Các phương pháp phân tích trong công nghệ sinh học: sử dụng sắc ký lỏng hiệu năng cao để phân tích hàm lượng cafein trong mẫu trà và cà phê

Tiểu luận Các phương pháp phân tích trong công nghệ sinh học: sử dụng sắc ký lỏng hiệu năng cao để phân tích hàm lượng cafein trong mẫu trà và cà phê Các phương pháp phân tích trong cnsh I GIỚI THIỆU Cafein (1,3,7 trimethylxanthine) một alkaloid họ xanthine, là thành phần kích thích chính trong 60 loài thực vật bao gồm trà, cà phê, ca cao.

Học viên: Lê Thị Thùy Dung - 20211161M

Sử dụng phương pháp HPLC-UV xác định hàm lượng caffein trong các mẫu trà và cà phê của các thương hiệu địa phương khác nhau có sẵn trên thị trường tại Kathmandu và Kaski, Nepal.

TIỂU LUẬN CÁC PHƯƠNG PHÁP

PHÂN TÍCH TRONG CNSH

SỬ DỤNG PHƯƠNG PHÁP HPLC ĐƠN GIẢN ĐỂ XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG CAFFEIN TRONG TRÀ VÀ CÀ PHÊ

I GIỚI THIỆU

Cafein (1,3,7-trimethylxanthine) - một alkaloid họ xanthine, là thành phần kích thích chính trong 60 loài thực vật bao gồm trà, cà phê, ca cao, v.v (Francis, 1999) Bên cạnh trà và cà phê, cafein cũng được tiêu thụ rất rộng rãi thông qua nhiều loại sản phẩm dành cho người ăn kiêng, như đồ uống ca cao, nước tăng lực, nước ngọt, v.v (Da Silva, 2011) Cafein là một loại bột màu trắng, không mùi, có vị hơi đắng Là một dẫn xuất của nhân xanthine, cafein có đặc tính dược lý (Francis, 1999) Nó là một chất kích thích trao đổi chất và hệ thống thần kinh trung ương, và được sử dụng cả về mặt giải trí và y tế để giảm mệt mỏi về thể chất và phục hồi sự tỉnh táo khi buồn ngủ xảy ra Sử dụng cafein giúp tỉnh táo hơn, dòng suy nghĩ nhanh hơn và rõ ràng hơn, tăng cường sự tập trung và khả năng phối hợp cơ thể nói chung tốt hơn (Sethuraman và cộng

sự, 2013)

Công thức hóa học của Cafein

Cafein được chứng nhận an toàn ở mức 200 ppm (Da Silva, 2011) Cafein không tích lũy trong cơ thể theo thời gian và thường được bài tiết trong vòng vài giờ sau khi tiêu thụ (Barone

và Roberts, 1996) Tỷ lệ tiêu thụ trà trung bình trên toàn quốc được dự đoán là 3,5 g/người/ngày ở Nepal (Rijal, 2014)

Sự thay đổi về hàm lượng cafein giữa các loài thực vật khác nhau là kết quả của sự đa dạng

về chủng loại, sự thay đổi khí hậu ở các khu vực trồng trọt và kỹ thuật làm vườn Trong chè, lá non có hàm lượng cao nhất Điều kiện chế biến cũng ảnh hưởng đến hàm lượng cafein Nhiệt

độ rang cà phê cao làm mất đi lượng cafein nhỏ hơn do quá trình thăng hoa Trong trà có hàm lượng cafein cao hơn trong hạt cà phê, nhưng 200 tách trà được pha trên mỗi pound lá trà, trong khi chỉ khoảng 40-60 tách cà phê thường được pha chế cho mỗi pound hạt cà phê Hàm lượng cafein trong cà phê arabica, cà phê robusta và cà phê hòa tan lần lượt nằm trong khoảng (0,58-1,7), (1,2-3,3) và (2,2-5,0), trong khi ở trà đen, trà xanh và trà hòa tan, mức độ của nó dao động từ (1,2-4.6), (1.0-2.4), (4.0-5.0) tương ứng (Francis, 1999) Hàm lượng cafein trong trà và

cà phê của Nepal không được nhỏ hơn 2 (1% chất khô) theo các tiêu chuẩn bắt buộc do Luật Thực phẩm ban hành năm 1967 (DFTQC, 2012) đặt ra Nghiên cứu này được thực hiện với mục tiêu phát triển một phương pháp đã được xác thực để phân tích thường xuyên hàm lượng cafein trong các sản phẩm trà và cà phê có sẵn ở Nepal

 Tính chất vật lý và hóa học của cafein:

Dung môi hòa tan

Tan nhiều trong dung dịch ethyl axetat, chloroform, pyrimidine, pyrrole, tetrahydrofuran; tan vừa phải trong rượu, axeton; ít tan trong ether dầu hỏa, ether, benzen

Độ axit (pKa) 10,4 (40°C)

II PHƯƠNG PHÁP

2.1 Thu thập mẫu

Tổng cộng có 12 mẫu trà CTC, 7 mẫu trà xanh, 8 mẫu hạt cà phê rang chín vừa và 3 mẫu bột

cà phê rang được thu thập từ Kathmandu và huyện Kaski, Nepal

(Trà CTC: trà đen viên, được chế biến theo phương pháp tự động trên máy CTC, bao gồm các công đoạn : làm héo trà xuống còn 70% độ ẩm, đưa trà vào xử lý CTC để cắt nhỏ và vo viên, lên men- oxi hóa, và giai đoạn sấy trà khô xuống còn 3% độ ẩm)

Các mẫu cà phê và trà được giữ ở nhiệt độ phòng trong suốt quá trình phân tích Tất cả các dụng cụ thủy tinh đã được làm sạch đúng cách, sau đó tráng bằng nước HPLC trước khi sử dụng Các hóa chất và thuốc thử được sử dụng trong nghiên cứu này ở cấp độ phân tích, mẫu chuẩn cafein (Sigma-Aldrich) được sử dụng trong nghiên cứu này đã được Viện Khoa học và Công nghệ Quốc gia Hoa Kỳ truy xuất nguồn gốc

2.2 Xác định độ ẩm

Độ ẩm của mẫu trà và cà phê được xác định theo AOAC, 2005

2.3 Chuẩn bị mẫu

 Đầu tiên, các mẫu trà và cà phê được nghiền thành bột kích thước 300 ± 50 μm vàm và khoảng 0,3 g mẫu bột cà phê và chè được cân trong bình nón 250 ml

 Sau đó 200 ml nước cất được thêm vào và đặt trên bể ổn nhiệt (100 C) Quá trình chiết xuất được thực hiện trong nửa giờ

 Sau đó, dung dịch được làm lạnh, duy trì thể tích đến 250 ml và được lọc qua giấy lọc Whatmann số 1

 Dùng pipet lấy 1 ml dịch lọc vào bình định mức 10 ml sạch và thêm nước HPLC đến vạch

2.4 Chuẩn bị dung dịch chuẩn

Dung dịch gốc cafein 100 ppm được chuẩn bị bằng cách cân chính xác 10 mg cafein nguyên chất (Sigma-Aldrich) và chuyển định lượng nó vào bình định mức 100 ml

Các mẫu chuẩn 2, 4, 6, 8 và 10 ppm được chuẩn bị bằng cách pha loãng nối tiếp dung dịch gốc với nước HPLC Vẽ đồ thị đường chuẩn ngoại của diện tích pic so với nồng độ của chất chuẩn Hàm lượng cafein (ppm) của các mẫu khác nhau được tính toán bằng phép nội suy trong phương trình hồi quy của đường phù hợp nhất Sau đó, các kết quả được trình bày theo tỷ lệ phần trăm chất khô

2.5 Thiết bị đo đạc

 Điều kiện HPLC:

 HPLC model 1514 (Simadzu Corporation)

 Cột Zorbax Eclipse Plus 18 C, kích thước lỗ 5μm vàm, đường kính trong 4,6mm và dài 150 mm

 Pha đảo: ODS

 Tốc độ dòng 1ml/phút (không đổi)

 Nhiệt độ cột duy trì 40 C

 UV detectơ đặt ở bước sóng 275nm

 Pha động: Nước : Methanol (60:40)

 Thể tích tiêm mẫu: 10μm vàl

2.6 Phân tích thống kê

Các kết quả được biểu thị dưới dạng Mean ± SD và được phân tích thống kê bằng cách sử dụng MS Excel 2007 Đối với các tính toán có liên quan phần mềm Labsolutions

2.7 Phương pháp kiểm chứng

Theo khuyến nghị của ICH, (2005), các đặc điểm kiểm chứng được xem xét trong nghiên cứu này là độ tuyến tính, phạm vi, giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ), độ lặp lại và

độ thu hồi

Năm dung dịch cafein tiêu chuẩn khác nhau từ 2-10 ppm được thực hiện để đánh giá biểu

đồ tín hiệu như một hàm của nồng độ chất phân tích Để có độ chính xác, lặp lại trong ngày và liên ngày được thực hiện bằng dung dịch chuẩn 10 ppm cho 6 lần xác định LOQ và LOD được xác định bằng cách ghi lại và so sánh các tín hiệu đo được từ các mẫu có nồng độ đã biết Tỷ lệ tín hiệu cực đại trên nhiễu (Signal to Noise ratio - S/N) nằm giữa 3: 1 và 10: 1 đã được xem xét cho LOD và LOQ Khả năng thu hồi được kiểm tra bằng cách thêm các mẫu trắng (trà đã khử cafein) vào các mẫu chuẩn cafein nồng độ khác nhau và phân tích hàm lượng của chúng

III Kết quả và thảo luận

Trước khi các thông số xác thực được tiến hành, kiểm tra nhận dạng được tiến hành để phân biệt giữa cafein và các hợp chất có cấu trúc tương tự có thể có mặt Quy trình phân biệt được thực hiện bằng cách thu kết quả dương từ các sản phẩm trà, cà phê, mẫu trắng và các mẫu chuẩn Không có nhiễu đáng kể hoặc đỉnh bị nhiễu hoặc trùng với đỉnh của cafein

3.1 Độ tuyến tính và phạm vi

Năm nồng độ khác nhau của dung dịch cafein tiêu chuẩn trong khoảng từ 2 đến 10 ppm được phân tích, tương đối đại diện cho các sản phẩm trà và cà phê có sẵn Đồ thị hiệu chuẩn được tạo bằng cách sử dụng vòng tiêm 10μm vàl và đường cong được thiết lập theo diện tích pic và nồng độ của cafein trong các dung dịch tiêu chuẩn Kết quả thu được cho thấy một mối quan hệ tuyến tính

Mỗi giá trị tín hiệu đo từ mẫu nồng độ chuẩn là giá trị trung bình của ba lần xác định Đồ thị hiệu chỉnh (Hình 1) cho thấy mối tương quan thuận chặt chẽ giữa tín hiệu thiết bị và nồng độ của các mẫu cafein chuẩn Thí nghiệm về độ tuyến tính cho thấy rằng hàm lượng cafein được tìm thấy tuyến tính trong khoảng nồng độ từ 2 đến 10 µg/ml Giá trị R2 là 0,9928

Hình 1 Đường cong hiệu chuẩn

Hình 2 Sắc ký đồ của cafein ở (2 ppm, Detector 275nm)

Hình 3 Sắc ký đồ của cafein trong mẫu trà

3.2 Độ lặp lại

Độ lặp lại của phương pháp được khảo sát bằng cách thực hiện 6 lần phân tích lặp lại 1 dung dịch chuẩn (10 ppm) trong cùng một ngày (đối với độ lặp lại trong ngày) và ngày khác nhau để

có độ chính xác giữa các ngày Kết quả cho thấy % RSD (hệ số biến thiên) cho thời gian lưu và diện tích đạt yêu cầu để phân tích Kết quả của độ lặp lại được thể hiện trong Bảng 1 và 2

Bảng 1 Độ lặp lại trong ngày đối với 10 ppm

STT lặp lại Nồng độ chuẩn

Mẫu (ppm) Thời gian lưu (phút) Diện tích

Độ lệch chuẩn 0,023 2686,217

Bảng 2 Độ lặp lại khác ngày đối với 10 ppm

STT lặp lại Nồng độ chuẩn

Mẫu (ppm) Thời gian lưu (phút) Diện tích

Độ lệch chuẩn 0,044 3474,202

3.3 Độ nhạy

Độ nhạy của phương pháp được đo bằng Giới hạn phát hiện (LOD) và Giới hạn định lượng (LOQ) LOD và LOQ được xác định bằng cách đo tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu S/N từ mẫu chuẩn nồng

độ thấp của chất phân tích so với pic nền của mẫu trắng

Phần mềm công cụ (Shimadzu Lab Solutions Version 5.60SP2) đã phát hiện tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu 3:1 đối với nồng độ cafein 0,2 ppm, giá trị này nằm ngoài giới hạn phát hiện của phương pháp này Tương tự, LOQ được tìm thấy là 0,7 ppm tại đó phần mềm công cụ đánh giá tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu là 10:1

3.4 Khả năng thu hồi

Độ chính xác của phương pháp được xác định bằng cách thêm mẫu trắng (trà đã khử cafein) vào các mẫu chuẩn (1, 5 và 10 ppm) và phân tích khả năng thu hồi của chúng

Bảng 3: Thu hồi cafein

Mẫu trắng

STT mẫu

Nồng độ cafein trong mẫu (mg)

Nồng độ cafein trong mẫu pha (mg)

Nồng độ cafein thu hồi được (mg)

Tỉ lệ thu hồi (%)

3.5 Kết quả về hàm lượng cafein trong các mẫu trà và cà phê khác nhau

Hàm lượng cafein được biểu thị theo phần trăm khối lượng, tương đương với gam trên 100g chất khô cà phê/trà theo công thức:

Ac là diện tích pic cafein của dung dịch chuẩn cafein xác định bằng HPLC, tính bằng đơn vị diện tích

Ax là diện tích pic cafein của dung dịch mẫu xác định bằng HPLC, tính bằng đơn vị diện tích;

ms là khối lượng phần mẫu thử, tính bằng gam (g);

V là thể tích dung dịch mẫu chiết được, xác định được

Pc là nồng độ khối lượng của dung dịch chuẩn cafein, tính bằng gam trên lít (g/l)

Wd là hàm lượng chất khô của mẫu

Bảng 5: Hàm lượng cafein trong trà và cà phê

Lưu ý: Hàm lượng cafein trong các mẫu trà và cà phê được phân tích và chuyển đổi thành % chất khô Giá trị thu được là giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn

IV KẾT LUẬN

 Cafein được phân tích trong chất chiết xuất từ nước của các mẫu trà và cà phê Thời gian lưu của cafein là 2,6 phút Các dung dịch chuẩn được pha để xác định độ tuyến tính với giá trị hệ số tương quan (R2) là 0,9928 RSD cho độ lặp lại đạt yêu cầu LOD và LOQ lần lượt là 0,7 và 0,2 ppm

 Khả năng thu hồi cao (>97%) đã được tìm thấy khi thêm mẫu chuẩn cafein vào các mẫu trắng Không quan sát thấy hiệu ứng ma trận đáng kể nào trong quá trình xác nhận Do

đó, phương pháp xác nhận này được sử dụng để định lượng cafein trong các mẫu sản phẩm trà và cà phê được thu thập từ các nơi khác nhau

 Sắc ký lỏng cho phép nhanh chóng tách cafein khỏi các chất khác như axit tannic, axit caffeic và đường Phương pháp này đã được khuyến nghị cho Phòng thí nghiệm Thực phẩm Trung ương để phân tích cafein thường quy trong trà và cà phê

TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] Pokhrel, P., Shrestha, S., Rijal, S K., & Rai, K P (2016) A simple HPLC Method for the Determination of Caffeine Content in Tea and Coffee Journal of Food Science and Technology Nepal, 9, 74-78

[2] TCVN 9723:2013 Cà phê và sản phẩm cà phê - Xác định hàm lượng cafein bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPCL) - Phương pháp chuẩn