xx TÓM TẮT KHOÁ LUẬN Đề tài được thực hiện nhằm tận dụng nguồn phụ phẩm trong quy trình sản xuất trái cây sấy để lên men giấm theo phương pháp hồi lưu, cố định vi khuẩn trên giá thể.. K
TỔNG QUAN
Tổng quan về giấm
2.1.1 Sơ lược về lịch sử giấm
Từ giấm “vinaigre” bắt nguồn từ các từ “vin” và “aigre”, trong tiếng Pháp có nghĩa là
Giấm đã được biết đến từ khoảng 3000 B.C khi người Babylon sử dụng trái cây và nhựa cây chà là để sản xuất rượu, nhưng khi tiếp xúc với không khí, chúng đã chuyển thành giấm Cùng thời gian này, giấm cũng được tìm thấy trong các bình đựng của người Ai Cập Ngoài ra, giấm còn xuất hiện ở Trung Quốc vào khoảng 1200 B.C và ở Hy Lạp vào khoảng 400 B.C Kể từ khi phát hiện ra giấm, con người đã sử dụng nó cho mục đích ẩm thực như gia vị và chất bảo quản thực phẩm, cũng như trong y học để điều trị vết thương Người La Mã đã pha loãng giấm với nước để tạo ra đồ uống posca, phục vụ cho binh lính trong những cuộc hành quân dài ngày.
Vào năm 1723, Stahl đã chiết xuất acid acetic từ giấm, nhưng nguyên nhân hình thành vẫn chưa được xác định Đến năm 1778, Durande đã cô đặc giấm để tạo ra acid acetic băng, và vào năm 1814, Berzelius đã phân tích và giải thích sự hình thành acid acetic thông qua quá trình oxy hóa rượu Năm 1822, Persoon phát hiện ra vi khuẩn hiếu khí trong giấm và đặt tên là Mycoderma Năm 1823, Schutzenbach đã giới thiệu quy trình lên men giấm, cho phép sản xuất giấm chỉ trong 3 đến 7 ngày.
2.1.2 Các loại giấm phổ biến
Trên thị trường hiện nay, có nhiều loại giấm với thành phần và công dụng khác nhau, bao gồm giấm gạo (như giấm gạo lên men Ajinomoto, giấm gạo Meekong, giấm gạo Ottogi), giấm hoa quả (giấm táo Ottogi, giấm táo Organic Uchibori, giấm trái cây vị nho/lựu/thơm Petitzel) và giấm uống (giấm gạo Vtox của Ajinomoto, giấm gạo đen Orihiro, giấm vị rau củ Freshjoy) Giấm trái cây nổi bật với mùi thơm dịu nhẹ và độ chua vừa phải, có thể được sử dụng trực tiếp trong món ăn hoặc kết hợp với các nguyên liệu khác để tạo ra nước chấm, nước sốt chua ngọt, làm tăng hương vị cho món ăn.
Giấm thường được phân loại dựa trên nguồn nguyên liệu sản xuất, với nhiều loại giấm khác nhau có mặt trên thị trường như giấm lên men từ tinh bột, giấm từ trái cây và giấm từ rượu Dưới đây là một số loại giấm phổ biến hiện nay.
Bảng 2.1 Một số loại giấm phổ biến từ các nhóm nguyên liệu khác nhau (Suman Vikas
Giấm gạo (Rice wine vinegar)
Rượu được sản xuất từ gạo thông qua quá trình lên men, trong đó đường và tinh bột có trong gạo được chuyển hóa thành rượu Phương pháp này được phát minh bởi người Trung Quốc và đã trở nên phổ biến ở nhiều quốc gia châu Á.
Giấm mạch nha (Malt vinegar)
Lên men từ lúa mạch đã nghiền, có vị ngọt dịu, ít chua hơn giấm trắng và được sử dụng rộng rãi ở Anh
Có màu nâu, vị chua ngọt lên men từ nho Trebbiano (giống nho trắng thường được làm rượu vang trắng) và được ủ trong các thùng gỗ (Balsamic)…
Lên men từ quả táo tươi, có chứa ít nhất 4g acid acetic trong 100ml giấm ở 20℃ và được sử dụng rộng rãi ở Hoa Kỳ
Lên men từ nhựa cây dừa, có màu trắng đục, vị nhẹ hơn giấm táo, nồng độ acid thấp và được sủ dụng rộng rãi ở Thái Lan
Lên men từ mía, có vị ngọt nhẹ, đậm đà và được sử dụng rộng rãi ở Philippine
Giấm chưng cất (Distilled vinegar)
Loại giấm nguyên chất, thường không màu, chỉ nên sử dụng để muối chua
Giấm vang (Wine vinegar or Grape vinegar)
Lên men chua dịch rượu nho (rượu vang đỏ hoặc trắng), có hương vị đặc biệt, dịu và được sử dụng phổ biến ở vùng Nam và Trung Âu
Loại giấm không có bọt, lên men từ nho Chardonnay hoặc Pinot Noir
Một số loại giấm ăn phổ biến và được ưa chuộng tại Việt Nam bao gồm giấm Mekong, giấm hoa quả A Tuấn Khang, giấm gạo Ajinomoto, giấm táo Ottogi và giấm trắng Heinz.
Giấm trái cây nhập khẩu có giá cao, như giấm táo Heinz Mỹ (473mL) giá 61.900VNĐ, giấm nho đỏ Chatel Pháp (750mL) giá 75.000VNĐ, giấm lựu Daesang Hàn Quốc (500mL) giá 95.000VNĐ, và giấm táo Bragg Mỹ (273mL) giá 199.000VNĐ Tuy nhiên, sản phẩm giấm sạch và giấm hoa quả nội địa đang được ưa chuộng, như giấm vải của Công ty TNHH Thương mại Kim Ngân, sản xuất 20.000-30.000 lít/tháng và giúp tiêu thụ 50-60 tấn cùi vải mỗi năm, với giá từ 25.000VNĐ đến 35.000VNĐ/chai 450mL Công ty TNHH nông sản Cô Tâm cũng cung cấp giấm mơ trà xanh với sản lượng 1.000 chai/tháng, giá 32.000VNĐ/chai 420mL Giấm táo mèo Hoàng Liên của hợp tác xã Tiên Phong Mường Vi, sản xuất 10.000 lít/năm và được công nhận OCOP 3 sao, có giá 30.000VNĐ/chai 500mL.
Giấm trái cây sản xuất tại Việt Nam có chất lượng tương đương với giấm nhập khẩu nhưng giá thành rẻ hơn Hiện nay, nhiều công ty mới đang chú trọng vào việc sử dụng nguyên liệu trái cây tươi, trong khi chưa khai thác hiệu quả nguồn phụ phẩm từ quá trình chế biến trái cây để sản xuất giấm.
Giấm là nguyên liệu đa năng trong chế biến thực phẩm, có thể kết hợp với các gia vị khác để làm rau củ muối chua, nước xốt salad, và nước xốt ướp thức ăn Ngoài việc tăng hương vị, acid trong giấm còn giúp làm mềm thịt, hải sản và rau củ quả Hơn nữa, giấm là thành phần thiết yếu trong quy trình chế biến nhiều sản phẩm thực phẩm như phomai, tương ớt và mayonnaise.
Giấm có tác dụng ức chế vi sinh vật gây bệnh trên rau quả tươi, đặc biệt là khi áp dụng cho các mẫu cà rốt cắt lát có kích thước 2-5mm, được cấy vi khuẩn Salmonella typhimurium với mật độ 6 và 3 log cfu/g.
Ngâm cà rốt trong dung dịch giấm (4.03% acetic) và nước cốt chanh theo tỉ lệ 1:1 (v/v) trong 30 phút có khả năng ức chế hoàn toàn vi khuẩn S typhimurium (Sengun và Karapinar, 2004).
Giấm có tác dụng chống nhiễm trùng hiệu quả, được Hippocrates (460 - 377 B.C) khuyến nghị sử dụng để làm sạch và điều trị vết loét Ông cùng các cộng sự đã phát triển một loại thuốc gọi là “Oxymer”, kết hợp mật ong nguyên chất và giấm trắng theo tỉ lệ 4:1 để điều trị ho cấp tính Ngoài ra, giấm còn có thể được sử dụng để làm sạch và điều trị nấm móng.
Gần đây, các chuyên gia khuyên không nên sử dụng chế phẩm giấm để điều trị vết thương, mặc dù trước đây nó được sử dụng cho các tình trạng như tay, mụn cóc và nhiễm trùng tai Acid acetic, ở nồng độ không độc (≤ 0.0025%), không có hiệu quả trong việc ức chế các vi khuẩn như Escherichia coli, Enterococcus nhóm D và Bacteroides fragilis.
Các hợp chất polyphenol và vitamin trong giấm có tác dụng chống oxy hóa mạnh mẽ, giúp cải thiện sức khỏe Đặc biệt, acid chlorogenic trong giấm táo có khả năng ức chế quá trình oxy hóa LDL, từ đó ngăn ngừa các bệnh tim mạch.
Bảng 2.2 Các hợp chất phenolic có trong các loại gấm khác nhau (Budak, 2014)
Loại giấm Hợp chất phenolic
Giấm táo Acid gallic, catechin, epicatechin, acid chlorogenic, acid caffeic và acid p-coumaric
Giấm nho Acid gallic, catechin, epicatechin, acid chlorogenic, acid caffeic, acid syringic và acid ferulic
Sherry vinegar contains a variety of beneficial compounds, including gallic acid, protocatechuic acid, and protocatechualdehyde It is also rich in tyrosol, p-hydroxybenzoic acid, catechin, and p-hydroxybenzaldehyde Additionally, sherry vinegar features syringic acid, vanillin, caftaric acid, and both cis- and trans-p-coumaric acids Other notable components include fertaric acid, caffeic acid, and ferulic acid, contributing to its unique flavor and potential health benefits.
Tổng quan về vi khuẩn acid acetic trong qúa trình lên men giấm
Vi khuẩn acid acetic (AAB) được Beijerinck phát hiện lần đầu vào năm 1898 và được gọi là Acetobacter Đến năm 1934 - 1935, nhà khoa học Nhật Bản Asai đã phân loại AAB thành hai chi chính: Acetobacter aceti và Gluconobacter suboxydans.
Ngày nay, nhiều nhánh mới của AAB được các nhà khoa học tìm thấy, góp phần đa dạng cho chủng vi khuẩn acid acetic
Hình 2.1 Hình ảnh vi khuẩn acid acetic
(https://www.sciencephoto.com/media/79517/view) 2.2.1 Đặc điểm hình thái, sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn acetic
Vi khuẩn acid acetic là các tế bào Gram âm, không sinh bào tử, có hình dạng elip hoặc hình que Kích thước của chúng thay đổi từ 0.4 đến 1μm về đường kính và từ 0.8 đến 4.5μm về chiều dài.
AAB là loại vi sinh vật không di chuyển hoặc có thể di chuyển nhờ vào đơn mao hoặc chu mao, thường xuất hiện đơn lẻ, theo cặp hoặc trong chuỗi ngắn Chúng có khả năng thay đổi hình dạng tế bào linh hoạt, tùy thuộc vào điều kiện sinh trưởng, với các hình dạng như dạng sợi, dạng phình trương và hình chùy AAB thuộc nhóm vi sinh vật ưa ấm, có khả năng phát triển trong các khoảng nhiệt độ, pH và áp suất thẩm thấu khác nhau.
9 phát triển tối ưu của chúng là 25 - 30℃, giá trị pH tối ưu là 5.0 - 6.5, tuy nhiên chúng có thể phát triển ở các giá trí pH thấp hơn (Sengun, 2011)
AAB thuộc nhóm vi khuẩn hiếu khí bắt buộc trong lớp Alphaproteobacteria, bộ Rhodospirillales và họ Acetobacteraceae (Kersters, 2006) AAB có tốc độ sinh trưởng nhanh
Trong điều kiện môi trường được cung cấp oxy liên tục sau 12 giờ, từ một tế bào có thể tạo ra
17 triệu tế bào Trong quá trình sinh trưởng, AAB tạo thành acid acetic và nồng độ acid thấp sẽ kích thích sự phát triển của chúng (Nguyễn Đức Lượng, 2002)
2.2.2 Đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn acetic
AAB là vi sinh vật khó phân lập và nuôi cấy, do đó cần lựa chọn môi trường nuôi cấy phù hợp tùy thuộc vào từng loại AAB (Sengun, 2011) Để AAB sinh trưởng và phát triển, cần cung cấp đầy đủ nhu cầu dinh dưỡng, trong đó các nguồn cacbon chủ yếu bao gồm D-glucose, D-mannitol, và trong một số trường hợp, ethanol và acid acetic được thêm vào với nồng độ khác nhau Các nguồn nitơ cần thiết bao gồm peptone, chiết xuất nấm men, cùng với các loại muối và khoáng chất như Na2HPO4.
KH2PO4, MgSO4, (NH4)2HPO4, và (NH4)2SO4 là những hợp chất quan trọng trong nghiên cứu vi sinh vật (Spinosa, 2002) Để phân lập và nuôi cấy vi khuẩn axit acetic (AAB), một số môi trường thường được sử dụng bao gồm GYC agar (chứa 2% glucose, 1% cao nấm men, và 2% canxi carbonate), YGM (gồm cao nấm men, glucose, và mannitol), và RAE (bao gồm cao nấm men, glucose, và peptone).
The article discusses various nutrient formulations used in microbiological studies, including Na2HPO4.2H2O, citric acid, and water, along with different combinations such as YEPG/Mg, which consists of yeast extract, peptone, glucose, and magnesium ions; YEPE/Mg2+, containing yeast extract, peptone, magnesium ions, and ethanol; MAE, which includes yeast extract, peptone, glucose, and acetozym DS; and YGP, made up of yeast extract, glucose, and peptone, as referenced by Ndoye (2009) The focus is on the characteristics of bacterial colonies cultivated in these media.
Acetobacter aceti được nuôi cấy trong môi trường GYC có màu nhạt đến trắng, hình tròn, lồi, nhẵn với đường kính nhỏ hơn 3mm Loài vi khuẩn này phát triển tốt ở nhiệt độ từ 28 đến 35℃ và cho các phản ứng như catalase dương tính, oxidase âm tính, H2S âm tính và indol âm tính A aceti sử dụng các nguồn carbon như ethanol, glycerol và natri acetate, và chỉ phát triển trong môi trường có 20 – 25% D-glucose; không phát triển khi nồng độ glucose vượt quá 30% (Tahir Zahoor và cộng sự, 2006).
AAB has the ability to oxidize alcohols and sugars, accumulating significant amounts of corresponding oxidation products such as acetic acid from ethanol and gluconic acid, 2-ketogluconic acid, 5-ketogluconic acid, and 2,5-diketogluconic acid from glucose It can also oxidize lactate and acetic acid into CO2 and H2O Additionally, AAB produces exopolysaccharides, primarily cellulose, along with dextran, acetan, xylan, and other polysaccharides, particularly levans They also generate soluble pigments in their growth environment (Sengun, 2017).
2.2.3 Cơ chế lên men giấm
Dựa vào nhóm nguồn gốc nguyên liệu mà quá trình lên men giấm trải qua các giai đoạn khác nhau:
1 Giấm lên men từ tinh bột
Nguyên liệu chứa tinh bột → đường → ethanol → acid acetic
2 Giấm lên men từ đường
Nguyên liệu chứa đường → ethanol → acid acetic
3 Giấm lên men từ rượu
Nguyên liệu chứa rượu → acid acetic
Dù bắt nguồn từ nguyên liệu nào, quy trình sản xuất giấm vẫn phải trải qua quá trình lên men acid acetic có phương trình tồng quát như sau:
Phản ứng giữa ethanol và oxy tạo ra axit acetic và nước, giải phóng 493 kJ năng lượng Theo nghiên cứu của Theo Raspor và Goranovic (2008), hàm lượng ethanol có ảnh hưởng lớn đến hoạt động của Acetobacter aceti (AAB) trong quá trình lên men Nồng độ ethanol ban đầu cao có thể làm giảm sức sống của AAB do tác dụng kháng khuẩn của ethanol, trong khi nồng độ ethanol thấp (0.1-0.2%) lại làm tăng nguy cơ bị oxy hóa Quá trình lên men axit acetic diễn ra trong tế bào vi khuẩn rất phức tạp và trải qua nhiều giai đoạn khác nhau.
1 Sự tạo thành acetaldehyde nhờ alcohol dehydrogenase
CH3CH2OH → CH3CHO + 2H + + 2e
2 Hydrate hóa acetaldehyde thành Aldehyde nhờ Alcohol Dehydrogenase
3 Sự tạo thành acid acetic nhờ Aldehyde Dehydrogenase
CH3CH(OH)2 → CH3COOH + 2H + + 2e
Các phương pháp lên men
2.3.1 Phương pháp lên men chậm
Phương pháp lên men chậm, hay còn gọi là phương pháp Orleans, ra đời vào năm 1670 tại vùng nho nổi tiếng của Pháp Quá trình này bắt đầu khi dịch vang nho được để trong thùng gỗ hở nắp, dẫn đến sự phát triển của màng vi sinh vật trên bề mặt và làm cho dịch trở nên chua Để sản xuất giấm, người ta sử dụng thùng gỗ đứng và thời gian lên men kéo dài khoảng 5 tuần Sau khi hoàn thành, giấm được lọc trong và thanh trùng để bảo quản lâu dài Trong quá trình lên men, vi khuẩn giấm phát triển và tạo thành màng vi sinh vật, nhưng màng này có thể bị hư hại khi có va chạm hoặc trong quá trình thao tác với sản phẩm.
Quá trình lên men diễn ra khi màng vi khuẩn mới hình thành trên bề mặt thoáng sau khi phá vỡ cấu trúc màng cũ Dụng cụ lên men đơn giản và dễ chế tạo, mang lại chất lượng giấm thơm ngon Tuy nhiên, thời gian lên men kéo dài, năng suất thấp và nồng độ acid trong giấm không cao Hơn nữa, thiết bị này khó có thể cơ khí hóa và tự động hóa (Suman và cộng sự, 2014).
2.3.2 Phương pháp lên men nhanh
Phương pháp lên men nhanh, hay còn gọi là phương pháp Đức, được phát hiện vào năm 1823 bởi Schiizenbachi, giúp giảm đáng kể thời gian lên men.
Nguyên tắc của phương pháp này là tạo bề mặt tiếp xúc lớn hơn giữa vi khuẩn
Acetobacter sử dụng không khí để oxy hóa rượu thông qua các chất mang như bọt biển, dăm bào, lõi ngô, bã mía và xơ mướp Thùng lên men thường được làm bằng gỗ, có chiều cao gấp đôi đường kính, kích thước khoảng từ 2.5 – 6m x 1.2 - 3m Dịch lên men được chuyển từ trên xuống, trong khi không khí được đưa vào từ dưới lên Thiết bị có thể hoạt động liên tục trong 20 – 30 năm Sau 3 - 7 ngày lên men, sản phẩm có thể được thu hoạch và bắt đầu một chu kỳ mới Ưu điểm của phương pháp này là thời gian lên men ngắn và giấm thu được có nồng độ cao.
Nhược điểm: Hiệu suất kinh tế chưa cao do thiết bị khá phức tạp, phải chọn vật liệu chất mang phù hợp
2.3.3 Phương pháp lên men chìm
Phương pháp lên men chìm, hay còn gọi là phương pháp sục khí, được phát hiện bởi Ebner và Hromatka vào năm 1955 Trong phương pháp này, không khí được sục qua dịch lên men, tạo thành một thể huyền phù với vi khuẩn Acetobacter và dịch lỏng trong các thiết bị lên men đặc biệt, nổi bật là Axetator-Frings của Tây Đức Quá trình lên men có thể thực hiện theo mẻ, bán liên tục hoặc liên tục, với sản phẩm được thu hồi hoàn toàn sau khi lên men theo mẻ Đối với lên men bán liên tục, 2/3 giấm thành phẩm được lấy ra và bổ sung cơ chất, cho phép tạo ra 11-12% acid acetic Trong khi đó, lên men liên tục thu được 8-9% acid acetic sau 48 giờ Ưu điểm của phương pháp này bao gồm thời gian lên men nhanh, hiệu suất cao (90-95%), và thiết bị nhỏ gọn với khả năng tự động hóa cao.
Nhược điểm: Thiết bị phức tạp và tính ổn định không cao Yêu cầu về việc cung cấp oxy rất phức tạp
2.3.4 Phương pháp lên men kết hợp Đây là phương pháp kết hợp giữa phương pháp nhanh và chìm Thiết bị lên men theo phương pháp này gồm 2 phần:
Thùng lên men được thiết kế theo phương pháp nhanh nhằm tối ưu hóa bề mặt tiếp xúc giữa vi khuẩn acetic và không khí, giúp oxy hóa rượu hiệu quả Trong thiết bị này, dịch lên men được chuyển từ trên xuống, thấm qua giá đỡ chứa chất mang và được tuần hoàn nhiều lần nhờ hệ thống ống dẫn và máy bơm trong thùng chứa dịch lên men.
Thùng chứa dịch lên men được trang bị máy bơm, cho phép dịch lên men được bơm trở lại thùng qua ống dẫn, tưới đều lên các giá đỡ Hệ thống này còn có ống dẫn hồi lưu kết nối với thiết bị sục khí, cung cấp oxy để tăng tốc quá trình lên men Phương pháp này kết hợp ưu điểm của cả hai phương pháp nhanh và chìm, mang lại hiệu quả cao trong quá trình sản xuất.
Khi hệ thống lên men hoạt động, việc ngừng cung cấp điện không ảnh hưởng đến vi khuẩn, vì các van thông khí bên trong thiết bị mở ra cho phép không khí vào qua sự thông khí tự nhiên Điều này giúp màng vi khuẩn trên đệm không bị chết, tuy nhiên, phần dưới của máy vẫn phụ thuộc vào nguồn điện để cung cấp oxy cho vi khuẩn hoạt động.
Nhược điểm: Thiết bị yêu cầu phức tạp, cồng kềnh Giống vi khuẩn sử dụng phải phù hợp cả 2 phương pháp (Nguyễn Trương Bảo Trân, 2007).
Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men giấm
Trong nội dung này, chúng tôi sẽ đề cập tới các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình lên men giấm từ rượu thành acetic
2.4.1 Ảnh hưởng của hàm lượng ethanol trong dịch lên men giấm
Nồng độ ethanol tối ưu cho sự phát triển của vi khuẩn acetic là từ 6 - 7% (v/v) hoặc 9 - 14% (v/v), tùy thuộc vào loại vi khuẩn AAB (Vũ Thị Hồng, 2000) Trong các thí nghiệm nuôi cấy không liên tục, tốc độ phát triển của vi sinh vật tăng từ 0.13 đến 0.21 h\(^{-1}\) khi nồng độ ethanol trong dịch nuôi cấy từ 0.5 đến 6 g/L (Nanba và cộng sự, 1984) Tuy nhiên, khi nồng độ ethanol tăng lên 40 g/L, sự phát triển và tốc độ sinh trưởng của vi khuẩn bị kìm hãm nghiêm trọng, và ở nồng độ 120 g/L, không có sự phát triển nào của vi khuẩn được ghi nhận.
Nghiên cứu của Drysdale & Fleet (1988) chỉ ra rằng nồng độ ethanol tối ưu trong môi trường lên men của vi khuẩn Acetobacter aceti là khoảng 13g/L Tuy nhiên, giá trị này còn phụ thuộc vào nồng độ của các hợp chất khác, đặc biệt là acid acetic, như được đề cập bởi Gómez và các cộng sự.
Sau quá trình lên men, vi khuẩn AAB có thể oxy hóa acid acetic để thu nhận năng lượng, dẫn đến việc giấm bị nhạt trong quá trình bảo quản Để ngăn chặn hiện tượng này, cần kiểm tra thường xuyên hàm lượng ethanol và dừng quá trình lên men khi hàm lượng ethanol giảm xuống còn 0.3 – 0.5%.
2.4.2 Ảnh hưởng của hàm lượng chất khô hòa tan trong dịch lên men giấm
Quá trình sản xuất giấm yêu cầu một lượng đường cần thiết cho sự phát triển của vi khuẩn, giúp tạo ra acid acetic Việc lên men acetic từ nguyên liệu chứa đường diễn ra qua hai giai đoạn, bắt đầu với quá trình lên men ethanol, trong đó đường được phân giải kỵ khí thành ethanol.
CO2 được sản xuất dưới tác dụng của nấm men, sau đó trải qua quá trình lên men acid acetic, trong đó ethanol bị oxy hóa thành acid acetic nhờ khuẩn acid acetic Ngoài ra, có thể bổ sung ethanol để chuyển hóa trực tiếp thành acetic trong một giai đoạn lên men Tuy nhiên, hàm lượng đường D-glucose quá cao (30%) trong dịch lên men có thể ngăn chặn và ức chế sự phát triển của vi khuẩn.
2.4.3 Ảnh hưởng của nguồn C, N, P và các nguyên tố vi lượng Để quá trình oxy hóa xảy ra nhanh, trong dịch lên men ngoài acid acetic, rượu ethanol, dung dịch lên men cần được bổ sung một số muối khoáng (NH4)2SO4, (NH4)2PO4, KH2PO4, MgSO4, CaHPO4, FeCl3…tùy theo nhu cầu cụ thể của từng loài; cũng có thêm vitamin và chất kích thích sinh trưởng như pepton, cao nấm men, cao thịt… (Vũ Thị Hồng, 2000)
Nghiên cứu về lên men giấm trái cọ cho thấy Acetobacter aceti có khả năng sinh acid acetic cao trong khoảng pH 4.5 - 6.5, với độ pH tối ưu cho sự phát triển của AAB từ 5.5 đến 6.3 Mặc dù vậy, vi khuẩn này vẫn có thể tồn tại ở pH thấp từ 3.0 đến 4.0, và một số chủng được phân lập từ môi trường sục khí chứa acetate có thể phát triển ở pH thấp hơn, từ 2.0 đến 2.2 Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng có ba nhóm chủng trong sản xuất giấm: acetophilic phát triển ở pH khoảng 3.5, acetophobic ở mức pH cao hơn 6.5, và acetotolerant có thể phát triển ở cả hai giá trị này.
2.4.5 Ảnh hưởng của nhiệt độ
Vi khuẩn Acetobacter thuộc nhóm ưa ấm, nhiệt độ thích hợp đối với chúng là từ 25 -
Nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển của vi khuẩn AAB là khoảng 30℃ (Holt và cộng sự, 1994) Một số loài AAB vẫn có thể hoạt động và phát triển chậm ở nhiệt độ thấp (10℃) (Joyeux và cộng sự, 1984) Tuy nhiên, khi nhiệt độ vượt quá 50℃, hoạt động của chúng sẽ bị ức chế, dẫn đến đình chỉ sự sinh sản và tăng tổn thất cho vi khuẩn, làm giảm hiệu suất quá trình lên men do sự bay hơi của acid acetic và rượu ethanol AAB có thể chết khi tiếp xúc với nhiệt độ 60℃ trong 10 phút (Epstein, 1940) Nhiệt độ tối ưu cho quá trình oxy hóa sẽ thay đổi tùy theo từng loài.
35℃ (De Ory và cộng sự, 1998) Nhưng trong sản xuất công nghiệp người ta dùng những loài AAB thích ứng cho quá trình oxy hoá là 30 - 40℃ (Vũ Thị Hồng, 2000).
Một số hiện tượng hư hỏng giấm
2.5.1 Giấm bị đục và giảm độ chua
Giấm sau khi lên men cần được lọc để loại bỏ màng cellulose do vi khuẩn tạo ra, cùng với các thành phần nguyên liệu như tinh bột và trái cây, nhằm hạn chế hiện tượng giấm bị đục.
Trong sản xuất giấm, thường xảy ra hai quá trình oxy hóa: oxy hóa C2H5OH thành
CH3COOH và oxy hóa CH3COOH thành CO2 và H2O
Quá trình oxy hóa C2H5OH thành CH3COOH mang lại lợi ích cho sản xuất, trong khi oxy hóa CH3COOH thành CO2 và H2O lại gây hại Oxy hóa có thể diễn ra theo hai hướng: oxy hóa hóa học và oxy hóa sinh học, trong đó oxy hóa sinh học chuyển CH3COOH thành CO2 và H2O Các loài như Candida mycoderma, Acetobacter xylinum và Acetobacter aceti có khả năng thực hiện quá trình này Để khắc phục tình trạng oxy hóa không mong muốn, cần thực hiện lên men lại và vệ sinh thiết bị lên men sạch sẽ hoặc thanh trùng ở nhiệt độ 60-70℃ Ngoài ra, việc thêm K2S2O5 với liều lượng 5-15 gram/100 lít giấm kết hợp với thanh trùng Pasteur cũng giúp tăng độ bền của giấm.
Lươn giấm (Angiullula aceti) là một tác nhân gây hư hại phổ biến trong sản xuất giấm, có hình dạng giống giun tròn, màu hồng và có thể nhìn thấy bằng kính lúp Kích thước của con đực trưởng thành khoảng 1mm, trong khi con cái trưởng thành có kích thước từ 1-2mm Chúng sinh sản và phát triển mạnh ở nồng độ giấm thấp dưới 6%, nhưng bị ức chế và không thể phát triển ở nồng độ acid cao trên 9%.
Lươn giấm sử dụng vi khuẩn acetic làm nguồn dinh dưỡng và có khả năng phát triển nhờ vào C2H5OH, CH3COOH, đường, và các chất hữu cơ chứa nitơ Mặc dù chúng thường không độc hại cho con người, nhưng khi có số lượng lớn, chúng có thể làm vỡ màng giấm, gây đục giấm và giảm hiệu suất lên men Để ngăn chặn sự phát triển của lươn giấm, người ta thường thêm 1 - 2% NaCl vào giấm thành phẩm Sau 1 - 2 ngày, lươn giấm sẽ chết, và cần lọc hoặc đun giấm ở nhiệt độ 40 - 50℃ để loại bỏ chúng.
2.5.3 Ruồi giấm Ở những cơ sở sản xuất giấm có rất nhiều ruồi giấm Ruồi giấm có màu nâu đỏ, kích thước khoảng 2.5 - 3mm Ruồi giấm thường phát triển ở phần trên, phần dưới của thiết bị lên men Chúng làm giảm acid acetic, sinh ra những ấu trùng và thường là vật trung gian lây nhiễm các vi sinh vật gây hại giấm Do đó cần phải hạn chế sự xuất hiện ruồi giấm bằng cách che kín cửa, đậy kín các phần hở của thiết bị lên men và vệ sinh khu sản xuất (Nguyễn Đức Lượng, 1996; Lương Đức Phẩm, 1998)
Trong sản xuất giấm, có hai loại bọ giấm phổ biến: loại lớn màu trắng với kích thước từ 0.8 đến 1.5mm và loại nhỏ màu nâu kích thước từ 0.3 đến 0.4mm Khi phát hiện nhiều bọ giấm trong thiết bị lên men, cần sử dụng hơi nóng để tiêu diệt chúng.
Các nghiên cứu liên quan đến đề tài
Từ 15 chủng vi khuẩn acetic đang lưu trữ tại Viện Nghiên cứu và Phát triển Công Nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ, đã tuyển chọn được chủng VL2 có khả năng sinh acid tốt (hàm lượng aicd đạt 3.20% (w/v) sau 4 ngày lên men và định danh 16S thuộc loài Acetobacter senegalensis Sử dụng VL2 để nghiên cứu quá trình lên men acetic từ dịch sơ ri với 2 giai đoạn (lên men ethanol rồi tiếp tục lên men acetic) Dịch sơ ri có nồng độ chất khô là 10 o Bx, pH 5 được lên men bằng Sac.cerevisiae mật độ 10 7 tế bào/ml và A senegarlensis mật độ 10 5 tế bào/mL thu được sản phẩm giấm sơ ri có hàm lượng acid đạt acetic 6.99% sau 8 ngày lên men ở 28 – 32℃ (Trịnh Nguyệt Trân và cộng sự, 2007)
Theo khảo sát điều kiện lên men giấm dứa bằng chủng Acetobacter senegalensis mật độ
Dứa được sơ chế và ép lấy nước cốt, sau đó pha loãng với tỉ lệ 1 dứa:3 nước Nồng độ đường được điều chỉnh lên 10g/L và bổ sung 8% ethanol (v/v), cùng với việc điều chỉnh pH về 5 Quá trình lên men diễn ra ở nhiệt độ phòng (28-32℃) trong 8 ngày, cho ra hàm lượng acid acetic cao nhất đạt 3.74%.
16 quan sát thấy giấm dứa không giữ được màu sắc ban dầu, do chủng Acetobacter senegalensis trong quá trình lên men nên tạo vẩn đục (Đỗ Thị Hiền, 2018)
Chuối già chín (Musa acuminata Colla cv.) được sử dụng để sản xuất giấm qua quy trình lên men Nguyên liệu được sơ chế, chần ở 70℃ trong 5 phút, sau đó xay nhuyễn và điều chỉnh pH về 4.5 Enzyme Pactinex Ultra SPL được thêm vào hỗn hợp chuối, tiếp theo là lọc dịch quả và điều chỉnh nồng độ lên men đạt 18 o Bx Quá trình lên men rượu diễn ra với Saccharomyces cerevisiae trong 8 ngày, sau đó nồng độ ethanol được điều chỉnh xuống 5% và tiếp tục lên men giấm bằng Acetobacter aceti ATTC 15975 với mật độ 10^5 tế bào/ml theo phương pháp lên men chậm Kết quả cho thấy sau 6 tuần lên men ở 37℃, nồng độ axit acetic đạt 4%, mang lại hương vị thơm ngon cho giấm chuối (Nguyễn Thị Mai Hiền, Nguyễn Minh Thuỷ, 2014).
Nước mía được sử dụng để sản xuất giấm thông qua quy trình lên men rượu kéo dài từ 9 đến 20 ngày, tiếp theo là lên men acetic ở nhiệt độ phòng trong 15 đến 21 ngày với vi khuẩn acetic Kết quả thu được là giấm có hàm lượng acid tổng đạt 3.04% (w/v), trong đó chứa 8.16 – 13.65 mg/g acid acetic Giấm mía đường có màu vàng nâu và hương thơm nhẹ nhàng của rượu và mía Ngoài ra, lựu, táo và gạo cũng là những nguyên liệu có thể lên men để tạo ra giấm với hàm lượng acetic lớn hơn 6%.
NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGUYÊN CỨU
Nguyên liệu, hóa chất, dụng cụ
Vi khuẩn Acetobacter aceti được cung cấp bởi phòng thí nghiệm Vi sinh thực phẩm thuộc bộ môn Vi sinh và phát triển sản phẩm, khoa Công nghệ Hóa học và Thực phẩm, trường Đại học Nông Lâm, TP HCM.
Nguyên liệu lên men được cung cấp bởi Công ty TNHH Lê Trung Thiên, bao gồm dịch đường ngâm thơm - một phụ phẩm từ quá trình chế biến thơm sấy dẻo Địa chỉ công ty là 450 Nguyễn Xiển, Phường Long Thành Mỹ, TP Thủ Đức, TP HCM.
Chất mang: Xơ mướp được xử lý bằng cách hấp tiệt trùng trong nồi autoclave ở 121℃, 1atm trong 15 phút
3.1.2 Hóa chất sử dụng trong đề tài
Bảng 3.1 Hóa chất sử dụng trong đề tài
Tên hóa chất Nguồn gốc Mục đích
Trung Quốc Bổ sung dinh dưỡng vào môi trường nhân giống vi sinh vật
CH 3 COOH Trung Quốc Điều chỉnh pH dịch lên men
C 2 H 5 OH 96% v/v Việt Nam Bổ sung cồn cho môi trường lên men Ống chuẩn NaOH 0.1N
Việt Nam Chuẩn độ acid acetic
Hình 3.1 Tế bào Acetobacter aceti quan sát dưới kính hiển vi ở vật kính 100
Hóa chất mua tại cửa hàng hóa chất Hóa Nam Địa chỉ: 293/4, Lý Thường Kiệt, phường
3.1.3 Dụng cụ và thiết bị
Bảng 3.2 Dụng cụ và thiết bị sử dụng trong đề tài
Thiết bị và dụng cụ Mục đích
Hệ thống lên men hồi lưu, máy bơm Lên men giấm
Nồi Autoclaue (Hirayama HVE-50) Tiệt trùng
Tủ cấy vô trùng (Telstar AV-100) Cấy vi sinh vật
Máy lắc (Ika Ks 260 basic) Nhân giống vi sinh vật
Kính hiển vi 02 mắt (Revelation III) Quan sát vi khuẩn
Máy đo pH (Hanna HI991003) Đo pH
Khúc xạ kế (Atago Master T, thang đo 0 - 33% Brix) Đo ⁰Brix
Cân phân tích (Precisa LS 2200C) Cân hoá chất sử dụng
Một số dụng cụ thí nghiệm cơ bản (bình tam giác, pipet, ống đong, buret, erlen, đĩa petri, que cấy, đèn cồn…)
Nhân giống vi sinh vật
Địa điểm nghiên cứu
Đề tài được thực hiện tại:
Phòng thí nghiệm vi sinh, khoa Công nghệ Hóa học và Thực phẩm, trường Đại học Sư phạm kỹ thuật TP HCM
Phòng thí nghiệm Vi sinh thực phẩm thuộc Bộ môn Vi sinh và phát triển sản phẩm, Khoa Công nghệ Hóa học và Thực phẩm, Trường Đại học Nông Lâm TP HCM, chuyên nghiên cứu và phát triển các sản phẩm thực phẩm an toàn và chất lượng.
Quy trình sản xuất giấm thơm trong nghiên cứu
3.3.1 Sơ đồ quy trình sản xuất
Bước 1: Chuẩn bị môi trường
Dịch đường ngâm thơm là phụ phẩm của quá trình sản xuất thơm sấy của công ty TNHH
Lê Trung Thiên cho biết rằng phụ phẩm này có hàm lượng đường cao, vì vậy cần pha loãng đến độ Brix khảo sát Đồng thời, acid acetic sẽ được sử dụng để điều chỉnh pH trong khoảng 4.5 – 5.5, và bổ sung thêm (NH4)2SO4.
Nồng độ 8g/L (NH4)2HPO4 và 2g/L là phù hợp cho quá trình lên men giấm (Nguyễn Phú Thọ, 2018) Môi trường nhân giống vi khuẩn cần được khử trùng ở nhiệt độ 115℃ trong 10 phút, trong khi môi trường lên men được đun ở 85℃ trong 3 phút và sau đó để nguội.
Hình 3.2 Sơ đồ quy trình lên men giấm thơm
TN4: Ảnh hưởng của chế độ thanh trùng đến quá trình bảo quản giấm
Xác định một số thành phần hóa lý
Môi trường nhân giống Môi trường lên men Khử trùng
Lên men hồi lưu Lọc Đóng chai Thanh trùng
TN1,2,3: Ảnh hưởng của nồng độ ethanol, chất khô hòa tan, pH tới quá trình lên men giấm dứa
Nội dung nghiên cứu
Bước 2: Nhân giống vi khuẩn
Bổ sung vi khuẩn Acetobacter aceti vào erlen 250ml chứa môi trường nhân giống và nuôi cấy lắc 150 vòng/phút trong 2 - 4 ngày ở nhiệt độ phòng Tất cả dụng cụ sử dụng trong quá trình nhân giống đã được khử trùng, và thao tác nuôi cấy vi khuẩn được thực hiện trong tủ cấy vô trùng.
Xử lý chất mang xơ mướp bao gồm việc rửa sạch và hấp tiệt trùng ở nhiệt độ 121℃ trong 15 phút với áp suất 1 atm Sau khi để nguội, xơ mướp được ngâm trong dung dịch acid acetic 5% để điều chỉnh pH đạt mức tối ưu cho vi khuẩn Acetobacter aceti, sau đó xếp thành lớp mỏng trong bình lên men.
Cố định vi khuẩn vào chất mang bằng cách bổ sung 500ml dịch tăng sinh chứa vi khuẩn đã nhân giống với mật độ 10^7 tế bào/mL lên lớp xơ mướp trải đều trên giá đỡ.
Lên men acetic được thực hiện bằng cách sử dụng hệ thống hồi lưu có bơm, với tốc độ dòng chảy 1750L/giờ và 10 lít dịch lên men cho mỗi mẻ, ở nhiệt độ phòng Các yếu tố như nồng độ ethanol, nồng độ chất khô hòa tan và pH được khảo sát trong các thí nghiệm riêng biệt Sự thay đổi nồng độ acid acetic trong quá trình lên men được theo dõi thông qua phương pháp chuẩn độ acid bằng NaOH 0.1N với chỉ thị phenolphtalein.
Khi hàm lượng acetic đạt 4%, quá trình lên men kết thúc Sản phẩm được lọc bằng vải và đóng vào chai thủy tinh 250ml trước khi thanh trùng Thí nghiệm 4 được thực hiện để khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian thanh trùng, nhằm xác định chế độ thanh trùng phù hợp cho sản phẩm giấm thơm.
3.4 Nội dung nghiên cứu 3.4.1 Xác định thành phần hoá lý của dịch nước thơm
Nguyên liệu đã được gửi đến trung tâm kiểm nghiệm Eurofins Sắc Ký Hải Đăng tại Thành phố Hồ Chí Minh để phân tích các thành phần hóa lý của dịch đường ngâm thơm, bao gồm pH, độ Brix (⁰Bx), polyphenol và hàm lượng acid tổng.
3.4.2 Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của nồng độ ethanol tới quá trình lên men acid acetic bằng thiết bị hồi lưu a Mục đích
Thí nghiệm này nhằm nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ ethanol đến quá trình lên men, từ đó xác định nồng độ ethanol tối ưu cho quá trình này.
Thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên một yếu tố và ba lần lặp lại
NT1, NT2, NT3 ứng với dịch thơm lên men có bổ sung thêm nồng độ ethanol với tỷ lệ lần lượt 4%, 6%, 8%
Bảng 3.3 Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của nồng độ ethanol
Nghiệm thức Nồng độ ethanol bổ sung (% v/v)
NT 3 8 c Sơ đồ thí nghiệm d Cách thực hiện
Dịch đường ngâm thơm được pha loãng với nồng độ chất khô hòa tan 10 o Bx, bổ sung (NH4)2SO4 và (NH4)2HPO4, sau đó đun ở 85℃ trong 3 phút và để nguội về nhiệt độ phòng Tiếp theo, acid acetic được sử dụng để điều chỉnh pH của dịch lên men đạt 5, và ethanol 96% được bổ sung theo bảng 3.1 Dịch lên men từ ba nghiệm thức được đưa vào các hệ thống lên men hồi lưu đã chuẩn bị với chất mang chứa vi khuẩn Acetobater aceti, với đơn vị thí nghiệm là 10 lít dịch lên men cho mỗi mẻ.
Chỉ tiêu theo dõi: Hàm lượng acid acetic
Thời gian theo dõi mẫu: 1 lần/ngày trong 8 ngày lên men liên tục
Bổ sung cồn NT1, NT2, NT3
Lên men hồi lưu ở nhiệt độ phòng Xác định hàm lượng acid
Hình 3.3 Sơ đồ thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của nồng độ cồn
3.4.3 Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng nồng độ chất khô hoà tan tới quá trình lên men acid acetic bằng thiết bị hồi lưu a Mục đích
Thí nghiệm nhằm khảo sát ảnh hưởng của nồng độ chất khô hòa tan đến quá trình lên men, từ đó xác định giá trị o Brix phù hợp.
Thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên một yếu tố và ba lần lặp lại
NT1, NT2, NT3ứng với dịch thơm lên men được điều chỉnh nồng độ chất khô hòa tan lần lượt là 8, 10, 12 ( o Bx)
Bảng 3.4 Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của nồng độ chất khô hòa tan
Nghiệm thức Nồng độ chất khô hòa tan ( o Brix)
NT 3 12 c Sơ đồ thí nghiệm d Cách thực hiện
Dịch đường ngâm thơm được pha loãng theo nồng độ chất khô như bảng 3.2, điều chỉnh pH về 5, và bổ sung ethanol 96% vào dịch lên men dựa trên kết quả thí nghiệm 1 Cách tiến hành thí nghiệm được thực hiện tương tự như ở thí nghiệm 1.
Phối trộn Điều chỉnh độ Brix NT1, NT2, NT3
Lên men hồi lưu ở nhiệt độ phòng Xác định hàm lượng acid
Hình 3.4 Sơ đồ thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng nồng độ chất khô hoà tan
23 Đơn vị thí nghiệm: 10 lít dịch lên men/mẻ
Chỉ tiêu theo dõi: Hàm lượng acid acetic
Thời gian theo dõi mẫu: 1 lần/ngày trong 8 ngày lên men liên tục
3.4.4 Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của pH tới quá trình lên men acid acetic bằng thiết bị hồi lưu a Mục đích
Thí nghiệm được tiến hành để nghiên cứu ảnh hưởng của pH đến quá trình lên men, nhằm xác định giá trị pH tối ưu cho quá trình này Bố trí thí nghiệm được thiết kế một cách khoa học để thu thập dữ liệu chính xác.
Thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên một yếu tố và ba lần lặp lại
NT1, NT2, NT3 ứng với dịch thơm lên men được điều chỉnh pH lần lượt là 4.5, 50, 5.5
Bảng 3.5 Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của pH
NT 3 5.5 c Sơ đồ thí nghiệm
Phối trộn Điều chỉnh pH NT1, NT2, NT3
Lên men hồi lưu ở nhiệt độ phòng Xác định hàm lượng acid
Hình 3.5 Sơ đồ thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của pH
Dịch đường ngâm thơm được pha loãng với nồng độ chất tan đã được điều chỉnh theo kết quả thí nghiệm 2 pH của dịch cũng đã được điều chỉnh dựa trên khảo sát trong bảng 3.5 Ngoài ra, ethanol 96% đã được bổ sung vào dịch lên men theo kết quả thí nghiệm.
1) Cách tiến hành thí nghiệm tương tự như ở thí nghiệm 1 Đơn vị thí nghiệm: 10 lít dịch lên men/mẻ
Chỉ tiêu theo dõi: Hàm lượng acid acetic
Thời gian theo dõi mẫu: 1 lần/ngày trong 7 ngày lên men liên tục
3.4.5 Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng của chế độ thanh trùng tới chất lượng giấm thơm a Mục đích
Thí nghiệm nhằm khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian thanh trùng đến chất lượng giấm thành phẩm, từ đó xác định chế độ thanh trùng tối ưu cho sản phẩm giấm thơm.
Thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên hai yếu tố với ba lần lặp lại
Bảng 3.6 Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng chế độ thanh trùng
10 NT4 NT5 NT6 c Sơ đồ thí nghiệm
Giấm thơm Lọc Đóng chai Thanh trùng
Xác định hàm lượng acid acetic Quan sát các chỉ tiêu màu sắc, độ trong
Hình 3.6 Sơ đồ thí nghiệm khảo sát chế độ thanh trùng giấm thơm
Dịch đường ngâm thơm được pha loãng đến độ brix nhất định, sau đó bổ sung (NH4)2SO4 và (NH4)2HPO4, đun ở 85℃ trong 3 phút và để nguội về nhiệt độ phòng pH được điều chỉnh bằng acid acetic và bổ sung ethanol 96% Dịch lên men được đưa vào hệ thống lên men hồi lưu với chất mang xơ mướp đã cố định vi khuẩn Acetobater aceti, lên men ở nhiệt độ phòng cho đến khi hàm lượng acetic đạt 4% Sau quá trình lên men, sản phẩm được lọc, đóng chai thủy tinh 250ml và thanh trùng, sau đó làm nguội và bảo quản ở nhiệt độ phòng.
Chỉ tiêu theo dõi: Hàm lượng acid acetic và các chỉ tiêu cảm quan màu, mùi, độ trong của giấm thơm thành phẩm
Thời gian theo dõi mẫu: 45 ngày.
Phương pháp nghiên cứu
Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã chọn phương pháp lên men hồi lưu cố định vi sinh vật trên giá thể Thiết bị lên men hồi lưu bao gồm hai phần như đã nêu trong mục 2.3.4.
Hình 3.7 Sơ đồ thiết bị lên men hồi lưu
1: Bình chứa dịch lên men
2: Bình chứa chất mang và vi khuẩn Acetobacter aceti
3: Ống dẫn dịch đi lên bình lên men
4: Ống dẫn dịch sau khi lên men xuống bình chứa dịch
5: Lưới đỡ giá thể xơ mướp
6: Giá thể chất mang (xơ mướp)
8: Vòi phân phối dịch lên men
9: Van thu hồi dịch sau lên men
Dịch đường ngâm thơm lên men được chuyển từ bình chứa (1) đến bình lên men (2) qua ống dẫn (3) kết nối với máy bơm (7) Dịch chảy từ từ và phân bố đều trên bề mặt giá thể nhờ vòi phân phối (8) Tại bình lên men, quá trình lên men giấm diễn ra khi dịch dứa đi qua các lớp giá thể (6) chứa vi khuẩn, trải qua hai giai đoạn: chuyển hóa đường thành rượu và oxy hóa rượu thành acid acetic Sau đó, dịch lên men quay trở lại bình chứa qua ống dẫn (4), tạo ra sự hồi lưu tuần hoàn Sản phẩm của quá trình lên men được thu hồi qua van (9).
3.5.2.1 Phương pháp xác định hàm lượng acid acetic
Theo TCVN 4589-88, hàm lượng acid tổng được xác định bằng phương pháp trung hòa, sử dụng NaOH 0.1N và chỉ thị phenolphtalein 0.1% Đối với giấm thơm, mẫu nước có màu nhạt, cần hút 5-10ml mẫu vào bình tam giác 100ml, thêm 20ml nước cất và 3 giọt phenolphtalein 0.1%, sau đó lắc đều Tiến hành chuẩn độ bằng NaOH 0.1N cho đến khi dung dịch chuyển sang màu hồng nhạt bền trong 30 giây, và ghi nhận thể tích NaOH đã sử dụng.
Hàm lượng acid tổng (quy về acid acetic) được tính bằng g/100ml theo công thức:
∑a: Hàm lượng acid tổng có trong mẫu giấm (g/100ml)
V: Thể tích NaOH 0.1N dùng để chuẩn độ mẫu dịch lên men (ml)
𝑉 ′ : Thể tích mẫu dịch lên men mang đi chuẩn độ (ml)
0.006: Hệ số của acid acetic
3.5.2.2 Phương pháp xác định hàm lượng polyphenol
Hàm lượng polyphenol được xác định qua phương pháp đo quang sau khi phản ứng với thuốc thử Folin-Ciocalteu Chúng tôi đã gửi mẫu phân tích đến trung tâm kiểm nghiệm Eurofins Sắc Ký Hải Đăng tại Thành phố Hồ Chí Minh.
3.5.3 Phương pháp xử lý số liệu thống kê
Dữ liệu thu thập từ các lần lặp lại thí nghiệm đã được xử lý thống kê thông qua phương pháp phân tích phương sai (ANOVA), cùng với việc tính toán giá trị độ lệch chuẩn và hệ số tương quan Các bảng biểu và đồ thị được tạo ra bằng phần mềm Minitab và Excel 2019.
KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
Kết quả xác định thành phần hoá lý của dịch đường ngâm thơm
Mẫu dịch đường ngâm thơm đã được phân tích thành phần hóa lý tại trung tâm Eurofins Sắc Ký Hải Đăng, Tp Hồ Chí Minh, và kết quả được trình bày trong bảng dưới đây.
Bảng 4.1 Kết quả xác định thành phần hoá lý của dịch thơm
Chỉ tiêu Đơn vị Phương pháp Kết quả pH TCVN 7806:2007 (ISO 1842:1991) 3.08
Hàm lượng acid tổng g/100 mL TCVN 4589:1988 0.98
Mẫu dịch đường ngâm thơm có độ Brix cao (29.6 o Brix), do đó cần pha loãng xuống các độ Brix khảo sát khi chuẩn bị dịch lên men Vì nguyên liệu chỉ là phụ phẩm từ quá trình chế biến thơm sấy với hàm lượng dinh dưỡng thấp, nên cần bổ sung các muối khoáng như (NH4)2HPO4 và (NH4)2SO4 để cung cấp các nguyên tố vi lượng như N, P, S, giúp vi khuẩn phát triển tốt hơn Các muối khoáng này sẽ làm tăng pH trong dịch lên men, vì vậy cần điều chỉnh lại pH bằng CH-.
Hàm lượng polyphenol trong nguyên liệu chỉ đạt 0.08 g/100mL (tương đương 80mg/100g), thấp hơn nhiều so với polyphenol trong vỏ quả thơm (652.8mg GAE/100g) và phần lõi quả thơm (1270.1mg GAE/100g) (Campos và ctv, 2020) Nghiên cứu của Eduardo Coelho và cộng sự (2017) cho thấy hàm lượng polyphenol không thay đổi trước và sau khi lên men giấm từ trái cây cô đặc như cam, xoài, sơ ri và chuối.
Ảnh hưởng của nồng độ ethanol tới quá trình lên men acid acetic bằng hệ thống lên
Dựa trên nguyên lý hoạt động của phương pháp lên men hồi lưu, chúng tôi đã thiết kế một hệ thống lên men đơn giản và tiết kiệm bằng các vật liệu dễ tìm Tất cả các vật liệu như bình nước, ống dẫn, giá đỡ và bơm đều được rửa sạch và khử trùng bằng ethanol Bình chứa dịch lên men có dung tích 21 lít, và trong quá trình thực hiện đề tài, chúng tôi đã lên men 10 lít cho mỗi mẻ.
Hình 4.1 Các hệ thống lên men hồi lưu sử dụng trong thí nghiệm
Ethanol là một cơ chất quan trọng trong quá trình lên men giấm, với hàm lượng tối ưu từ 6 – 15% (Nguyễn Đức Lượng và cộng sự, 2004) Nghiên cứu cho thấy, khi lên men giấm dừa, nồng độ ethanol 4% mang lại hàm lượng acetic cao nhất (Nguyễn Phú Thọ, 2018) Trong thí nghiệm 1, chúng tôi đã chọn các nồng độ ethanol 4, 6, và 8% v/v tương ứng với NT 1, NT 2, và NT 3 để khảo sát sự sinh ra của acid acetic Kết quả về ảnh hưởng của nồng độ ethanol đến quá trình lên men acid acetic được trình bày trong Bảng 4.2.
Bảng 4.2 Ảnh hưởng của ethanol đến hàm lượng acid acetic tạo thành
Hàm lượng acid acetic tạo thành (g/100mL)
Các trung bình với chữ cái viết thường khác nhau trong cùng một hàng cho thấy sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa các hàm lượng acid trong từng điều kiện lên men (ρ < 0.05).
Kết quả từ Bảng 4.2 và phụ lục B cho thấy nồng độ ethanol ảnh hưởng đến hàm lượng acid sinh ra theo thời gian Ở NT 3 với 8% ethanol, quá trình lên men diễn ra chậm và lượng acid acetic chỉ đạt 2.198g/100mL sau 8 ngày Mặc dù ethanol là cơ chất cho quá trình lên men giấm, nồng độ cao có thể ức chế hoạt động của vi khuẩn acetic (Raspor, 2008) Nghiên cứu về lên men giấm từ rượu vang chuối cho thấy khi bổ sung ethanol 7% và 9% v/v, acid acetic sinh ra thấp tương ứng 0.809% và 0.379% (Nguyễn Thị Mai Hiền, 2014) Khi bổ sung 10% ethanol vào môi trường nuôi cấy vi khuẩn A aceti, sự phát triển của vi khuẩn bị ức chế và acid sinh ra rất thấp (Zahoor, 2006) Ở NT 1 với 4% ethanol, lượng acetic sinh ra chưa đạt yêu cầu (< 4 g/100mL), mặc dù nồng độ 4% được cho là tốt nhất cho quá trình lên men giấm dừa trong điều kiện lắc.
Nghiên cứu cho thấy rằng 50 vòng/phút với Acetobacter indonesiensis (mật độ 10^7 tế bào/mL) chỉ tạo ra 2.5g acetic/100mL trong giấm dừa (Nguyễn Phú Thọ, 2018), thấp hơn so với 3.777g/100mL ở NT1 sau 7 ngày lên men Sự khác biệt này có thể do phương pháp lên men và các điều kiện như nhiệt độ, sự thoáng khí, hoặc sự khác nhau giữa giống và loài (Gullo and Giudici, 2008) Kết quả cũng cho thấy phương pháp lên men hồi lưu hiệu quả hơn so với phương pháp lên men lắc Ở NT2 (bổ sung 6% ethanol v/v), sau 7 ngày lên men, nồng độ acetic đạt cao nhất là 4.214g/100mL, có sự khác biệt có ý nghĩa so với hai nghiệm thức còn lại Tương tự, khi lên men giấm từ vang khoai lang tím với nồng độ cồn 5.5% v/v và thêm Acetobacter aceti (mật độ 10^5 tế bào/mL), giấm thu được đạt 4.275% acetic (Nguyễn Thị Mỹ Tuyền, 2016).
Từ ngày 1 đến ngày 7, có sự gia tăng, nhưng từ ngày 7 đến ngày 8 lại có xu hướng giảm Nguyên nhân có thể là do quá trình lên men hồi lưu, giúp cơ chất tiếp xúc liên tục với vi khuẩn thông qua chất mang xơ mướp.
Acetobacter aceti có khả năng chuyển hóa ethanol mạnh mẽ, dẫn đến việc cơ chất trở nên không đủ trong quá trình trao đổi chất Khi vi khuẩn đã hoàn tất việc chuyển hóa ethanol, quá trình oxy hóa acid acetic sẽ diễn ra.
H2O và CO2 (Kanchanarach và cộng sự, 2010)
Từ 3 kết quả của NT1, NT 2, NT 3, chúng tôi chọn NT2 bổ sung nồng độ ethanol 6% v/v để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo.
Ảnh hưởng của nồng độ chất khô hoà tan tới quá trình lên men acid acetic bằng hệ thống lên men hồi lưu
Khi sử dụng nguyên liệu chứa đường để lên men acetic, có thể thực hiện qua hai giai đoạn: đầu tiên là lên men ethanol trong điều kiện kỵ khí, sau đó chuyển sang lên men acetic, hoặc có thể bổ sung cồn để tiến hành lên men acetic.
CO2 được sản sinh dưới tác dụng của nấm men, sau đó trải qua quá trình lên men acid acetic, trong đó ethanol bị oxy hóa thành acid acetic nhờ khuẩn acid acetic Một phương pháp khác là bổ sung ethanol để chuyển hóa trực tiếp thành acetic trong một giai đoạn lên men Thông thường, quá trình lên men giấm trái cây được thực hiện qua hai giai đoạn, sử dụng nguyên liệu như sơ ri và chuối già chín.
Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng phụ phẩm từ quá trình sản xuất thơm sấy dẻo, vốn chỉ chứa ít đường và chất dinh dưỡng Việc bổ sung nấm men không mang lại hiệu suất cao cho quá trình lên men ethanol và tốn thời gian Do đó, chúng tôi quyết định bổ sung ethanol ngay từ đầu và tập trung vào chuyển hóa của vi khuẩn Acetobacter aceti Ở giai đoạn này, nồng độ chất khô hòa tan chỉ đóng vai trò là nguồn dinh dưỡng, cung cấp năng lượng cho vi khuẩn hoạt động.
Quá trình khảo sát ảnh hưởng của nồng độ chất khô hòa tan đến quá trình lên men acid acetic bằng hệ thống lên men hồi lưu đã cho ra kết quả như được trình bày trong Bảng 4.3.
Bảng 4.3 Ảnh hưởng của nồng độ chất khô đến hàm lượng acid acetic tạo thành
Hàm lượng acid acetic tạo thành (g/100mL)
Các trung bình với chữ cái viết thường khác nhau trong cùng một hàng cho thấy sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa các hàm lượng acid trong từng điều kiện lên men (ρ < 0.05).
Kết quả từ Bảng 4.3 cho thấy ở NT1 (8 o brix), hàm lượng acid đạt cao nhất 3.461g/100mL vào ngày thứ 6, sau đó giảm dần Trong khi đó, NT2 (10 o brix) và NT3 (12 o brix) cho thấy quá trình lên men diễn ra nhanh hơn, với hàm lượng acid tăng từ ngày 2 đến ngày 7 trước khi giảm Nguyên nhân có thể là do lượng cơ chất sử dụng để lên men giảm, dẫn đến quá trình oxy hóa acid acetic thành H2O và CO2.
Dịch dứa cô đặc được điều chỉnh về 13 o Brix và lên men bằng Acetobacter pasteurianus và Gluconobacter oxydans cho ra giấm với nồng độ 5.8% acetic (O’keefe, 2015) Trong khi đó, dịch ép dứa điều chỉnh tới 15 o Brix và bổ sung Acetobacter aceti chỉ thu được 4.2% acetic (Divyashree, 2022) Nồng độ chất khô hòa tan trong các nghiên cứu này cao hơn so với khảo sát của chúng tôi, do họ thực hiện lên men acetic theo hai giai đoạn: rượu hoá bằng Saccharomyces cerevisiae và acetic hoá bằng AAB Khi thử nghiệm lên men giấm Balsamic theo phương pháp tĩnh, nghiên cứu sử dụng dịch lên men với 7% ethanol (v/v) và 25% đường (glucose và fructose tỉ lệ 1:1) Trong điều kiện này, AAB chuyển hoá carbon theo thứ tự ethanol, sau đó đến glucose và glycerol, ưu tiên chuyển hoá ethanol để tạo acetic, rồi mới sử dụng glucose để tạo gluconate Kết thúc quá trình lên men, tỷ lệ fructose cao hơn glucose trong dịch đường, dẫn đến hàm lượng acid cao hơn do sự hình thành gluconic, trong khi acid bay hơi giảm (Giudici, 2012) Chúng tôi sử dụng nồng độ chất tan thấp hơn vì đã bổ sung ethanol trực tiếp để chuyển hóa thành acid acetic, rút ngắn thời gian lên men; nếu sử dụng quá nhiều đường sẽ ức chế hoạt động của vi khuẩn, ảnh hưởng đến lượng acetic sinh ra.
Hàm lượng acetic sau 7 ngày lên men ở NT2 là 4.335 g/100mL, không khác biệt đáng kể so với NT3 (4.346 g/100mL) Do đó, để tối ưu hóa hiệu quả lên men và kinh tế, chúng tôi chọn o Brix thích hợp là 10 cho thí nghiệm tiếp theo Nghiên cứu về lên men acid acetic từ dịch ép trái điều cũng cho thấy o Brix là 9.
2015), tương tự với kết quả của chúng tôi
Ảnh hưởng của pH tới quá trình lên men acid acetic bằng hệ thống lên men hồi lưu
Chỉ số pH ban đầu đóng vai trò quan trọng trong quá trình lên men giấm, với pH thích hợp giúp thúc đẩy sự phát triển sinh khối và khả năng tổng hợp acid acetic Kết quả thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của pH đến quá trình lên men acid acetic bằng hệ thống lên men hồi lưu được trình bày trong Bảng 4.4, với các giá trị pH lần lượt là 4.5, 5 và 5.5.
Bảng 4.4 Ảnh hưởng của pH đến hàm lượng acid acetic tạo thành
Hàm lượng acid acetic tạo thành (g/100mL)
Các trung bình với chữ cái viết thường khác nhau trong cùng một hàng cho thấy sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa các hàm lượng acid trong từng điều kiện lên men (ρ < 0.05).
Theo Bảng 4.4, hàm lượng acetic tăng dần theo thời gian lên men ở cả ba nghiệm thức Ở NT1 (pH 4.5), quá trình lên men diễn ra chậm với lượng acetic sinh ra chỉ đạt 3.450g/100mL, thấp hơn so với NT2 và NT3 Tại pH 4.5, dịch xoài bổ sung 4% ethanol (v/v) lên men bằng Acetobacter aceti theo phương pháp tĩnh trong 8 ngày cho thấy quá trình lên men không ổn định và hàm lượng acetic sinh ra chỉ đạt 2.444% (Lê Thị Thu Phương, 2020).
Trong 3 nghiệm thức, NT2 (pH 5) sau 7 ngày lên men, thu được hàm lượng acetic cao nhất (4.340g/100mL) khác biệt có ý nghĩa so với 2 nghiệm thức còn lại (phụ lục D) Với các kết quả lên men acid acetic khác từ dịch sơ ri, nước dừa khô, nước ép dứa khi điều chỉnh dịch lên men đạt pH 5 đều thu được hàm lượng acetic cao nhất Cụ thể, nước ép dứa bổ sung 8% ethanol (v/v) lên men bằng A senegarlensis mật độ 10 6 tế bào/mL ở nhiệt độ phòng (28-32℃) trong 8 ngày thu được hàm lượng acetic 3.74% (Đỗ Thị Hiền, 2018) Dịch sơ ri có 10 o Bx được lên men bằng Sac cerevisiae mật độ 10 7 tế bào/ml và A senegarlensis mật độ 10 5 tế
Trong nghiên cứu của Trịnh Nguyệt Trân và cộng sự (2007), sản phẩm đạt hàm lượng acid acetic 6.99% khi ủ và lắc ở 200 vòng/phút trong 8 ngày tại nhiệt độ 28 – 32℃ với mật độ 34 bào/mL Tương tự, Nguyễn Phú Thọ (2018) đã chỉ ra rằng nước dừa khô bổ sung 4% ethanol và lên men bằng Acetobacter indonesiensis với mật độ 10^7 tế bào/mL, đạt hàm lượng acetic cao nhất là 2.87g/100mL sau 7 ngày lắc ở 50 vòng/phút.
Như vậy, chúng tôi lựa chọn NT2 (pH 5) là thích hợp cho quá trình lên men giấm.
Ảnh hưởng của chế độ thanh trùng tới chất lượng giấm trong thời gian bảo quản
Dựa trên kết quả từ thí nghiệm 2, 3, 4, chúng tôi đã phát triển quy trình lên men acetic bằng phương pháp lên men hồi lưu với vi khuẩn Acetobacter aceti từ dịch ngâm đường thơm 10 obrix Quá trình này bao gồm việc thanh trùng ở nhiệt độ 85℃ trong 3 phút, bổ sung 6% ethanol (v/v) và điều chỉnh pH về 5 Sau 7 ngày lên men ở nhiệt độ phòng, sản phẩm đạt 4.358 acetic g/100mL, có màu vàng nhạt và mùi thơm nhẹ của dứa Chúng tôi đã tiến hành thanh trùng theo các chế độ khảo sát và bảo quản giấm trong môi trường sạch sẽ, thoáng mát, tránh ánh nắng trực tiếp ở nhiệt độ phòng Kết quả khảo sát ảnh hưởng của chế độ thanh trùng đến chất lượng giấm được trình bày trong Bảng 4.5.
Bảng 4.5 Ảnh hưởng của chế độ thanh trùng đến chất lượng giấm
Hàm lượng acetic còn lại theo thời gian (g/100mL)
Nghiệm thức 0 ngày 15 ngày 30 ngày 45 ngày
Các trung bình với chữ cái viết thường khác nhau trong cùng một hàng cho thấy sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa các hàm lượng acid trong từng điều kiện thanh trùng (ρ < 0.05).
Nhiệt độ thanh trùng và thời gian xử lý ảnh hưởng đến hàm lượng acetic trong giấm trong quá trình bảo quản Cụ thể, ở NT1 (60℃/5 phút), sau 30 ngày, hàm lượng acetic giảm xuống còn 4.323g/100mL, có sự khác biệt có ý nghĩa so với sản phẩm ban đầu Các nghiệm thức NT2 (60℃/10 phút), NT3 (65℃/5 phút) và NT4 (65℃/10 phút) cũng cho thấy hàm lượng acetic giảm sau 45 ngày bảo quản, với các giá trị lần lượt là 4.322, 4.325 và 4.329 g/100mL, đều có sự khác biệt có ý nghĩa so với sản phẩm ban đầu Sự khác biệt này có thể do nhiệt độ và thời gian thanh trùng chưa tiêu diệt hoàn toàn vi sinh vật trong giấm, dẫn đến sự hiện diện của vi khuẩn acetic, tiếp tục quá trình oxy hóa sinh học và làm giảm chất lượng giấm.
Sau 45 ngày bảo quản với nghiệm thức NT5 (70℃/5 phút) và NT6 (70℃/10 phút), lượng acetic giảm nhẹ nhưng không có sự khác biệt có ý nghĩa so với sản phẩm ban đầu Màu sắc của giấm vẫn giữ nguyên màu vàng nhạt, trong suốt, không có cặn và vẫn giữ được mùi thơm nhẹ Điều này cho thấy chế độ thanh trùng của hai nghiệm thức đã hiệu quả trong việc tiêu diệt hoặc ức chế vi sinh vật, ngăn chặn vi khuẩn acetic oxy hóa acetic để duy trì sự sống Tuy nhiên, do giới hạn về thời gian, nghiên cứu chỉ được thực hiện trong 45 ngày.
Do vậy chúng tôi chọn NT 5 (70℃/5 phút) và NT 6 (70℃/10 phút) là chế độ thích hợp để thực hiện thanh trùng sản phẩm giấm