nghiên cứu khả năng sinh sản và mối tương quan với các đa hình gen thụ thể prolactin và properdine của lợn nái lai f1 (đực rừng thái lan x nái địa phương pác nặm)

Rất rất hay!

MỤC LỤC

Trang phụ bìa

Lời cam đoan i

Lời cảm ơn ii

Mục lục iii

Các ký hiệu và chữ viết tắt vi

Danh mục các bảng vii

Danh mục các hình viii

MỞ ĐẦU 1

1 Đặt vấn đề 1

2 Mục tiêu của đề tài 2

3 Ý nghĩa của đề tài 2

3.1 Ý nghĩa khoa học 2

3.2 Ý nghĩa thực tiễn 3

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 Cơ sở khoa học về di truyền trong chăn nuôi lợn 4

1.1.1 Cơ sở khoa học của việc cho lai tạo giữa lợn đực rừng và lợn nái lai 4

1.1.2 Đặc điểm sinh lý sinh dục của lợn nái 5

1.1.2.1 Đặc điểm sinh lý của lợn nái hậu bị 5

1.1.2.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát dục của lợn cái 6

1.1.3 Khả năng sinh sản của lợn nái và các yếu tố ảnh hưởng 7

1.1.4 Đặc điểm và khả năng sản xuất của lợn địa phương Pác Nặm 9

1.2 Cơ sở khoa học và lý luận về di truyền 11

1.2.1 Cấu trúc của nucleic acid - DNA 11

1.2.2 Tổng hợp DNA in vitro 12

1.2.3 Gen và những quan niệm về gen 13

1.2.4 Các chỉ thị di truyền 14

1.2.5 Một số phương pháp sử dụng trong nghiên cứu gen lợn và ứng dụng 15

1.2.6 Ứng dụng của các chỉ thị di truyền đến tính trạng số lượng ở lợn 17

1.3 Cơ sở lý luận về phương pháp nghiên cứu 18

1.3.1 Phương pháp tách DNA 18

1.3.2 Phương pháp nhân đoạn DNA đặc hiệu 18

1.3.2.1 Phản ứng PCR cho phép nhân các đoạn DNA định trước 18

1.3.2.2 Cách tiến hành phản ứng PCR chuỗi trùng hợp 19

1.3.3 Enzym giới hạn 20

1.3.4 Phương pháp RFLP 20

1.3.5 Điện di trên gel agarose 21

1.4 Các gene liên quan đến tính trạng sinh sản của lợn 22

1.4.1 Gen thụ thể prolactin 22

1.4.2 Gen Properdine 24

1.4.3 Các gen sinh sản khác 25

1.5 Tình hình nghiên cứu gen lợn trong và ngoài nước 26

1.5.1 Nghiên cứu gen lợn ở nước ngoài 26

1.5.2 Nghiên cứu gen lợn ở Việt Nam 27

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 31

2.1 Đối tượng và vật liệu nghiên cứu 31

2.2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 31

2.2.1 Thời gian nghiên cứu 31

2.2.2 Địa điểm nghiên cứu 31

2.3 Nội dung nghiên cứu 31

2.4 Phương pháp nghiên cứu 31

2.4.1 Phương pháp nghiên cứu khả năng sinh sản của lợn nái rừng lai 31

2.4.2 Phương pháp nghiên cứu đa hình gen PRLR và gen Properdine 33

2.4.2.1 Hóa chất và thiết bị 33

2.4.2.2 Phương pháp tách chiết DNA 34

2.4.2.3 Phương pháp quang phổ kế để xác định hàm lượng DNA 36

2.4.2.4 Phản ứng chuỗi trùng hợp - PCR 36

2.5 Phương pháp theo dõi các chỉ tiêu 38

2.5.1 Phương pháp theo dõi các chỉ tiêu về khả năng sinh sản 38

2.5.2 Phương pháp theo dõi các chỉ tiêu về đa hình gene 40

2.6 Xử lý số liệu 41

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 43

3.1 Kết quả nghiên cứu về khả năng sinh sản của lợn nái lai F1 43

3.1.1 Đặc điểm sinh lý sinh dục của lợn nái lai 43

3.1.2 Khả năng sinh sản của lợn nái lai F1 44

3.1.3 Sinh trưởng tích lũy của lợn con 46

3.1.4 Sinh trưởng tương đối và sinh trưởng tuyệt đối 47

3.1.5 Tiêu tốn thức ăn/kg lợn con giống 49

3.1.6 Chi phí thức ăn/ kg lợn con giống 50

3.2 Kết quả phân tích đa hình gen PRLR và gen Properdine 51

3.2.1 Kết quả tách DNA 51

3.2.2 Kết quả nhân đoạn gen PRLR và Properdine 52

3.2.3 Phân tích đa hình gen PRLR bằng enzym giới hạn Alu I 54

3.2.4 Phân tích đa hình gen Properdine bằng enzyme giới hạn SmaI 58

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 63

1 Kết luận 63

2 Tồn tại 63

3 Đề nghị 64

TÀI LIỆU THAM KHẢO 65

PHỤ LỤC 71

CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

DNA Deoxyribonucleic acid Axit Deoxyribonucleic

dNTP Deoxynucleoside triphosphate Deoxynucleosit triphosphátEDTA Ethylene diamine tetracetic acid Axít êthylen điamin têtraceetic

RFLP Restriction Fragment Length

AFLP Amplified Fragment length

Polymorphism

Đa hình chiều dài các đoạn DNA được khuếch đại

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Vị trí cắt của enzyme giới hạn ALuI và SmaI 21

Bảng 1.2 Các gen khác liên quan đến tính trạng sinh sản của lợn 25

Bảng 2.1 Danh mục các hoá chất sử dụng trong phân tích gene 33

Bảng 2.2 Các trang thiết bị và dụng cụ thí nghiệm 33

Bảng 2.3 Các thành phần phản ứng PCR để nhân đoạn gen 36

Bảng 2.4 Các chu trình nhiệt trong phản ứng PCR sử dụng cặp mồi Leptin và PIT1 37

Bảng 2.5 Sản phẩm PCR của gen PRLR và Properdine được xử lý bởi các enzyme giới hạn ALuI và SmaI 38

Bảng 3.1 Chỉ tiêu sinh lý sinh dục của lợn nái lai F1 43

Bảng 3.2 Chỉ tiêu về khả năng sinh sản của lợn nái lai 45

Bảng 3.3 Khối lượng lợn con qua các kỳ cân 46

Bảng 3.4 Sinh trưởng tuyệt đối của lợn con qua các kỳ cân 47

Hình 3.2 Biểu đồ sinh trưởng tuyệt đối của lợn con qua các thời kỳ cân 48

Bảng 3.5 Sinh trưởng tương đối của lợn con qua các kỳ cân 49

Bảng 3.6 Tiêu tốn thức ăn/kg lợn con giống 50

Bảng 3.7 Chi phí thức ăn/ kg lợn con giống 50

Bảng 3.8 Tỉ số OD260nm/OD280nm vànồng độ của DNA 52

Bảng 3.9 Tần số kiểu gen và tần số alen của đoạn gen PRLR 55

Bảng 3.10 Ảnh hưởng của PRLR đến số lượng lợn con sinh ra còn sống/lứa 57

Bảng 3.11 Tỷ lệ kiểu gen và tần số alen của gene Properdine 59

Bảng 3.12 Ảnh hưởng của Properdine đến số lượng lợn con sinh ra còn sống/lứa 61

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 3.1 Đồ thị sinh trưởng tích lũy của lợn con theo mẹ qua các thời kỳ cân 47

Hình 3.2 Biểu đồ sinh trưởng tuyệt đối của lợn con qua các thời kỳ cân 48

Hình 3.3 Điện di sản phẩm PCR được nhân lên từ cặp mồi PRLR 53

Hình 3.4 Điện di sản phẩm PCR được nhân lên từ cặp mồi Properdine 53

Hình 3.5 Gen PRLR được cắt bởi enzyme giới hạn ALuI 55

Hình 3.6 Tỷ lệ kiểu gen và tần số alen của gen PRLR 56

Hình 3.7 Gen Properdin được cắt bởi enzyme giới hạn SmaI 58

Hình 3.8 Tỷ lệ kiểu gen và tần số alen của gen Properdine 60

- Thái Bình Dương, trong đó Việt Nam là nước có số đầu lợn tương đối lớn Tổngđàn lợn ở Việt Nam tính đến tháng 6/2005 là 28 triệu con [30] Theo số liệu thống

kê tại thời điểm 01/04/2010, cả nước có 27,3 triệu con, trong đó số đầu lợn nái là4,18 triệu con) [9] Bên cạnh việc nhập khẩu và chăn nuôi các giống lợn hướng nạc,lợn lai giữa lợn nội và lợn ngoại, thì các giống lợn địa phương vẫn được sử dụngrất phổ biến đặc biệt khu vực miền núi trung du bởi khả năng thích nghi cao vớiđiều kiện khí hậu cũng như điều kiện chăn nuôi của vùng nông thôn nghèo ViệtNam Mặc dù các giống lợn nội có nhược điểm là số con/lứa đẻ thấp, tăng trưởngchậm, tỷ lệ mỡ và tiêu tốn thức ăn cao, nhưng thịt mỡ thơm ngon rất được ngườidân ưa chuộng

Lợn địa phương Pác Nặm được nuôi phổ biến ở trong các nông hộ theo hìnhthức bán hoang dã quanh nhà và vườn rừng, nguồn thức ăn chủ yếu là ngô, sắn, cámgạo và rau cỏ tự nhiên Cũng như các giống lợn địa phương khác, lợn địa phươngPác Nặm có đặc điểm nổi trội như khả năng thích nghi cao, thịt thơm và ngon Đặcbiệt nhóm lợn đen tuyền, thường được coi là đặc sản bởi nuôi tự nhiên, không cótồn dư thuốc tăng trọng cũng như kháng sinh và bị săn mua ráo riết dẫn đến nguy cơtuyệt chủng cao Trong những năm qua, các nhà khoa học trường Đại học NôngLâm Thái Nguyên đã phối hợp với Phòng Nông nghiệp và PTNT huyện Pác Nặmtiến hành chọn lọc, lai tạo giống lợn địa phương Pác Nặm với lợn rừng Thái Lan tạo

ra nhóm lợn lai mang các đặc điểm có giá trị của cả hai giống lợn bố và mẹ Tuynhiên, một hạn chế đặt ra là khả năng sinh sản của cả hai nhóm lợn rừng và lợn địa

phương Pác Nặm đều không cao, làm ảnh hưởng đến tốc độ tăng đàn Số lợn conđẻ/lứa là một chỉ tiêu kinh tế kỹ thuật rất quan trọng, những nghiên cứu cải tiến vấn

đề này luôn là mối quan tâm của các nhà khoa học Ngoài việc chọn lọc theo kỹ thuậttruyền thống, việc áp dụng các kỹ thuật di truyền học phân tử để xác định các locusgen và các vùng nhiễm sắc thể chứa các locus gen có ảnh hưởng đến các tính trạngnày đang mở ra một hướng nghiên cứu đầy triển vọng Trong đó, một số chỉ thị ditruyền liên quan đến tính trạng này như ESR (Oestrogen receptor gene) [52], PRLR(Prolactin recptor gene) [57], FSH (Follicle Stimulating Hormone  suybinit Gene)[47], Properdine đã được nghiên cứu ở một số giống lợn

Với mục đích ứng dụng các kỹ thuật di truyền phân tử để xác định sự tươngquan giữa đa hình gen và số con/lứa đẻ ở lợn lai và khảo sát khả năng sinh sản củachúng nhằm phục vụ công tác chọn lọc và lai tạo đàn lợn giống phù hợp với điềukiện tự nhiên và chăn nuôi của người dân, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài:

“Nghiên cứu khả năng sinh sản và mối tương quan với các đa hình gen thụ thể prolactin và properdine của lợn nái lai F1 (đực rừng Thái Lan x nái địa phương Pác Nặm)”.

2 Mục tiêu của đề tài

Nghiên cứu sức sản xuất của lợn nái lai F1 (Đực Rừng Thái Lan x nái địaphương Pác Nặm) và xác định ảnh hưởng của đa hình gene Prolactin, Properdineđến khả năng sinh sản của lợn nái lai F1 phục vụ cho công tác chọn tạo dòng lợnRừng lai cung cấp cho nhu cầu sản xuất

3 Ý nghĩa của đề tài

Chương 1TỔNG QUAN TÀI LIỆU1.1 Cơ sở khoa học về di truyền trong chăn nuôi lợn

1.1.1 Cơ sở khoa học của việc cho lai tạo giữa lợn đực rừng và lợn nái lai (♂ Thái Lan x nái địa phương Pác Nặm)

Lai giống là phương pháp nhân giống bằng cách cho con đực giống và cái giốngthuộc hai quần thể khác nhau phối giống với nhau Hai quần thể này có thể là hai dòng,hai giống hoặc hai loài khác nhau, do vậy đời con không còn là dòng, giống thuần mà

là con lai giữa hai dòng, giống khởi đầu là bố mẹ của chúng Ví dụ: cho lợn đựcYorkshire phối giống với lợn cái Móng Cái, đời con là Yorkshire x Móng Cái

- Vai trò tác dụng của lai giống:

Lai giống có hai tác dụng chủ yếu Một là tạo được ưu thế lai ở đời con về một

số tính trạng nhất định Các tác động cộng gộp là nguyên nhân của hiện tượng sinhhọc này Hai là làm phong phú thêm bản chất di truyền ở thế hệ lai bởi vì con lai cóđược những đặc điểm di truyền của giống khởi đầu, người ta gọi đó là tác dụng phốihợp Điều này có nghĩa là lai giống sử dụng được tác động cộng gộp các nguồn gen

ở thế hệ bố mẹ

+ Ưu thế lai

Khái niệm ưu thế lai được đề xuất bởi Shull (1914) [40]

Ưu thế lai là hiện tượng con lai có sức sống, sức chống đỡ bệnh tật và năngsuất cao hơn mức trung bình của thế hệ bố mẹ

Mức độ ưu thế lai của một tính trạng được tính bằng công thức sau:

H (%)=

1/2( AB+BA)−1/2( A+B)

1/2( A+B )

x 100Trong đó:

H: ưu thế lai

AB : giá trị kiểu hình trung bình của con lai bố A, mẹ BBA: giá trị kiêu hình trung bình của con lai bố B, mẹ AA: giá trị trung bình của dòng (giống) A

B: giá trị trung bình của dòng (giống) B

Cần phân biệt 3 kiểu ưu thế lai sau:

Ưu thế lai cá thể: là ưu thế lai do kiểu gen của chính con vật gây nên

Ưu thế lai của mẹ: là ưu thế lai do kiểu gen mà mẹ con vật gây ra thông quađiều kiện ngoại cảnh cung cấp cho nó Chẳng hạn, nếu bản thân mẹ là con lai, thôngqua sản lượng sữa, khả năng nuôi con khéo mà con lai có được ưu thế này

Ưu thế lai của bố: ưu thế lai của bố không bằng ưu thế lai của mẹ Có rất ít tínhtrạng có được ưu thế lai của bố, song cũng có thể thấy rằng, khả năng thụ thai, tìnhtrạng sức khỏe của con đực lai tạo nên ưu thế lai cho đời con của nó

Các tính trạng liên quan đến khả năng nuôi sống và khả năng sinh sản có ưuthế lai cao nhất Các tính trạng có hệ số di truyền thấp thường có ưu thế lai cao, vìvậy để cải tiến các tính trạng này, so với chọn lọc, lai giống là giải pháp nhanh hơn,hiệu quả hơn

Hai quần thể vật nuôi càng khác biệt với nhau về di truyền bao nhiêu thì ưu thếlai thu được khi lai giữa chúng càng lớn bấy nhiêu Ưu thế lai cao nhất ở F1, ưu thếlai ở thế hệ F2 ( giao phối giữa F1 x F1, hoặc F1 với dòng bố, mẹ khởi đầu chỉ bằng1/2 ưu thế lai của F1

1.1.2 Đặc điểm sinh lý sinh dục của lợn nái

1.1.2.1 Đặc điểm sinh lý của lợn nái hậu bị

Lợn nái khi thành thục về tính sẽ xuất hiện các triệu chứng động dục và kèm theoquá trình rụng trứng Đồng thời lợn nái hậu bị vẫn tiếp tục sinh trưởng đề thành thục vềthể vóc Chu kỳ động dục của lợn nái trung bình là 21 ngày (biến động từ 18-25 ngày)

Chu kỳ của lợn nái phụ thuộc vào các yếu tố khác nhau:

- Ảnh hưởng của giống: Giống khác nhau có chu kỳ động dục khác nhau: Lợn

Ỉ, từ 19 - 21 ngày lợn Móng Cái từ 18 - 25 ngày

- Ảnh hưởng của tuổi: Nái tơ thì có chu kỳ tính thường ngắn hơn lợn náitrưởng thành Theo Kralling, lợn nái ở lứa đẻ thứ 2, thứ 3 thì chu kỳ tính trung bình

là 20,8 ngày, lứa 6 -7 là 21,5 ngày; lứa 8- 9 là 22,4 ngày Khi theo dõi sinh sản trênlợn Ỉ thấy ở lứa thứ nhất chu kỳ tính 19 ngày, lứa thứ 2 là 20 ngày (Lưu Kỷ, 1976)

Theo Xignort thời gian động dục lần đầu thường ngắn hơn những lần sau, đồng thờithường không có trứng rụng hoặc trứng rụng rất ít, kích thước tế bào trứng nhỏ hơnnhững lần sau

- Ảnh hưởng của dinh dưỡng: Nếu dinh dưỡng tốt thì chu kỳ tính ổn định vàngược lại

- Trong thời gian động dục lợn nái có sự rụng trứng, từ đó liên quan đến sự thụthai, chửa và đẻ

Trong quá trình động dục, hàm lượng hormone có sự thay đổi qua các ngàytrong chu kì động dục của lợn nái Oestrogen tăng mạnh từ ngày thứ 10 và cao nhất

ở ngày 20-21 (29 - 30pg/ml trong huyết thanh), sau đó giảm dần xuống 7-8 ở ngàythứ 8 sau động dục Hàm lượng prostaglandin trong tĩnh mạch tử cung thay đổi vàđột nhiên tăng cao ở ngày 15 (6ng/ml), trong khi bình thường tỷ lệ này 0,3-0,5ng/ml Hormone progesterone tăng tiết từ ngày 1 đến 13 (32 ng/ml) trong huyếtthanh và giảm dần và xuống tỷ lệ thấp nhất ở ngày thứ 20, chỉ còn 0,8-1ng/ml Hàmlượng prolactin huyết thanh thay đổi liên tục từ ngày 13 đến ngày thứ 5 sau chu kìđộng dục biến động lên đến 15 ng/ml và sau 1 ngày xuống lại 1,5-1,8ng/ml, cứ thayđổi lên xuống theo chu kì 2-3 ngày nhưng ở ngày đầu chu kì từ 2-13 có hàm lượngthấp 1,8ng/ml FSH và LH thay đổi và khi động dục tỷ lệ FSH/LH = 1/3

Số lượng tế bào trứng rụng trong 1 chu kỳ động dục phụ thuộc vào giống, tuổi,

và chế độ nuôi dưỡng, chăm sóc Qua một số nghiên cứu cho biết, lợn nái Móng Cái

15 - 30 tế bào Số lượng tế bào trứng rụng phụ thuộc vào chế độ nuôi dưỡng Vì vậyngười ta thường tăng cường nuôi dưỡng lợn nái trước khi phối giống để tăng số tếbào trứng rụng nhưng đến lúc gần động dục cho giảm tiêu chuẩn ăn, (Kiều Minh Lực

và CTV, 2002) [16]

1.1.2.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát dục của lợn cái

Sự thành thục về tính của lợn phụ thuộc nhiều yếu tố

- Giống: Theo Trần Thế Thông lợn nái Móng Cái thành thục về tính lúc 4tháng 12 ngày, trọng lượng đạt 12 kg Trong cùng một giống nhưng khi phối đồnghuyết thì thành thục về tính muộn hơn

- Chế độ dinh dưỡng: Dinh dưỡng là yếu tố rất quan trọng Trong cùng mộtgiống, nếu dinh dưỡng tốt thì tuổi thành thục về tính sớm và ngược lại.

- Mùa vụ: Theo Smith, lợn con đẻ vào mùa đông thì thành thục sớm hơn vềmùa hè

- Sự có mặt của lợn đực: Sự có mặt của lợn đực đã thúc đẩy nhanh sự xuấthiện chu kỳ động dục có trứng rụng, Cole (1970) đã chứng minh rằng nếu hàngngày chúng ta cho con đực tiếp xúc với lợn nái ở tuổi 165 - 190 ngày đã làm tăngnhanh hoạt động sinh dục của con cái.[16]

1.1.3 Khả năng sinh sản của lợn nái và các yếu tố ảnh hưởng

- Tuổi động dục lần đầu

Là tuổi khi lợn cái có biểu hiện động dục lần đầu tiên Tuổi động dục lần đầukhác nhau về giống lợn, ví dụ: lợn nội có tuổi động dục lần đầu sớm hơn nái ngoại.Lợn ỉ động dục ở 3 - 4 tháng tuổi (Trần Văn Phùng, và cs, 2006) [22]

- Tuổi phối giống lần đầu

Là tuổi tại thời điểm phối giống lần đầu, thông thường người ta chưa tiến hànhphối giống cho lợn động dục lần đầu tiên tại thời điểm này lợn chưa thành thục vềthể vóc, số lượng trứng rụng còn ít, người ta thường phối giống cho lợn nái kỳ thứ 2hoặc kỳ thứ 3 vì vậy chúng ta cần theo dõi tránh phối giông sớm hoặc muộn gâytổn thất về kinh tế

- Tuổi đẻ lứa đầu

Là tuổi lợn mẹ đẻ lứa đầu tiên Tuổi đẻ lúa đầu phụ thuộc vào giống và chế độnuôi dưỡng, ví dụ lợn Mẹo tuổi động hớn đầu tiên lúc 8 tháng tuổi (Phạm Hữu Doanh,

và cs, 1996) [16]

- Số con sơ sinh còn sống đến 24h/lứa đẻ: là chỉ tiêu kinh tế rất quan trọng Nó

phụ thuộc vào khả năng đẻ nhiều hay ít con của giống, trình độ phối giống của ngườinuôi dưỡng chăm sóc, và điều kiện chăm sóc nuôi dưỡng lợn nái chửa Trong 24 giờsau khi sinh nhưng con không đạt khối lượng sơ sinh trung bình của giống, dị dạng, thì sẽ bị loại thải Ngoài ra do lợn con chưa nhanh nhẹn bị lợn mẹ đè chết

- Bình quân số lợn con đẻ ra còn sống/lứa: là tỷ lệ giữa tổng số lợn con đẻ ra

còn sống trong 24 giờ kể từ khi lợn nái đẻ xong của tất cả các lứa đẻ trên tổng sốlứa đẻ Số con đẻ ra để lại nuôi: số lợn con đẻ ra còn sống để lại nuôi, đối với lợnngoại khối lượng lớn hơn 0,8 kg, đối với lợn nội khối lượng lớn hơn 0,3 kg

- Tỷ lệ sống: tỷ lệ sống của lợn con sau 24 giờ là tỷ lệ số lợn con còn sống đến

24 giờ so với số con đẻ ra còn sống

- Số con cai sữa/ lứa: đây là chỉ tiêu kinh tế kỹ thuật rất quan trọng, quyết định

năng suất trong chăn nuôi lợn nái, nó phụ thuộc vào kỹ thuật chăn nuôi lợn con búsữa, khả năng tiết sữa khả năng nuôi con của lợn mẹ và khả năng hạn chế các yếu tốgây bệnh cho lợn con Đó là số lợn con còn sống cho đến khi cai sữa, thời gian caisữa dài hay ngắn phụ thuộc vào trình độ chế biến thức ăn và kỹ thuật nuôi Trongchăn nuôi đại trà thường cai sữa vào 35 hoặc 42 ngày tuổi

- Số con cai sữa /nái/năm: là chỉ tiêu tổng quát nhất để đánh giá năng suất

chăn nuôi lợn nái Chỉ tiêu này phụ thuộc vào thời gian cai sữa lợn con và số lợncon cai sữa trong mỗi lứa đe Nếu cai sữa sớm sẽ tăng số lứa đẻ/nái/năm, và tăng sốlượng lợn con cai sữa trong mỗi lứa thì số lượng lợn con cai sữa/nái/năm cao vàngược lại Số lượng lợn con cai sữa/nái/năm là tỷ lệ giữa tổng số lợn con cai sữatrong năm so với tổng số lợn nái sinh sản trong năm

- Khối lượng sơ sinh:

Là khối lượng lợn con được cân ngay sau khi đẻ, đã được cắt rốn, lau khô vàbấm số tai và trước khi cho bú ngày đầu tiên

Khối lượng sơ sinh toàn ổ là chỉ tiêu nói lên khả năng nuôi dưỡng thai của lợn

mẹ, đặc điểm giống, kỹ thuật quản lý chăm sóc và phòng bệnh cho lợn nái chửa Do đóthành tích này phụ thuộc cả vào phần của lợn nái và phần nuôi dưỡng của con người.Khối lượng sơ sinh toàn ổ là khối lượng của tất cả lợn con sinh ra còn sống vàđược phát dục hoàn toàn Nếu những lợn sinh ra khỏe mạnh mà bị lợn mẹ đè chết thì

đó thuộc về trách nhiệm của con người chứ không phụ thuộc vào năng suất của lợn nái.Khối lợn sơ sinh phụ thuộc vào giống, khối lượng sơ sinh của lợn nội (Ỉ, Móng Cái)thường từ 0,4 - 0,6 kg/con, khối lượng sơ sinh của lợn ngoại trung bình 1,1 - 1,2 kg/con

Lợn con có khối lượng sơ sinh càng cao thì khả năng sinh trưởng càng nhanh,khối lượng cai sữa sẽ cao.

- Khối lượng cai sữa toàn ổ:

Ngoài chỉ tiêu số con cai sữa trên lứa, khối lượng toàn ổ lúc cai sữa cũng là chỉtiêu quan trọng để đánh giá năng suất của lợn nái

Hiện nay các cơ sở chăn nuôi thường áp dụng thời gian cai sữa khác nhau tùythuộc vào khả năng chế biến thức ăn và trình độ kỹ thuật nuôi dưỡng, cho nên để đánhgiá thành tích của lợn nái chúng ta thường xác định khối lượng lợn con lúc 56 hoặc 60ngày tuổi, có như vậy chúng ta mới so sánh và đánh giá thành tích của lợn nái với nhauđược Còn việc xác định khối lượng của lợn con lúc cai sữa ở thời điểm sớm hơn chỉnhằm mục đích xác định mức dinh dưỡng cho lợn con một cách chính xác đảm bảocung cấp đầy đủ nhu cầu dinh dưỡng cho lợn con ở giai đoạn sau cai sữa

Khối lượng lợn con cai sữa phụ thuộc rất lớn vào khối lượng sơ sinh và là cơ

sở cho việc nâng cao khối lượng xuất chuồng sau này

Khối lượng bình quân của lợn con khi cai sữa (kg) bằng tổng số khối lượnglợn con cai sữa (kg) so với tổng số lợn con cai sữa

1.1.4 Đặc điểm và khả năng sản xuất của lợn địa phương Pác Nặm

Ở nước ta hiện nay các giống lợn địa phương rất phong phú Miền núi phía BắcViệt Nam nuôi phổ biến là các giống lợn Mẹo, lợn Mường Khương, lợn Táp Ná, lợnđịa phương Pác Nặm, Trải qua quá trình chọn lọc, các giống lợn ở nước ta đã thích

nghi với điều kiện tự nhiên và kinh tế xã hội của địa phương Chúng có đặc điểm ditruyền quý giá đó là khả năng sử dụng các loại thức ăn thô xanh, nghèo dinh dưỡng vàtính chống chịu các bệnh tật nhiệt đới rất tốt, nhất là bệnh ký sinh trùng Các giống lợnnày thường đẻ nhiều con và có phẩm chất thịt thơm ngon, một số giống có khả năngthích nghi với vùng núi cao, nhiệt độ thấp và một số lại quen với môi trường ẩm ướt(Lê Viết Ly, 1994) [20].

Giống lợn địa phương có tầm quan trọng đặc biệt trong đời sống các dân tộcthiểu số vùng núi phía Bắc Là con vật thân thuộc được nuôi nhiều nhằm cung cấpthịt mỡ cho nhu cầu của con người Giống lợn địa phương có những ưu điểm nổi bậtnhư rất phù hợp với điều kiện tự nhiên miền núi phía Bắc, điều kiện canh tác củanhân dân miền núi, khả năng chịu đựng kham khổ cao, thích hợp với phương thứcchăn nuôi chăn thả Thịt và mỡ lợn thơm ngon, được người dân ưa chuộng (Đặc biệtnhóm lợn đen tuyền đang được coi là hàng đặc sản) Tuy nhiên, lợn cũng có nhiềunhược điểm như kết cấu ngoại hình xấu, lưng võng, bụng xệ, tầm vóc nhỏ, đẻ ít con,sinh trưởng chậm Mặc dù có một số nhược điểm như vậy, nhưng đây vẫn là con vậtđược người dân địa phương ưa chuộng và nuôi nhiều Do một số quan niệm chưakhoa học của người dân trong công tác chọn giống và chăm sóc nuôi dưỡng, cùngvới xu thế phát triển hiện nay, với trào lưu phát triển của các giống lợn nhập nội cónăng xuất cao đã tạo ra các giống lợn lai với ưu thế hơn hẳn thì các giống lợn bảnđịa có xu hướng bị thu hẹp dần Đặc biệt với nhóm lợn đen tuyền của giống lợn bảnđịa nuôi tại Pác Nặm, do những đặc điểm ưu việt về chất lượng thịt được người tiêudùng ưa chuộng cho nên có nguy cơ tuyệt chủng đang dần hiện hữu Vì vậy chúng

ta cần tìm ra các biện pháp bảo tồn và phát triển các giống lợn địa phương

Đặc điểm của giống lợn địa phương Pác Nặm: Dựa vào màu sắc lông, da có thểchia làm 3 nhóm như sau: [21]

* Nhóm đen tuyền:

Toàn thân đen tuyền Nhóm này có đặc điểm là tương đối nhỏ, có đặc điểm hoang

sơ hơn Nhóm lợn này được nuôi nhiều ở bà con dân tộc H'mông và dân tộc Dao Hiện

nay số lượng còn không nhiều chỉ chiếm từ 6,10% 8,33% đàn lợn nái điều tra, 2,42 3,92% đàn lợn thịt Nguyên nhân là do mặc dù có khối lượng nhỏ, lớn chậm nhưng thịtngon, là đối tượng cung cấp thực phẩm có chất lượng cao do đó làm suy giảm đáng kể

-số lượng đàn lợn Cần có biện pháp bảo tồn tránh nguy cơ tuyệt chủng

* Nhóm lợn lang trắng đen

Nhóm lợn này có màu lông trắng và đen xen kẽ Các vết lang trắng không cố định

và mức độ lang không giống nhau, con nhiều, con ít Các vết lang này thường phân bố ởbụng, ngang sườn, cổ, vai, lưng, gương mũi, 4 ngón chân, giữa trán và đuôi Phần cònlại có da và lông màu đen Nhóm lợn này chiếm từ 33,34% - 53,66% tổng đàn lợn nái;

từ 52,29 - 66,59% tổng đàn lợn thịt Nhìn chung nhóm lợn lang trắng đen này có tầmvóc to hơn và lớn nhanh hơn được nuôi nhiều ở vùng thấp hơn nơi có người dân tộc Tàysinh sống

1.2 Cơ sở khoa học và lý luận về di truyền

1.2.1 Cấu trúc của nucleic acid - DNA (Desoxyribonucleic acid)

Phân tử DNA là một chuỗi xoắn kép gồm hai chuỗi đơn Mỗi chuỗi đơn là một chuỗinucleotide Mỗi nucleotide gồm ba thành phần: nhóm phosphate, đường desoxyribose

và một trong bốn base và thường được ký hiệu bằng chữ cái đầu tiên của các base đó(A-adenine, C-cytosine, G-guanine và T-thymine) Hai chuỗi đơn kết hợp với nhau nhờcác liên kết hydrogen hình thành giữa các base bổ sung nằm trên hai chuỗi: A bổ sungcho T và C bổ sung cho G Mỗi chuỗi đơn có một trình tự định hướng với một đầu

5’phosphate tự do, đầu kia là 3’ hydroxyl tự do (quy ước là 5’ ® 3’ Hướng của hai chuỗiđơn trong chuỗi xoắn kép ngược nhau, nên được gọi là hai chuỗi đối song [10]

Một đặc điểm của phân tử DNA có ý nghĩa rất quan trọng được sử dụng vàophương pháp lai phân tử Đó là khả năng biến tính và hồi tính Biến tính là hiệntượng hai sợi đơn của phân tử DNA tách rời nhau khi các liên kết hydrogen giữa cácbase bổ sung nằm trên hai sợi bị đứt do các tác nhân hóa học (dung dịch kiềm,formamide, urea) hay do tác nhân vật lý (nhiệt) Sau đó, nếu điều chỉnh nhiệt độ vànồng độ muối thích hợp, các sợi đơn có thể bắt cặp trở lại theo nguyên tắc bổ sung,

để hình thành phân tử DNA ban đầu, đó là sự hồi tính [3]

1.2.2 Tổng hợp DNA in vitro

Phần lớn những hiểu biết về các quá trình hóa sinh tham gia vào việc tổng hợpDNA là bắt nguồn từ công trình của A Kornberg và đồng nghiệp năm 1950 TheoKornberg những chất cần thiết cho quá trình tổng hợp DNA trong ống nghiệm

(invitro) là:

1 Hỗn hợp của tất cả bốn deoxyribonucleotit 5' - triphosphat

2 Các ion Mg2+

3 Enzym DNA - polymerase tinh sạch chiết xuất từ E.coli

4 DNA có trọng lượng phân tử cao

Trong những thí nghiệm đầu tiên Kornberg đã nhận ra được số lượng DNAlớn gấp khoảng 20 lần số lượng DNA đưa vào Phản ứng tiếp diễn cho đến khihết một trong các tiền chất 5' - triphosphat, mặc dù chất quan trọng đối vớiphản ứng là Enzym DNA - polymerase có tác dụng hình thành mối liên kếtphosphodiester Lúc đầu người cho rằng DNA phân tử lượng cao có thể thựchiện 2 chức năng trong phản ứng: một là làm chất mồi (primer) nghĩa là đóngvai trò như đỉnh sinh trưởng để bổ sung các nucleotit mới, hai là đóng vai tròkhuôn để tổng hợp sợi DNA mới có trình tự bổ trợ (bổ sung) cho cácbazơnitơ.Tất cả các số liệu hiện có chứng tỏ rằng DNA này chỉ thực hiện chứcnăng thứ hai [3]

1.2.3 Gen và những quan niệm về gen

Khái niệm về gen như một quan niệm di truyền tách biệt, phát hiện đượcnhờ phép phân tích lai của Mendel, đã được W.Johannson đưa vào năm 1909.

Theo Johannson thì "nhiều tính trạng của cơ thể được xác định bởi những cái mà chúng ta gọi là gen" [10] Quan niệm đó về gen tồn tại suốt cả giai đoạn phát

triển của di truyền học kinh điển Từ đó đến nay bản chất của gen là vấn đề trungtâm của di truyền học Người đầu tiên thành công trong việc cụ thể hóa các kháiniệm về gen là T.Morgan (1926) Có thể tóm tắt quan điểm về gen của trườngphái Morgan như sau:

- Gen là đơn vị đột biến, nghĩa là gen bị biến đổi như một tổng thể hoàn chỉnh

- Gen là đơn vị tái tổ hợp, nghĩa là trao đổi chéo không bao giờ diễn ra ở bêntrong gen mà chỉ có thể diễn ra ở giữa các gen

- Gen là đơn vị chức năng, nghĩa là gen hoạt động như một đơn vị thống nhấtquy định một tính trạng của cơ thể

Vào những năm 50, DNA được chứng minh là vật chất di truyền, mô hình cấutrúc DNA của Waston - Crick được nêu ra và học thuyết trung tâm ra đời Gen đượchiểu là một đoạn DNA trên nhiễm sắc thể mã hóa cho một polypeptide hay RNA(một đại phân tử sinh học)

Cuối những năm 70, việc phát hiện ra gen gián đoạn ở Eucaryote cho thấy

có những đoạn DNA không mã hóa cho các aminoacid trên phân tử protein

Khái niệm gen được chỉnh lý một lần nữa: "gen là một đoạn DNA đảm bảo cho việc tạo ra một polypeptide, nó bao gồm cả vùng trước và sau vùng mã hóa cho protein và cả những đoạn không mã hóa (intron) xen giữa các đoạn mã hóa (exon)" Hiện nay có thể định nghĩa gen một cách tổng quát như sau: "gen là đơn vị chức năng cơ sở của bộ máy di truyền, chiếm một locus nhất định trên nhiễm sắc thể và xác định một tính trạng nhất định Các gen là những đoạn vật chất di truyền mã hóa cho những sản phẩm riêng lẻ như các RNA được sử dụng trực tiếp hoặc cho tổng hợp các enzym, các protein cấu trúc hay các mạch polypeptide để gắn lại tạo ra các protein có hoạt tính sinh học" [31]

1.2.4 Các chỉ thị di truyền (genetic marker)

Trong nhiều thập kỷ qua, ứng dụng các phương pháp chọn lọc dựa trên khoa học

về di truyền quần thể và khoa học thống kê đã cho phép tạo ra vật nuôi có hiệu suất tăngtrưởng cao Các kết quả dựa trên chọn lọc kiều hình với một tính trạng kinh tế quan trọng

ở gia súc, gia cầm đã đạt được nhiều thành tựu đáng kể Tuy nhiên, theo thời gian nhữnghạn chế của phương pháp này trong việc cải thiện tính di truyền vật nuôi đã trở nên rõràng Hiệu quả của chúng giảm khi các tính trạng mong muốn khó định lượng, khả năng

di truyền thấp (ví dụ như tính kháng bệnh) Thêm vào đó, việc chọn lọc nói chung chỉhạn chế các đặc tính có thể đo lường một cách phù hợp ở một số lượng lớn các mẫu Mộtvài đặc tính như: tỷ lệ sống sót, năng suất trứng… lại biểu hiện rất muộn trong quá trìnhsống nên khó có thể dùng làm tiêu chí có ích trong chọn lọc Ngoài ra hiệu quả chọn lọcdựa trên kiểu hình thường không cao khi mục tiêu chọn lọc có tương quan di truyềnkhông phù hợp (ví dụ như năng suất sữa và hàm lượng protein của sữa), sự tương tác átchế của gen) và giữa các gen với môi trường cũng rất phức tạp, do đó khó có thể xácđịnh một cách chính xác nếu chỉ dựa trên kiểu hình và phả hệ [41]

Sự phát triển của kỹ thuật sinh học phân tử đã mở ra khả năng xác định và sửdụng các biến dị hệ gen cho việc nâng cao tính di truyền của giống vật nuôi Đặcbiệt sự ra đời của các chỉ thị di truyền (các trình tự đánh dấu trên bộ gen liên kết vớicác tính trạng cần quan tâm) có thể giúp giải quyết những hạn chế của các phươngpháp trên

Hệ thống các chỉ thị phân tử chính đang được sử dụng để nghiên cứu di truyền

ở động vật có thể kể đến: RELP, RAPD, AFLP, Microsatellites… Trong nghiêncứu, các chỉ thị này được sử dụng vào nhiều mục đích:

* Dùng để đánh giá mức độ biến động di truyền trong một quần thể vật nuôi.Nếu mức độ biến động di truyền này còn cao thì cần tiếp tục quá trình chọn lọcnhằm ổn định dòng

* Cho phép đánh giá sự khác biệt di truyền giữa hai cá thể bố mẹ Sự khác biệtnày càng lớn thì tính dị hợp tử ở thế hệ con càng cao

* Theo dõi hiệu quả của một chương trình chọn giống định hướng đối với mộtallele đặc biệt.

* Xác định các chỉ thị ở các locus có liên kết chặt chẽ với các tính trạngmong muốn

Dựa trên chức năng, người ta chia các chỉ thị di truyền thành hai loại cơ bảnnhư sau:

A Chỉ thị loại I (known function)

Còn gọi là các ứng cử gen (cendidate gene) - là những chỉ thị đối với nhữnggen đã biết chính xác sản phẩm biểu hiện, do vậy được voi là quyết định tới các tínhtrạng mong muốn [51] Những chỉ thị loại này chủ yếu là các gen nằm trong vùng

mã hoá (coding gene), gồm RELP, SNP

B Chỉ thị loại II (unknown functions)

Là những chỉ thị đối với những gen nằm ngoài vùng mã hoá, có thể nằm gầnhoặc cách xa đoạn gen đã biết sản phẩm biểu hiện Chỉ thị loại này chưa được biết

về sản phẩm của nó, song cũng được xác định là có tác động hoặc ảnh hưởng đếntính trạng [51] Chỉ thị DNA này thường được phát hiện nhờ kỹ thuật RAPD,AFLP, Microsatellites, Minisatellites…

Trong nghiên cứu và phân tích di truyền các giống vật nuôi, mỗi loại chỉ thịphân tử có một thế mạnh riêng và đem lại hiệu quả nhất định Do đó, việc lựa chọn

và sử dụng chỉ thị phân tử nào trong nghiên cứu là phù hợp còn tuỳ thuộc vào mụcđích cũng như điều kiện cơ sở vật chất cũng như các trang thiết bị thí nghiệm

1.2.5 Một số phương pháp sử dụng trong nghiên cứu gen lợn và ứng dụng

Trong chọn giống ở lợn và nhiều gia súc khác, thường thì các chỉ thị di truyềnđược sử dụng có liên quan đến các tính trạng năng suất, chất lượng thịt, sinh sản,khả năng kháng bệnh…

Nghiên cứu đa hình gen (DNA) vật nuôi và xác định sự liên quan của nó vớicác tính trạng có ý nghĩa kinh tế nhằm tìm các chỉ thị di truyền hỗ trợ cho công tácchọn giống rất có ý cả trong khoa học lẫn thực tiễn

Sử dụng các phương pháp phân tích đa hình có thể xác định các chỉ thị ditruyền ở mức độ sinh hoá (như: Sự đa hình nhóm máu, đa hình protein/enzymehoặc hệ thống kháng nguyên) hoặc ở mức độ DNA (lai ghép DNA-DNA, phântích đa hình bằng enzyme giới hạn (RFLP) với DNA nhân hoặc DNA ty thể,khuếch đại ngẫu nhiên đa hình DNA (RAPD), khuếch đại đa hình chiều dài cácđoạn gen nhân có chọn lọc (AFLP), đa hình các trình tự lặp lại đơn giản:minisatellites, microsatellie (MS), SNP - đa hình nucleotide đơn…).

Mỗi phương pháp đều có những ưu nhược điểm nhất định Nhìn chung, chúngđều dựa vào sự khác biệt về chiều dài các đoạn giới hạn (do đột biến làm mất haythêm một vị trí nhận biết của enzyme giới hạn) hoặc số lượng các trình tự lặp lại tạimột vùng trên bộ gen giữa các cá thể khác nhau

* Phương pháp phân tích đa hình các đoạn cắt bằng enzyme giới hạn (PolymeraseChain Reaction - Restriction Fragment Lenghth Polymorphism = PCR-RFLP)

- Nguyên lý của phương pháp này là nhờ PCR (Polymerase Chain Reaction) đểkhuếch đại đoạn gen cần nghiên cứu bằng các đoạn mồi chuyên biệt, sau đó dùngenzyme giới hạn để cắt đoạn gen đó tại các điểm đột biến nhất định để từ đó xác định

sự có mặt hay không của điểm đột biến đó tương ứng với sự có mặt hay không của cácallele tương ứng với các đột biến đó trong đoạn gen mà ta quan tâm nghiên cứu Từ đóxác định tần số tương đối của các allele cũng như gen đó có đa hình hay không…

* Phương pháp phân tích đa hình chiều dài các đoạn DNA được khuếch đại(Amplified Fragment Lenghth Polymorphisms = AFLP)

AFLP cũng là một trong những kỹ thuật phân tích đa hình được sử dụng khá phổbiến Kỹ thuật này dựa trên nguyên tắc của PCR nhưng đoạn mồi được thiết kế theo trình

tự của những đoạn DNA đã biết, do đó sản phẩm nhân có độ đặc hiệu cao Winimers và

cs (2002) đã sử dụng 48 cặp mồi AFLP xác định vị trí gen quy định tính trạng tỷ lệ thịt

xẻ và độ dày mỡ lưng ở các thế hệ lợn F2 Duroc và Berlin của Đức [58]

* Phương pháp phân tích đa hình Microsatellile (MS)

MS là phương tiện rất hiệu quả để đánh giá mức độ đa hình và quan hệ ditruyền quần thể động vật Mới đây, tổ chức Nông lương thế giới (FAO) đã đưa ra

danh sách 27 chỉ thị cho lợn Thời gian qua, nhiều nghiên cứu về đa dạng di truyền

đã được tiến hành trên các giống lợn châu Âu, Trung Quốc và Hàn Quốc Một dự ánnghiên cứu lớn nhằm đánh giá mức độ đa dạng di truyền của 50 giống lợn TrungQuốc và so sánh với 59 giống lợn châu Âu đang được tiến hành bởi Blott và cs(2003) [25] Ở Việt Nam, các nghiên cứu về đa dạng sinh học trên các giống lợn sửdụng các MS nhìn chung còn hạn chế

* Phương pháp phân tích đa hình bằng trình tự DNA

Việc xác định đa hình không chỉ dựa trên kích thước allele mà còn dựa trên nhữngthông tin về trình tự nucleotide của nó Người ta có thể phân tích trình tự cac nucleotidetrực tiếp trên sản phẩm PCR hay gắn sản phẩm PCR hay gắn sản phẩm PCR vào một

vector và biến nạp vào tế bào E.coli Ngày nay nhờ có kỹ thuật PCR nên các phương

pháp phân tích trình tự đã cải tiến, cùng với sự trợ giúp của máy xác định trình tự tựđộng, các phần mềm thu thập và xử lý số liệu thích hợp… đã giúp cho việc xác địnhtrình tự được nhanh, chính xác và dễ dàng hơn

1.2.6 Ứng dụng của các chỉ thị di truyền đến tính trạng số lượng ở lợn

Trong chọn giống ở lợn và nhiều gia súc khác, thường các chỉ thị di truyền được sửdụng có liên quan đến các tính trạng năng suất, chất lượng thịt, sức sinh sản và khả năngkháng bệnh… Đó là những tính trạng số lượng (Quantitative trait) hay còn gọi làcác tính trạng liên tục (vì trong quần thể, giá trị của các tính trạng này biến thiênliên tục) và các locus di truyền tương ứng của chúng được coi là các locus tính trạng

số lượng (QTL- Quantitative trait loci)

Hiện nay, việc sử dụng các chỉ thị di truyền để phát hiện những vùng trong bộgen liên quan đến tính trạng số lượng được ứng dụng rộng rãi, đặc biệt chúng còn được

sử dụng vào việc xác định dấu vết di truyền, hình thành các bản đồ liên kết (linkagemap) hay bản đồ các locus tính trạng số lượng (QTL mapping) với vị trí các gen mãhoá cho các tính trạng mong muốn, nhằm đáp ứng nhanh và hiệu quả việc chọn lọcphục vụ cho các chiến lược lai tạo và chọn giống theo phương pháp cổ điển

Việc phát triển các chỉ thị di truyền phân tử nói chung đều đòi hỏi trình độ kỹthuật cao song có nhiều những ưu điểm: Nó cho phép sử dụng nguồn gèn mà không

làm ảnh hưởng đến sự điều hoà và biểu hiện tự nhiên của gen; chỉ cần một lượng rấtnhỏ chứa rất ít vật liệu di truyền vẫn có thể cho kết quả nhanh và chính xác Do vậy,thời gian vừa qua số lượng gen và chỉ thị di truyền trên bản độ di truyền của lợn đãkhông ngừng được gia tăng.

1.3 Cơ sở lý luận về phương pháp nghiên cứu

1.3.1 Phương pháp tách DNA

DNA là phân tử có kích thước lớn, do đó trong thao tác cần tránh mọi tác nhân

cơ học hay hóa học quá mạnh có thể làm đứt gãy phân tử này Có nhiều phươngpháp tách chiết DNA tế bào [3] Nói chung các phương pháp tách chiết cơ bản đóđều được tiến hành theo ba bước:

Bước 1: Phá vỡ màng tế bào và màng nhân (tế bào Eukaryote)

Bước 2: Loại bỏ các thành phần không mong muốn trong mẫu, chủ yếu là cácprotein

Bước 3: Kết tủa DNA, mục đích của việc kết tủa là nhằm thu nhận DNA dướidạng cô đặc, một phần nhằm bảo vệ chúng ra khỏi sự phân hủy các enzym, mặtkhác có thể hòa tan chúng lại trong dung dịch theo nồng độ mong muốn

1.3.2 Phương pháp nhân đoạn DNA đặc hiệu (phản ứng PCR)

1.3.2.1 Phản ứng PCR cho phép nhân các đoạn DNA định trước

Kỹ thuật nhân đoạn DNA đặc hiệu, hay còn gọi là kỹ thuật PCR (Polymerase ChainReaction) được Kary Mullis hoàn thiện vào giữa những năm 80 và được xem là mộtcuộc cách mạng trong di truyền học phân tử Kỹ thuật này là một phương pháp hoàn toànmới trong việc nghiên cứu và phân tích gen [19]

Kỹ thuật PCR sử dụng các đặc điểm của quá trình sao chép DNA DNApolymerase dùng các đoạn DNA mạch đơn làm khuôn để tổng hợp nên sợi mới bổtrợ với nó Các sợi DNA mạch đơn này có thể được tạo ra theo cách đơn giản là đunnóng dung dịch DNA mạch kép tới gần nhiệt độ sôi (94oC-97oC) DNA polymerasecũng đòi hỏi phải có một đoạn ngắn DNA mạch kép (đoạn mồi - primer) để khởiđầu quá trình tổng hợp Vì vậy để khởi đầu quá trình tổng hợp DNA cần cung cấpđoạn mồi oligonucleotit (có độ dài từ 6 đến 30 nucleotit), đoạn này gắn với khuôn

tại điểm khởi đầu sao chép Đó là đặc điểm quan trọng đầu tiên của kỹ thuật PCR vìDNA polymerase được điều khiển để tổng hợp một đoạn DNA đặc thù Cả hai sợiADN đều được dùng để làm khuôn cho quá trình tổng hợp nên các đoạn mồioligonucleotit được cung cấp cho cả hai sợi Trong kỹ thuật PCR, các đoạn mồiđược chọn để chặn hai đầu của đoạn DNA cần nhân lên, sao cho các sợi DNA tổnghợp mới được bắt đầu tại mỗi đoạn mồi và kéo dài về phía đoạn mồi nằm trên sợikia [3] Như vậy sau mỗi chu kỳ các điểm bám cho các đoạn mồi lại xuất hiện trênmỗi sợi DNA mới được tổng hợp Hỗn hợp phản ứng lại được đun nóng lên để táchsợi ban đầu khỏi sợi mới tổng hợp, các sợi này sau đó lại dùng làm khuôn cho chu

kỳ tiếp theo bao gồm các bước: gắn đoạn mồi, tổng hợp DNA và tách rời các đoạn

- Bước 2 (bắt cặp mồi) : nhiệt độ được hạ thấp cho phép các mồi bắt cặp vớikhuôn; trong thực nghiệm nhiệt độ này dao động trong khoảng 40-70oC và kéo dài

30 giây - 1 phút

- Bước 3 (sinh tổng hợp) : nhiệt độ được nâng lên 72oC đây là nhiệt độ thíchhợp cho enzym DNA polymerase hoạt động tiếp tục lắp ghép các nucleotit bổ sungvới mạch khuôn kéo dài sợi DNA mới

Một chu kỳ bao gồm ba bước trên sẽ được lặp đi lặp lại nhiều lần, mỗi lầnlại làm tăng gấp đôi lượng mẫu của lần trước Đây là sự khuyếch đại theo cấp sốnhân, theo tính toán sau 30 chu kỳ sự khuyếch đại sẽ là 106 so với số lượng bảnmẫu ban đầu [19]

1.3.3 Enzym giới hạn

Hiện tượng giới hạn và enzyme giới hạn do Hamilton Smith và cộng sự phát

hiện đầu tiên (1970) ở vi khuẩn Hemophilus influezae Bình thường tế bào vi khuẩn

bị nhiễm phage thường bị phage phá hủy Một số vi khuẩn khi bị nhiễm phage,không bị phage phá hủy mà có khả năng phân hủy DNA phage, nhờ một số loạienzym đặc hiệu có trong tế bào vi khuẩn Các loại enzym trong tế bào vi khuẩn cóthể cắt DNA phage ở những vị trí nhất định thành những đoạn ngắn, những enzymnày được gọi là enzym giới hạn [42]

Enzym giới hạn (Restriction Enzym - RE) là các enzym thuộc nhóm enzymendonuclease, có khả năng nhận biết các trình tự nucleotid đặc hiệu trên phân tửDNA (khoảng 4 - 8 nucleotid), cắt đặc hiệu phân tử DNA ở những vị trí nhất địnhthành những đoạn ngắn

1.3.4 Phương pháp RFLP

- RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism DNA): đa hình chiều dàicác đoạn DNA cắt bởi enzyme giới hạn Kỹ thuật này dựa trên đặc điểm của các loạienzyme giới hạn khác nhau, tạo nên các đoạn cắt DNA khác nhau phân biệt bằng điện di

đồ Các đoạn cắt còn được gọi là các "dấu vân tay- Fingerprinting" đặc trưng cho từng

phân tử DNA Phương pháp này được sử dụng để xác định sự khác biệt trong cấu trúc bộgen của các cá thể, các loài sinh vật, nhằm so sánh sự khác biệt về cấu trúc gen quan tâmgiữa các mẫu nghiên cứu [19]

- Nguyên lý: các mẫu nghiên cứu được tách chiết, tinh sạch DNA rồi xử lýbằng cùng môt loại enzyme giới hạn Mỗi enzyme giới hạn sẽ nhận biết và cắtđặc hiệu DNA ở những vị trí xác định Do đó, các bộ gen có cấu trúc khác nhautạo nên số lượng đoạn cắt DNA khác nhau, và có thể có kích thước khác nhau.Ngược lại, những bộ gen hoàn toàn giống nhau tạo nên số lượng và kích thướccác đoạn cắt DNA giống nhau, có thể phát hiện nhờ điện di đồ

Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng enzyme cắt giới hạn cho gen PRLR là

ALu I và gen Properdine là SmaI Vị trí cắt của enzyme giới hạn ALuI và SmaI được

mô tả như bảng sau:

Bảng 1.1 Vị trí cắt của enzyme giới hạn ALuI và SmaI

PRLR/ALuI

vi khuẩn

Arthrobacter luteus

5’ CCCGGG 3’

3’ GGGCCC 5’

5’ CCC GGG 3’3’ GGG CCC 5’

1.3.5 Điện di trên gel agarose

Điện di là một phương pháp được sử dụng phổ biến trong nghiên cứu cấu trúc vàđặc điểm sinh học của phân tử mang điện tích (DNA, Protein v.v ) Nguyên lý chungcủa phương pháp điện di là dựa vào điện tích âm của DNA trong môi trường có điệntrường Sở dĩ DNA mang điện tích âm là nhờ các nhóm photphat nằm trên khungphosphodiester của chúng Các phân tử DNA có kích thước khác nhau sẽ di chuyển từcực âm sang cực dương với tốc độ khác nhau [19]

Kiểu gel dùng trong điện di có tác dụng rất quan trọng đối với mức độ phântách các phân tử Có hai loại gel được dùng phổ biến là Agarose và Polyacrylamid

và trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng gel Agarose

Agarose là phân tử polymer được tách chiết từ rong biển, cấu tạo bởi 2 monome làD-galactoza và 3,6 - anhydroL-galacoza nên sau khi đun sôi sẽ tạo thành mạng lưới chophép các phân tử khác nhau đi qua tùy theo kích thước và trọng lượng của phân tử.Agarose nóng chảy ở nhiệt độ 90-1000C và ở nhiệt độ bình thường trong phòng thínghiệm thì Agarose bị đông đặc lại Dựa vào tính chất này của gel agarose mà ta có thểlựa chọn nhiệt độ thích hợp với từng nồng độ của gel để có thể điện di được các phân tử

có khối lượng phân tử khác nhau

Sự di chuyển của DNA trong gel điện di có được hiệu quả hay không được quyếtđịnh bởi một phần rất lớn của nồng độ ion, thành phần các chất có trong đệm điện di.Trong trường hợp nếu không có sự có mặt của các ion thì sự dẫn điện là rất nhỏ với tốc

độ di chuyển của DNA cũng rất thấp Nếu nồng độ các ion trong đệm điện di cao thì độdẫn điện rất hiệu quả nhưng lượng nhiệt sinh ra rất lớn và vì vậy trong một số trường hợpxấu có thể xảy ra là gel sẽ bị nóng chảy còn DNA sẽ bị biến tính [10].

1.4 Các gene liên quan đến tính trạng sinh sản của lợn

1.4.1 Gen thụ thể prolactin (PRLR)

* Vị trí, vai trò của gen PRLR

Gen thụ thể prolactin trong bản đồ gen của lợn được định vị trên nhiễm sắc thể có

16 với các vùng chức năng từ 16bp1.4 hoặc 16bp2.2-2.3 (Vincent và cs, 1998) [57]tương ứng với vị trí 5p112- p13 của người vànhiễm sắc thể số 2 và 15 của chuột [35].Gen PLRL có kích thước 449bp và mã hóa 95 acid amin với trình tự mã hóa là:

"QENGDRPEKAGAPETSKEYAQVSRVMDNHILVLVQDPRARNVAPFEEPTKETPPSRPQNPAAKDLASFTTAPGHCRHPLGGLDYLDPAGFMHSFQ"Các nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng số lượng thụ thể prolactin của màng trong

dạ con tăng ở ngày thứ 12 của thời kỳ mang thai bởi sự tổng hợp estrogen của bào thai đãchi phối lại sự tiết PGF2 để duy trì chức năng của thể vàng Vì vậy, prolactin có thểđóng một vai trò quan trọng trong quá trình mang thai ở lợn, ảnh hưởng đến số lượngcon sinh ra còn sống sót trong mỗi lứa đẻ [50]

Thụ thể prolactin có thể tìm thấy ở nhiều loại mô, nhiều loại động vật khácnhau (Kellyetal, 1991) [45] Gen này còn có quan hệ với nhiều nhóm gen khác nhaunhư gen thụ thể của hormone sinh trưởng, nó cũng tham gia thành phần cấu tạo của

họ thụ thể cytokin, chúng cũng đóng vai trò hoạt hoá enzyme kinase và ATATs (tín

hiệu biến đổi và hoạt hoá quá trình sao chép) (Clevenger và cs, 1998; Bole - Feysot

và cs, 1998) Gen PRLR đã được giải trình tự một phần và hiện có trong ngân hànggen GenBank: U96306

* Đa hình gen PRLR và sự liên quan của gen PRLR với tính trạng sinh sản của lợn

Kiểu alen A cho thấy sự tương quan với số lượng con sinh ra còn sống sóttrong mỗi lứa đẻ ở lợn Theo kết quả nghiên cứu của van Rens BT và cs, (2003) [56],gen PRLR hoặc một gen liên kết rất gần nó có ảnh hưởng đến buồng trứng, tử cung,

nhau thai ở lợn Do đó, nó có thể ảnh hưởng đến số con sinh ra trong một lứa Bởi

vì, các gen khác cũng như các yếu tố môi trường có thể làm thay đổi ảnh hưởng củagen PRLR trong vòng 112 ngày cho đến khi sinh nên gen PRLR có thể được coi làmột chỉ thị gen quan trọng cho tính trạng tỷ lệ rụng trứng và có vai trò quan trọngvới sự thụ thai ở lợn cũng như số lượng con sinh ra trong một lứa đẻ [56]

Nguyễn Văn Cường và cs (2005) [7] đã nghiên cứu đa hình gen PRLP ở giốnglợn Landrace và Yorkshire (là 2 giống lợn ngoại đã được nhập và nuôi một thời giandài ở Việt Nam) bằng phương pháp PCR - RFLP Với đoạn mồi đặc hiệu đã nhân đặchiệu được đoạn gen PRLP có độ lớn tương ứng với vị trí 163 bp, khi phân tích đa hình

đoạn gen này bằng enzyme cắt hạn chế AluI các tác giả đã phát hiện thấy cả 3 kiểu gen

PRLP đều xuất hiện ở 2 giống lợn nói trên với tần số tương đối giống nhau Trong đó,kiểu gen BB có tần số cao nhất rồi đến các kiểu gen AA và AB

Phạm Thanh Phương (2006) [25] đã nghiên cứu đa hình gen PRLP ở giống lợnMóng Cái) bằng phương pháp PCR - RFLP Với đoạn mồi đặc hiệu đã nhân đặc hiệuđược đoạn gen PRLP có độ lớn tương ứng với vị trí 163 bp, khi phân tích đa hình đoạn

gen này bằng enzyme cắt hạn chế AluI tác giả đã phát hiện thấy cả 3 kiểu gen PRLP đều

xuất hiện Trong đó, kiểu gen BB có tần số cao nhất rồi đến các kiểu gen AA và AB Trong thí nghiệm của mình Xu N Y và cs (2003) [59] đã ứng dụng phương phápPCR - RFLP để phân tích sự phân bố của gen PRLP trong ba dòng của lợn Jinhua Tácđộng của PRLP với tính trạng sinh sản trên các giống lợn này được tính toán bằng phầnmềm SPSS Tần số kiểu gen AA, AB, BB của gen PRLP ở các dòng Jinhua I, II và IIIlần lượt là: 0,2560; 0,3929; 0,3512; 0,2000; 0,2667; 0,5333 và 0,1273; 0,4909; 0,3818

và tần số tương đối của alen A và B ở các dòng Jinhua I, II và III lần lượt là: 0,45; 0,55;0,33; 0,67 và 0,37; 0,63 Tuy nhiên họ đã không thấy có sự kết hợp đáng kể nào giữalocus PRLR với tính trạng sinh sản của lợn Jinhua đồng thời cũng không thấy có sựtương tác giữa ESR và PRLP đến số lợn con sinh ra còn sống sót và toàn bộ số lượngcủa lợn con được sinh ra (p < 0,05) và trọng lượng con lúc sơ sinh (p< 0,01)

Nghiên cứu của Terman A (2005) [55] tập trung chủ yếu vào việc phát hiệncác đột biến DNA để từ đó xác định mối tương quan giữa kiểu gen PRLR và kích

cớ lứa đẻ của các con lợn nái Ba Lan (Large White x Landrace) Nhằm xác định cáctính trạng sinh sản: tổng số lợn con được sinh ra (TNB), số lợn con sinh ra còn sống(NBA) và số lợn con cai sữa Sự đa hình của gen PRLR cũng được phân tích bằngphương pháp PCR - RFLP với các đoạn mồi đặc hiệu và enzyme cắt hạn chế là

AluI Tần số xuất hiện hai alen của gen PRLR là alenA = 0,62 và allele B = 0,38.

Theo nghiên cứu của Marek Kmiec và Arkadiusz Terman (2006) [49]: nghiêncứu tập trung theo dõi 229 con lợn đực thuộc các nguồn gốc khác nhau thuộc nhiềuvùng địa lý khác nhau bằng cách thu nhận tinh dịch từ các con lợn đực đem thụ tinhcho các con lợn nái với cùng một điều kiện chăm sóc DNA hệ gen được thu nhậnmột cách tinh khiết từ máu Kiểu gen PRLR đã được xác định nhờ phương phápPCR - RFLP Đa hình gen PRLR được nghiên cứu và phát hiện nhờ enzyme cắt hạn

chế AluI Tần số tương đối của alen A ở các con lợn đực trong các nghiên cứu trên

là lớn hơn nhiều so với alen B trong đó đặc biệt ở giống Hampshire x Pietrain tần sốtương đối của alen A lên tới 83% trong khi alen B chỉ có 17% Nếu ta so sánh cáckết quả nghiên cứu của các tác giả như đã đề cập ở trên có thể thấy rằng tần sốtương đối của các alen A ở các con lợn đực là lớn hơn so với các con lợn nái

1.4.2 Gen Properdine

Gen Properdine: định vị ở gần vùng trung tâm nhiễm sắc thể số 7 của lợn

1/2p11 - p12 (printon và cs, 2000; Ponsuksili và cs,2001) Properdine có chức năng

sinh lý quan trọng đối với tính trạng sinh sản như sự phát triển tế bào biểu mô tử cung

(Hasty và cs, 1993), số lượng con sinh ra/lứa ở chuột (Matsumoto và cs, 1997) [33].Trình tự gen Properdin đã được giải trình tự và có mặt trên ngân hàng gen quốc tếNCBI Reference Sequence: M59240.1

Gen Properdine có một vùng intron và 3 vùng exon, trong đó vùng exon bắtđầu từ nucleotid 104 đến nucleotid 229 Vùng exon của gen Properdine tham gia mãhoá được 469 acid amin với trình tự là:

"AIRCPRPHDFENGEYWPRAPYYNLSDEISFHCYDGYTLRGSANR

TCQVTGRWDGQTAICDDGAGYCPNPGIPIGTRKVGTQYRLEDSVTYYCTRGLTLRGSQRRTCQEGGSWSGTEPSCQDSFMYDTPAEVAEAFLSSLTETIEGVDAED"

Buske và đồng tác giả (2005) đã phân tích đa hình gen properdine trên 123 lợnnái F2 thương mại (Large White x Landrace) x Leicoma Kết quả phân tích cho thấykiểu gen Properdine ảnh hưởng đến tính trạng sinh sản (số lượng con sinh ra và sốlượng con sinh ra sống sót/lứa) ở dòng lợn nghiên cứu cụ thể là số con sinh ra và sốcon sinh ra sống sót/lứa của kiểu gen AA và BB lần lượt là 10,55; 10 và 13,19;12,11 với mức ý nghĩa p < 0.05) [33].

Nguyễn Thị Diệu Thúy, Trần Quỳnh Anh (2009) đã phân tích gen Properdineliên quan đến tính trạng sinh sản của lợn Móng Cái Kết quả phân tích kiểu gen vàkiểu alen của đoạn gen properdine ở 51 lợn nái Móng Cái cho thấy xuất hiện cả haidạng alen A và B với tần số 21,6% A và 78,4% B, đồng thời tạo ra tổ hợp 3 kiểugen AA, AB và BB với tần số lần lượt là 5,9%, 31,4% và 62,7% Như vậy alen B cótần số xuất hiện cao hơn hẳn alen A, kiểu gen AA cũng xuất hiện với tần số thấp(5,9%) và chỉ xuất hiện ở những nhóm có số con sống sót thấp [33]

1.4.3 Các gen sinh sản khác

Ngoài gen PRLR và Properdine trong nghiên cứu này còn có một số ứng cửgen khác như ESR (Estrogen receptor), RBP4 (retinol- binding protein 4), OPN(osteopontin), FSHB (follicle stimulating hormone  polypeptit)… được xem là cóliên quan đến chức năng sinh sản ở lợn Dưới đây trình bày sơ lược một số nghiêncứu về các gen này trên một số giống lợn khác nhau

Bảng 1.2 Các gen khác liên quan đến tính trạng sinh sản của lợn

(NST) Tính trạng quy định

* Gen thụ thể estrogen (ESR) của lợn nằm trên NST số 1 với độ dài là 185 bp,các nghiên cứu đã chỉ ra rằng alen B đường như có tác dụng làm gia tăng số lượnglợn con được sinh ra trong mỗi lứa đẻ (Rothschild 1996, Short 1997) [52, 54].

* Gen RBP4: nằm trên NST 14; mã hoá cho hormon kích thích sự tăng trưởng củamàng trong dạ con của lợn mang thai và có vai trò quan trọng trong sự vận chuyểnvitamin A và protein ở tử cung cũng như các quá trình sinh lý sinh hoá khác trong quátrình hình thành bào thai vì vậy nó ảnh hưởng đến sự sống sót của phôi thai [45]

* Gen OPN: gen này nằm trên NST số 8 và nó quy định chiều dài của sừng tửcung và tỷ lệ rụng trứng

* Gen FSHB: nằm trên NST số 2 và mã hoá cho hormon kích thích bao noãn(follicle stimulating hormone - FSH) Gen FSH có chiều dài 10kb Trong đó, cùng 5’-flanking dài 6kb và đơn vị phiên mã dài 4kb, gồm 3 exon FSH tương tác với thụ thểcủa nó nằm trên các tế bào hạt và có tác dụng kích thích sự trưởng thành và biệt hoácủa các tế bào trứng trước khi thụ tinh Sự đa hình của FSH đã được nghiên cứu rất kỹ

ở nhiều giống lợn khác nhau như Meishan, Landrace, Yorshire … [47, 48] Kết quảcủa sự đột biến gen ở FSH là sự xen vào của transposon (gen nhảy) chứa toàn bộ trình

tự của RNA polymerase II cũng như các vùng có thể sao chép Transposon này có độdài 292 bp xen vào ở vị trí 809 bp, nằm giữa intron I và exon II của gen FSH Đột biếnnày liên quan đến số con sinh ra trong một lứa, những cá thể mang transposon thì sốlượng con sinh ra trong một lứa ít hơn so với cá thể không mang transposon

1.5 Tình hình nghiên cứu gen lợn trong và ngoài nước

1.5.1 Nghiên cứu gen lợn ở nước ngoài

Trong vài thập kỷ vừa qua, ứng dụng di truyền phân tử để xác định các locus genảnh hưởng đến các tính trạng kinh tế quan trọng trong chăn nuôi đã đạt được nhiều thànhtựu đáng kể Điều này đã tăng cường các chương trình cải tạo nguồn gen bằng conđường cải tạo trực tiếp trên các gen hoặc các vùng gen ảnh hưởng đến các tính trạng kinh

tế thông qua chọn lọc có sự hỗ trợ của các marker và chuyển gen Một số gen ảnh hưởngđến các đặc điểm kinh tế quan trọng đã được nghiên cứu như: Các đột biến genRianodine receptor - 1 (hay gen Halothane) gây ra triệu chứng mẫn cảm stress; các gen

Etrogen, Prolactin receptor, Gonadotropin releasing hormone, Retinol binding protein 4liên quan đến số con trong một lứa đẻ; các gen Heart fatty-acid binding protein,Adipocyte fatty-acid binding protein, Rendement napole, Insulin like growth factor-2,Rianodine receptor-1 ảnh hưởng đến chất lượng thịt; các gen Melanocortin-4, Myogenin,Leptin receptor, Insulin like growth factor-1, Pituitary-specific transcription factor-1 cóliên quan đến sự tăng trọng và các gen alpha (1,2) fucosyltransferase liên quan đến khảnăng miễn dịch và chống chịu bệnh (Rothchild, 2000)… [53]

Các tính trạng kinh tế cũng được chú trọng nghiên cứu nhiều bao gồm: các ứng cửgen liên quan đến tính trạng sinh trưởng và sản lượng thịt ở lợn đã được tiến hành nghiêncứu như GH (Knorr và cs, 1997); PIT1 (Yu và cs, 1995); IFG-1 (Casas Carrillo và cs,1997); myogenin (MYOG) (Soumillion và cs, 1997; Te Pas và cs, 1999)… [44]

Ở nhiều nước trên thế giới như: Đức, Mỹ, Ba Lan, Hà Lan, Trung Quốc, ViệtNam Đã và đang rất chú trọng tới vấn đề phát triển các chỉ thị di truyền phục vụ chocông tác chọn giống động vật Dựa trên các chỉ thị di truyền nhiều công trình đã thiết lậpthành công bản đồ di truyền liên kết và định vị các gen có tầm quan trọng về kinh tế như:Andersson và CS (2000), Archibald và CS (1994), Walling và CS (2000)… [2]

Năm 1964, sau khi bản đồ di truyền ở lợn được công bố bởi Andresen và Baker,

số lượng gen và chỉ thị di truyền trên bản đồ di truyền lợn đã được phát triển khôngngừng Các vạch ghi trên bản đồ di truyền lợn đã nhanh chóng tăng lên, từ 28 locus(trong năm 1984) tới 50 gen và đã được tìm thấy; năm 1996, trên bản đồ gen lợn đãxác định được khoảng 1100 locus Năm 1999 số lượng gen và chỉ thị di truyền đãlên tới hơn 1800 trong đó có khoảng 250 gen… Đến tháng 10 năm 2003 bản đồ genlợn đã xác định được 3017 locus, trong đó có 1158 chỉ thị loại I và 1859 chỉ thị loạiIII Cho đến tháng 10 năm 2005 thì con số đó đã lên tới trên 5000 locus [35]

1.5.2 Nghiên cứu gen lợn ở Việt Nam

Thời gian gần đây một số nghiên cứu trong nước về lĩnh vực này mới được bắtđầu quan tâm đến nhưng chủ yếu các kết quả nghiên cứu mới dừng ở một số genriêng lẻ và chưa có hệ thống Các nhà nghiên cứu cũng đã tập trung quan tâm tớiviệc chọn lọc ưu thế của các giống lợn nội Tại các viện nghiên cứu trong nước,

việc phát triển các chỉ thị di truyền tìm sự liên quan với các tính trạng mong muốn,phục vụ cho công tác chọn giống lợn rất được chú ý Các giống lợn nội được sửdụng làm đối tượng nghiên cứu chủ yếu là lợn Móng Cái, Mường Khương, Tạp Ná,lợn Mẹo, lợn Cỏ… Các hướng nghiên cứu chủ yếu tập trung vào việc phân tích đahình di truyền của một số gen liên quan đến các tính trạng kinh tế.

Nguyễn Văn Hậu và cs (1999) đã tiến hành giải trình tự đoạn gen hormone

sinh trưởng (GH) (từ nucleotide 381 đến nucleotide 802) trên 3 giống lợn nội Việt

Nam (lợn ỉ, Móng Cái và lợn H’mông) Kết quả phân tích đoạn gen FH có độ lớn

422 bp trong vùng exon 2 và phân tích trình tự đã phát hiện được các điểm đột biếntại vị trí 507, 555 và 556 Các đột biến này là cơ sở tạo ra sự đa hình của gen GH vàlàm cơ sở cho xác định mối liên quan của đa hình gen đến tốc độ tăng trọng, tỷ lệnạc và chất lượng thịt ở lợn [14]

Nguyễn Ngọc Tuân và cs (2001) [36] đã bước đầu nghiên cứu khảo sát tần sốgen Halothane và ảnh hưởng của gen này lên sức tăng trưởng, phẩm chất thị và khảnăng sinh sản của lợn tại các trại Tp HCM Tần số của ba kiểu gen NN, Nhà nước

và nn lần lượt là 55,6%, 40,7% và 3,7% Kiểu gen đồng hợp tử lặn nn có quan hệvới tỷ lệ chết cao, phẩm chất thịt giảm (thịt có màu tái, mềm và rỉ nước)

Phạm Thu Thuỷ và cs (2003) [35] đã phân tích đa hình đặc trưng của đoạntrình tự gen PIT1 (có độ lớn 300 bp) ở một số giống lợn địa phương và lợn ngoại.Kết quả phân tích cho thấy các trình tự thuộc 3 giống lợn (Landrace, Ba Xuyên,

Mỹ Văn) có mức độ bảo thủ cao 99,6% Khi so sánh với trình tự của giống lợnYorkshine (EMBL - G66934) trên Ngân hàng gen đã phát hiện được 2 điểm đa hìnhnucleotide đơn thuộc vùng mã hoá của gen Tuy nhiên các tác giả khẳng định đột biếnnày không ảnh hưởng tới các dấu hiệu sinh trưởng

Võ Thị Tuyết và cs (2001) thông báo công trình nghiên cứu ứng dụng kỹ thuậtPCR để phát hiện gen Prolactin tạo tiền đề cho việc chọn tạo giống lợn nái cao sảnđang bắt đầu được tiến hành Lê Thị Thuý và cs (2005) đã phân tích đa hình và trình

tự đoạn gen Osteopontin liên quan đến khả năng sinh sản ở lợn, cụ thể là nó tương tácvới thụ thể intergrin, chất bám dính liên quan đến khả năng làm tổ của bào thai trong

dạ con của lợn Kết quả phân tích thể hiện đa hình trong tần số allele ở giống lợn nội

(Móng Cái) và 2 giống lợn nhập nội (Landrace và Yorkshire), còn giống lợn Bảnkhông có đa hình ở đoạn gen nghiên cứu (chỉ xuất hiện allele B) [38]

Lê Thị Thuý và cs (2004) cũng đã nghiên cứu cấu trúc và đa hình gen thụ thểhormone estrogen (ESR) và ảnh hưởng của nó đến khả năng sinh sản của giống lợn (lêntính trạng số con/lứa đẻ ở 5 giống lợn nội và một giống lợn ngoại)

Nguyễn Văn Cường và cs (2004); đã xác định gen liên quan đến tính trạng sốlượng con/lứa đẻ quan phân tích gen FSH ở 5 giống lợn Việt Nam (Móng Cái,Mường Khương, Mẹo, Cỏ, Tạp Ná) và 2 giống lợn nhập ngoại vào Việt Nam(Landrace và Yorkshire) Kết quả phân tích đoạn gen FSH có kích thước khác nhauphụ thuộc vào sự có mặt hay không có transposon ở 1 hoặc cả 2 nhiễm sắc thể;trong các giống lợn nội tần suất kiểu gen TT (gen FSH có mang transposon - sốcon/lứa đẻ thấp) dao đọng từ 67% đến 96,7% (trung bình 86,7%), trong khi đó ở lợnngoại tỷ lệ này thấp hơn nhiều, dao động từ 12,5% đến 17,6% (trung bình 15%).Ngược lại tần suất kiểu gen NN (gen FSH không mang transposon - số con/lứa đẻcao) ở lợn nội trung bình 4% thấp hơn so với lợn ngoại, trung bình 78% Việc xácđịnh tần suất xuất hiện kiểu gen này ở các giống lợn nghiên cứu đã chỉ ra rằng: vớigiống lợn ngoại do quá trình chọn lọc nhân tạo nên kiểu gen cho số con/lứa đẻ thấp

đã bị thải loại, còn ở các giống lợn nội do hoàn toàn chăn nuôi tự nhiên nên kiểu genliên quan đến tính trạng đó còn khá cao Vì vậy ở các giống lợn nội nếu tiến hànhchọn lọc có định hướng sẽ nâng cao được năng suất sinh sản và số con/lứa đẻ [8] Một số đặc điểm di truyền của một số chỉ tiêu sinh lý, sinh hoá có liên quan đến khảnăng kháng bệnh của lợn nội (Móng Cái) và lợn ngoại (Landrace và Yorkshire) nuôi ởViệt Nam đã được đề cập đến trong công trình nghiên cứu của Văn Lệ Hằng và cs(1998) Kết quả nghiên cứu cho thấy giống lợn nội có khả năng kháng bệnh do thíchnghi với điều kiện khí hậu nhiệt đới tốt hơn so với 2 giống lợn ngoại nói trên [13]

Nhữ Văn Thụ (2004) phân tích 10 chỉ thị phân tử RADP trên 2 giống lợn nội ỉ vàMóng Cái Kết quả phân tích cho thấy, phản ứng RADP thành công với hầu hết các cặpmồi (trừ OPC3 và OPC7) Tuy kết quả bước đầu mới chỉ dừng lại ở sự khảo sát, cha có

xử lý thống kê sự đa hình giữa các giống lợn nghiên cứu song cũng chỉ ra giá trị của cácchỉ thị RADP trong việc nhận dạng giống vật nuôi [31]

Nguyễn Thị Diệu Thuý và cs (2004) cũng đã tiến hành phân tích đa hình gen

GH (Growth Hormone) trên 2 giống lợn ngoại (Landrace và Yorkshire) và giốnglợn nội Móng Cái; kết quả đã xác định được gen GH có tần số xuất hiện là rất khácnhau giữa các giống lợn ngoại và giống lợn nội [32]

Nguyễn Vân Anh (2005) [2] đã nghiên cứu đa hình di truyền gen hormonesinh trưởng - GH (có kích thước 605 bp), Myogenin - MYOG (vùng 3’ có kíchthước 134 bp và vùng 5’ có kích thước 353 bp) và mối tương quan với khả năngtăng trọng ở lợn Móng Cái Bằng phương pháp PCR-RFLP, kết quả xác định được

sự có mặt của alen C2 có liên quan đến mức độ tăng trọng trung bình của lợn MóngCái với độ chính xác 97,5% Đồng thời trong nghiên cứu của mình tác giả đã xácđịnh rằng ở kiểu gen MYOG, sự có mặt hay không của kiểu gen AA và BB khôngbiểu hiện sự sai khác rõ rệt về tốc độ tăng trọng trung bình của lợn Móng Cái

Nguyễn Thu Thuý (2005) [34] đã phân tích đa hình gen H-FABP (Heart Acid Binding Protein) và gen Ryr-1 Ryanodine Receptor-1 ở một số giống lợ nViệt Nam Kết quả đã xác định được trình tự đoạn gen H-FABP (816bp) của 5giống lợn Cỏ, Mẹo, Móng Cái, Mường Khương, Tạp Ná; phát hiện được 17 độtbiến gồm 3 đột biến thêm nucleotide và 14 đột biến thay thế (5 đột biến C/T, 3 độtbiến T/C, 2 đột biến A/G, 1 đột biến C/G, G/A, G/T, G/C) trên trình tự gen H-FABP

Fatty-ở các giống lợn Việt Nam Đồng thời, tác giả cũng đã xác định được trình tự genRYR-1 ở 5 giống lợn nói trên và phát hiện được 6 điểm đột biến thay thế nucleotide

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU2.1 Đối tượng và vật liệu nghiên cứu

Nghiên cứu được tiến hành trên tổng số 15 con lợn nái lai F1 (Đực rừng TháiLan x nái địa phương Pác Nặm) sinh sản từ lứa 1-3

Các mẫu mô tai sử dụng trong phân tích gene được thu từ những lợn nái nuôi tạiTrại chăn nuôi động vật xã Tức Tranh, huyện Phú Lương, tỉnh Thái Nguyên

2.2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

2.2.1 Thời gian nghiên cứu

Đề tài được tiến hành từ 06 / 2010 đến 09/ 2011

2.2.2 Địa điểm nghiên cứu

- Trại chăn nuôi xã Tức Tranh, huyện Phú Lương, tỉnh Thái Nguyên

- Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ tế bào động vật - Viện Công nghệsinh học Hà Nội

- Phòng thí nghiệm Bộ môn Sinh học phân tử - Viện Khoa học Sự sống - Đạihọc Nông Lâm Thái Nguyên

2.3 Nội dung nghiên cứu

- Nghiên cứu khả năng sinh sản của lợn lai F1 (đực rừng Thái lan x nái địaphương Pác Nặm)

- Nghiên cứu đa hình gen Prolactin và gen Properdine ở lợn lai F1 (đực rừngThái lan x nái địa phương Pác Nặm)

2.4 Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Phương pháp nghiên cứu khả năng sinh sản của lợn nái rừng lai

Thí nghiệm theo dõi trên đàn lợn nái lai F1 sinh ra từ công thức lai giữa lợnđực rừng Thái Lan x lợn nái địa phương Pác Nặm Các chỉ tiêu về khả năng sinhsản được so sánh với lợn địa phương Pác Nặm

Số lượng lợn nái lai 15 con, theo dõi qua ba lứa đẻ (1, 2 và 3) Khả năng sinh sảncủa lợn nái địa phương Pác Nặm dựa trên kết quả theo dõi trực tiếp nuôi tại trại Chănnuôi động vật hoang dã Tức Tranh

- Kỹ thuật chăm sóc, nuôi dưỡng đàn lợn nái:

Lợn nái chửa được chăm sóc và nuôi dưỡng theo chế độ riêng Nái chửa đượcnhốt vào chuồng hạn chế ra sân vận động, lợn vận động trước bữa ăn 30 phút, sau bữa

ăn lợn được nhốt vào chuồng ngay Chuồng trại luôn được dọn vệ sinh sạch sẽ Lợnđược nuôi theo khẩu phần để đảm bảo duy trì hoạt động, nuôi thai và tiết sữa nuôi con.Một ngày lợn được ăn 2 bữa vào gần trưa và chiều tối Thức ăn được nấu chín trộn vớirau xanh như chuối hoặc ngô hòa nước cho ăn Ngoài 2 bữa ăn chính lợn nái chửa đượccung cấp 1 bữa rau xanh/ngày khoảng từ 2 - 3kg

Trước khi lợn đẻ 3 - 5 ngày, chuồng lợn được sát trùng và cho đệm lót (rơm,

lá chuối khô…) vào chuồng làm ổ đẻ, trong thời gian này chế độ ăn tăng về chấtlượng giảm về số lượng tránh thức ăn chèn ép thai

Sau khi đẻ lợn đươc ăn theo chế độ riêng dựa vào khối lượng cơ thể và sốlượng con để lại nuôi để duy trì hoạt động và tiết sữa nuôi con

Sau khi cai sữa lợn được chăm sóc để hồi phục và chú ý theo dõi động dục

để phối giống sau đẻ

- Kỹ thuật chăm sóc đàn lợn con theo mẹ:

Lợn con sinh ra được lau khô cắt nanh, cát rốn, cho bú sữa đầu, mùa đôngthắp bóng điện sưởi ấm cho lợn con Chuồng nuôi luôn được vệ sinh sạch sẽ nhằmhạn chế bệnh cho lợn con nhất là bệnh lợn con phân trắng, lợn con được ra sân chơi

tự do có dào ngăn cách với bên ngoài Tập ăn cho lợn con từ 21 ngày tuổi, cân khốilượng lúc 21 ngày tuổi, 35 ngày tuổi và cai sữa (56 ngày tuổi) cân vào sáng sớm

Các chỉ tiêu theo dõi:

- Số con đẻ ra/lứa; số con đẻ ra còn sống/lứa; số con sống đến 21 ngày; sốcon sống đến cai sữa, tỷ lệ nuôi sống đến 21, cai sữa (56 ngày tuổi)

- Khối lượng sơ sinh, 21, 35 ngày tuổi và cai sữa

- Tiêu tốn và chi phí thức ăn/kg lợn con lúc cai sữa

2.4.2 Phương pháp nghiên cứu đa hình gen PRLR và gen Properdine

2.4.2.1 Hóa chất và thiết bị

Bảng 2.1 Danh mục các hoá chất sử dụng trong phân tích gene

2 Hỗn hợp: Phenlo; Chlorophorm;

4 EDTA (Ethylene diamine tetraacetic acid) Sigma

8 Chỉ thị DNA (100 bp), đệm tra mẫu Fermentas

9 Các thành phần phản ứng PCR (đệm PCR 10x,

Bảng 2.2 Các trang thiết bị và dụng cụ thí nghiệm

1 Cân phân tích Mettler Toledo, Thuỵ Điển

3 Hệ thống điện di DNA Bio - Rad, Mỹ

4 Hệ thống chụp ảnh tự động Pharmacia Biotech, Thuỵ Điển

2.4.2.2 Phương pháp tách chiết DNA

Việc thu mẫu được tiến hành như sau; mẫu mô được cắt bằng kìm bấm chuyêndụng ở góc tai Mỗi mẫu được cho vào ống nghiệm riêng có chứa cồn (ethanol)70%, sau đó đưa về phòng thí nghiệm và bảo quản 4oC cho đến khi tách DNA

DNA hệ gen được tách chiết theo phương pháp của Ausubel và cs (1995) gồmcác bước như cơ bản như sau:

Bước 1:

- Cân 20mg mẫu mô tai lợn để khô cồn ở nhiệt độ phòng, thấm khô bằng giấy

- Dùng Nito lỏng nghiền mẫu thành dạng bột mịn

- Cho 500 µl dung dịch phá màng (cho làm 2 lần, mỗi lần 250 µl )

- Hút dịch vào ống efpendof 1,5ml

Bước 2:

- Cho 2,5 µl Protein k (20 mg/ml) ủ qua đêm ở 560C

- Cho 2 µl Rnase (100mg/ml) ủ trong 60ph ở 370C

- Cho 500 µl CH3COONH4 7,5M để trong 60 ph ở - 200 C

- Ly tâm 13000 v/ph trong 30ph ở 40C Thu dịch nổi (lặp lại 2 lần)

Bước 3:

- Cho cồn tuyệt đối vào với tỷ lệ 2:1 để trong 2 tiếng ở - 200C (hoặc qua đêm)

- Ly tâm 13000v/ph trong 30ph ở 40C, thu tủa

Rửa tủa:

- Dùng 500µl cồn 700 cho vào ly tâm 13000v/ph trong 10 - 15 ph ở 40C

( lặp lại 2 lần)

- Để khô cồn trong không khí ở nhiệt độ phòng

- Hòa tan tủa bằng 100µl TE, bảo quản ở 40C

- Điện di kiểm tra sự có mặt của AND tổng số trên gel agarose 1% sau đó soi gel

Điện di trên gel agarose

DNA sau khi được tách chiết, chạy phản ứng PCR và cắt bằng enzym giới hạn đềuđược phân tích định tính bằng phương pháp điện di trên gel agarose