được sản sinh bởi vi khuẩn Gram âm, Gram dương và cổ khuẩn được xem xét ở

mức độ di truyền Nói chung, đầy đủ các chức bacteriocin sản xuất bởi các vi khuẩn Gram âm đƣợc mã hóa thông qua ba gen liên kết chặt chẽ là gen độc tố, miễn dịch

và các gen phân giải (Hình 1.2A) Tuy nhiên, có sự khác biệt đáng kể trong di truyền học của colicin, bacteriocin giống colicin, bacteriocin giống đuôi phage và microcin (Hình 1.2) Ví dụ, các cụm gen colicin bao gồm ba gen liên quan bacteriocin xếp gần nhau trong một cụm, trong khi bacteriocin giống colicin nhƣ pyocin S3 không có một gen phân giải (Hình 1.2A-B)

Hình 1.2.Tổ chức di truyền của bacteriocin

(Nguồn: Bakkal, 2012) (Mũi tên ngang đại diện cho gen, không mở rộng) A- tổ chức di truyền cụm gen colicin PSO và Pimm đại diện cho vùng

promoter của SOS và các gen miễn dịch.caa gen mã hóa colicin A; cai mã hóa gen miễn dịch và cal mã hóa gen lysis (chuyển thể từ Cascales et al, 2007)

B- tổ chức di truyền của cụm gen bacteriocin giống colicin như P-box đề cập

đến các các vị trí liên kết cho điều tiết phiên mã (PrtN); pyoS3A gen mã hóa pyocin S3; pyoS3I mã hóa gen miễn dịch (chuyển thể từ Duport et al, 1995)

C- tổ chức di truyền của bacteriocin giống đuôi phage bao gồm cụm gen mã

hóa bacteriocin prtN và prtR mã hóa yếu tố kích hoạt phiên mã (PrtN) và repressor

(PrtR), tương ứng.PRF 9 và PRF24-26 mã hóa các gen lysis; PRF10-23 và

PRF28-43 mã hóa R2 và F2 pyocin gen cấu trúc, (chuyển thể từ Nakayama et al, 2000)

D- tổ chức di truyền cụm gen lantibiotic PnisA, PnisRK, và PnisF mã hóa gen

promoter tương ứng nis A, nisRK, và nisFEG; NisA mã hóa tiền thân nisinA;

nisR và nisK mã hóa protein cho quá trình sinh tổng hợp nisin; nisB, nisC, nisT,

và nisP mã hóa protein chế biến và di chuyển nisin; nisI, nisF, nisE, và nisG mã

hóa các protein miễn dịch (chuyển thể từ Kuipers et al, 1993)

E- tổ chức di truyền cụm gen archaeocin.Sulfolobicin bao gồm SulA

và SulB protein, được mã hóa bởi sulA và các gen sulB (chuyển thể từ Ellen

et al, 2011)

Hai đại diện bacteriocin giống đuôi phage R và F-typepyocin, R2 và F2, được mã hóa trong một nhóm gen lớn kéo dài hơn 40 kb (Nakayama et al, 2000) và bao gồm 44 khung đọc mở (Nakayama et al., 2000) Khung đọc mở bao gồm gene

điều tiết, phân giải, R, và các gen pyocin F (Hình 1.2C) Các bacteriocin Gram

dương tính di truyền phức tạp hơn, với các gen mã hóa sửa đổi trong quá trình dịch

mã của độc tố Tổ chức di truyền khác nhau giữa các lớp bacteriocin Gram dương cũng như các yêu cầu hoạt động phối hợp hai peptide của các loại bacteriocin II Một ví dụ được cung cấp bởi cụm gen nisin (Hình 1.2D), trong đó bao gồm 11 gen (nisABTCIPRKFEG) chức năng mã hóa như tổng hợp của tiền thân nisin (nisA), quy định của quá trình sinh tổng hợp nisin (nisRK), chế biến và di chuyển của nisin (nisBCTP), và khả năng miễn dịch (nisIFEG) (Kuipers et al, 1993)

Tổ chức di truyền của archaeocin chưa được tìm hiểu nhiều như các

bacteriocin khác Một nghiên cứu gần đây cho thấy sulfolobicin của Sulfolobus

acidocaldarius bao gồm hai loại protein là Sula và SulB, được mã hóa tương ứng

bởi gen sulA và gen sulB (Hình.1.2E) Hai loại protein có liên quan với lỗ màng tế

bào trong môi trường ngoại bào (Ellen et al., 2011) Các tổ chức gen của archaeocin

cũng là đặc trưng Sun và cộng sự(2005) đã thấy rằng gen halC8 mã hóa cả hai

halocin C8 và khả năng miễn dịch protein Hali (Sun et al, 2005) Nó khác với bacteriocin khác trong đó các gen riêng biệt thường mã hóa bacteriocin gây độc và protein miễn dịch

1.3.4 Sinh tổng hợp bacteriocin

Bacteriocin thường được tạo ra trong điều kiện bị stress như hạn chế về dinh dưỡng, mật độ cao (Riley & Gordon, 1999) Sinh tổng hợp bacteriocin của vi khuẩn Gram âm liên quan đến vật chủ; thường liên quan đến hệ thống SOS Hệ thống SOS bao gồm protein RecA và LexA LexA là một ức chế phiên mã, liên kết với promoter bacteriocin và ngăn cản phiên mã của bacteriocin Trong điều kiện bị

stress như hư hại DNA và tiếp xúc với tia cực tím biểu hiện của gen recA được cảm

ứng RecA liên kết với LexA và do đó ngăn cản sự ức chế sản xuất bacteriocin (Cascales et al, 2007) Các biểu hiện của bacteriocin giống như colicin S-pyocin và bacteriocion giống đuôi phage như RF pyocin cũng phụ thuộc vào RecA, ngoại trừ những gen này có một P-box trong vùng promoter của chúng thay vì SOS -box (Nakayama et al, 2000) Hơn nữa, không có sự ức chế của LexA thì bacteriocin được biểu hiện Kích hoạt RecA gắn kết vào các protein ức chế phiên mã PtrR, dẫn

đến biểu hiện của phiên mã kích hoạt gen ptrN PtrN liên kết với P-box và gây ra

các biểu hiện của gen pyocin (Michel-Briand Baysse, 2002) Ngoài ra, vi khuẩn Gram dương có con đường sinh tổng hợp bacteriocin cụ thể Ví dụ, nisin điều chỉnh quá trình sinh tổng hợp riêng của mình điều kiện phụ thuộc vào mật độ tế bào (Eijsink et al, 2002) Cuối cùng, có rất ít các nghiên cứu về bacteriocin của cổ khuẩn Cơ chế sinh tổng hợp của chúng vẫn còn đang được nghiên cứu (Suphan Bakkal, 2012)

1.4 Tình hình nghiên cứu về vi khuẩn biển sinh bacteriocin

Hệ vi sinh vật biển đa dạng và phong phú là tiềm năng lớn cho các nghiên

cứu sản sinh các hoạt chất sinh học đặc biệt là các hợp chất kháng khuẩn đó là yếu

tố cần thiết cho cuộc chiến sinh tồn trong thế giới hiển vi của vi sinh vật Tuy nhiên,

các nghiên cứu về vi sinh vật biển sản xuất bacteriocin hoặc các hợp chất tương tự

bacteriocin (BLIS) đặc biệt là các vi sinh vật biển sống bám trên động vật biển lại

rất ít Cho đến nay, những nghiên cứu như vậy vẫn hoàn toàn bỏ ngỏ ở Việt Nam

Hình 1.3 Số lượng bài báo nghiên cứu về bacteriocin trong mỗi thời kỳ 10 năm

từ 1950-2010 được trích dẫn trên Pubmed

Trong đó “Colicin” là các bacteriocin từ E coli,

“microcin” là các bacteriocin rất nhỏ từ enterobacteria,

“LAB bacteriocin” là bacteriocin từ vi khuẩn lactic

“marine bacteriocin” là các bacteriocin có nguồn gốc từ biển

(Nguồn: Desriac et al, 2010) Bacteriocin đầu tiên được phát hiện từ vi sinh vật biển là từ vi khuẩn Vibrio

harveyi (trước đây là Beneckea harveyi) McCall và Sizemore (1979) đã tuyển chọn

được 795 chủng Vibrio spp phân lập từ đảo Galveston, Texas có khả năng sản sinh

bacteriocin (McCall &Sizemore, 1979) Nghiên cứu này thể hiện rằng khoảng 5%

của vi khuẩn Vibrio spp có khả năng sản sinh ra một tác nhân gây chết có trọng

lượng phân tử cao giống bacteriocin Tiếp tục nghiên cứu cho thấy rằng nguồn của chất gây chết giống bacteriocin là một plasmid, đồng thời cũng xác định rằng phạm

vi kháng được giới hạn đối với các chủng B harveyi Bacteriocin này được đặt tên

harveyicin (McCall & Sizemore, 1979) Năm 1982, Hoyt và Sizemore nghiên cứu bản chất hóa học của harveyicin Họ đã chỉ ra rằng harveyicin là một chất có bản chất là protein, nhạy cảm khi xử lý với protease, trypsin, papain, và kháng pepsin và lipase Hơn nữa, harveyicin có hoạt tính ổn định ở nhiệt độ phòng và -200

C trong một vài tuần hoặc có thể đến một vài tháng Tuy nhiên, protein mất hoạt tính sau khi xử lý nhiệt ở 550

C trong 4 giờ (Hoyt & Sizemore, 1982) Hoyt và Sizemore (1982) cũng nghiên cứu vai trò của harveyicin trong cuộc cạnh tranh của vi khuẩn trong ruột và sinh vật phù du môi trường ở nhiệt độ khác nhau (4-390

C), pH 9,5), và nồng độ muối (1,75%và 3,5%) Họ cũng thực hiện một thử nghiệm cạnh tranh trên vi khuẩn sinh bacteriocin có khả năng phát sáng và chủng nhạy cảm với bacteriocin của vi khuẩn có khả năng phát sáng ở nồng độ bằng nhau (106

(5-tế bào / ml) Tỷ lệ của dòng sản xuất harveyicin, chủng nhạy cảm harveyicin đạt mức cao trong môi trường đường ruột (250 C, độ mặn cao (3%), và pH kiềm (pH 9,5)) Các chủng sản xuất harveyicin cũng cạnh tranh căng thẳng với chủng nhạy cảm harveyicin tại môi trường có tính axit (pH 5.0) (Hoyt & Sizemore, 1982) Thực tế là môi trường sống tự nhiên của loài này là trong ruột cá (một môi trường có tính axit), sản xuất bacteriocin có thể là một lợi thế cạnh tranh cho dòng sản xuất bacteriocin trong môi trường này

Việc xác định của harveyicin dẫn đến nhiều nghiên cứu bacteriocin của vi khuẩn biển, trong đó tập trung chủ yếu vào đặc tính sinh hóa của bacteriocin và các chất ức chế giống như bacteriocin (BLIS) (Bagenda et al, 2008; Carraturo et al, 2006; Hoyt & Sizemore, 1982; Longeon et al, 2004; McCall Sizemore, 1979; Messi

et al, 2003) Phần lớn các nghiên cứu này tập trung vào phổ kháng khuẩn rộng của các chủng sản xuất do tiềm năng của họ để sử dụng như kháng sinh và probiotic.Tuy nhiên, các tác giả đã không tiếp tục mô tả xác định bacteriocin hoặc BLIS, mà chỉ đưa ra các phân loại ban đầu

Bacteriocin biển tương đối đa dạng Carnobacterium là vi khuẩn Gram

dương sinh axit lactic phân lập từ các sinh vật biển (như cá và các loài bọt biển), từ môi trường lạnh và ôn đới, cũng như từ môi trường trên mặt đất bao gồm cả đất

mùa đông, lớp băng vĩnh cửu và phân ngựa (Leisner et al, 2007) C divergens và C

maltaromaticum (trước đây gọi như C piscicola) là loài nhiều nhất nghiên cứu từ

chi này Loài Carnobacterium có thể sản xuất bacteriocin ở nhiệt độ thấp và nồng

độ muối cao (Buchanan & Bagi, 1997) Hơn nữa, các vi khuẩn tồn tại trong các sản phẩm cá và có khả năng sinh ra axit (Tahiri et al, 2009) Vì vậy, những loài này đã được tập trung nghiên cứu cường độ cao do tiềm năng của chúng như là probiotic (Leisner et al, 2007) V1a Piscicocin, V1b, V41 divercin, piscicocin CS526, divergicin M35, carnocin U149, và carnobacteriocin B2 là một số của các

bacteriocin phân lập từ loài Carnobacterium biển (Tahiri et al, 2004; Yamazaki et

al, 2005) Các Những bacteriocin có các đặc tính tương tự với các bacteriocin loại II của các vi khuẩn Gram dương

Nhiều BLIS đã được xác định từ các loài sinh vật biển thuộc Vibrio,

Aeromonas, Carnobacterium, Lactococcus, Streptomyces, Pseudoalteromonas, Enterococcus, và chi Pediococcus (Carraturo et al, 2006; Messi et al, 2003;

Shehane & Sizemore, 2002; Zai et al, 2009) Những loài này rất quan trọng trong ngành công nghiệp hải sản và sức khỏe con người Bacteriocin và BLIS phân lập từ

vi sinh vật biển rất đa dạng Tuy nhiên, chúng có đặc điểm chung với bacteriocin từ

vi khuẩn và cổ khuẩn Chúng có thể là các peptide nhỏ (5-10 kDa) như microcin của vi khuẩn Gram âm, microhalocin của halobacteria, và bacteriocin lớp I và II của

vi khuẩn Gram dương Chúng cũng có thể được kích thước lớn hơn (10-90 kDa) như colicin bacteriocin giống colicin của vi khuẩn Gram âm Đa số các BLIS biển

đã được thử nghiệm với một số protease bao gồm trypsin, proteinase K, và pronase

A, thường được sử dụng để xác định bacteriocin hoạt động Một số có đặc điểm độc

đáo Ví dụ, Blis-IW1, Blis BC1, BC2 từ loài vi khuẩn Vibrio có một phần là carbohydrate trong khi Blis VIB 571 từ V harveyi có một phần là lipid (Shehane &

Sizemore, 2002) Phương thức hoạt động của BLIS này là chưa rõ và phổ kháng của

chúng thay đổi, hoặc thu hẹp như bacteriocin vi khuẩn Gram âm hoặc khá rộng như quan sát thấy trong bacteriocin của vi khuẩn Gram dương (Yamazaki et al, 2005) Hơn nữa, sự ổn định của BLIS hoạt động khác nhau BLIS IW1 không hoạt động sau khi lưu trữ lạnh ở -70C, như bacteriocin giống đuôi phage Những loại khác, chẳng hạn như BLIS-BC1, BLIS-BC2, và BLIS-400, vẫn còn hoạt động sau khi xử

lý lạnh, như được quan sát thấy ở colicin và bacteriocin giống colicin Một số BLIS cũng kháng với điều trị bằng các dung môi hữu cơ Ví dụ, BLIS-400 có khả năng kháng hóa chất hữu cơ bao gồm methanol, ethanol, acetone, và chloroform (Carraturo et al, 2006) Tính năng này tương tự như một số bacteriocin phân lập từ

vi khuẩn Gram dương và cổ khuẩn (Carraturo et al, 2006) Cuối cùng, hầu hết các BLIS từ vi khuẩn biển được sản xuất tĩnh trong giai đoạn tăng trưởng, tương tự như bacteriocin từ vi khuẩn Gram dương (Pinto et al, 2009; Tahiri et al, 2004)

1.5 Tiềm năng ứng dụng của bacteriocin biển

Việc sử dụng bacteriocin biển trong các ứng dụng probiotic, chất bảo quản,

và, sôi nổi nhất là lựa chọn thay thế thuốc kháng sinh cổ điển đang cần được quan tâm nghiên cứu (Gillor et al, 2007) Tuy nhiên có một số yếu tố đóng một vai trò quan trọng trong khả năng sử dụng bacteriocin như các chế phẩm sinh học và hoặc chất bảo quản sinh học trong ngành thủy sản Vi sinh vật tự nhiên của thủy sản cần tiếp tục được nghiên cứu về độ nhạy cảm của chúng với bacteriocin Thông tin này nên được kết hợp vào các hướng dẫn sử dụng cho bacteriocin để sử dụng các protein này thận trọng chống lại tác nhân gây bệnh có liên quan Các điều kiện môi trường, chẳng hạn như độ pH và nhiệt độ, trong quá trình tăng trưởng thủy sản và chế biến cũng có thể ảnh hưởng đến hoạt động của bacteriocins áp dụng và cần nghiên cứu sâu thêm (Galvez et al, 2007) Mặc dù vậy, nghiên cứu về vi sinh vật thủy sản sản xuất bacteriocin là rất phong phú và loại bacteriocin cũng rất đa dạng trong môi trường thủy sản (Zai et al, 2009) Chúng đã được chứng minh là không độc hại đối với tế bào có nhân thật và thực vật thân thảo, làm cho chúng được chú ý đến như một giải pháp thay thế an toàn hơn kháng sinh truyền thống (Galvez et al, 2008.) Chúng cũng được chứng minh là bacteriocin tinh khiết không ảnh hưởng

đến chất lượng cảm quan cho của thủy sản và ổn định với nồng độ mặn 10% Ngoài

ra, phổ kháng khuẩn tương đối hẹp của bacteriocin so với các kháng sinh truyền cho hạn chế các áp lực chọn lọc cho vi khuẩn phát triển khả năng kháng các kháng sinh

và do đó làm giảm tỷ lệ mắc các mầm bệnh kháng thuốc Bởi vì các lý do nêu trên, một số người cho rằng bacteriocin nên được áp dụng cho các loại thực phẩm khô bằng cách phun hoặc là bacteriocin khô hoặc các chủng có khả năng sinh bacteriocin được sử dụng như probiotic (Galvez et al, 2007) Ví dụ, Brillet và cộng

sự (2005) đã cho thấy các rằng các bacteriocin sản xuất Carnobacterium divergens

V41 có thể sử dụng như một chất bảo quản sinh học cho ức các sự tăng trưởng của

vi khuẩn Listeria monocytogenes trong cá hồi hun khói lạnh (Brillet et al, 2005)

Ngoài ra, Schobitz và cộng sự (1999) trực tiếp áp dụng một BLIS từ

Carnobacterium piscicola vào thịt đóng gói chân không, ức chế sự tăng trưởng của

L monocytogenes trong thịt đóng gói chân không sau 14 ngày kể từ ngày lưu trữ ở

4oC (Schobitz et al., 1999) Những nghiên cứu giúp hỗ trợ trong tranh luận để bacteriocin được sử dụng như một kỹ thuật bảo quản sinh học trong ngành thủy sản Công nghệ này đã nổi lên trong ngành công nghiệp thực phẩm trên mặt đất như chúng ta thấy với là nisin (phụ gia thực phẩm FDA chấp thuận) và MicrogardTM (BLIS của vi khuẩn trong sữa) Cũng đã có nghiên cứu cho thấy bacteriocin có thể được kết hợp với các phương pháp hiện hành của điều trị kháng sinh và bảo quản để cho các tác dụng hiệp đồng, chẳng hạn như kết hợp bacteriocin vào hoạt động bao

bì sinh học (Pilet & Leroi, 2011) Ví dụ, bacteriocin có thể được ngâm tẩm vào lớp phủ gel hoặc màng polyethylene và có thể được áp dụng cho thủy sản trong bao bì (Neetoo et al, 2008) Việc áp dụng bacteriocin vào đóng gói hải sản được xem như

là một phương pháp bảo quản sinh học đầy hứa hẹn (Aasen et al, 2003) Trong thực

tế, cố định của bacteriocins trên vật liệu phủ để bảo quản sinh học thực sự có thể làm giảm chi phí bao bì do giảm số lượng và chi phí của chất kháng khuẩn cần thiết

để gắn vào màng (Galvez et al, 2008) và có thể sự kết hợp của bacteriocins và phương pháp hiện tại được sử dụng trong ngành công nghiệp thủy sản có tiềm năng

để tăng cường đảm bảo sự tươi mới bằng cách đảm bảo sự ức chế các vi sinh vật