(Đồ án HCMUTE) tối ưu hóa các hợp chất có khả năng kháng oxy hóa và ức chế enzyme tiêu hóa tinh bột từ lá ổi rừng

Biểu đồ bề mặt phản ứng cho thấy ảnh hưởng của nồng độ dung môi % và thời gian chiết h đến khả năng ức chế gốc tự do DPPH ứng với tỉ lệ dung môi/nguyên liệu là 40 mL/g ..... Biểu đồ bề

TỔNG QUAN

Giới thiệu về ổi

Ổi có tên khoa học là Psidium guajava L thuộc:

Ổi (Psidium L.) là một loại trái cây nhiệt đới phổ biến, được tiêu thụ cả tươi lẫn chế biến, nổi bật với giá trị dinh dưỡng vượt trội so với các loại trái cây khác Loại trái cây này không chỉ có năng suất cao mà còn mang lại lợi nhuận kinh tế lớn mà không cần chăm sóc nhiều Bên cạnh đó, các bộ phận của cây ổi như búp non, lá non, vỏ rễ và vỏ thân cũng được sử dụng trong y học.

1.1.1 Nguồn gốc Ổi (Psidium guajava L.) thuộc họ cây lá hai mầm Myrtaceae, chi Psidium Chi Psidium có khoảng 150 loài, trong đó có 5 loài chính: Psidium guianense, Psidium cowianum, Psidium chinense, Psidium Friedrichsthalianum và Psidium guajava Trong đó, ổi thuộc loài Psidium guajava được trồng phổ biến nhất Một số giống ổi được trồng và đặt tên theo vị trí mà chúng được trồng (Adsule và Kadam, 1995)

Psidium guajava, hay còn gọi là ổi, là loài cây bản địa của Mexico và đã lan rộng ra khắp Nam Mỹ, châu Âu, châu Phi và châu Á Vào đầu thế kỷ 17, người Bồ Đào Nha đã mang ổi đến Ấn Độ, từ đó nó phát triển mạnh mẽ ở các nước nhiệt đới và cận nhiệt đới châu Á, với Basti ở Uttar Pradesh được cho là nơi đầu tiên tiếp nhận giống cây này Hiện nay, ổi phát triển ở nhiều khu vực nhiệt đới và cận nhiệt đới trên toàn thế giới, cho thấy khả năng thích nghi với nhiều điều kiện khác nhau.

Với nhu cầu ngày càng tăng đối với sản phẩm tươi và chế biến, trồng ổi đã trở nên phổ biến và có thị trường lớn tại hơn 60 quốc gia Ấn Độ hiện là quốc gia sản xuất ổi lớn nhất thế giới, tiếp theo là Trung Quốc, Kenya, Thái Lan, Indonesia, Pakistan, Mexico, Brazil, Bangladesh, Nigeria, Philippines, Việt Nam và Ai Cập (Gill, 2016).

Hình 2.1 Cây ổi (Psidium guajava L.)

2.1.1 Đặc điểm sinh thái Ổi là cây gỗ nhỏ hay cây bụi, cao 2-8 m, phân cành rộng Thân cây thường có dạng đốm, với lớp vỏ vảy bên ngoài màu nâu đỏ Rễ cây ổi thuộc loại rễ cọc Lá cây ổi hình bầu dục hoặc thuôn dài, dài 7-15 cm, có gân nổi rõ, mặt dưới thường có lông Hoa to, lưỡng tính, mọc từng chùm 2, 3 chiếc, ít khi ở đầu cành mà thường ở nách lá Những bông hoa với đài hoa màu xanh lục hình chuông phân chia không đều Hoa ổi có sáu cánh hoa màu trắng và nhiều nhị hoa với bao phấn màu vàng Hoa thụ phấn chéo dễ dàng nhưng cũng có thể tự thụ phấn (Adsule và Kadam, 1995)

Hình 2.2 Cây, lá và hoa ổi

Quả ổi là loại quả mọng, có lớp thịt dày và nhiều hạt nhỏ bên trong Hạt của quả ổi cứng và có hình đa giác, trong khi các giống không hạt thường chứa rất ít hạt Hình dáng quả ổi chủ yếu là tròn, nhưng cũng có một số giống có hình trứng hoặc hình quả lê Quả ổi trưởng thành có chiều dài khoảng 4 cm.

10 cm và đường kính 4-8 cm (Singh, 1988) Trọng lượng trung bình của quả thay đổi từ 50 -

Quả ổi trưởng thành thường có màu vàng, với thịt quả màu trắng hoặc kem, và trong một số giống có màu hồng Quả ổi thường giòn, thơm và ngọt, trong khi quả chín sẽ mềm hơn nhưng vẫn giữ được hương thơm và vị ngọt.

Ổi là loại cây phát triển tốt ở hầu hết các vùng khí hậu nhiệt đới và cận nhiệt đới, mặc dù nó không chịu được sương giá Nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển của ổi nằm trong khoảng 23 - 28°C Cây ổi có thể trồng trên nhiều loại đất, nhưng đất thịt nhẹ, thoát nước tốt là thích hợp nhất Ngoài ra, ổi cũng phù hợp với đất có độ chua thấp và hàm lượng nitơ, phốt pho, kali thấp, đây là những yếu tố hạn chế chính trong sản xuất cây trồng.

Dựa vào màu sắc ruột, ổi được phân thành hai loại chính: ổi ruột đỏ (P guajava var Pomifera) và ổi ruột trắng (P guajava var Pyrifera) (Barbalho và cộng sự, 2012).

Hình 2.4 Ổi ruột đỏ và ổi ruột trắng

Hiện nay, Việt Nam sở hữu nhiều giống ổi đa dạng và phong phú, mỗi giống có năng suất và chất lượng khác nhau về độ giòn, độ ngọt và hương vị Ngoài những giống ổi phổ biến trên toàn thế giới, còn có các giống đặc trưng như ổi tím Malaysia, ổi nữ hoàng, ổi lê, ổi Ruby ruột đỏ, ổi sẻ, ổi ruột đỏ, ổi sim Nhật và ổi đuôi phụng.

Hình 2.5 Lá của các giống ổi

Thành phần hóa học của lá ổi

Lá ổi là nguồn cung cấp dinh dưỡng phong phú với các hợp chất sinh học có lợi cho sức khỏe như polysaccharide, protein, polyphenol, vitamin và khoáng chất Chúng có khả năng phòng ngừa nhiều bệnh lý, bao gồm đái tháo đường, bệnh tim mạch, viêm nhiễm, ung thư, tiêu chảy và kháng khuẩn (Shabbir và cộng sự, 2020).

Bảng 2.1 Thành phần hóa học chung của lá ổi (Mandal và cộng sự, 2009)

Hợp chất Hàm lượng / 100g Độ ẩm 82,47%

Các polysaccharide có nhiều đặc tính lý hóa, sinh học và dược lý như chống oxy hóa, chống viêm, và điều hòa miễn dịch khối u Chúng có thể được chiết xuất bằng phương pháp hỗ trợ sóng siêu âm, chứa 9,13% acid uronic và 64,42% tổng số đường, trong đó 2,24% là đường khử Ngoài ra, hàm lượng sulfate trong các hợp chất này khoảng 18,58% Các polysaccharide này có thể thay thế acarbose trong việc kiểm soát bệnh đái tháo đường và được sử dụng như chất phụ gia chống oxy hóa trong thực phẩm (Luo và cộng sự, 2018).

Bảng 2.2 Các hợp chất polysaccharide có trong lá (Kim và cộng sự, 2016)

Protein là các đại phân tử sinh học quan trọng, bao gồm các acid amin, đóng vai trò thiết yếu trong quá trình sinh trưởng và phát triển, đồng thời được xem là chất xúc tác sinh học Nghiên cứu cho thấy hàm lượng protein trong lá ổi đạt 16,8 mg protein/100g, được xác định bằng phương pháp Lowry Khi tính theo hàm lượng chất khô, protein trong lá ổi chiếm 9,73% (Rahman và cộng sự, 2013).

Lá ổi giàu khoáng chất và vitamin như canxi, kali, lưu huỳnh, magie, vitamin C và B Nghiên cứu của Thomas và cộng sự (2017) đã chỉ ra hàm lượng các khoáng chất này trong lá ổi, được trình bày trong bảng 2.3.

Bảng 2.3 Hàm lượng khoáng chất và vitamin có trong lá ổi (Thomas và cộng sự, 2017)

Khoáng chất và vitamin Hàm lượng / 100g

Vitamin C cao giúp tăng cường hệ miễn dịch và bảo vệ sức khỏe mạch máu, trong khi vitamin B quan trọng cho việc cải thiện lưu thông máu, thư giãn hệ thần kinh và kích thích hoạt động não bộ.

2.2.5 Acid phenolic và các hợp chất liên quan

Nghiên cứu về thành phần phenolic trong lá ổi đã chỉ ra sự hiện diện của 11 acid phenolic, cùng với các hoạt chất sinh học có khả năng chống bệnh đái tháo đường loại 2 trong dịch chiết lá ổi (Jayachandran và cộng sự, 2018).

Bảng 2.4 Thành phần acid phenolic có trong dịch chiết lá ổi (Jayachandran và cộng sự,

Tên hợp chất Khối lượng Công thức hóa học

Thành phần acid phenolic trong cây ổi có sự khác biệt giữa các bộ phận và phương pháp chiết xuất ảnh hưởng đến hiệu suất thu được Các acid phenolic này có thể kết hợp với các hợp chất khác hoặc tồn tại dưới dạng glycosidic.

Flavonoid là hợp chất chính được chiết xuất từ cây ổi, với hầu hết các nhóm flavonoid được tìm thấy trong lá ổi Nhiều flavonoid glycoside đã được xác định từ lá và quả ổi, chủ yếu là các dẫn xuất quercetin Sự đa dạng của các loại đường kết hợp với flavonoid tạo thành glycoside flavonoid, và hầu hết các glycoside này được liên kết qua vị trí hydroxyl C-.

Hình 2.6 Sự đa dạng của các loại đường được kết hợp vào các aglycones flavonoid trong ổi

Các hợp chất flavonoid như quercetin, kaempferol, guaijaverin, avicularin, myricetin, hyperin và apigenin được chiết xuất từ lá và nghiên cứu về khả năng ức chế enzyme α-glucosidase và α-amylase (Wang và cộng sự, 2010) Quercetin, hợp chất chủ yếu trong lá, đã được xác nhận bởi nhiều nghiên cứu Hàm lượng flavonoid chiết xuất từ lá được sắp xếp theo thứ tự: Quercetin > kaempferol > catechin > quercitrin > rutin > luteolin > epicatechin (Muller và cộng sự, 2018).

Nghiên cứu cho thấy các hợp chất hoạt tính sinh học chiết xuất từ lá ổi, như peltatoside, hyperoside, isoquercetin và guaijaverin, có tác dụng chống bệnh đái tháo đường (Eidenberger và cộng sự, 2013).

Xác định hàm lượng polyphenol từ lá cây ổi là một chủ đề quan trọng trong ngành hóa thực phẩm Năm 1965, quercetin, guaijaverin, leucocyanidin và tannin đã được phân lập từ lá ổi Nhiều nhóm nghiên cứu đã sử dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao kết hợp với phân tích khối phổ (HPLC-MS) để định lượng các hợp chất phenol trong lá ổi Các hợp chất như morin, quercitrin, guajaverin, procyanidin B và hyperin chiếm 41,2% tổng số hợp chất phenol.

Lá chứa một số lượng lớn các hợp chất phenolic, với 72 hợp chất được phát hiện qua chiết xuất ethanol bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) Phân tích định lượng cho thấy sự phong phú của các hợp chất trong hai giống ổi ruột đỏ và ổi ruột trắng Thành phần hóa học của lá ổi từ các vùng khác nhau như Đài Loan, Trung Quốc, Brazil, Thái Lan, Mỹ, Tây Ban Nha, Mexico và Panama có sự khác biệt Các hợp chất chống oxy hóa trong dịch chiết lá được sắp xếp theo nồng độ: flavonols, flavan-3-ols, dẫn xuất acid gallic và ellagic, benzophenones, và flavanones Sử dụng sắc ký ngược dòng tốc độ cao, năm glycoside flavonoid và một glycoside diphenylmethane đã được phân lập từ lá ổi Chiết xuất từ ethanol cũng đã phân lập được kaempferol, quercetin, quercitrin, isoquercitrin, guaijaverin, avicularin, hyperoside và reynoutrin, cùng với diphenylmethane và các dẫn xuất benzophenone.

2.2.7 Các phenol và tannin hiếm

Lá ổi chứa guajadial B, một meroterpenoid dựa trên humulene, mặc dù hoạt tính sinh học của nó chưa được xác định Ba meroterpenoids chiết xuất từ lá ổi được gọi là guadial A, psiguadial C và psiguadial D Ngoài ra, các hợp chất phenolic kết hợp với terpenoid, như psidals A-C, cũng rất phổ biến trong ổi và được biết đến với hoạt tính sinh học (Gao và cộng sự, 2012).

Trích ly lá bằng methanol 80% đã thu được ba hợp chất guavinosides A-C Guavinoside C có thể là dẫn xuất galloyl của quercetin, trong khi guavinoside A là 2,4,6-trihydroxybenzophenone và guavinoside B là 2,4,6-trihydroxy-3,5-dimethylbenzophenone Guavinoside C được tạo ra từ việc este hóa dẫn xuất α-L-arabinofuranoside của quercetin hoặc avicularin với acid gallic (Matsuzaki và cộng sự, 2010).

Từ lá ổi phân lập được năm dẫn xuất galloyl và xác định chúng là 1-O-(1,2-propanediol)-6-O- galloyl-β-D-glucopyranoside, acid gallic, acid ellagic, acid ellagic, glucopyranoside và quercetin-3-O-(6”-galloyl)

Tanin là thành phần chính của cây ổi, được tìm thấy ở tất cả các bộ phận như lá, quả và vỏ thân Hợp chất guavin B, một loại ellagitannin, đã được phân lập từ lá ổi cùng với procyandin và có cấu trúc polyhydroxybenzophenone với liên kết O-glucoside, không có liên kết este (Okuda và cộng sự, 1984) Các hợp chất tannin khác có trong lá ổi bao gồm pedunculagin, casuarictin, tellimargandin I, strictinin, isostrictinin, casuarinin, casuariin và stachyurin (Okuda và cộng sự, 1982).

2.2.8 Tinh dầu và các thành phần không phải phenol khác

Lợi ích của dịch chiết lá ổi

Các chất hoạt tính sinh học chiết xuất từ lá ổi có nhiều tác dụng quan trọng, bao gồm chống co thắt, kháng khuẩn, và hỗ trợ điều trị tiêu chảy và kiết lỵ Chúng cũng có khả năng chống oxy hóa, bảo vệ gan, chống dị ứng, chống viêm, và kháng khuẩn Ngoài ra, lá ổi còn giúp hạ đường huyết cho bệnh nhân đái tháo đường và có tiềm năng trong việc chống ung thư (Elixabet và cộng sự, 2016).

Nghiên cứu của Hsieh CL và cộng sự (2005) cùng với Yamashiro S và cộng sự (2003) chỉ ra rằng dịch chiết từ lá ổi chứa các thành phần có khả năng chống glycat, giúp ngăn ngừa các bệnh thoái hóa thần kinh và tim mạch Ojewole (2005) đã phát hiện sự hiện diện của các hợp chất phenolic trong lá ổi, chứng minh tác dụng hạ đường huyết và hạ huyết áp trên chuột mắc bệnh đái tháo đường khi được điều trị bằng dịch chiết này Ngoài ra, nghiên cứu của Kim và cộng sự (2011) cũng cho thấy lá ổi chứa các hợp chất có khả năng ức chế gốc tự do.

Các phương pháp trích ly

Trích ly là quá trình hóa lý, trong đó chất hòa tan được rút ra từ chất lỏng hoặc chất rắn bằng một dung môi khác thông qua sự khuếch tán của các chất có nồng độ khác nhau Có hai loại trích ly: trích ly lỏng, khi chất hòa tan nằm trong chất lỏng, và trích ly rắn, khi chất hòa tan nằm trong chất rắn.

Trích ly là phương pháp quan trọng để thu nhận các thành phần từ hỗn hợp rắn hoặc dung dịch, đóng vai trò thiết yếu trong chuẩn bị mẫu và phân tích hợp chất sinh học Gần đây, các kỹ thuật trích ly liên tục đã được cải tiến nhằm rút ngắn thời gian, giảm tiêu thụ dung môi hữu cơ và tăng hiệu suất, từ đó giảm chi phí và ô nhiễm môi trường Nhiều phương pháp hiện đại như trích ly hỗ trợ sóng siêu âm, trích ly CO siêu tới hạn, và trích ly bằng áp suất cao đang được nghiên cứu Để tối ưu hóa nguyên liệu, các hợp chất tự nhiên cần được tách hiệu quả qua quá trình trích ly Nguyên liệu thường được ngâm trong dung môi để hòa tan, sau đó các thành phần di chuyển vào dung môi qua khuếch tán và thẩm thấu Các phương pháp truyền thống như Soxhlet và trích ly hồi lưu thường có thời gian hoạt động dài, yêu cầu nhiều mẫu và dung môi, dẫn đến giảm hoạt tính của hợp chất mục tiêu và hiệu quả trích ly kém, đồng thời ảnh hưởng đến môi trường và sức khỏe con người.

Trong các phương pháp trích ly, chúng tôi chủ yếu hướng tới nghiên cứu các phương pháp Soxhlet và phương pháp trích ly sử dụng áp suất cao

Phương pháp Soxhlet, được phát minh bởi Franz von Soxhlet vào năm 1879, là kỹ thuật chiết chất béo phổ biến nhất và đã trở thành tiêu chuẩn trong hơn một thế kỷ qua Phương pháp này được sử dụng để đo lường hiệu suất của các phương pháp trích ly mới Tuy nhiên, quá trình trích ly bằng Soxhlet kéo dài từ 18 đến 24 giờ và tiêu tốn một lượng lớn dung môi.

Phương pháp Soxhlet truyền thống sử dụng ống chiết cellulose để chứa mẫu, kết nối với cốc dung môi từ bình chưng cất Hơi dung môi di chuyển lên cột và tràn vào khoang chứa ống chất rắn, hòa tan các hợp chất không bay hơi Quá trình này lặp lại cho đến khi thu được các hợp chất mong muốn (Lo´ pez-Bascon và LuquedeCastro, 2020) Để nâng cao hiệu quả, đã có các phương pháp thay thế phát triển dựa trên nguyên lý trích ly tương tự nhưng với các tính năng cải tiến.

Hình 2.7 Chiết bằng máy Soxtest

2.4.2 Phương pháp áp suất cao

Phương pháp trích ly bằng áp suất cao (HPE) là một kỹ thuật tiên tiến, hoạt động ở nhiệt độ từ 50 đến 200°C và áp suất từ 3,5 đến 20 MPa, giúp nâng cao hiệu quả chiết xuất so với các phương pháp truyền thống Kỹ thuật này sử dụng mẫu rắn trong ngăn chiết và dung môi hữu cơ hoặc nước ở điều kiện áp suất và nhiệt độ cao hơn điểm sôi Hệ thống HPE bao gồm bơm cung cấp dung môi, hệ thống gia nhiệt để tăng nhiệt độ, ngăn chiết chứa mẫu, bộ điều khiển áp suất ngược và bộ thu sản phẩm cuối cùng.

HPE là kỹ thuật chiết xuất sử dụng dung môi lỏng ở nhiệt độ và áp suất cao, giúp nâng cao hiệu suất chiết xuất so với các phương pháp truyền thống Việc sử dụng dung môi ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ sôi trong khí quyển cho phép tăng cường khả năng hòa tan và đặc tính truyền khối Kỹ thuật này được giới thiệu lần đầu bởi Dionex Corporation vào năm 1995 tại Hội nghị Pittcon, với tên gọi Công nghệ chiết xuất dung môi tăng tốc (ASE®).

Kỹ thuật chiết xuất này, còn được biết đến với các tên gọi như chiết chất lỏng có áp suất, chiết dung môi có áp suất, chiết xuất dung môi nhanh và chiết xuất dung môi tăng cường, sử dụng nước làm dung môi chiết thì được gọi là chiết nước nóng có áp (Pressurized Hot Water Extraction - PHWE) (Arwar và Charlotta, 2011).

Máy chiết nhanh Buchi E-916 là thiết bị tự động chuyên dụng cho việc chiết xuất song song các hợp chất hữu cơ từ nhiều loại mẫu rắn hoặc bán rắn thông qua phương pháp gia nhiệt dưới áp suất.

Nó có thể thực hiện được 6 mẫu với thể tích cell tối đa là 40mL Tổng thể tích bình thu hồi từ

Hệ thống chiết xuất có dung tích từ 60 đến 220mL, với dải điều khiển nhiệt độ từ 30 đến 200C và áp suất từ 50 đến 150bar Nhiều loại dung môi tinh khiết có thể được sử dụng tùy thuộc vào ứng dụng cụ thể Để duy trì dung môi ở trạng thái lỏng trong quá trình chiết, áp suất được tạo ra trong ngăn chiết Để đạt hiệu suất chiết cao, thường thực hiện nhiều chu kỳ chiết Sau khi hoàn tất, các chất chiết được làm mát trong bộ làm mát và thu hồi vào các bình chứa.

Các ứng dụng chiết xuất chất trong môi trường, thực phẩm, dược phẩm và polyme rất đa dạng Chúng bao gồm việc chiết các chất gây ô nhiễm theo phương pháp EPA 3545A, thu hồi chất béo từ thịt, hạt có dầu, và sản phẩm sữa, cũng như chiết xuất các chất phân tích từ sản phẩm tự nhiên và thuốc Ngoài ra, quy trình này còn áp dụng cho các hợp chất đơn phân, oligome và phụ gia trong polyme.

Một giai đoạn chiết hoàn chỉnh gồm các giai đoạn sau (AG, 2019):

 Thiết lập các thông số

 Chuẩn bị dụng cụ để vận hành

 Cho mẫu vào cell chiết

 Đặt các bình thu hồi vào khay thu hồi

 Đặt cell vào ngăn gia nhiệt

 Giai đoạn 2: Các chu kỳ chiết

Một chu kỳ chiết bao gồm ba bước chính: tăng nhiệt, giữ nhiệt và thu hồi, với thời gian do người dùng xác định Trong bước tăng nhiệt, áp suất và nhiệt độ trong ngăn chiết được tăng dần đến các thông số đã cài đặt Bước giữ nhiệt duy trì các thông số này không đổi, tương ứng với quá trình chiết ở nhiệt độ và áp suất ổn định Cuối cùng, van được mở để thu hồi dịch chiết vào bình thu hồi Cả ba bước này được lặp lại nhiều lần theo chương trình chiết.

 Giai đoạn 3: Xả đường ống và tháo ngăn gia nhiệt

 Rửa sạch đường ống bằng dung môi mới và thu chất lỏng vào bình thu hồi

 Xả bằng khí nitơ để loại bỏ dung môi còn sót lại

Hình 2.8 Thiết bị trích ly sử dụng áp suất cao

Bảng 2.6 Ưu, nhược điểm của phương pháp Soxhlet và phương pháp trích ly bằng áp suất cao Ưu điểm Nhược điểm

- Tiết kiệm dung môi, chỉ cần một lượng ít dung môi có thể chiết triệt để các chất có trong lá

- Không tốn các thao tác lọc

- Chiết triệt để các hợp chất có trong lá vì lá luôn được chiết bằng dung môi tinh khiết

- Các chất luôn bị đun ở nhiệt độ sôi của dung môi nên các hợp chất kém bền nhiệt có thể bị phân hủy

Phương pháp trích ly có sử dụng áp suất cao

- Nhanh chóng, không cần lọc

- Tiêu thụ dung môi thấp

- Năng suất trích ly cao

- Ít tạp chất trong dịch chiết so với các phương pháp khác

- Cần phải thiết lập nhiều thông số

- Các hợp chất không bền với nhiệt có thể bị phân hủy

2.5 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước về trích ly chất hoạt tính sinh học từ nguyên liệu thiên nhiên

2.5.1 Tình hình nghiên cứu ngoài nước về trích ly chất hoạt tính sinh học từ nguyên liệu thiên nhiên

Lá ổi là một phần quan trọng của cây ổi, có tác dụng chữa trị nhiều vấn đề sức khỏe nhờ vào các đặc tính kháng khuẩn, chống oxy hóa, chống ung thư và chống loét Sự nghiên cứu về việc trích ly các chất hoạt tính sinh học trong lá ổi đang thu hút sự quan tâm của các nhà khoa học.

Vibha Porwal và cộng sự (2012) đã nghiên cứu các phương pháp trích ly và hiệu suất của chúng, trong đó khảo sát việc sử dụng các dung môi như ethanol, methanol, ethyl acetate và nước Nghiên cứu chỉ ra rằng nước được ưa chuộng hơn trong y tế so với các dung môi khác Đặc biệt, dịch chiết từ lá ổi có khả năng ngăn ngừa bệnh thoái hóa thần kinh và tim mạch, đồng thời thể hiện hoạt động chống ung thư.

Nghiên cứu của Dong-Hyun You và cộng sự (2011) đã chỉ ra rằng dịch chiết từ lá ổi có hoạt tính chống oxy hóa mạnh nhất và khả năng ức chế enzyme tyrosinase cao Điều này cho thấy lá ổi có tiềm năng phát triển thành sản phẩm làm sáng da và chất bảo quản tự nhiên.

Theo nghiên cứu của Theo Venâncio Alves Amaral và cộng sự (2020), phương pháp trích ly hỗ trợ sóng siêu âm mang lại hiệu suất cao hơn so với các phương pháp truyền thống Nghiên cứu đã khảo sát ảnh hưởng của phương pháp này đến hiệu suất chiết xuất lá ổi, đồng thời phân tích mối tương quan giữa hàm lượng polyphenol tổng và hoạt tính chống oxy hóa Các chất chiết khô được thu nhận từ dịch chiết hydroethanolic (50 và 70%) thông qua phương pháp siêu âm Hàm lượng polyphenol tổng được xác định bằng thuốc thử Folin-Ciocalteau, trong khi khả năng chống gốc tự do được đo bằng phương pháp DPPH Kết quả nghiên cứu cung cấp cơ sở quan trọng cho việc ứng dụng các hợp chất phenolic chiết xuất từ lá ổi với hoạt tính chống oxy hóa.

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

Nguyên vật liệu và thiết bị nghiên cứu

3.1.1 Lá ổi Đối tượng nghiên cứu là lá ổi rừng (Psidium Guajava L.) được thu hái tại khu rừng tự nhiên thuộc huyện M’Drak, Đak Lak vào tháng 2/2022

Lá ổi được sử dụng trong nghiên cứu có chiều dài khoảng 10-12cm/lá, thu hái từ lá thứ

Chọn những lá không bị sâu hại có độ tuổi từ 4 trở xuống Sau khi thu hái, lá cần được đưa về phòng thí nghiệm trong ngày, rửa sạch và sấy khô bằng tủ sấy đối lưu ở nhiệt độ 50 °C cho đến khi đạt độ ẩm mong muốn.

Bột lá ổi được xay mịn với kích thước nhỏ hơn 1mm và được bảo quản trong túi zipper có túi hút ẩm Để đảm bảo chất lượng, bột lá ổi được lưu trữ trong tủ lạnh ở nhiệt độ -30 độ C cho các nghiên cứu sau này.

Bột lá ổi có độ ẩm là 8,01 ± 0.10% (phụ lục 3A)

Các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu này bao gồm:

- Thiết bị trích ly áp suất cao (HPE) Buchi E-916

- Máy UV-VIS Model: V630 Jasco

- Máy đọc đĩa ELISA – iMark Microplate Absorbance Reader

Thuốc thử Folin – Ciocalteu phenol, natri cacbonat, natri bicacbonat, quercetin, acid gallic, trolox, DPPH, ABTS, và cơ chất  - nitrophenyl -  - D glucopyranoside, α-amylase, α-glucosidase cùng với methanol được cung cấp bởi Sigma-Aldrich (St Louis, MO, Hoa Kỳ) Ngoài ra, các hóa chất và thuốc thử phân tích khác như NaNO2 5%, AlCl3 10%, NaOH 1M, Na2HPO4, NaH2PO4.2H2O, CaCl2, DNS, NaOH, KNaC4H4O6.4H2O và tinh bột cũng được sử dụng trong nghiên cứu.

- Bình định mức, bình tam giác, cốc đong, ống đong

- Pippet, miccropipette, bóp cao su, phễu

- Giấy lọc, giấy nhôm thực phẩm

- Ống ly tâm, ống nghiệm

- Bông gòn không thấm nước

Phương pháp nghiên cứu

Tổng quan về tài liệu

Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình trích ly polyphenol từ lá ổi

Quy hoạch thực nghiệm và tối ưu hóa quá trình trích ly polyphenol từ lá ổi

Các phương pháp trích ly

Phương pháp áp suất cao

Khảo sát hoạt tính của lá ổi

Hàm lượng polyphenol tổng Hàm lượng flavonoid Chống oxy hóa bằng DPPH

Chống oxy hóa bằng ABTS Ức chế -amylase Ức chế -glucosidase

3.2.2 Quy trình trích ly lá ổi

1/ Lựa chọn nguyên liệu – Rửa

Mục đích của việc lựa chọn lá ổi là để đảm bảo chúng đáp ứng yêu cầu chất lượng, không bị dập nát hay héo úa Sau đó, cần rửa sạch lá ổi để loại bỏ tạp chất, tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình trích ly sau này.

Để tiến hành, cần chọn những lá ổi rừng tươi ngon, không bị dập nát hay héo úa Sau khi hái, lá ổi rừng cần được rửa sạch dưới vòi nước.

Mục đích : tiền xử lý hỗ trợ cho quá trình trích ly

Cách tiến hành : lá ổi rừng được sấy ở 50C đến khối lượng không đổi, sau đó tiến hành xay nhuyễn lá ổi rừng thành bột

Mục đích : hòa tan các hợp chất polyphenol vào dung môi, giúp chiết được các hợp chất polyphenol trong dịch chiết

Cách tiến hành: Trích ly bằng cách sử dụng phương pháp Soxhlet, trích ly áp suất cao

Mục đích: nhằm loại bỏ phần cặn ra khỏi dịch chiết

Cách thực hiện : cho dịch chiết vào ống ly tâm và ly tâm 3500 vòng/phút trong 10 phút.

Nội dung nghiên cứu

3.3.1 Trích ly bằng phương pháp Soxhlet

Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện chiết đến hàm lượng polyphenol tổng

Việc lựa chọn điều kiện trích ly khác nhau có ảnh hưởng đáng kể đến mức độ thu nhận polyphenol Do đó, cần tiến hành khảo sát để xác định điều kiện chiết thích hợp nhằm tối ưu hóa quá trình này.

Để thực hiện quy trình, đầu tiên cân 1g bột lá ổi rừng và cho vào túi lọc Tiếp theo, đặt túi giấy vào trụ chiết và đổ dung môi vào ngập mẫu Sau đó, lắp trụ chiết chứa dung môi và mẫu vào vị trí cố định trên thiết bị Mở van để cho nước lạnh vào ống sinh hàn, sau đó bật công tắc bộ gia nhiệt và điều chỉnh nhiệt độ lên 80 độ C.

Hệ thống Soxhlet Đo các thông số

Thông số cần đo: Đo hàm lượng polyphenol tổng, flavonoid, chống oxy hóa: DPPH,

ABTS, ức chế α-amylase và α-glucosidase

Bảng 3.1 Các yếu tố khảo sát theo phương pháp Soxhlet

STT Nồng độ (%) Thời gian (giờ) Tỉ lệ dung môi/nguyên liệu

Sau khi thực hiện các khảo sát theo các thông số ở bảng 3.2, ta chọn được khoảng tối ưu: Nồng độ methanol: 40 – 60%

Tỉ lệ dung môi/nguyên liệu: 30:1 – 50:1 mL/g

Thí nghiệm 2: Tối ưu hóa điều kiện chiết polyphenol

Mục đích của nghiên cứu là xác định điều kiện chiết xuất tối ưu nhằm thu được hàm lượng polyphenol và flavonoid cao nhất, đồng thời tối đa hóa hoạt tính kháng các gốc tự do DPPH, ABTS, cũng như khả năng ức chế α-amylase và α-glucosidase.

Phương pháp bề mặt đáp ứng được sử dụng để tối ưu hóa điều kiện chiết xuất lá ổi, với ba thông số chính: nồng độ dung môi (X1), thời gian chiết (X2) và tỉ lệ dung môi/nguyên liệu (X3) Thí nghiệm được thiết kế theo mô hình trực giao cấp 2, sử dụng phần mềm Design Expert 12 để bố trí thí nghiệm.

Phương trình hồi quy thực nghiệm cấp trực giao cấp 2:

Y: Biến phụ thuộc xi,j: Nhân tố mã hóa của biến độc lập bo: Hệ số hồi quy bậc 0 bj: Hệ số hồi quy bậc 1 mô tả ảnh hưởng của biến Xj đến Y bij: Hệ số ảnh hưởng đồng thời của biến Xi và Xj đến Y bjj: Hệ số hồi quy bậc hai mô tả ảnh hưởng của biến X 2 j đến Y

Xác định hệ số b j , b ji , b jj : bj = ∑ 𝑥 𝑗𝑖 𝑦 𝑖

Số thí nghiệm bố trí trong quy hoạch trực giao cấp 2 với cấu trúc tâm:

Trong số 20 thí nghiệm được tiến hành, có 8 thí nghiệm ở hai biên, có 6 thí nghiệm ở điểm sao và 6 thí nghiệm tại tâm

3.3.2 Trích ly bằng phương pháp sử dụng áp suất cao (HPE)

Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện chiết đến hàm lượng polyphenol tổng trong phương pháp HPE

Việc lựa chọn các điều kiện chiết xuất khác nhau sẽ ảnh hưởng đến mức độ thu nhận polyphenol Do đó, cần tiến hành khảo sát để xác định điều kiện chiết xuất tối ưu nhằm nâng cao hiệu quả thu nhận polyphenol.

Cách thực hiện: Cân 1,5g bột lá ổi rừng và 10g cát nhồi vào ống chiết của máy Speed

Extractor Buchi-E916 Cài đặt các thông số vận hành máy: Áp suất 130bar Nhiệt độ chiết, nồng độ dung môi, thời gian chiết sẽ thực hiện theo bảng 3.2

Thông số cần đo: Đo hàm lượng polyphenol tổng, flavonoid, chống oxy hóa: DPPH,

ABTS, ức chế α-amylase và α-glucosidase

1,5g bột lá ổi Ống chiết

Hệ thống HPE Đo các thông số

Bảng 3.2 Thông số khảo sát các yếu tố phương pháp trích ly HPE

STT Nồng độ (%) Thời gian (phút) Nhiệt độ (C)

Sau khi thực hiện các khảo sát ở bảng trên, ta chọn được khoảng tối ưu:

Thí nghiệm 4: Tối ưu hóa điều kiện chiết polyphenol

Mục tiêu của nghiên cứu là xác định điều kiện chiết xuất tối ưu nhằm thu được hàm lượng polyphenol và flavonoid cao nhất, đồng thời tối đa hóa hoạt tính kháng các gốc tự do DPPH, ABTS, cũng như khả năng ức chế α-amylase và α-glucosidase.

Phương pháp bề mặt đáp ứng được sử dụng để tối ưu hóa điều kiện chiết xuất lá ổi, với ba thông số chính: nồng độ dung môi (X1), thời gian chiết (X2) và nhiệt độ chiết (X3) Thí nghiệm được thiết kế theo mô hình trực giao cấp 2, sử dụng phần mềm Design Expert 12 để bố trí các thí nghiệm.

Phương trình hồi quy thực nghiệm cấp trực giao cấp 2:

Y: Biến phụ thuộc xi,j: Nhân tố mã hóa của biến độc lập bo: Hệ số hồi quy bậc 0 bj: Hệ số hồi quy bậc 1 mô tả ảnh hưởng của biến Xj đến Y bij: Hệ số ảnh hưởng đồng thời của biến Xi và Xj đến Y bjj: Hệ số hồi quy bậc hai mô tả ảnh hưởng của biến X 2 j đến Y

Xác định hệ số b j , b ji , b jj : bj = ∑ 𝑥 𝑗𝑖 𝑦 𝑖

Số thí nghiệm bố trí trong quy hoạch trực giao cấp 2 với cấu trúc tâm:

Trong số 20 thí nghiệm được tiến hành, có 8 thí nghiệm ở hai biên, có 6 thí nghiệm ở điểm sao và 6 thí nghiệm tại tâm.

Phương pháp phân tích

3.4.1 Xác định hàm lượng polyphenol tổng

Hàm lượng polyphenol tổng số được xác định theo phương pháp của Quang Vinh Nguyen và Jongbang Eun (2011) bằng cách xây dựng đường chuẩn gallic Đường chuẩn được tạo ra từ 1mL dung dịch axit gallic trong methanol với các nồng độ khác nhau: 0,0078, 0,0156, 0,03125, 0,0625 và 0,125 mg/mL, trộn với 5mL thuốc thử Folin - Ciocalteu (pha loãng 10 lần) và 4mL Na2CO3 (75 g/L) Độ hấp thu của dung dịch được đo sau 30 phút ở bước sóng 765 nm bằng máy UV-VIS Sau khi xây dựng đường chuẩn và phương trình tương quan giữa nồng độ gallic và độ hấp thụ, độ hấp thụ của mẫu cao chiết được xác định tương tự như axit gallic, thay thế bằng 1mL dịch chiết Tổng hàm lượng polyphenol của cao trích được tính theo giá trị tương đương với axit gallic (gallic acid equivalents - GAE) dựa vào đường chuẩn.

Trong đó: C: hàm lượng polyphenol tổng (mgGAE/g) c:giá trị độ hấp thu tương ứng với đường chuẩn acid gallic (mg/mL) (phụ lục 3B)

V là thể tích mẫu (mL) m là khối lượng dịch mẫu (g)

3.4.2 Xác định hàm lượng flavonoid trong dịch chiết

Tổng hàm lượng flavonoid được xác định theo phương pháp của Vinh Nguyen và Jongbang Eun (2011) bằng cách xây dựng đường chuẩn quercetin Đường chuẩn được tạo ra từ 0,5 mL dung dịch quercetin trong methanol với các nồng độ 0,02, 0,04, 0,06, 0,08 và 0,1 mg/mL, trộn với 2,5 mL nước cất và 0,15 mL NaNO2 5% Sau 5 phút, bổ sung 0,3 mL AlCl3 10%, tiếp theo là 1 mL NaOH 1M và 0,55 mL nước cất sau 6 phút, rồi đo độ hấp thụ ở bước sóng 510 nm bằng máy UV-VIS Đường chuẩn và phương trình tương quan giữa nồng độ quercetin và độ hấp thụ được xây dựng, sau đó độ hấp thụ của mẫu dịch chiết được xác định tương tự với 0,5 mL dung dịch mẫu Tổng hàm lượng flavonoid của cao trích được tính toán tương đương với quercetin (quercetin equivalent – QE) dựa vào đường chuẩn.

Trong đó: F là hàm lượng favonoid tổng (mgQE/g) f là giá trị độ hấp thụ tương ứng với đường chuẩn quercetin (mg/mL) (phụ lục 3C)

V là thể tích mẫu (mL) m là khối lượng mẫu (g)

3.4.3 Xác định khả năng kháng oxy hóa

Khả năng ức chế gốc tự do DPPH được nghiên cứu theo phương pháp của Tang Van Nguyen và cộng sự (2015) Dung dịch DPPH được chuẩn bị bằng cách pha loãng với methanol (0,24 g/L) để đạt độ hấp thụ 1,1 ± 0,02 tại bước sóng 515 nm Sau đó, 0,1 mL dịch chiết được trộn với 3,9 mL dung dịch DPPH trong ống nghiệm và để trong 30 phút ở nhiệt độ phòng trong điều kiện tối Độ hấp thụ của dung dịch phản ứng được đo tại bước sóng tương ứng.

Kết quả từ máy quang phổ ở bước sóng 515 nm cho thấy Trolox được sử dụng làm chất đối chứng dương Hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH được xác định thông qua IC50, tức là nồng độ dịch chiết có khả năng ức chế 50% gốc tự do DPPH.

Khả năng ức chế gốc tự do ABTS được thực hiện theo nghiên cứu của Tang Van Nguyen và cộng sự (2015) Dung dịch ABTS làm việc được chuẩn bị từ hỗn hợp ABTS 7,4 mM và Kali Persulfate 2,6 mM, sau đó bảo quản trong 12 giờ trong điều kiện tối để đạt được nồng độ ABTS với độ hấp thụ 1,1 ± 0,02 tại bước sóng 734 nm Tiến hành cho 1,8 mL dung dịch ABTS vào ống nghiệm chứa 0,2 mL dịch chiết, lắc đều và để phản ứng trong 2 giờ trong bóng tối trước khi đo độ hấp thụ tại bước sóng.

Trolox, với bước sóng 734 nm, được sử dụng làm đối chứng dương trong nghiên cứu Khả năng ức chế gốc tự do ABTS được tính theo mg trolox equivalent (mg TE/g chất khô) Hoạt tính kháng oxy hóa được xác định thông qua một công thức cụ thể.

Trong đó: AB là độ hấp thụ màu của mẫu kiểm chứng (mẫu chỉ chứa dung môi)

AA là độ hấp thụ màu của dung dịch phản ứng chứa dịch chiết sau 2 giờ

Khả năng ức chế được tính bằng công thức: \$\text{Khả năng ức chế} = \% \text{kháng oxy hoá} - b \times V \times \text{độ pha loãng} \, (\text{mgTE/g})\$, trong đó, \$a\$ và \$b\$ là hệ số trong phương trình chuẩn Trolox, \$V\$ là thể tích mẫu (mL) và \$m\$ là khối lượng mẫu (g).

3.4.4 Xác định khả năng ức chế α-amylase và α-glucosidase

Khả năng ức chế α-amylase được xác định theo phương pháp của Kwon (2006) Trong thí nghiệm, 200 μL dung dịch chiết xuất với nồng độ khác nhau được trộn với 300 μL dung dịch α-amylase (2 μg/mL) và ủ ở 40 °C trong 10 phút Sau đó, 400 μL dung dịch tinh bột 1% trong đệm phosphate được bổ sung và tiếp tục ủ ở 40 °C trong 20 phút Phản ứng được kết thúc bằng cách thêm 2 mL dinitrosalicylic acid, sau đó ủ thêm 10 phút trong nước sôi và làm nguội đến nhiệt độ phòng Cuối cùng, độ hấp thụ được đo ở bước sóng 540 nm bằng máy UV-VIS.

Khả năng ức chế enzyme α – glucosidase được xác định theo phương pháp của Hogan (2010) Trong thí nghiệm, 50 μL dung dịch chiết xuất hòa tan trong đệm phosphate 0,1 M (pH 6,8) với các nồng độ khác nhau được trộn với 50 μL dung dịch α – glucosidase 2 àg/mL và ủ ở nhiệt độ 37 °C trong 20 phút.

Bổ sung 50 μL dung dịch p–nitrophenyl-α-D-Glucopyranoside 2,5 mM trong đệm phosphate 0,1M (pH 6,8) Tiếp tục ủ ở 37 ° C trong 30 phút Sau khi ủ tiến hành đo độ hấp thụ ở bước sóng

405 nm bằng máy ELISA (BIO-RAD iMARK microplate reader) Khả năng ức chế hoạt tính α– amylase và α–glucosidase được tính như sau:

A0 là độ hấp thụ của mẫu kiểm chứng (mẫu chỉ chứa dung môi hòa tan cao chiết) ở thời điểm ban đầu

A1 là độ hấp thụ của mẫu thí nghiệm

IC50 (nồng độ ức chế tối đa một nửa) là thước đo quan trọng trong việc đánh giá khả năng ức chế một chức năng sinh học hoặc hóa sinh cụ thể Đây là biện pháp định lượng cho biết nồng độ cần thiết của một chất ức chế để làm giảm hoạt động của một quá trình sinh học hoặc thành phần sinh học xuống 50% Thành phần sinh học có thể bao gồm enzyme, tế bào, thụ thể tế bào hoặc vi sinh vật (Swinney, 2011).

IC50 được xác định bằng cách vẽ đồ thị thể hiện mối quan hệ giữa phần trăm ức chế và nồng độ Sử dụng phần mềm Excel, ta có thể thu được phương trình có dạng y = ax + b, với y = 50.

Trong đó: a, b: là hệ số của phương trình y = ax + b được thiết lập từ 5 điểm với x là nồng độ mẫu (mg/mL), y là khả năng ức chế enzyme (%)

Phương pháp xử lý số liệu

Kết quả thí nghiệm được phân tích bằng phần mềm IBM SPSS Statistics 26, nhằm tính toán giá trị trung bình, độ lệch chuẩn, độ chính xác và xác định sự khác biệt có ý nghĩa ở mức alpha 5% giữa các mẫu.

Bảng thiết kế thí nghiệm theo phương pháp bề mặt đáp ứng CCD, cùng với bảng phân tích ANOVA và biểu đồ không gian 3D, đã được xử lý để tính toán và dự đoán các giá trị tối ưu của mô hình bằng phần mềm Design Expert phiên bản 12.0.3 – StatEase.

KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

Phương pháp Soxhlet

Nghiên cứu của Nguyễn Quang Vinh và cộng sự (2022) chỉ ra rằng hàm lượng polyphenol tổng trong cao chiết lá ổi rừng có mối tương quan thuận chặt chẽ với hàm lượng flavonoid tổng và hoạt tính sinh học Do đó, nghiên cứu này sẽ khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố công nghệ đến khả năng trích ly polyphenol từ lá ổi rừng bằng kỹ thuật Soxhlet, nhằm xác định vùng tối ưu và xây dựng mô hình tối ưu để nâng cao hiệu quả trích ly Hiệu quả trích ly phụ thuộc vào nhiều yếu tố như tính chất nguyên liệu, thành phần và hàm lượng hợp chất cần chiết tách, do đó việc lựa chọn thông số công nghệ phù hợp cho từng loại nguyên liệu là rất quan trọng Trong nghiên cứu này, ba thông số công nghệ sẽ được khảo sát: nồng độ dung môi trích ly (methanol), tỉ lệ dung môi/nguyên liệu và thời gian trích ly.

4.1.1 Ảnh hưởng của nồng độ dung môi đến quá trình trích ly polyphenol từ lá ổi rừng

Các hợp chất polyphenol trong thực vật rất đa dạng và phong phú, với khả năng phân cực khác nhau dẫn đến sự khác biệt trong khả năng hòa tan Việc lựa chọn dung môi cho quá trình trích ly phụ thuộc vào khả năng thấm của dung môi vào tế bào thực vật (Cracolice và Peters, 2009) Kết quả khảo sát về ảnh hưởng của nồng độ dung môi đến quá trình trích ly polyphenol từ lá ổi rừng được trình bày trong bảng 4.1.

Bảng 4.1 Ảnh hưởng nồng độ dung môi tương ứng với thời gian chiết là 3h, tỉ lệ dung môi/nguyên liệu 30:1 bằng phương pháp Soxhlet

Các chữ cái giống nhau trong cùng một cột thể hiện sự giống nhau về mặt ý nghĩa  = 5%.

Nồng độ dung môi trong quá trình trích ly ảnh hưởng đáng kể đến khả năng trích ly polyphenol từ lá ổi rừng, với hàm lượng polyphenol tổng đạt cao nhất 115,35 ± 3,95 (mgGAE/g) ở nồng độ methanol 50% Khi nồng độ methanol tăng lên 60% và 70%, hàm lượng polyphenol tổng có xu hướng giảm Điều này cho thấy polyphenol hòa tan tốt trong methanol 50%, và độ phân cực của dung môi là yếu tố quan trọng trong việc tăng khả năng hòa tan Nghiên cứu của Muhammad và cộng sự (2019) cũng chỉ ra rằng polyphenol hòa tan nhiều hơn trong hỗn hợp methanol và nước Elixabet và cộng sự (2016) cho biết hàm lượng polyphenol tổng trích ly từ methanol tinh khiết thấp hơn so với các hỗn hợp dung môi khác Phạm Thị Kim Quyên và cộng sự (2016) xác nhận rằng khi nồng độ methanol tăng từ 0 đến 50%, hàm lượng polyphenol tổng tăng, nhưng giảm khi nồng độ tiếp tục tăng từ 50 đến 70% Nghiên cứu của Valentina M Simic và cộng sự (2016) cho thấy hàm lượng polyphenol tổng từ quả mâm xôi cũng đạt cao nhất ở nồng độ ethanol 50% Ngược lại, Florina Dranca và Mircea Oroian (2015) cho rằng hàm lượng polyphenol tổng từ vỏ cà tím tăng khi nồng độ dung môi từ 50% đến 70%, nhưng tiếp tục tăng nồng độ lại dẫn đến giảm nhẹ hàm lượng Sự khác biệt này có thể do các loại nguyên liệu thực vật khác nhau có nồng độ dung môi tối ưu khác nhau.

4.1.2 Ảnh hưởng của tỉ lệ dung môi/nguyên liệu đến quá trình trích ly polyphenol từ lá ổi rừng

Nghiên cứu cho thấy tỉ lệ dung môi/nguyên liệu có ảnh hưởng đến khả năng trích ly polyphenol từ thực vật, và tỉ lệ này còn phụ thuộc vào loại nguyên liệu và dung môi sử dụng (Manuel và cộng sự, 2017) Kết quả khảo sát về ảnh hưởng của tỉ lệ dung môi/nguyên liệu đến quá trình trích ly polyphenol từ lá ổi rừng được trình bày trong bảng 4.2.

Bảng 4.2 Ảnh hưởng tỉ lệ dung môi/nguyên liệu tương ứng với thời gian chiết là 3h, nồng độ dung môi là 50% bằng phương pháp Soxhlet

Tỉ lệ dung môi/nguyên liệu

Các chữ cái giống nhau trong cùng một cột thể hiện sự giống nhau về mặt ý nghĩa  = 5%.

Khi tăng tỉ lệ dung môi/nguyên liệu từ 20:1 lên 40:1 (mL/g), hàm lượng polyphenol tổng có xu hướng tăng, nhưng lại giảm khi tỉ lệ này đạt 50:1 Nghiên cứu của Phạm Thị Kim Quyên và cộng sự (2016) cho thấy sự chênh lệch gradient nồng độ giữa các chất trong nguyên liệu và môi trường chiết làm tăng hiệu quả chiết Nồng độ bão hòa là điểm tối đa mà chất tan có thể được chiết xuất trong dung môi, và tỉ lệ dung môi/nguyên liệu cần phải thấp hơn nồng độ bão hòa (Yee và cộng sự, 2019) Tại tỉ lệ 20:1, nhiều chất tan vẫn còn trong nguyên liệu thực vật, dẫn đến hiệu quả trích ly không cao Ngược lại, ở tỉ lệ 50:1, hàm lượng polyphenol tổng giảm do nồng độ chất hòa tan trong nguyên liệu và dung dịch đã đạt đến nồng độ bão hòa.

Tăng hàm lượng nước trong hệ dung môi dẫn đến hiện tượng trương nở trong nguyên liệu thực vật, làm tăng sự tiếp xúc giữa chất nền và dung môi, từ đó nâng cao năng suất chiết xuất (Hemwimon và cộng sự, 2007) Tỉ lệ chất rắn trên dung môi cao được cho là thuận lợi cho việc chiết xuất các hợp chất phenolic, nhờ vào gradient nồng độ giữa chất rắn và dung môi, thúc đẩy tốc độ khuếch tán và cho phép chiết xuất nhiều chất rắn hơn (Al-Farsi và cộng sự, 2007) Nghiên cứu của Zhang và cộng sự (2007) cho thấy rằng hoạt tính sinh học tăng khi lượng dung môi chiết xuất tăng, nhưng sẽ không tiếp tục tăng khi đạt trạng thái cân bằng (Tan và cộng sự, 2011) Tỉ lệ dung môi/nguyên liệu ảnh hưởng đến độ hòa tan và hằng số cân bằng, làm tăng tổng hàm lượng phenolic (Cacace và Mazza, 2003) Nghiên cứu của Pei và cộng sự (2014) chỉ ra rằng hàm lượng polyphenol tổng tăng đáng kể khi tỉ lệ chất rắn trên dung môi tăng từ 1/10 lên 1/20 và 1/60 Tương tự, nghiên cứu về các hợp chất phenolic từ lá lốt (Stamatopoulos và cộng sự, 2014) cho thấy hiệu suất tách chiết tăng cho đến tỉ lệ chất rắn/dung môi là 1/8, sau đó không đổi ở tỉ lệ 1/10.

4.1.3 Ảnh hưởng của thời gian chiết đến quá trình trích ly polyphenol từ lá ổi rừng

Thời gian trích ly đóng vai trò quan trọng trong việc chiết xuất các hợp chất polyphenol, với việc tăng thời gian chiết dẫn đến hàm lượng polyphenol tổng cao hơn (Cracolice và Peters, 2009) Kết quả khảo sát về ảnh hưởng của thời gian chiết đến quá trình trích ly polyphenol từ lá ổi rừng được trình bày trong bảng 4.3.

Bảng 4.3 Ảnh hưởng thời gian chiết tương ứng với nồng độ dung môi là 50%, tỉ lệ dung môi/nguyên liệu 40:1 bằng phương pháp Soxhlet

Các chữ cái giống nhau trong một cột thể hiện sự giống nhau về mặt ý nghĩa  = 5%.

Hàm lượng polyphenol tổng tăng từ 2h đến 4h, đạt đỉnh 251,30 ± 2,98 (mgGAE/g) ở 4h, nhưng giảm khi trích ly 5h Theo định luật thứ hai của Fick, thời gian kéo dài làm tăng sự khuếch tán các chất từ tế bào ra ngoài, nhưng hiệu quả chiết không tăng mãi mãi Khi thời gian chiết kéo dài, các hợp chất polyphenol đạt trạng thái cân bằng, dẫn đến giảm hàm lượng polyphenol tổng (Pham và cộng sự, 2016) Chew và cộng sự (2011) cũng chỉ ra rằng thời gian chiết dài có thể làm tăng tiếp xúc với oxy, tăng khả năng oxy hóa polyphenol Nghiên cứu của Nguyen và cộng sự (2020) cho thấy hàm lượng polyphenol tổng cao nhất (96,09 μgGAE/mg) đạt được khi chiết 3h và giảm dần khi thời gian chiết tăng, có thể do sự tương tác giữa các thông số trong quá trình trích ly.

Kết luận từ bảng 4.1, 4.2 và 4.3 cho thấy hàm lượng polyphenol tổng đạt cao nhất khi sử dụng nồng độ dung môi methanol 50%, thời gian chiết 4 giờ và tỉ lệ dung môi/nguyên liệu 40:1 mL/g Những thông số này xác định vùng tối ưu cho quy trình công nghệ.

 Nồng độ dung môi methanol: 40-60%

 Tỉ lệ dung môi/nguyên liệu: 30:1 – 50:1 mL/g

4.1.4 Tối ưu quá trình trích ly polyphenol từ lá ổi rừng bằng phương pháp Soxhlet

Kết quả khảo sát cho thấy các thông số công nghệ ảnh hưởng đến hiệu suất trích ly polyphenol từ lá ổi rừng bằng phương pháp Soxhlet Dựa trên đó, vùng lựa chọn đã được xác định để xây dựng mô hình Central Composite Design tối ưu thông qua phần mềm Design Expert 12 Giá trị biên của các thông số chiết đã được trình bày trong bảng 4.4.

Bảng 4.4 Sơ đồ bố trí thí nghiệm mã hóa các biến độc lập

Tên biến Mức nghiên cứu

Biến thực Biến mã hóa -α -1 0 +1 +α

X 3 : Tỉ lệ dung môi/nguyên liệu

4.1.4.1 Ảnh hưởng của các thông số quá trình đến hàm lượng polyphenol tổng, hàm lượng flavonoid trong dịch chiết a/ Kết quả thí nghiệm Ảnh hưởng của ba biến: nồng độ dung môi, thời gian chiết và tỉ lệ dung môi/nguyên liệu đến hàm lượng polyphenol tổng và hàm lượng flanovoid trong dịch chiết lá ổi rừng được thể hiện trong bảng 4.5 Hàm lượng polyphenol tổng được tính dựa trên chất chuẩn là acid gallic, và có đơn vị là mgGAE/g Hàm lượng flaonoid trong dịch chiết được tính dựa trên chất chuẩn là quercetin, với đơn vị là mgQE/g

Bảng 4.5 Kết quả bố trí thí nghiệm đầy đủ theo quy hoạch thực nghiệm (CCD) giá trị hàm lượng polyphenol tổng và flavonoid

STT Biến thực Biến mã hóa Hàm lượng polyphenol tổng

Ghi chú: (*) thí nghiệm được tiến hành tại biên, ( c ) thí nghiệm được tiến hành tại điểm tâm

Các chữ cái giống nhau trong cùng một cột thể hiện sự giống nhau về mặt ý nghĩa  = 5%. b/ Phân tích thống kê và sự phù hợp của mô hình

Dữ liệu thực nghiệm được phân tích thông qua phương sai (ANOVA), trong khi ý nghĩa của các hệ số hồi quy được đánh giá dựa trên giá trị p tương ứng.

Bảng 4.6 Phân tích Anova ảnh hưởng của các yếu tố đến hàm lượng polyphenol tổng

Giá trị Tổng các bình phương

Sự thiếu phù hợp 4322,07 5 864,41 47,08 0,0003 Có ý nghĩa

Bảng 4.7 Phân tích Anova ảnh hưởng của các yếu tố đến hàm lượng flanovoid trong dịch chiết

Giá trị Tổng các bình phương

Sự thiếu phù hợp 4004,49 5 800,9 192,59 < 0,0001 Có ý nghĩa

Bảng 4.8 Kết quả phân tích sự phù hợp của mô hình và thực nghiệm của polyphenol tổng

Thông số Giá trị Thông số Giá trị Độ lệch chuẩn 21,01 R 2 0,9398

Giá trị trung bình 185,15 R 2 hiệu chỉnh 0,8856

Hệ số biến thiên (CV) (%) 11,35 R 2 dự đoán 0,5284 Độ chính xác phù hợp

Bảng 4.9 Kết quả phân tích sự phù hợp của mô hình và thực nghiệm của flavonoid

Thông số Giá trị Thông số Giá trị Độ lệch chuẩn 20,06 R 2 0,7581

Giá trị trung bình 101,48 R 2 hiệu chỉnh 0,5405

Hệ số biến thiên (CV) (%) 19,77 R 2 dự đoán -0,7338 Độ chính xác phù hợp

Mô hình hàm lượng polyphenol tổng có R² là 0,9398, cho thấy tính đầy đủ cao với chỉ 6,02% không giải thích được, chứng tỏ mô hình phù hợp Trong khi đó, R² của hàm lượng flavonoid là 0,7581, mặc dù không cao nhưng vẫn trong khoảng cho phép, với 24,19% không giải thích được Giá trị p của sự thiếu phù hợp của cả hai mô hình đều nhỏ hơn 0,05, cho thấy mô hình chưa tương thích với thực nghiệm Đối với polyphenol tổng, R² hiệu chỉnh là 0,8856, chênh lệch hơn 0,2 so với R² dự đoán 0,5284, cho thấy mô hình có vấn đề Giá trị R² dự đoán là -0,7338, cho thấy khả năng dự đoán chưa tốt Mô hình cần được kiểm định lại thông qua mẫu kiểm chứng để xác nhận tính khả thi Nếu giá trị đo được nằm trong khoảng tính toán, mô hình có thể được sử dụng.

Tỉ lệ dung môi/nguyên liệu và các tương tác 2 chiều giữa các biến có ảnh hưởng không đáng kể đến giá trị của TPC với độ tin cậy 95%, khi giá trị p của X2, X3, X1X2, X1X3, X2X3, X2^2 và X3^2 đều lớn hơn 0,05 Tương tự, các yếu tố này cũng không có tác động đáng kể đến giá trị TFC Tuy nhiên, những yếu tố có giá trị p nhỏ hơn 0,05 cho thấy chúng có ảnh hưởng quan trọng đến hàm mục tiêu.

Sau khi xử lý dữ liệu bằng phần mềm Design Expert, chúng tôi đã thu được phương trình hồi quy thể hiện ảnh hưởng của ba biến đến hàm lượng polyphenol tổng (TPC).

Sau khi loại bỏ các hệ số hồi quy không có ý nghĩa ra khỏi mô hình, phương trình hồi quy của mô hình như sau:

Tiến hành xử lý số liệu, thu được phương trình thể hiện ảnh hưởng của ba biến đến hàm lượng flavonoid (TFC) trong dịch chiết:

Sau khi loại bỏ các hệ số hồi quy không có ý nghĩa ra khỏi mô hình, phương trình hồi quy của mô hình như sau:

Trong đó: X1: Nồng độ dung môi (%)

X3: Tỉ lệ dung môi/nguyên liệu (ml/g) d/ Ảnh hưởng của các yếu tố

Phương pháp trích ly bằng áp suất cao

Việc lựa chọn thông số công nghệ cho từng loại nguyên liệu và phương pháp trích ly là rất quan trọng Nghiên cứu này tập trung vào việc khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố công nghệ đến khả năng trích ly polyphenol từ lá ổi rừng bằng phương pháp trích ly áp suất cao Mục tiêu là xác định giá trị biên và xây dựng mô hình tối ưu hóa khả năng trích ly polyphenol Ba thông số công nghệ được khảo sát bao gồm nồng độ dung môi (methanol), thời gian chiết và nhiệt độ chiết.

4.2.1 Ảnh hưởng của nồng độ dung môi đến quá trình trích ly polyphenol từ lá ổi rừng

Các nguyên liệu thực vật khác nhau chứa lượng hợp chất polyphenol khác nhau, dẫn đến nồng độ dung môi tối ưu cũng khác nhau Kết quả khảo sát về ảnh hưởng của nồng độ dung môi đến quá trình trích ly polyphenol từ lá ổi rừng bằng phương pháp trích ly áp suất cao được trình bày trong bảng 4.21.

Bảng 4.21 Ảnh hưởng của nồng độ dung môi tương ứng với thời gian chiết là 10 phút, nhiệt độ chiết là 60  C bằng phương pháp trích ly bằng áp suất cao

Các chữ cái giống nhau trong cùng một cột thể hiện sự giống nhau về mặt ý nghĩa  = 5%.

Hàm lượng polyphenol tổng đạt mức cao nhất là 178,93 ± 3,39 (mgGAE/g) ở nồng độ dung môi 50% Tuy nhiên, khi nồng độ dung môi tăng lên 60% và 70%, hàm lượng polyphenol tổng lại giảm Phương pháp Soxhlet cho thấy mức độ polyphenol thu được bị ảnh hưởng bởi độ hòa tan của các hợp chất polyphenol trong dung môi, với hàm lượng polyphenol tổng cao nhất ở nồng độ 50% Nghiên cứu này cũng chỉ ra ảnh hưởng của điều kiện chiết đến hàm lượng polyphenol và khả năng chống oxy hóa của dịch chiết lá bầu đất (Gynura procumbens).

Nghiên cứu của Phạm Thị Kim Quyên và cộng sự (2016) cho thấy rằng nồng độ dung môi 50% mang lại hàm lượng polyphenol cao nhất đạt 31,61 mgGAE/g khi trồng Lour tại Khánh Hòa Đồng thời, Nagendra Prasad và cộng sự (2009) đã chỉ ra rằng việc trích ly bằng áp suất cao ảnh hưởng đến năng suất chiết, tổng hàm lượng phenol và hoạt tính chống oxy hóa của vỏ nhãn, trong đó việc tăng nồng độ ethanol từ 25% đến 50% làm tăng hàm lượng phenol nhờ vào flavonoid và các hợp chất phenolic có khả năng thủy phân trong hỗn hợp ethanol và nước.

4.2.2 Ảnh hưởng của thời gian chiết đến quá trình trích ly polyphenol từ lá ổi rừng

Trong các phương pháp trích ly thông thường, thời gian chiết lâu hơn sẽ làm tăng hiệu quả chiết (Cracolice và Peters, 2009) Tuy nhiên, trong phương pháp trích ly bằng áp suất cao, thời gian chiết lại không ảnh hưởng đáng kể đến hàm lượng polyphenol tổng Kết quả khảo sát về ảnh hưởng của thời gian chiết đến quá trình trích ly polyphenol từ lá ổi rừng bằng phương pháp này được trình bày trong bảng 4.22.

Bảng 4.22 Ảnh hưởng của thời gian chiết tương ứng với nồng độ dung môi là 50%, nhiệt độ chiết là 60  C bằng phương pháp trích ly bằng áp suất cao

Các chữ cái giống nhau trong cùng một cột thể hiện sự giống nhau về mặt ý nghĩa  = 5%.

Giá trị tổng phenolic (TPC) đạt đỉnh 178,97 ± 1,48 (mgGAE/g) sau 10 phút chiết xuất Khi thời gian chiết tăng lên 15 và 20 phút, TPC có xu hướng giảm Ở áp suất 130 bar, sự gia tăng thời gian chiết không làm tăng đáng kể giá trị TPC Theo lý thuyết Pascal, áp suất tác động đồng nhất và tức thì lên nguyên liệu trong quá trình chiết xuất áp suất cao, dẫn đến sự cân bằng áp suất nhanh chóng giữa bên trong và bên ngoài tế bào Điều này cho phép tốc độ khuếch tán của dung môi cao, giúp đạt được năng suất chiết xuất tối ưu trong thời gian ngắn.

Nghiên cứu cho thấy hàm lượng polyphenol tổng đạt mức cao nhất sau 10 phút chiết xuất, điều này được xác nhận bởi Zhang và cộng sự (2005) cũng như Prasad và cộng sự (2008) trong các nghiên cứu về flavonoid từ keo ong và vải thiều Lin và cộng sự (2022) chỉ ra rằng việc tăng thời gian chiết có thể nâng cao hiệu quả, nhưng sau một thời gian nhất định, kết quả không có sự thay đổi đáng kể Khảo sát cho thấy các hợp chất trong lá ổi được hòa tan bằng áp suất cao và đạt trạng thái cân bằng sau khoảng 10 phút, do đó, việc kéo dài thời gian chiết sẽ không mang lại hiệu quả cao hơn (Ahmad và cộng sự, 2021).

4.2.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ chiết đến quá trình trích ly polyphenol từ lá ổi rừng

Nghiên cứu của Durling và cộng sự (2007) cùng với Silva và cộng sự (2007) cho thấy rằng nhiệt độ có ảnh hưởng tích cực đến hiệu quả chiết xuất các hợp chất polyphenol Kết quả khảo sát về tác động của nhiệt độ trong quá trình trích ly polyphenol từ lá ổi rừng bằng phương pháp trích ly áp suất cao được trình bày trong bảng 4.23.

Bảng 4.23 Ảnh hưởng của nhiệt độ chiết tương ứng với nồng độ dung môi là 50%, thời gian chiết là 10 phút bằng phương pháp trích ly bằng áp suất cao

Các chữ cái giống nhau trong cùng một cột thể hiện sự giống nhau về mặt ý nghĩa  = 5%.

Giá trị TPC tăng dần từ 60C đến 80C, đạt cao nhất ở 80C với 242,8231 mgGAE/g, nhưng bắt đầu giảm khi nhiệt độ lên 90C Nghiên cứu của Durling và Silva cho thấy nhiệt độ cao làm tăng hiệu quả chiết xuất polyphenol nhờ vào khả năng hòa tan và khuếch tán tốt hơn (Al-Farsi và Lee, 2008) Wang và cộng sự cũng phát hiện rằng nhiệt độ cao giúp giải phóng polyphenol liên kết, làm tăng tính thấm của màng tế bào thực vật Tuy nhiên, nhiệt độ quá cao có thể phá hủy các chất chống oxy hóa không bền (Liyana và Shahidi, 2005) và dẫn đến phân hủy polyphenol do phản ứng thủy phân, oxy hóa và polymer hóa (Simon và cộng sự, 1990) Nghiên cứu của Nagendra Prasad cho thấy khi chiết xuất vỏ nhãn, hàm lượng phenol đạt cao nhất ở 50C (23 ± 0,3 mg/g) và có xu hướng giảm khi nhiệt độ tiếp tục tăng.

Kết luận từ bảng 4.21, 4.22 và 4.23 cho thấy hàm lượng polyphenol tổng đạt cao nhất khi sử dụng nồng độ dung môi methanol 50%, thời gian chiết 10 phút và nhiệt độ chiết 80C.

Từ đó, chọn được vùng tối ưu của các thông số công nghệ như sau:

 Nồng độ dung môi methanol: 40-60%

4.2.4 Tối ưu quá trình trích ly polyphenol từ lá ổi rừng bằng phương pháp trích ly bằng áp suất cao

Kết quả khảo sát cho thấy các thông số công nghệ ảnh hưởng đến hiệu suất trích ly polyphenol từ lá ổi rừng bằng phương pháp trích ly áp suất cao Giá trị biên của các thông số chiết đã được xác định và trình bày trong bảng 4.24 Dựa trên những giá trị này, mô hình tối ưu đã được xây dựng bằng phương pháp đáp ứng bề mặt có tâm quay, sử dụng phần mềm Design Expert 12.

Bảng 4.24 Sơ đồ bố trí thí nghiệm mã hóa các biến độc lập

Tên biến Mức nghiên cứu

Biến thực Biến mã hóa -α -1 0 +1 +α

4.2.4.1 Ảnh hưởng của các thông số quá trình đến hàm lượng polyphenol tổng, hàm lượng flavonoid trong dịch chiết a/ Kết quả thí nghiệm Ảnh hưởng của ba biến: nồng độ dung môi, thời gian chiết và nhiệt độ chiết đến hàm lượng polyphenol tổng và hàm lượng flanovoid trong dịch chiết lá ổi rừng được thể hiện trong bảng 4.25 Hàm lượng polyphenol tổng được tính dựa trên chất chuẩn là acid gallic, và có đơn vị là mgGAE/g Hàm lượng flavonoid trong dịch chiết được tính dựa trên chất chuẩn là quercetin, với đơn vị là mgQE/g

Bảng 4.25 Kết quả bố trí thí nghiệm đầy đủ theo quy hoạch thực nghiệm (CCD) hàm lượng polyphenol tổng và flavonoid bằng áp suất cao

STT Biến thực Biến mã hóa Hàm lượng polyphenol tổng

Ghi chú: (*) thí nghiệm được tiến hành tại biên, ( c ) thí nghiệm được tiến hành tại điểm tâm

Các chữ cái giống nhau trong cùng một cột cho thấy sự tương đồng về mặt ý nghĩa với mức ý nghĩa $\alpha = 5\%$ Bên cạnh đó, việc phân tích thống kê cũng như đánh giá sự phù hợp của mô hình đã được xây dựng là rất quan trọng.

Dữ liệu thực nghiệm được phân tích thông qua phương sai (ANOVA), trong khi ý nghĩa của các hệ số hồi quy được đánh giá dựa trên giá trị p tương ứng.

Bảng 4.26 Phân tích Anova ảnh hưởng của các yếu tố đến hàm lượng polyphenol tổng

Giá trị Tổng các bình phương

Sự thiếu phù hợp 1070,92 5 214,18 235,94 < 0,0001 Có ý nghĩa

Bảng 4.27 Phân tích Anova ảnh hưởng của các yếu tố đến hàm lượng flanovoid trong dịch chiết

Giá trị Tổng các bình phương

Sự thiếu phù hợp 524,00 5 104,80 155,31 < 0,0001 Có ý nghĩa

Bảng 4.28 Kết quả phân tích sự phù hợp của mô hình và thực nghiệm của polyphenol tổng

Thông số Giá trị Thông số Giá trị Độ lệch chuẩn 10,37 R 2 0,9200

Giá trị trung bình 208,04 R 2 hiệu chỉnh 0,8479

Hệ số biến thiên (CV) (%) 4,98 R 2 dự đoán 0,4148 Độ chính xác phù hợp

Bảng 4.29 Kết quả phân tích sự phù hợp của mô hình và thực nghiệm của flavonoid

Thông số Giá trị Thông số Giá trị Độ lệch chuẩn 7,26 R 2 0,8116

Giá trị trung bình 112,07 R 2 hiệu chỉnh 0,6420

Hệ số biến thiên (CV) (%) 6,48 R 2 dự đoán -0,3230 Độ chính xác phù hợp

Giá trị R² của mô hình hàm lượng polyphenol tổng là 0,92, cho thấy chỉ có 8% mô hình không được giải thích, trong khi R² của mô hình hàm lượng flavonoid là 0,8116, cho thấy 18,84% mô hình không được giải thích Giá trị p của sự thiếu phù hợp của cả hai mô hình đều nhỏ hơn 0,05, cho thấy mô hình chưa tương thích với thực nghiệm Giá trị R² hiệu chỉnh của mô hình là 0,8479, chênh lệch lớn hơn 0,2 so với giá trị R² dự đoán, cho thấy mô hình có vấn đề Giá trị R² dự đoán là -0,3230, cho thấy mô hình chưa được dự đoán tốt Cả hai mô hình cần được kiểm định lại bằng cách thực hiện mẫu kiểm chứng xác nhận Theo bảng 4.26, giá trị p của X1, X2, X1X2, X1X3 và X2X3 lớn hơn 0,05, cho thấy nồng độ dung môi, thời gian chiết và tương tác 2 chiều giữa các yếu tố có ảnh hưởng nhưng không đáng kể đến hàm lượng polyphenol tổng với độ tin cậy 95% Các yếu tố X3, X1², X2², X3² có giá trị p nhỏ hơn 0,05, ảnh hưởng đến hàm lượng polyphenol tổng.

X2, X3, X1X2, X1X3, X2X3, X1 2 và X2 2 lớn hơn 0,05 nên chỉ có hàm phi tuyến tính của nhiệt độ chiết có ảnh hưởng đáng kể đến giá trị hàm lượng flavonoid với độ tin cậy 95%

Tiến hành xử lý số liệu, ta được phương trình hồi quy thể hiện ảnh hưởng của ba yếu tố đến hàm lượng polyphenol tổng như sau:

Sau khi loại bỏ các hệ số hồi quy không có ý nghĩa ra khỏi mô hình, phương trình hồi quy của mô hình như sau:

Phương trình hồi quy thể hiện ảnh hưởng của ba yếu tố đến hàm lượng flavonoid trong dịch chiết:

Sau khi loại bỏ các hệ số hồi quy không có ý nghĩa ra khỏi mô hình, phương trình hồi quy của mô hình như sau:

X3: Nhiệt độ chiết (C) d/ Ảnh hưởng của các yếu tố

So sánh phương pháp trích ly áp suất cao và Soxhlet

Các phương pháp trích ly hợp chất tự nhiên có năng suất và hiệu quả khác nhau, với hàm lượng hợp chất hoạt tính sinh học cao là yếu tố quan trọng trong sản xuất sản phẩm thiên nhiên tiết kiệm chi phí và tối ưu hóa năng suất Nghiên cứu này so sánh hiệu suất trích ly giữa phương pháp Soxhlet và phương pháp trích ly hỗ trợ áp suất cao, với các điều kiện chiết tối ưu Kết quả về hàm lượng polyphenol tổng, flavonoid, hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH, ABTS và ức chế enzyme tiêu hóa tinh bột như α-amylase, α-glucosidase được trình bày trong bảng 4.41.

Bảng 4.41 Giá trị hàm mục tiêu của phương pháp Soxhlet và phương pháp HPE ở điều kiện tối ưu

Chỉ tiêu Phương pháp Soxhlet Phương pháp HPE Polyphenol (mgGAE/g) 259,61 ± 5,54 a 235,83 ± 4,96 b

ABTS (mgTE/g) 343,89 ±4,16 b 559,17 ±5,23 a α-amylase (IC 50 àg/ml) 34,80 ± 1,74 b 30,30 ± 1,21 a α-glucosidase (IC 50 àg/ml) 9,90 ± 0,65 b 3,17 ± 0,32 a

Các chữ cái giống nhau trong cùng một cột thể hiện sự giống nhau về mặt ý nghĩa  = 5%

Hàm lượng polyphenol tổng của phương pháp Soxhlet cao hơn so với phương pháp áp suất cao, trong khi hàm lượng flavonoid của hai phương pháp không khác nhau có ý nghĩa Dịch chiết trích ly bằng phương pháp HPE cho thấy hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH, ABTS và ức chế α-amylase, α-glucosidase cao hơn đáng kể so với phương pháp Soxhlet Điều này có thể do áp suất hỗ trợ trong quá trình trích ly giúp phá vỡ tế bào thực vật, cho phép trích xuất các hợp chất sinh học có hoạt tính cao hơn Ngược lại, phương pháp Soxhlet với thời gian tiếp xúc nhiệt dài có thể làm hỏng một số hợp chất nhạy cảm với nhiệt trong lá ổi rừng.

Các hợp chất flavonoid thường được chiết xuất bằng các phương pháp truyền thống như chiết dung môi và chưng cất hơi nước, nhưng những phương pháp này có nhược điểm như thời gian chiết xuất lâu, mất các hợp chất dễ bay hơi và phân hủy các hợp chất không bão hòa Phương pháp chiết xuất bằng HPE có ưu điểm vượt trội, bao gồm thời gian chiết ngắn hơn, giảm thiểu sự phân hủy của các hợp chất không bền và tính chọn lọc cao trong việc chiết xuất các hợp chất mong muốn Tuy nhiên, nhược điểm lớn nhất của HPE là chi phí vận hành cao.