Động học dập tắt huỳnh quang của a glucosidase bằng genistein

Phân tích phổ huỳnh quang của α-glucosidase cho thấy rằng genistein dập tắt huỳnh quang của α-glucosidase thông qua hai cơ chế: Dập tắt huỳnh quang động và dập tắt huỳnh quang tĩnh trong

S K L 0 0 8 8 5 4

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KỸ THUẬT TP HỒ CHÍ MINH

KHOA CÔNG NGHỆ HÓA HỌC VÀ THỰC PHẨM

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ HÓA HỌC

−−−−−−−−−−

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

Tp Hồ Chí Minh, ngày 05 tháng 08 năm 2022

ĐỘNG HỌC DẬP TẮT HUỲNH QUANG CỦA α-GLUCOSIDASE BẰNG GENISTEIN

1 Nguyễn Thị Mỹ Duyên 18128012

GVHD: TS Hồ Phương

i

TÓM TẮT

Trong nghiên cứu này, hoạt tính kháng α-glucosidase của genistein đã được khảo sát Genistein ức chế α-glucosidase với IC50 = 7,79 μM Phân tích phổ huỳnh quang của α-glucosidase cho thấy rằng genistein dập tắt huỳnh quang của α-glucosidase thông qua hai cơ chế: Dập tắt huỳnh quang động và dập tắt huỳnh quang tĩnh trong đó dập tắt huỳnh quang tĩnh chiếm ưu thế, nghĩa là tạo phức α-glucosidase – genistein ở trạng thái nền Quá trình dập tắt huỳnh quang này có hằng số dập tắt huỳnh quang lưỡng phân tử

là kq = 4,04 × 1013 M-1s-1 genistein liên kết với α-glucosidase với hằng số kết hợp là Ka

là 3,38×105 M-1 Để nghiên cứu cơ chế tương tác giữa genistein và α-glucosidase, phổ huỳnh quang của phức chất α-glucosidase với 8-anilino-1-naphthalene sulfonic acid (ANS) đã được khảo sát khi có và không có genistein Kết quả thu được là cường độ huỳnh quang của phức chất này giảm khi tăng nồng độ của genistein Điều này cho thấy rằng genistein tương tác kỵ nước với α-glucosidase Ngoài ra, kết quả nghiên cứu động học enzyme cho thấy rằng genistein là chất ức chế không cạnh tranh đối với α-glucosidase

Xin gửi lời cảm ơn đến các bạn sinh viên lớp Công nghệ kỹ thuật hóa học ở 3 chuyên ngành hữu cơ, vô cơ, polyme đã luôn đồng hành, hỗ trợ nhóm trong suốt quá trình thực hiện luận văn

Quá trình thực hiện luận văn tốt nghiệp có hạn và kiến thức chuyên ngành, kỹ năng chưa thành thạo nên không thể không tránh khỏi những thiếu sót trong quá trình nghiên cứu

và báo cáo đề tài Vì vậy, xin mong nhận được sự đóng góp ý kiến từ quý Thầy Cô để luận văn của nhóm được hoàn thiện nhất

Xin trân trọng cảm ơn

iii

LỜI CAM ĐOAN

Chúng tôi xin cam đoan luận văn tốt nghiệp là Công trình nghiên cứu của riêng cá nhân nhóm được thực hiện dưới sự cố vấn của Cô Hồ Phương và Thầy Hoàng Minh Hảo Luận văn hoàn toàn không sao chép của bất kỳ ai, tất cả dữ liệu điều do nhóm tự nghiên cứu, đọc, dịch tài liệu, tổng hợp, suy luận và làm thực nghiệm có được Nội dung lý thuyết trong luận văn nhóm có sử dụng một số tài liệu tham khảo như đã trình bày một cách đầy đủ Kết quả của đề tài là trung thực và chưa được công bố ở bất kỳ công trình nào khác

Thành phố Hồ Chí Minh, ngày… Tháng 08 năm 2022

Sinh viên thực hiện

Nguyễn Thành Duy

Sinh viên thực hiện

Nguyễn Thị Mỹ Duyên

iv

MỤC LỤC

TÓM TẮT i

LỜI CẢM ƠN ii

LỜI CAM ĐOAN iii

MỤC LỤC iv

DANH MỤC HÌNH ẢNH vi

DANH MỤC BẢNG viii

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT ix

MỞ ĐẦU 1

Lý do chọn đề tài: 1

Mục tiêu nghiên cứu: 1

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu: 2

Phương pháp nghiên cứu: 2

Cấu trúc luận văn: Luận văn gồm 3 chương 2

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3

1.1 Genistein 3

1.2 Hiện tượng dập tắt huỳnh quang 3

1.3 Sai lệch khỏi phương trình Stern-Volmer 6

1.4 Hiện tượng phát huỳnh quang của enzyme hoặc protein: 7

1.5 Phức chất phát huỳnh quang giữa enzyme và ANS (8-anilinonaphthalene-1-sulfonic acid) 8

1.6 Động học Enzyme 9

CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM 14

2.1 Nguyên liệu, hóa chất, dụng cụ và thiết bị nghiên cứu: 14

2.1.1 Nguyên liệu, hóa chất: 14

v

2.1.2 Dụng cụ và thiết bị: 14

2.2 Thực nghiệm: 15

2.2.1 Quá trình dập tắt huỳnh quang của tryptophan bởi genistein 15

2.2.2 Quá trình dập tắt huỳnh quang của α-glucosidase bởi genistein 16

2.2.3 Quá trình dập tắt huỳnh quang của phức α-glucosidase - ANS bởi genistein 17 2.2.4 Khảo sát IC50 của genistein có tác dụng ức chế α-glucosidase 19

2.2.5 Xác định cơ chế phản ứng giữa α-glucosidase và genistein: 22

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 24

3.1 Quá trình dập tắt huỳnh quang của tryptophan bởi genistein 24

3.2 Hoạt tính của genistein đối với -glucosidase 24

3.3 Quá trình dập tắt huỳnh quang của -glucosidase bởi genistein 25

3.4 Tương tác liên kết kỵ nước giữa -glucosidase và genistein 27

3.4.1 Phổ phát xạ của phức chất enzyme – ANS 27

3.4.2 Tương tác liên kết kỵ nước của -glucosidase và genistein 28

3.5 Phân loại ức chế giữa genistein và -glucosidase 29

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 31

Kết luận 31

Kiến nghị 31

DANH MỤC CÁC TÀI LIỆU THAM KHẢO 32

PHỤ LỤC 34

vi

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1 1: Cấu trúc hóa học của genistein 3Hình 1 2: Hiện tượng dập tắt huỳnh quang 4Hình 1 3: Cấu trúc hóa học của tryptophan 7Hình 1 4: Cấu trúc hóa học của tyrosin 7Hình 1 5: Cấu trúc hóa học của phenylalanine 7Hình 1 6: Phổ hấp thụ (a) và phổ phát xạ (b) của tryptophan, tyrosin, phenylalanine 8Hình 1 7: Cấu trúc của ANS (8-anilinonaphthalene-1-sulfonic acid) 8Hình 1 8: Ức chế cạnh tranh 9Hình 1 9: Ức chế không cạnh tranh 10Hình 1 10: Đồ Thị Lineweaver−Burk 11Hình 1 11: Ức chế cạnh tranh 12Hình 1 12: Ức chế không cạnh tranh 12Hình 1 13: Ức chế vừa cạnh tranh vừa không cạnh tranh 13 Hình 3 1: Cường độ phát xạ của tryptophan khi có mặt của genistein ở các nồng độ khác nhau 24Hình 3 2: Phần trăm ức chế enzyme tại các nồng độ khác nhau của enzyme 25Hình 3 3: Cường độ phát huỳnh quang của -glucosidase khi có và không có genistein 26Hình 3 4: Đồ thị của phương trình Stern – Volmer (a) Đồ thị của phương trình (12) (b) 27Hình 3 5: Phổ phát xạ của phức chất enzyme – ANS 28

vii

Hình 3 6: Quang phổ huỳnh quang phức -glucosidase – ANS trong trường hợp không

có và có mặt của genistein 29Hình 3 7: Đồ thị Lineweaver – Burk Vận tốc phản ứng (v) 30

viii

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2 1: Dụng cụ và thiết bị: 15Bảng 2 2: Pha dãy nồng độ mẫu thử 16Bảng 2 3: Pha dãy nồng độ 17Bảng 2 4: Pha dãy nồng độ 18Bảng 2 5: Bố trí thí nghiệm trên dĩa 96 giếng 20Bảng 2 6: Pha mẫu chứng trắng từ mẫu Genistein 10µM và 100 µM 20

Bảng 2 7: Pha mẫu thử từ mẫu Genistein 10 µM và 100 µM 21

Bảng 2 8: Chuẩn bị mẫu đo cho nồng độ genistein 0 μM 22Bảng 2 9: Chuẩn bị mẫu đo cho nồng độ genistein 20 μM 23Bảng 2 10: Chuẩn bị mẫu đo cho nồng độ genistein 50 μM 23 Bảng 3 1: Giá trị IC50, các thông số động học ức chế và cơ chế ức chế -glucosidase của genistein 30

ix

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

ANS (C6H5NHC10H6SO3H): 8-anilino-1-naphthalene sulfonic acid

DMSO ((CH3)2SO): Dimethyl sulfoxide

PNPG (C12H15NO8): 4-Nitrophenyl α-D-glucopyranoside

PNP (C6H5NO3): p-nitrophenol

Việc nghiên cứu ra cơ chế nhằm ức chế hoạt động của enzyme α-glucosidase là bài toán

mà các nhà nghiên cứu luôn nỗ lực để tìm ra câu trả lời thỏa đáng nhằm bào chế ra thuốc giúp hỗ trợ điều trị bệnh đái tháo đường Trong khoá luận này, nhóm tập trung nghiên cứu cơ chế dập tắt tryptophan trong enzyme α-glucosidase bởi genistein thông qua việc

đo phổ phát huỳnh quang florescences, cơ chế ức chế của phản ứng của enzyme glucosidase với chất nền 4-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside khi có mặt của genistein Đồng thời xác định IC50 của genistein và xác định loại liên kết tương tác trong quá trình phản ứng

α-Chính vì thế, nhóm đã chọn đề tài “Động học dập tắt huỳnh quang của α-glucosidase bằng genistein” để nghiên cứu

Mục tiêu nghiên cứu:

- Tìm hiểu tổng quan về khả năng phát huỳnh quang của tryptophan, genistein và glucosidase

α Khảo sát quá trình dập tắt huỳnh quang tryptophan bởi genistein

- Xác định động học dập tắt huỳnh quang giữa α-glucosidase và genistein

- Xác định cơ chế tương tác giữa α-glucosidase và genistein thông qua phổ phát huỳnh quang của phức chất α-glucosidase – ANS

- Xác định IC50 của genistein

- Xác định cơ chế ức chế α-glucosidase bởi genistein thông qua đồ thị Lineweaver – Burk

2

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

- Phổ phát huỳnh quang của tryptophan khi có mặt và không có mặt genistein

- Phổ phát huỳnh quang của α-glucosidase khi có mặt và không có mặt genistein

- Phổ hấp thụ của dung dịch gồm α-glucosidase, chất nền, genistein

Phương pháp nghiên cứu:

- Đo phổ phát huỳnh quang của tryptophan khi có mặt và không có mặt genistein

- Đo phổ phát huỳnh quang của α-glucosidase khi có mặt và không có mặt genistein

- Đo phổ hấp thụ của dung dịch gồm α-glucosidase, chất nền, genistein

Cấu trúc luận văn: Luận văn gồm 3 chương

Chương 1: Tổng quan

Chương 2: Thực nghiệm

Chương 3: Kết quả và thảo luận

3

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1 Genistein

Genistein [Hình 1.1.] có công thức phân tử là C15H10O5

(5,7-dihydroxy-3-(4-hydroxyphenyl)-4H-1-benzopyran-4-một) một hợp chất tự nhiên có cấu trúc thuộc nhóm

hợp chất isoflavone

Hình 1 1: Cấu trúc hóa học của genistein

Genistein là một isoflavone chính có trong đậu tương và một số loại thực vật như: cây lupin, đậu fava, đậu nành, sắn dây Các nghiên cứu gần đây cho thấy, genistein có tác dụng điều trị bệnh tiểu đường [1] [2] [3]

Bệnh tiểu đường là do nồng độ glucose trong máu tăng cao so với bình thường Glucose

là sản phẩm của quá trình thủy phân carbohydrate sẽ làm tăng nồng độ đường glucose trong máu Quá trình này được xúc tác bởi enzyme glucosidase Vì vậy, nếu enzyme này

bị ức chế sẽ làm giảm lượng đường glucose trong máu và đây được xem là một phương pháp điều trị bệnh tiểu đường

Thử nghiệm in vitro cho thấy genistein ức chế mạnh α-glucosidase Ngoài ra, cơ chế ức

chế α-glucosidase bởi genistein đã được công bố [4] Tuy nhiên, bản chất ức chế của genistein đối với α-glucosidase và động học của quá trình ức chế chưa được nghiên cứu đầy đủ Vì vậy, mục tiêu của luận văn là làm sáng tỏ thêm cơ chế và động học của quá trình ức chế α-glucosidase bởi genistein thông qua các phép đo phổ phát huỳnh quang

và động học enzyme

1.2 Hiện tượng dập tắt huỳnh quang

Khi chiếu xạ liên tục vào phân tử có khả năng phát huỳnh quang F Phân tử phát huỳnh quang sẽ chuyển từ trạng thái cơ bản (F) lên trạng thái kích thích (F*) [Hình 1.2] Từ

(Trong đó kt là tổng các hằng số tốc độ của các quá trình phi phát xạ)

Trong điều kiện kích thích liên tục thì tốc độ hình thành F* và tốc độ giảm hoạt F*→ F

là như nhau Nồng độ F* được xác định bởi phương trình (3):

[F*] = 𝐈𝐚

Trong đó: I a là tốc độ hình thành (F*)

Nếu trong dung dịch có phân tử dập tắt huỳnh quang Q thì ngoài hai quá trình phát xạ

và phi phát xạ để F* quay về trạng thái nền F thì F* có thể giảm hoạt thông qua quá trình dập tắt huỳnh quang lưỡng phân tử theo phương trình (4):

Hiệu suất lượng tử (tỷ số giữa tốc độ phát huỳnh quang F*→F và tốc độ hình thành F*)

khi không có Q được biểu diễn bởi phương trình (6):

𝑘f + 𝑘t là thời gian sống của F* khi không có Q

Phương trình (8) được gọi là phương trình Stern-Volmer và Ksv là hằng số Stern-Volmer

Hằng số Ksv là tỷ lệ của hằng số dập tắt lưỡng phân tử so với hằng số phân rã đơn phân

6

Trong cơ chế dập tắt huỳnh quang động học, giai đoạn quyết định tốc độ phản ứng là

giai đoạn hình thành phức chất trung gian [FQ]* với hằng số tốc độ kd (difusion controlled limit)

Đối với một chất dập tắt hiệu quả khi giá trị Ksv ≈ 102 - 103 M-1 và nếu τ ≈ 10-8 s, thì kq

≈ 1010 – 1011 M-1s-1 [5]

1.3 Sai lệch khỏi phương trình Stern-Volmer

Khi có mặt của chất dập tắt huỳnh quang Q thì quá trình dập tắt huỳnh quang F * bởi Q

có thể xảy ra theo hai cơ chế hoặc dập tắt huỳnh quang động (dynamic quenching) hoặc dập tắt huỳnh quang tĩnh (static quenching) hoặc cả hai [5] theo phương trình (11):

Cơ chế dập tắt huỳnh quang tĩnh: F và Q tương tác hình thành phức chất [FQ] ở trạng

thái nền Quá trình này không làm thay đổi thời gian sống của F*

Nếu có sự tham gia của quá trình dập tắt huỳnh quang tĩnh thì thông tin về quá trình tạo phức chất giữa F và Q được biểu diễn bằng phương trình (12) [6] [7]

hv

1.4 Hiện tượng phát huỳnh quang của enzyme hoặc protein:

Có 3 amino acid trong enzyme có khả năng phát huỳnh quang bao gồm: Tryptophan, tyrosin, phenylalanine [Hình 1.3; 1.4; 1.5]:

Hình 1 3: Cấu trúc hóa học của tryptophan

Hình 1 4: Cấu trúc hóa học của tyrosin

Hình 1 5: Cấu trúc hóa học của phenylalanine Nếu kích thích với bước sóng thích hợp sẽ thu được các phổ phát huỳnh quang của từng amino acid [Hình 1.6]:

8

Hình 1 6: Phổ hấp thụ (a) và phổ phát xạ (b) của tryptophan, tyrosin, phenylalanine

Như vậy nếu một chất ức chế có tương tác với enzyme, cụ thể là có tương tác với các amino acid này thì khi có hiện diện của chất ức chế cường độ phát huỳnh quang của enzyme sẽ thay đổi Dựa vào hiện tượng này có thể xác định động học của quá trình dập tắt huỳnh quang của enzyme bởi các chất ức chế

1.5 Phức chất phát huỳnh quang giữa enzyme và ANS sulfonic acid)

(8-anilinonaphthalene-1-ANS [Hình 1.7] có thể tạo phức với enzyme thông qua tương tác kỵ nước, phức chất này có thể phát huỳnh quang khi được kích thích ở bước sóng thích hợp [8] [9] Nếu một chất ức chế có tương tác với enzyme thông qua tương tác kỵ nước thì chất ức chế này có thể cạnh tranh việc tạo phức giữa ANS với enzyme hay nói cách khác cường độ phát huỳnh quang của phức [ANS – enzyme] sẽ giảm khi có mặt của chất ức chế Bằng phương pháp này có thể xác định loại liên kết của chất ức chế với enzyme

Hình 1 7: Cấu trúc của ANS (8-anilinonaphthalene-1-sulfonic acid)

Ức chế cạnh tranh (Competitive inhibition): Chất nền (substrate) sẽ liên kết với

khoang gắn kết của enzyme Tiếp theo enzyme sẽ xúc tác phản ứng và tạo ra sản phẩm Tuy nhiên, khi có mặt của chất ức chế (inhibitor) thì chất ức chế có thể liên kết vào cùng khoang gắn kết với chất nền Lúc này chất ức chế sẽ cạnh tranh với chất nền tại khoang gắn kết Chất ức chế này được gọi là chất ức chế cạnh tranh

10

Hình 1 9: Ức chế không cạnh tranh

Chất ức chế không cạnh tranh (Non-Competitive inhibition): Khi không có mặt chất

ức chế thì vai trò xúc tác của enzyme vẫn xảy ra bình thường, nghĩa là chất nền sẽ gắn kết vào khoang gắn kết trên enzyme Tuy nhiên, khi có mặt của chất ức chế và chất ức chế không gắn vào đúng khoang gắn kết của chất nền mà gắn vào một trí khác (khoang gắn kết khác) trên enzyme Điều này làm khoang gắn kết của chất nền bị thay đổi hình dạng và lúc này chất nền không thể gắn vào khoang gắn kết Chất ức chế này gọi là chất

ức chế không cạnh tranh

Chất ức chế không cạnh tranh (Un-Competitive inhibition): Chỉ liên kết với phức

hợp enzym-cơ chất chứ không liên kết với enzym tự do Liên kết cơ chất có thể gây ra

sự thay đổi cấu trúc xảy ra trong enzym và làm lộ ra vị trí liên kết chất ức chế hoặc chất

ức chế có thể liên kết trực tiếp với cơ chất liên kết với enzym Trong cả hai trường hợp, chất ức chế không cạnh tranh với cơ chất để có cùng vị trí liên kết, do đó không thể khắc phục sự ức chế bằng cách tăng nồng độ cơ chất Cả Km và Vmax đều thay đổi, nhưng một dạng động học đặc biệt xuất hiện trong các điều kiện trạng thái ổn định

Việc xác định cơ chế ức chế có thể dựa vào đồ thị Lineweaver-Burk thông qua phương trình (14) [10] [11] [12]