TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KỸ THUẬT THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA CÔNG NGHỆ HÓA HỌC VÀ THỰC PHẨM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – 08/2022 NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP CHIẾT TÁCH ĐẾN HIỆU
TỔNG QUAN
Tổng quan về nguyên liệu sâm cau đen
2.1.1 Nguồn gốc, đặc điểm, phân loại
Sâm cau đen, hay còn gọi là tiên mao hoặc ngải cau, có tên khoa học là Curculigo orchioides Gaertn, thuộc họ Thủy tiên (Amaryllidaceae) nhưng hiện nay đã được phân loại vào họ Tỏi voi lùn (Hypoxidaceae) Loài này bao gồm 17 loài và bốn giống, trong đó có bảy loài được tìm thấy tại Trung Quốc (Chinese Academy of Sciences, 2000) Đến nay, đã có 10 loại được xác định, bao gồm Curculigo orchioides, Curculigo capitulata, Curculigo sinensis, Curculigo crassifolia, Curculigo breviscapa, Curculigo gracilis, Curculigo recvata, Curculigo glabrescens, Curculigo pilosa, và Curculigo latifolia.
Sâm cau là cây có thân hình trụ dài, cao khoảng 40cm và mọc thẳng, với một lá mầm và lá hình mác hẹp, dài từ 15 – 40cm và rộng 12 – 35mm Cuống lá dài 10cm và có gân lá song song Hoa của cây có màu vàng, mọc thành chùm nhỏ từ 3 – 5 bông trong bẹ lá, mỗi bông có 6 cánh Củ sâm cau phát triển từ rễ, có hình thuôn dài từ 12 – 15mm và có nhiều rễ phụ nhỏ.
Củ (thân rễ) sâm cau đen, có hình trụ và thuôn dài, là bộ phận chính được sử dụng trong nghiên cứu và sản xuất thuốc, và có thể được thu hái quanh năm.
Hình 2 1 Cây, rễ sâm cau đen (Curculigo orchiodes Gaertn)
Sâm cau là cây ưa sáng, ẩm, thường mọc ở chân núi đá vôi và thung lũng, phát triển tốt nhất từ tháng 5 đến tháng 7 Cây ra hoa hàng năm và tự nở quả để phát tán hạt, hình thành cây con Loài cây này phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới châu Á, bao gồm Campuchia, Ấn Độ, Malaysia, Thái Lan, phía nam Trung Quốc, Philippines và một số tỉnh phía Bắc Việt Nam như Cao Bằng, Lai Châu Sâm cau được coi là loài thuốc quý chữa bệnh viêm và sinh lý, được ghi nhận từ thời cổ và hiện đã có trong Danh mục đỏ cây thuốc Việt Nam (Đỗ Huy Bích và cộng sự, 2003).
2.1.2 Thành phần hoá học Đã có rất nhiều nghiên cứu trước đây chiết tách và phân lập các hợp chất thực vật có trong chi Curculigo và đặc biệt từ củ sâm cau Nhiều hợp chất sinh học đã được tìm thấy trong rễ cây, trong đó bao gồm các phenols và phenolic glucosides (Chang và Lee, 1998; Zou và cộng sự, 2010), lignans và lignan glucosides (Zhu và cộng sự, 2010), triterpenes và triterpenoid glucosides (Xu và cộng sự, 1992; Zou và cộng sự, 2012), flavones (Tiwari và Misra, 1967), alkaloids (Li và cộng sự, 2005)
Hình 2 2 Một số hợp chất thực vật được xác định từ dịch chiết lá và rễ của sâm cau
Ghi chú: Phân tích định tính cho thấy các hợp chất hóa thực vật có trong dịch chiết và được mô tả là có (+) hoặc không có (-)
Nghiên cứu đã xác định một số thành phần hóa học trong lá và thân rễ của sâm cau đen thông qua các phương pháp chiết xuất khác nhau Phần lớn các hợp chất được phân tích bằng phương pháp GC-MS, cho phép nhận diện các hóa thực vật như Cyclobarbital (0,36% trong lá và 3,88% trong thân rễ) và vitamin D3 (1,71% trong lá và 4,13% trong thân rễ) từ dịch chiết bằng dung môi methanol Ngoài ra, dịch chiết từ thân rễ sâm cau còn chứa 0,81% digitoxin và 0,64% Ethyl iso-allocholate, một hợp chất steroid (Brintha và cộng sự, 2017).
Từ thân rễ của sâm cau, Oacetyl-glucomannan COP90-1 được chiết xuất, có khả năng hòa tan trong nước với phân tử khối 4609 Da, giúp thúc đẩy sự tăng sinh và biệt hóa tế bào xương sơ cấp (Wang và cộng sự, 2017) Nghiên cứu tiếp theo của Wang và cộng sự (2019) đã phân lập thêm polysaccharides COP70-3, đồng thời công bố khả năng chống loãng xương của hợp chất này.
Hình 2 3 Dự đoán cấu trúc hóa học Oacetyl-glucomannan COP90-1
Curculigine là một hợp chất tự nhiên chứa clo, được tìm thấy trong thân rễ của sâm cau, với sự hiện diện của Chlorophenolic Glucosides (Xu và cộng sự, 1987; Xu và cộng sự, 1992) Nghiên cứu đã chỉ ra rằng 11 Chlorophenolic Glucoside có tác động vừa phải đến sự tăng sinh của xương Cụ thể, clo liên kết C-6 trong chlorophenol glycoside có thể làm giảm hoạt tính chống loãng xương, trong khi nhóm C-5 hydroxyl được đưa vào aglycone của chlorophenol glycoside lại làm tăng hoạt tính chống loãng xương (Wang và cộng sự, 2018).
Các hợp chất phenolic là các chất chuyển hóa chính trong chi Curculigo Từ thân rễ của C orchioides, hai phenolic glucosides được chiết xuất là orcinoside H và curculigoside I, cùng với mười hợp chất khác như orcinol glucoside, orcinol glucoside B, curculigoside A, B, C, G, 3-hydroxy-5-methylphenol-1-O-[β-glucopyranosyl-(1-6)-β-D-glucopyranoside], 3-hydroxy-5-methylphenol-1-O-[β-apiosyl-(1-6)-β-D-glucopyranoside], glucosyringic acid và benzyl-O-β-D-glucopyranoside (Wang và cộng sự, 2013).
Trong củ sâm cau đen, orcinol glucoside và các dẫn xuất của nó là các polyphenols quan trọng, đặc biệt trong hoạt tính kháng oxy Orcinol glucoside là một chất rắn vô định hình màu vàng với công thức phân tử đặc trưng.
C13H18O7 (Li và cộng sự, 2003), cấu trúc phân tử của orcinol glucoside được thể hiện ở Hình 2.4
Nghiên cứu về thành phần củ sâm cau đen cho thấy orcinol glucoside là một hợp chất ít độc hại với hoạt tính sinh học cao, có khả năng hỗ trợ các cơ quan chống lại độc tố từ thuốc và hóa chất Điều này chứng tỏ orcinol glucoside là một hợp chất tiềm năng đáng được chú ý Do đó, nhiều nghiên cứu đã được thực hiện để tìm ra phương pháp chiết tách tối ưu nhằm thu hồi tối đa hợp chất này (Liu và cộng sự, 2013).
Hình 2 4 Cấu trúc phân tử orcinol glucoside
Terpenoids là một nhóm nhỏ chất chuyển hóa thứ hai được tìm thấy ở loài Curculigo
Từ thân rễ của C orchioides một loại cycloartane mới là triterpenoid ketone (52) được phân lập và có độc tính với gan người trong thí nghiệm HL-7702
Thu được 6 terpenoid từ C orchioides là (3S,5R,6S,7E,9R)-megatigma-7-ene-3,5,6,9- tetrol (53), actinidionoside (54), (6S,9R)-roseoside (55), (-)-angelicoidenol-2-O-β-D- glucopyranoside (56), (-)-angelicoidenol-2-O-β-apiofuranosyl-(1→6)-β-D-gluco- pyranoside (57), tetillapyrone [(7R, 9S,10R) -3-metyl-5- (4-hydroxyl-5-hydroxylmethyl- tetrahydrofuryl)] - 6-hydroxypyran-2-one (58) (Zhang và cộng sự, 2019)
Hình 2 5 Terpenoids (52 – 58) của thực vật thuộc chi Curculigo
In addition to the aforementioned compounds, the rhizome of C orchioides contains eight cyclodipeptides: cyclo-(L-Ala-L-Tyr), cyclo-(L-Ser-L-Phe), cyclo-(Leu-Ala), cyclo-(Leu-Thr), cyclo-(Leu-Ser), cyclo-(S-Pro-R-Leu), cyclo-(Val-Ala), and cyclo-(Gly-D-Val) (Chen et al., 2017).
Hình 2 6 Cyclic Peptides (59 – 66) của thực vật thuộc chi Curculigo
2.1.3 Hoạt tính sinh học và ứng dụng dược học
Củ sâm cau đen, được biết đến từ thời xa xưa qua “Charak Samhita”, là một vị thuốc quý giúp giảm ho Thân rễ của cây này có dược tính ngọt, giải nhiệt, lợi tiểu, và kích thích tình dục, đồng thời hỗ trợ điều trị viêm nhiễm, bệnh ngoài da, và viêm phế quản Nhờ vào các hợp chất polyphenols như saponins, phenolic glycosides, và resins, củ sâm cau đen được ứng dụng rộng rãi trong y học Ayurvedic và nghiên cứu về hoạt tính sinh học của nó Một số hoạt tính sinh học và ứng dụng nổi bật của củ sâm cau đen bao gồm khả năng chống viêm và hỗ trợ sức khỏe tổng thể.
❖ Hoạt tính chống oxy hoá
Quá trình oxy hoá trong cơ thể con người gây tổn thương cho màng tế bào và các cấu trúc phân tử như protein, lipid và DNA, khi nó lấy electron từ các phân tử khác, tạo ra gốc tự do Những gốc tự do này có thể làm biến đổi, rối loạn chức năng hoặc thậm chí gây chết tế bào (Onkar và cộng sự, 2012) Sự tích tụ lớn gốc tự do dẫn đến tổn thương nghiêm trọng cho tế bào và các tình trạng bệnh lý nặng nề Do đó, ngày càng nhiều nghiên cứu tập trung vào việc sử dụng chất chống oxy hoá để trung hoà gốc tự do trong cơ thể.
Polyphenols là các hợp chất sinh học nổi bật với khả năng chống oxy hóa, giúp ngăn chặn sự hình thành gốc oxy đơn phân tử và giảm nguy cơ ung thư (Ali và cộng sự, 2011) Rễ cây sâm cau đen chứa nhiều polyphenols như flavonoids, glycosides, saponins và phytosterol, hỗ trợ hoạt động chống oxy hóa (Onkar và cộng sự, 2012) Nghiên cứu cho thấy chiết xuất từ củ có vai trò quan trọng trong việc bảo vệ gan khỏi tổn thương (Asif, 2012) Chiết xuất ethanol từ thân rễ cây sâm cau đen ở hàm lượng 1 – 25 µg cho thấy hoạt tính chống oxy hóa cao đối với các gốc tự do và giúp ngăn chặn mất thính giác do cisplatin (Kang và cộng sự, 2013) Nghiên cứu của Venukumar và cộng sự (2002) cho thấy chiết xuất methanol từ rễ cây sâm cau có khả năng bắt gốc tự do và tăng cường hoạt động của các enzyme chống oxy hóa như SOD, CAT, GPX và GRD Mức độ glutathione transferase (GTS) ở chuột nhiễm độc gan nặng có xu hướng trở về bình thường, chứng minh khả năng chống oxy hóa của chiết xuất methanol Các nghiên cứu khác như của Zhu và cộng sự (2010) và Nguyen và cộng sự (2015) đã chiết xuất breviscapin và các hợp chất phenolic glycosides từ thân rễ cây sâm cau, khẳng định hoạt tính chống oxy hóa và tính khả thi trong y học của loài thực vật này.
❖ Hoạt tính chống loãng xương
Tổng quan các hợp chất polyphenols và phương pháp chiết tách polyphenols
Polyphenols là hợp chất tự nhiên được hình thành từ quá trình trao đổi chất của thực vật, nổi bật với vai trò là chất chống oxy hóa trong trái cây, rau củ, chocolate và các đồ uống như trà, cà phê, rượu (Araújo và cộng sự, 2021) Chúng không chỉ tạo hương vị và màu sắc cho thực phẩm mà còn tăng cường khả năng chống oxy hóa và kéo dài thời gian bảo quản Polyphenols có nhiều đặc tính quan trọng như chống oxy hóa, bảo vệ tim mạch, chống ung thư, chống lão hóa, chống viêm và kháng khuẩn (Arts và cộng sự, 2005) Nhờ vào những hoạt tính đặc biệt này, polyphenols ngày càng được ứng dụng rộng rãi trong y dược, mỹ phẩm và công nghệ thực phẩm, thu hút sự quan tâm của cộng đồng khoa học.
❖ Phân loại các hợp chất polyphenols
Các hợp chất polyphenols có mặt phổ biến trong thực phẩm, đặc biệt là trong thực vật Chúng có cấu trúc đa dạng nhờ vào số lượng vòng phenol và các phân tử liên kết với vòng Các nhóm polyphenols chính bao gồm flavonoids, phenolic acids, phenolic alcohols, stilbenes và lignans (Archivio và cộng sự, 2007).
Flavonoids là nhóm polyphenols phổ biến, thường có trong trái cây và rau củ, đóng vai trò quan trọng trong việc tạo màu, tạo vị và tổng hợp enzyme cũng như vitamin Chúng có tác dụng lớn đối với sức khỏe con người, với các hoạt tính sinh học nổi bật như khả năng chống ung thư, ức chế tiêu xương, bảo vệ tim mạch và điều hòa các quá trình chuyển hóa.
Hình 2 7 Cấu trúc tổng quan của Flavonoids
Cấu trúc cơ bản của flavonoids là diphenylpropane, bao gồm hai vòng thơm (A và B) liên kết với một vòng rahydropyran (C) Trong tự nhiên, flavonoids được phân loại thành sáu nhóm khác nhau dựa trên sự khác biệt cấu trúc của vòng pyran, bao gồm flavonols, flavonones, flavanols, flavones, anthocyanins và isoflavons.
Hình 2 8 Cấu trúc phân tử các nhóm flavonoids
Acid phenolic là hợp chất tự nhiên thường có trong trái cây và rau củ, được phân loại thành hai nhóm chính: nhóm có nguồn gốc từ hydroxybenzoic và nhóm có nguồn gốc từ hydrocinnamic.
Nhóm acid phenolic, có nguồn gốc từ hydrobenzoic, đặc trưng bởi nhóm carboxylic (COOH), thường ít xuất hiện trong thực phẩm Một số acid hydrobenzoic điển hình bao gồm acid gallic, acid protocatehuic và acid vanillic (Archivio và cộng sự, 2007) Bên cạnh đó, nhóm hydrocinnamic acid bao gồm acid coumaric, acid caffeic và acid ferulic (Araújo và cộng sự, 2021).
Tyrosol (4-hydroxyphenylethanol) và hydroxytyrosol (3,4-dihydroxyphenylethanol) là hai phenolic alcohols quan trọng, chủ yếu có trong dầu ô liu nguyên chất Ngoài ra, tyrosol cũng xuất hiện trong các sản phẩm rượu vang đỏ, trắng và bia (Covas và cộng sự, 2003).
Hình 2 9 Cấu trúc phân tử tyrosol
Stilbenes là nhóm hợp chất không phổ biến như các polyphenols khác, chỉ chiếm một lượng nhỏ trong khẩu phần ăn của con người Resveratrol, một stilbenes nổi bật, thường có mặt trong nho, quả mọng và đậu phộng, tồn tại dưới hai dạng đồng phân cis và trans Nghiên cứu của Delmas và cộng sự (2006) cho thấy các hợp chất stilbenes có khả năng chống viêm và điều trị nhiễm trùng do mầm bệnh hoặc các triệu chứng căng thẳng.
Hình 2 10 Cấu trúc hai dạng đồng phân của resveratrol
Lignans được hình thành từ quá trình đồng phân hóa hai phân tử phenylpropane, với sự xúc tác của enzyme oxy hóa và sự kiểm soát của protein dirigent Chúng thường tồn tại ở dạng tự do và chủ yếu có trong hạt lanh, ngũ cốc và rau họ cải Hiện nay, lignans đang được nghiên cứu và phát triển do tiềm năng điều trị các bệnh ung thư (Saleem và cộng sự, 2005).
Hình 2 11 Cấu trúc phân tử lignans
2.2.2 Các phương pháp chiết tách polyphenols
Polyphenols có hoạt tính sinh học nổi trội, dẫn đến nhiều nghiên cứu về việc chiết tách chúng từ thực phẩm (Govindarajalu và cộng sự, 2019) Hiệu quả chiết tách polyphenols từ thực vật bị ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố, do tính chất không bền và sự đa dạng của chúng Mỗi loại polyphenol từ nguyên liệu thực vật khác nhau yêu cầu các điều kiện chiết tách khác nhau để đạt hiệu suất tối ưu Do đó, điều kiện chiết tách là kỹ thuật quan trọng ảnh hưởng đến khả năng thu hồi polyphenols và hoạt tính chống oxy hóa của thực vật (Majeed và cộng sự, 2016) Để xác định điều kiện chiết tách tốt nhất, cần khảo sát nhiều yếu tố, trong đó loại dung môi, tỷ lệ dung môi, thời gian và nhiệt độ chiết tách là những yếu tố quan trọng (Sulaiman và cộng sự, 2017).
Chiết tách là một bước quan trọng trong việc phân lập và tinh chế các hợp chất sinh học từ thực phẩm Nhiều phương pháp chiết tách, bao gồm Soxhlet, ngâm chiết, hỗ trợ vi sóng, lỏng siêu tới hạn, hỗ trợ enzyme và kích thích xung điện trường, đã được áp dụng để tối ưu hóa hiệu suất thu hồi polyphenols Tất cả các kỹ thuật này đều nhằm mục đích chiết xuất hợp chất sinh học từ mẫu thực vật phức tạp, nâng cao độ nhạy của phương pháp phân tích và chuyển đổi các hợp chất sinh học thành dạng dễ phát hiện hơn.
2.2.2.1 Các kỹ thuật ngâm chiết truyền thống
Nguyên liệu để chiết xuất các hợp chất polyphenols bao gồm thực phẩm, thực vật và đồ uống với số lượng nhỏ, do đó cần áp dụng nhiều phương pháp chiết xuất phù hợp với tính chất của nguyên liệu Các phương pháp chiết xuất truyền thống như ngấm kiệt (Percolation), ngâm dầm (Maceration), chiết xuất bằng nhiệt và chiết Soxhlet được sử dụng phổ biến Việc lựa chọn phương pháp chiết xuất phụ thuộc vào tính chất và thành phần của mẫu nguyên liệu (Sridhar và cộng sự, 2021).
Phương pháp ngấm kiệt (Percolation) là một kỹ thuật chiết tách truyền thống dùng để chiết xuất chất lỏng từ thực phẩm Dụng cụ chính của phương pháp này là bình ngấm kiệt, trong đó mẫu thực phẩm được trộn với nước và ngâm trong khoảng 24 – 48 giờ, tùy thuộc vào loại thực phẩm, cho đến khi thu được dịch chiết mong muốn Sau đó, dịch chiết sẽ được đưa vào thiết bị bay hơi để cô đặc đến nồng độ chất khô yêu cầu Kỹ thuật này cho phép dung môi chứa hoạt chất được thay thế liên tục bằng dung môi mới, khác với phương pháp ngâm dầm.
Phương pháp ngâm dầm (Marceration) là một kỹ thuật chiết tách đơn giản, thường được áp dụng trong quy trình chiết tách quy mô nhỏ Quy trình này bắt đầu bằng việc nghiền nhỏ mẫu nguyên liệu, sau đó cho vào bình kín và thêm dung môi để tiến hành ngâm chiết Thời gian ngâm có thể kéo dài đến bảy ngày, trong đó hỗn hợp cần được lắc định kỳ Sau khi ngâm, chất lỏng sẽ được lọc để loại bỏ cặn rắn, phần còn lại được gọi là marc (Singh và cộng sự, 2008).
❖ Phương pháp chiết tách bằng Soxhlet
Phương pháp Soxhlet, hay còn gọi là phương pháp chiết tách rắn - lỏng, là một kỹ thuật truyền thống được sử dụng để chiết chất béo trong thực phẩm, đặc biệt là các sản phẩm sữa Được phát minh vào năm 1879, Soxhlet vẫn được xem là một trong những phương pháp chiết tách tiêu chuẩn nhờ vào tính đơn giản của nó.
Vật liệu
Củ sâm cau đen, thu hái tại tỉnh Sơn La, Việt Nam vào tháng 1 năm 2022, là đối tượng nghiên cứu chính trong bài viết này Sau khi thu hoạch, củ được rửa sạch, cắt khúc, sấy khô, nghiền mịn và bảo quản kín để đảm bảo chất lượng.
Mẫu được bảo quản trong tủ đông ở nhiệt độ -18°C tại phòng thí nghiệm của bộ môn Công nghệ Thực phẩm, Trường Đại học Sư phạm Kỹ thuật Thành phố Hồ Chí Minh cho đến khi được sử dụng cho các thí nghiệm.
Hóa chất và thiết bị
- Dùng cho mục đích chiết tách hoạt chất từ củ sâm cau đen: ethanol 96%, ethanol 80%, ethyl acetate, acetone, nước cất
- Dùng cho mục đích xác định hoạt tính chống oxy hóa: 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH), methanol
- Dùng cho mục đích xác định polyphenols tổng số: thuốc thử Folin – Ciocalteu,
Na2CO3, gallic acid, methanol
- Máy phát sóng siêu âm
Thiết kế thí nghiệm
3.3.1 Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của phương pháp ngâm chiết truyền thống đến hiệu suất thu hồi hoạt chất
Hình 3 1 Quy trình ngâm chiết củ sâm cau đen truyền thống
- Khảo sát ảnh hưởng của các loại dung môi khác nhau đến hiệu suất chiết tách
Chiết tách 1g bột sâm cau đen bằng các dung môi acetone, ethyl acetate, ethanol 96%, ethanol 80% và nước cất với tỉ lệ dung môi/nguyên liệu là 20/1 (ml/g) ở nhiệt độ phòng trong 120 phút Hỗn hợp chiết tách được lọc qua giấy lọc 0,45 µm và pha loãng đến nồng độ thích hợp để phân tích chất khô tổng số, polyphenols tổng số và hoạt tính kháng oxy hóa trong các dịch chiết thu được Thí nghiệm được thực hiện lặp lại ba lần.
- Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi:nguyên liệu đến hiệu suất chiết tách
Trong thí nghiệm, 1g bột sâm cau đen được chiết tách bằng dung môi ethanol 80% để đạt hiệu suất thu hồi hoạt chất tối ưu Nghiên cứu khảo sát ảnh hưởng của bốn tỷ lệ dung môi/nguyên liệu là 10/1, 20/1, 40/1 và 80/1 (ml/g) trong điều kiện nhiệt độ phòng và thời gian chiết 120 phút Các chỉ tiêu được phân tích bao gồm hàm lượng chất khô tổng số, polyphenols tổng số và hoạt tính kháng oxy hóa trong các dịch chiết thu được, với thí nghiệm được lặp lại ba lần để đảm bảo độ tin cậy của kết quả.
- Khảo sát ảnh hưởng của thời gian chiết tách đến hiệu suất chiết tách
Chiết tách 1g bột sâm cau đen với 10mL dung môi ethanol 80% ở nhiệt độ phòng trong thời gian 60, 120, 180 và 240 phút Hỗn hợp chiết tách được lọc qua giấy lọc 0,45 µm và pha loãng đến nồng độ thích hợp để phân tích tổng số chất khủ, polyphenols tổng số và hoạt tính kháng oxy hóa trong các dịch chiết thu được Thí nghiệm được thực hiện lặp lại ba lần.
- Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ chiết tách đến hiệu suất chiết tách
Chiết tách 1g bột sâm cau đen với 10mL dung môi ethanol 80% ở nhiệt độ phòng,
Nhiệt độ chiết xuất được thực hiện ở 40°C, 50°C, 60°C và 70°C trong thời gian 120 phút Hỗn hợp chiết tách sau đó được lọc qua giấy lọc 0,45 µm và pha loãng đến nồng độ thích hợp để phân tích các chỉ tiêu như chất khô tổng số, polyphenol tổng số và hoạt tính kháng oxy hóa trong các dịch chiết thu được Thí nghiệm được lặp lại ba lần để đảm bảo độ tin cậy của kết quả.
3.3.2 Thí nghiệm 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của phương pháp ngâm chiết sử dụng hỗ trợ sóng siêu âm và vi sóng đến hiệu suất thu hồi hoạt chất
Hình 3 2 Quy trình ngâm chiết sâm cau đen hỗ trợ sóng siêu âm và vi sóng
- Chiết tách hỗ trợ sóng siêu âm (UAE)
Thiết bị chiết tách sâm cau đen trong nghiên cứu này là máy trích ly siêu âm của Vietsonic, Việt Nam Thí nghiệm được thiết kế dựa trên nghiên cứu của Chuyen và cộng sự (2017), với 10g bột sâm cau đen ngâm trong 100mL dung môi ethanol 80% Mẫu được gia nhiệt đến 60 ± 2 °C, sử dụng đầu phát sóng siêu âm tần số 28KHz và công suất 400W Nhiệt độ ngâm chiết được duy trì ở 60 ± 3 °C trong 5, 10, và 15 phút Hỗn hợp chiết tách sau đó được lọc qua giấy lọc 0,45 µm và pha loãng đến nồng độ thích hợp để phân tích chất khô tổng số, polyphenols tổng số và hoạt tính kháng oxy hóa Thí nghiệm được lặp lại ba lần để đảm bảo độ chính xác.
- Chiết tách hỗ trợ vi sóng (MAE)
Trong nghiên cứu này, thiết bị chiết tách sâm cau đen được sử dụng là lò vi sóng EMS3085X của Công ty TNHH Electrolux Việt Nam, hoạt động với tần số 2450MHz và công suất 900W Mẫu thử gồm 10g bột sâm cau đen được ngâm trong 100 ml dung môi ethanol 80%, với tỷ lệ dung môi/nguyên liệu là 10/1, trong bình tam giác.
Nghiên cứu này dựa trên công trình của Chuyen và cộng sự (2017), cho thấy nhiệt độ dung môi trong quá trình chiết tách hỗ trợ vi sóng có xu hướng tăng nhanh và dễ dàng đạt đến nhiệt độ sôi Do đó, phương pháp chiết tách gián đoạn được áp dụng với thời gian gia nhiệt là 15 giây.
Quá trình chiết mẫu được thực hiện trong 180, 360 và 540 giây với công suất 180W, xen kẽ 45 giây không nhiệt để tránh quá nhiệt Hỗn hợp chiết tách sau đó được lọc qua giấy lọc 0,45 µm và pha loãng đến nồng độ thích hợp để phân tích tổng chất khô, polyphenol tổng số và hoạt tính kháng oxy hóa trong các dịch chiết thu được Thí nghiệm được lặp lại ba lần để đảm bảo độ chính xác.
Phương pháp xác định chỉ tiêu kiểm tra
3.4.1 Phương pháp xác định hàm lượng chất khô tổng số
Nguyên tắc : Sấy đến khối lượng không đổi theo Tiêu chuẩn quốc gia TCVN
Để tiến hành, trước tiên chuẩn bị đĩa petri, sau đó sấy và cân đĩa, ghi nhận khối lượng ban đầu (m1) Tiếp theo, ngâm 1g bột sâm cau đen với dung môi để thực hiện quá trình ngâm chiết Sau khi hoàn tất, hút 10mL dịch chiết cho vào đĩa petri Cuối cùng, đặt đĩa chứa mẫu vào tủ sấy và sấy đến khi đạt khối lượng không đổi ở nhiệt độ thích hợp.
105 0 C Sau khi lấy mẫu ra khỏi tủ sấy đặt vào bình hút ẩm để làm nguội đến nhiệt độ phòng và cân, ghi nhận khối lượng (m2)
Hàm lượng chất khô tổng số của mẫu được xác định theo công thức:
• E: Hàm lượng chất khô tổng số của mẫu (mg/g)
• m2: khối lượng đĩa petri chứa mẫu sau khi sấy (mg)
• m1: khối lượng đĩa petri đã sấy ban đầu (mg)
• n: tỷ lệ dung môi/nguyên liệu
• V: thể tích dịch chiết mẫu; V = 10mL
3.4.2 Phương pháp xác định hàm lượng polyphenols tổng số
Hàm lượng tổng số polyphenols được xác định bằng phương pháp Folin-Ciocalteau theo Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 9745-1:2013, cùng với các nghiên cứu trước đây (Prior và cộng sự, 2005; Chuyen và cộng sự, 2017).
Phương pháp sử dụng thuốc thử Folin-Ciocalteau là phương pháp phổ biến nhất để đo tổng hàm lượng polyphenols trong thực phẩm Phương pháp này dựa trên phản ứng tạo màu của các hợp chất phenol với thuốc thử Folin-Ciocalteu, trong đó có phức hợp phospho – wolfram – natrimolydat Khi ở điều kiện kiềm, phức hợp này sẽ bị khử bởi các hợp chất phenolic, tạo ra sản phẩm có màu xanh dương với bước sóng hấp thụ cực đại ở 765nm Tổng hàm lượng polyphenols trong mẫu được tính và thể hiện dưới dạng mg gallic acid (GAE)/g nguyên liệu.
Để xây dựng đường chuẩn acid gallic, pha 0,025g acid gallic trong methanol và định mức lên 50mL, sau đó tạo ra các nồng độ 10; 20; 30; 40; 50; 60; 70 µg/mL Lấy 0,5 mL dung dịch acid gallic với các nồng độ này cho vào các ống nghiệm, thêm 2,5 mL dung dịch Folin-Ciocalteu 10% và để yên ở nhiệt độ phòng trong 5 phút Tiếp theo, bổ sung 2 mL dung dịch Na2CO3 7,5%, lắc đều và để phản ứng xảy ra trong phòng tối trong 30 phút Cuối cùng, đo độ hấp thụ màu của dung dịch ở 765 nm bằng máy đo hấp thụ quang phổ để xây dựng đường chuẩn và phương trình tương quan giữa nồng độ acid gallic và độ hấp thụ.
Hình 3 3 Đồ thị đường chuẩn acid gallic
Để xác định tổng hàm lượng polyphenols trong mẫu, lấy 0,5 mL dịch chiết vào ống nghiệm, thêm 2,5 mL dung dịch Folin-Ciocalteu 10% và để yên ở nhiệt độ phòng trong 5 phút Sau đó, bổ sung 2 mL dung dịch Na2CO3 7,5%, lắc ống nghiệm và để phản ứng xảy ra trong phòng tối trong 30 phút Đo độ hấp thụ màu của dung dịch ở bước sóng 765 nm bằng máy đo hấp phụ quang phổ UV-Vis và lặp lại thí nghiệm 3 lần Hàm lượng polyphenols tổng số được tính bằng mg acid gallic tương đương (mg GAE)/g nguyên liệu, và được tính theo công thức cụ thể cho dịch chiết sâm cau.
• X: hàm lượng polyphenols tổng số tương đương hàm lượng acid gallic (mg GAE/g nguyên liệu)
• C: nồng độ acid gallic tương đương tính được dựa vào phương trình đường chuẩn (μg/ml)
• n: hệ số pha loãng mẫu
• V: thể tích dung môi chiết mẫu (ml)
3.4.3 Phương pháp xác định hoạt tính kháng oxy hóa
Hoạt tính kháng oxy hóa của củ sâm cau đen được xác định thông qua phương pháp ức chế gốc tự do DPPH, theo Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 11939:2017 và nghiên cứu của Wong và cộng sự (2012).
Nguyên tắc của phương pháp DPPH là sử dụng hợp chất có gốc tự do bền màu tím, có khả năng hấp thụ mạnh tại bước sóng 515 nm Khi phản ứng với các chất chống oxy hóa, dung dịch DPPH chuyển từ màu tím sang màu vàng, dẫn đến sự giảm độ hấp thụ quang Sự thay đổi màu sắc này được đo bằng máy đo quang phổ, giúp xác định khả năng chống oxy hóa của các hợp chất nghiên cứu.
Hình 3 4.Công thức hóa học của DPPH và sản phẩm khử DPPH 2 tương ứng
Để chuẩn bị dung dịch DPPH, hòa tan 0,024g thuốc thử DPPH trong methanol và định mức lên 100ml Dung dịch này cần được bảo quản trong điều kiện tránh ánh sáng và ở nhiệt độ -20°C Để tạo dung dịch DPPH làm việc, hút 10ml dung dịch DPPH đã chuẩn bị và pha loãng với 45ml methanol, đảm bảo độ hấp thụ quang đạt 1,1 ± 0,02 tại bước sóng 515nm.
- Khảo sát hoạt tính ức chế gốc tự do của dịch chiết củ sâm cau đen
Các mẫu dịch chiết sâm cau đen được pha loãng đến nồng độ thích hợp, sau đó 0,2ml dịch chiết được cho vào từng ống nghiệm và bổ sung 3,8ml dung dịch DPPH Mẫu được lắc đều và để yên trong 1,5 giờ ở nhiệt độ phòng, tránh ánh sáng Đo mẫu ở bước sóng 515nm bằng máy đo quang phổ Mẫu đối chứng được thực hiện tương tự nhưng sử dụng dung môi ngâm chiết thay vì dịch chiết Phần trăm ức chế gốc tự do của DPPH được xác định theo công thức.
Khả năng ức chế DPPH (%) = ( 𝐴 0 −𝐴 1
Trong đó: A0 và A1 là độ hấp thụ quang của mẫu dịch chiết và mẫu đối chứng tương ứng ở bước sóng 515nm
Khả năng kháng oxy hóa của củ sâm cau đen được đánh giá thông qua giá trị IC50, là phần trăm mẫu nguyên liệu cần thiết để ức chế 50% gốc tự do Giá trị IC50 thấp hơn cho thấy khả năng kháng oxy hóa của hợp chất nghiên cứu cao hơn (Villano và cộng sự, 2007).
Kết quả phần trăm ức chế gốc tự do DPPH của mẫu dịch chiết sâm cau đen đã được tính toán cho từng nồng độ, từ đó xây dựng đồ thị thể hiện mối tương quan tuyến tính giữa phần trăm ức chế gốc tự do và nồng độ dịch chiết Qua đó, giá trị IC50 (g/ml) của mỗi mẫu dịch chiết sâm cau đen cũng được xác định.
Phương pháp phân tích và xử lý số liệu
Tất cả các thí nghiệm được thực hiện ba lần, và kết quả được trình bày dưới dạng giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê được xác định với mức p < 0,05 bằng phần mềm Statgraphics 3.0.
KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
Ảnh hưởng của loại dung môi đến hiệu quả chiết tách
❖ Ảnh hưởng của loại dung môi đến hiệu quả chiết tách chất khô tổng số
Hình 4 1 Ảnh hưởng của loại dung môi đến hiệu quả chiết tách chất khô tổng số
Ghi chú: Các ký tự khác nhau thể hiện sự khác nhau có nghĩa về mặt thống kê (p < 0,05)
Quá trình chiết tách hợp chất sinh học từ thực vật bị ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố như bản chất nguyên liệu, loại hợp chất cần chiết, phương pháp chiết, tính chất và tỷ lệ dung môi, cũng như các điều kiện công nghệ như nhiệt độ, thời gian và pH Trong các điều kiện giống nhau về nhiệt độ và thời gian, dung môi được xem là yếu tố quan trọng nhất ảnh hưởng đến hiệu quả thu hồi hợp chất (Lohvina và cộng sự, 2022) Nghiên cứu này khảo sát các dung môi bao gồm ethyl acetate, ethanol 96%, ethanol 80%, acetone và nước cất.
Biểu đồ Hình 4.1 cho thấy sự khác biệt rõ rệt trong hiệu quả trích ly chất khô tổng từ các loại dung môi khác nhau (p < 0,05) Ethyl acetate (23,87 mg/g nguyên liệu) và acetone (39,53 mg/g nguyên liệu) cho hiệu quả trích ly thấp do các hợp chất trong sâm cau đen không tan trong hai dung môi này Ngược lại, nước cất đạt hiệu quả chiết tách cao nhất (392,53 mg/g nguyên liệu) nhờ chứa các hợp chất tan trong nước như proteins, carbohydrates và saponins Nước là dung môi tốt cho phenolic acids và glucosides, có năng suất chiết tách cao hơn so với methanol và ethanol Ethanol được khảo sát ở hai nồng độ khác nhau, 96% (93,47 mg/g nguyên liệu) và 80% (211,27 mg/g nguyên liệu), cho thấy sự chênh lệch rõ rệt Ethanol có khả năng chiết tách các hợp chất phenolic, glycosides, cũng như các hợp chất non-phenolic như sterols và terpenoids Pha loãng ethanol với nước giúp tăng khả năng hòa tan và chiết tách carbohydrates, acid hữu cơ và amino acids.
❖ Ảnh hưởng của loại dung môi đến hiệu quả chiết tách polyphenols tổng số
Hình 4 2 Ảnh hưởng của loại dung môi đến hiệu quả chiết tách polyphenols tổng số
Các ký tự khác nhau trong nghiên cứu cho thấy sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p < 0,05) Hình 4.2 minh họa ảnh hưởng của từng dung môi đến hiệu quả chiết tách polyphenols, cho thấy hiệu quả chiết tách giảm dần theo thứ tự dung môi ethanol 80%.
Dịch chiết polyphenols sử dụng dung môi acetone (6,15 mg GAE/g nguyên liệu) và nước cất (8,77 mg GAE/g nguyên liệu) cho thấy hiệu quả thu hồi thấp.
Kết quả nghiên cứu cho thấy rằng sâm cau đen chứa không chỉ polyphenols mà còn nhiều hợp chất khác, dẫn đến hàm lượng chất khô tổng số cao nhất khi sử dụng dung môi nước, nhưng hiệu quả thu hồi polyphenols lại thấp Việc trích xuất các hợp chất hóa học phụ thuộc vào bản chất hóa học và độ phân cực của dung môi Các dung môi như nước và acetone không hiệu quả trong việc trích xuất proteins, polysaccharides, terpenens, chlorophyll và lipid, trong khi ethanol cho kết quả tốt hơn (Rajbhar và cộng sự, 2015).
Dung môi ethanol 80% cho hiệu quả thu hồi polyphenols cao gấp 1,5 lần so với ethanol 96% Sự khác biệt này tương đồng với các nghiên cứu trước, cho thấy ethanol pha loãng hiệu quả hơn cồn nguyên chất trong việc chiết tách polyphenols nhờ khả năng hòa tan cả hợp chất phân cực và không phân cực Độ pha loãng của dung môi ảnh hưởng lớn đến hàm lượng và chất lượng sản phẩm thu được.
Nghiên cứu của Li BB và cộng sự (2006) cho thấy hàm lượng polyphenols từ chồi nho tăng khi nồng độ ethanol đạt 50%, nhưng sau đó lại giảm Trong khi đó, Stoica R và cộng sự (2013) chỉ ra rằng nồng độ ethanol 70% và 72 – 85% trong nước là cần thiết để chiết xuất polyphenols tổng số từ nho đen khô và vỏ cam quýt.
❖ Ảnh hưởng của loại dung môi đến hoạt tính kháng oxy hóa
Hình 4 3 Ảnh hưởng của loại dung môi đến giá trị IC 50
Ghi chú: Các ký tự khác nhau thể hiện sự khác nhau có nghĩa về mặt thống kê (p < 0,05)
Sâm cau chứa nhiều hoạt chất sinh học với khả năng chống oxy hóa mạnh mẽ Nghiên cứu cho thấy hoạt tính kháng oxy hóa của củ sâm cau đen được thể hiện qua khả năng ức chế gốc tự do bằng phương pháp DPPH Giá trị IC50 cho biết hàm lượng chất chống oxy hóa cần thiết để ức chế 50% gốc tự do, với giá trị IC50 thấp hơn cho thấy khả năng chống oxy hóa của mẫu cao hơn (Villano và cộng sự, 2007).
Mẫu có hoạt tính kháng oxy hóa mạnh nhất khi sử dụng dung môi ethanol 80% với giá trị IC50 đạt 753,74 µg/mL Các dung môi còn lại đều có giá trị IC50 cao hơn 1400 µg/mL, cho thấy hoạt tính kháng oxy hóa giảm dần theo thứ tự: ethanol 80% > acetone > ethanol 96%.
Dịch chiết sâm cau đen sử dụng dung môi ethanol 80% cho hiệu quả tốt nhất, với khả năng chiết tách chất khô tổng số cao thứ hai và polyphenols đạt kết quả tốt nhất cùng hoạt tính kháng oxy hóa mạnh nhất Do đó, ethanol 80% được chọn để khảo sát chiết tách củ sâm cau đen trong nghiên cứu này, phù hợp với các nghiên cứu trước đây (Sharheen và cộng sự, 2010; Zhou và Yu, 2004) Hầu hết polyphenols là hợp chất phân cực, nên việc sử dụng dung môi phân cực cao như ethanol và nước cất sẽ mang lại hiệu quả thu hồi cao hơn so với các dung môi khác (Gil và cộng sự, 1999; Dai và Mumper).
Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng việc kết hợp dung môi hoặc sử dụng dung môi pha loãng có hiệu quả chiết tách và hoạt tính kháng oxy hóa cao hơn, vì ethanol không thể chiết tách 100% các hợp chất trong thực vật Sử dụng cồn pha loãng giúp tăng cường hiệu quả chiết tách cho các hợp chất chống oxy hóa tan trong nước Ethanol được ưa chuộng trong kỹ thuật chiết tách nhờ tính chất không độc hại và giá thành rẻ.
Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi đến hiệu quả chiết tách
❖ Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi đến hiệu quả chiết tách chất khô tổng số
Hình 4 4 Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi đến hiệu quả chiết tách chất khô tổng số
Ghi chú: Các ký tự khác nhau thể hiện sự khác nhau có nghĩa về mặt thống kê (p <
Dung môi ethanol 80% được chọn từ thí nghiệm trước sẽ được sử dụng cho thí nghiệm này Thí nghiệm được thực hiện ở nhiệt độ phòng trong khoảng thời gian 120 phút.
Khảo sát về thay đổi tỷ lệ dung môi/nguyên liệu cho thấy không có sự khác biệt lớn (p < 0,05) Tỷ lệ 40/1 đạt khả năng chiết tách tốt nhất với 229,73 mg/g nguyên liệu, trong khi tỷ lệ 10/1 có khả năng chiết tách kém nhất với 192,13 mg/g Khả năng chiết tách chất khô tổng số thấp nhất ở tỷ lệ 10/1 và tăng dần đến giá trị cao nhất ở tỷ lệ 40/1, nhưng khi tăng lên 80/1, hiệu quả chiết tách có dấu hiệu giảm Điều này phù hợp với định luật khuếch tán, khi tăng lượng dung môi, chênh lệch nồng độ giữa nguyên liệu và dung môi làm tăng tốc độ khuếch tán Tuy nhiên, tỷ lệ 80/1 tạo ra khoảng cách chênh lệch quá lớn, ảnh hưởng đến khả năng khuếch tán Yang và Zhang (2008) cũng đã chỉ ra rằng tỷ lệ 40/1 là tối ưu cho việc thu hồi hợp chất cao nhất từ một loài cây thảo mộc, và hiệu quả thu hồi không tăng khi nâng tỷ lệ.
❖ Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi đến hiệu quả chiết tách polyphenols tổng số
Hình 4 5 Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi đến hiệu quả chiết tách polyphenols tổng số
Ghi chú: Các ký tự khác nhau thể hiện sự khác nhau có nghĩa về mặt thống kê (p < 0,05)
Khả năng chiết tách polyphenols tổng số cho thấy sự khác biệt rõ rệt về hiệu quả khi sử dụng các tỷ lệ dung môi/nguyên liệu khác nhau Tỷ lệ dung môi 80/1 đạt hiệu quả chiết tách cao nhất với 27,41 mg/g nguyên liệu, trong khi tỷ lệ 10/1 có hiệu quả thấp nhất với 18,39 mg/g nguyên liệu Sự gia tăng tỷ lệ dung môi/nguyên liệu trong dịch chiết tương ứng với hàm lượng polyphenols tổng cũng tăng lên, phù hợp với nghiên cứu trước đó về chiết tách polyphenols từ vỏ cam (Nayak và cộng sự, 2015).
❖ Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi đến hoạt tính kháng oxy hóa
Hình 4 6 Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi đến giá trị IC 50
Các ký tự khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p < 0,05) Đồ thị Hình 4.6 cho thấy giá trị IC50 của các dịch chiết khác nhau (p < 0,05) khi khảo sát các tỷ lệ dung môi/nguyên liệu khác nhau Giá trị IC50 tăng dần theo tỷ lệ dung môi, cho thấy rằng khi tỷ lệ dung môi/nguyên liệu tăng, hoạt tính kháng oxy hóa giảm Tỷ lệ 80/1 có giá trị IC50 cao nhất (1144,94 µg/mL) và tỷ lệ 10/1 có giá trị thấp nhất (772,27 µg/mL), cho thấy hoạt tính kháng oxy hóa mạnh nhất.
Tỷ lệ dung môi/nguyên liệu 10/1 được xác định là tối ưu, vì nó cho phép tách chiết chất khô tổng số ở mức trung bình và đạt khả năng kháng oxy hóa cao nhất Hiệu quả chiết tách không thể tăng vô hạn với việc gia tăng tỷ lệ dung môi/nguyên liệu; khi đạt giá trị tối đa, việc tăng thêm tỷ lệ không còn ảnh hưởng nhiều đến hiệu quả chiết tách Nghiên cứu cho thấy tỷ lệ 10/1 mang lại giá trị IC50 thấp nhất, tương ứng với hoạt tính kháng oxy hóa mạnh nhất Các nhà nghiên cứu cũng đang tìm cách sử dụng tỷ lệ dung môi/nguyên liệu thấp hơn để giảm thiểu lượng dung môi sử dụng.
Ảnh hưởng của thời gian ngâm đến hiệu quả chiết tách
❖ Ảnh hưởng của thời gian ngâm đến hiệu quả chiết tách chất khô tổng số
Hình 4 7 Ảnh hưởng của thời gian ngâm đến hiệu quả chiết tách chất khô tổng số
Ghi chú: Các ký tự khác nhau thể hiện sự khác nhau có nghĩa về mặt thống kê (p < 0,05)
Sau khi chọn dung môi ethanol 80% và tỉ lệ dung môi/nguyên liệu là 10/1, nghiên cứu tiếp tục khảo sát ảnh hưởng của thời gian ngâm chiết đến hiệu quả thu hồi hợp chất Kết quả cho thấy hiệu quả thu hồi chất khô tổng số đạt cao nhất sau 60 phút chiết tách, với giá trị 189,53 mg/g nguyên liệu, và có xu hướng giảm dần khi thời gian tăng Tuy nhiên, không có sự khác biệt đáng kể giữa hai mẫu chiết tách ở 60 và 120 phút (p < 0,05).
❖ Ảnh hưởng của thời gian ngâm đến hiệu quả chiết tách polyphenols tổng số
Hình 4 8 Ảnh hưởng của thời gian ngâm đến hiệu quả chiết tách polyphenols tổng số
Ghi chú: Các ký tự khác nhau thể hiện sự khác nhau có nghĩa về mặt thống kê (p <
Kết quả nghiên cứu cho thấy hiệu quả thu hồi polyphenols từ dịch chiết sâm cau đen khác nhau tùy thuộc vào thời gian chiết tách Hàm lượng polyphenols cao nhất đạt được sau 120 phút ngâm chiết (20,42 mg GAE/g nguyên liệu), tiếp theo là 60 phút (19,50 mg GAE/g nguyên liệu), 180 phút (19,20 mg GAE/g nguyên liệu) và 240 phút (17,39 mg GAE/g nguyên liệu) Sau 120 phút, hàm lượng polyphenols có xu hướng giảm khi thời gian ngâm chiết tiếp tục tăng Nghiên cứu của Durling và cộng sự (2007) cũng cho thấy thời gian ngâm chiết ngắn giúp thu hồi polyphenols hiệu quả hơn, do thời gian chiết tách dài có thể làm bay hơi dung môi và tăng nguy cơ tiếp xúc với các tác nhân môi trường như oxy và ánh sáng (Juntachote và cộng sự, 2006; Chirinos và cộng sự, 2007; Chan và cộng sự, 2009) Thời gian chiết tách tối ưu còn phụ thuộc vào bản chất nguyên liệu và dung môi sử dụng (Rusak và cộng sự, 2008; Chuyen và cộng sự).
❖ Ảnh hưởng của thời gian ngâm đến hoạt tính kháng oxy hóa
Hình 4 9 Ảnh hưởng của thời gian ngâm đến giá trị IC 50
Ghi chú: Các ký tự khác nhau thể hiện sự khác nhau có nghĩa về mặt thống kê (p < 0,05)
Hình 4.9 cho thấy thời gian ngâm chiết có ảnh hưởng đáng kể đến giá trị IC50 của dịch chiết củ sâm cau đen
Nghiên cứu cho thấy mẫu sâm cau đen ngâm trong 120 và 180 phút không có sự khác biệt đáng kể về khả năng kháng oxy hóa, với giá trị IC50 lần lượt là 746,25 và 705,24 µg/ml Hoạt tính kháng oxy hóa của dịch chiết sâm cau tăng dần từ 60 đến 180 phút, nhưng giảm sau đó Nhiều nghiên cứu cũng chỉ ra rằng thời gian ngâm 180 phút mang lại kết quả tốt nhất, trong khi 60 phút không đủ để hòa tan các hợp chất polyphenols Việc chiết tách sau thời gian tối ưu có thể dẫn đến sự phân hủy các chất chống oxy hóa do tác động của oxy, ánh sáng và nhiệt độ Theo định luật khuếch tán Fick thứ hai, sự khuếch tán của các phân tử đạt trạng thái cân bằng sau một thời gian nhất định, do đó, ngâm lâu hơn có thể làm giảm khả năng khử gốc tự do DPPH Từ ba thí nghiệm, 120 phút được xác định là thời gian ngâm tối ưu để chiết tách củ sâm cau đen với dung môi ethanol 80%.
Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu quả chiết tách
❖ Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu quả chiết tách chất khô tổng số
Hình 4 10 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu quả chiết tách chất khô tổng số
Ghi chú: Các ký tự khác nhau thể hiện sự khác nhau có nghĩa về mặt thống kê (p < 0,05)
Nhiệt độ ngâm chiết là một yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến hiệu quả thu hồi polyphenols và hoạt tính kháng oxy hóa của thực phẩm, bên cạnh loại dung môi, tỷ lệ dung môi và thời gian ngâm chiết (Antony và Farid, 2022) Trong phương pháp chiết tách truyền thống, việc tăng nhiệt độ ngâm chiết trong khoảng 20 độ có thể cải thiện đáng kể hiệu quả chiết xuất.
Nghiên cứu cho thấy nhiệt độ 80 °C có thể tăng cường hiệu quả thu hồi hợp chất thực vật, đặc biệt là polyphenols (Oreopoulou và cộng sự, 2019) Do đó, ethanol 80% được chọn làm dung môi chiết tách củ sâm cau đen, với nhiệt độ sôi của ethanol là 78,3 °C Nhiệt độ chiết tách quá cao có thể làm bay hơi ethanol, dẫn đến thay đổi nồng độ ethanol trong dung môi (Shi và cộng sự, 2003) Trong nghiên cứu này, nguyên liệu sâm cau đen được khảo sát ở 5 khoảng nhiệt độ: nhiệt độ phòng, 40, 50, 60 và 70 °C trong 120 phút.
Theo Hình 4.10, tổng hàm lượng chất khô của củ sâm cau đen đạt tối ưu khi gia nhiệt trên 50 °C, với sự gia tăng 16,9% từ nhiệt độ phòng lên 50 °C (từ 173,60 đến 208,97 mg/g nguyên liệu), nhưng có xu hướng giảm nhẹ ở 60 – 70 °C Ngược lại, kết quả thu hồi polyphenols (Hình 4.11) cho thấy hiệu quả thu hồi tăng khi chiết tách ở 60 – 70 °C Điều này có thể do trong thành phần chất khô của dịch chiết còn chứa polysaccharides, monosaccharides, saponins, glycosides, alkaloids và các hợp chất không chứa vòng (Nie và cộng sự, 2013) Một số hợp chất nhạy cảm với nhiệt có thể bị phân hủy khi ngâm chiết củ sâm cau đen ở 60 – 70 °C sau 120 phút.
Nhiệt độ cao có khả năng làm mềm mô thực vật và yếu các liên kết giữa các nhóm chất thực vật, như phenol-protein và phenol-polysaccharide, từ đó giúp giải phóng hợp chất thực vật và tăng cường khuếch tán vào dung môi Đồng thời, độ nhớt và sức căng bề mặt của dung môi giảm ở nhiệt độ cao, tạo điều kiện thuận lợi cho sự tiếp xúc giữa dung môi và mẫu Tuy nhiên, gia nhiệt quá mức có thể dẫn đến quá trình oxy hóa nhanh chóng và phân hủy các hợp chất thực vật cần phân lập Hơn nữa, các thành phần không mong muốn như protein và polysaccharide có thể xâm nhập vào dung môi, hình thành mạng lưới gel, ảnh hưởng đến quá trình chiết tách và làm giảm nồng độ chất khô tổng số.
❖ Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu quả chiết tách polyphenols tổng số
Hình 4 11 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu quả chiết tách polyphenols tổng số
Ghi chú: Các ký tự khác nhau thể hiện sự khác nhau có nghĩa về mặt thống kê (p < 0,05)
Kết quả khảo sát cho thấy hàm lượng polyphenols có sự khác biệt rõ rệt ở ba khoảng nhiệt độ: nhiệt độ phòng, 40 °C, 50 °C và 60 – 70 °C (p < 0,05) Cụ thể, hàm lượng polyphenols khi ngâm sâm cau đen ở nhiệt độ phòng và 40 °C không có sự khác biệt đáng kể Tuy nhiên, khi tăng nhiệt độ từ 50 đến 60 °C, hàm lượng polyphenols tổng số tăng 11,5% (từ 19,83 đến 22,42 mg GAE/g nguyên liệu khô) và tiếp tục tăng nhẹ ở 70 °C (22,45 mg GAE/g nguyên liệu khô) Sự gia tăng này có thể được giải thích bởi hai cơ chế: bẻ gãy các liên kết giữa lignins và acid phenolic, cùng với sự tự phân hủy của lignins ở nhiệt độ cao, giải phóng nhiều hợp chất phenolic hơn Do đó, khoảng nhiệt độ 60 – 70 °C là tối ưu để thu được tối đa hợp chất polyphenols từ củ sâm cau đen, phù hợp với nghiên cứu của Alessandro và cộng sự (2000) cho thấy chiết tách ở 60 °C thu được lượng polyphenols gấp ba lần so với 20 °C.
❖ Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính kháng oxy hóa
Hình 4 12 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến giá trị IC 50
Ghi chú: Các ký tự khác nhau thể hiện sự khác nhau có nghĩa về mặt thống kê (p < 0,05)
Nhiệt độ ngâm chiết có ảnh hưởng đáng kể đến khả năng kháng oxy hóa của dịch chiết củ sâm cau đen, được chứng minh qua khả năng ức chế gốc tự do DPPH (p < 0,05) Cụ thể, trong khoảng thời gian ngâm chiết 120 phút, khi nhiệt độ ngâm chiết tăng từ nhiệt độ phòng lên 50°C, khả năng oxy hóa tăng 14,8% (giá trị IC50 giảm từ 766,5 xuống 653,47 µg/mL) Tuy nhiên, khả năng kháng oxy hóa lại giảm dần khi nhiệt độ tiếp tục được nâng cao.
Nhiệt độ là yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến hoạt tính kháng oxy hóa, đặc biệt là ở củ sâm cau đen, nơi các hợp chất phenolic đóng vai trò chính (Wu và cộng sự, 2005) Mỗi loại thực vật có nhiệt độ giới hạn để tối ưu hóa việc thu hồi các hợp chất chống oxy hóa, và sự thay đổi nhiệt độ có thể ảnh hưởng đến cơ chế hoạt động của các chất này Nhiệt độ có thể tác động đến các phản ứng mà chất chống oxy hóa tham gia hoặc làm chúng bay hơi (Réblová, 2012) Ngoài ra, việc ngâm chiết ở nhiệt độ cao trong thời gian dài có thể dẫn đến sự phân hủy các hợp chất kháng oxy hóa liên kết với polyphenols (Sulaiman và cộng sự, 2017).
Nghiên cứu cho thấy nhiệt độ 60 °C là tối ưu nhất để chiết tách củ sâm cau đen, ảnh hưởng tích cực đến hiệu suất thu hồi chất khô tổng số, polyphenols và hoạt tính kháng oxy hóa Kết quả này hỗ trợ các nghiên cứu trước đó về tác động của nhiệt độ trong kỹ thuật chiết tách polyphenols truyền thống, cho thấy ethanol là dung môi hiệu quả nhất trong quá trình chiết tách.
He và cộng sự (2014) đã thu hồi và phân lập 45 hợp chất hoá học trong củ sâm cau đen, bao gồm các hợp chất polyphenols, ở nhiệt độ 60 °C trong 120 phút Nghiên cứu này phù hợp với các nghiên cứu trước đó về ảnh hưởng của nhiệt độ chiết tách đến hiệu quả thu hồi polyphenols, như nghiên cứu của Spigno và cộng sự (2006) trên bã nho, Dent và cộng sự (2013) trên lá xô thơm, và Sulaiman (2017) trên lá cây bìm bịp, tất cả đều sử dụng dung môi ethanol và xác định nhiệt độ chiết tách tối ưu là 60 °C.
Ảnh hưởng của sóng siêu âm đến hiệu quả chiết tách
❖ Ảnh hưởng của sóng siêu âm đến hiệu quả chiết tách chất khô tổng số
Hình 4 13 Ảnh hưởng của sóng siêu âm đến hiệu quả chiết tách chất khô tổng số
Ghi chú: Các ký tự khác nhau thể hiện sự khác nhau có nghĩa về mặt thống kê (p < 0,05)
Kết quả từ Hình 4.13 cho thấy hiệu quả thu hồi chất khô tổng số của dịch chiết củ sâm cau đen khi sử dụng sóng siêu âm ở tần số 28kHz và nhiệt độ 60°C Chất khô tổng số tăng rõ rệt khi thời gian ngâm chiết kéo dài, đạt hiệu quả tối ưu sau 15 phút với 292,97 mg/g nguyên liệu Sự gia tăng này được giải thích bởi việc kéo dài thời gian ngâm giúp tăng cường tiếp xúc giữa dung môi và nguyên liệu, đồng thời phá vỡ nhiều bọt khí hơn, làm yếu thành tế bào thực vật, từ đó tăng tốc độ truyền khối và hiệu quả thu hồi hợp chất.
❖ Ảnh hưởng của sóng siêu âm đến hiệu quả chiết tách polyphenols tổng số
Hình 4 14 Ảnh hưởng của sóng siêu âm đến hiệu quả chiết tách polyphenols tổng số
Ghi chú: Các ký tự khác nhau thể hiện sự khác nhau có nghĩa về mặt thống kê (p < 0,05)
Thời gian ngâm trong chiết tách hỗ trợ sóng siêu âm có ảnh hưởng đáng kể đến hiệu quả chiết tách polyphenols trong củ sâm cau đen Kết quả cho thấy hiệu suất chiết tách tăng từ 5 đến 15 phút, với giá trị polyphenols tăng từ 21,28 đến 23,73 mg GAE/g nguyên liệu Sự gia tăng này cũng phản ánh sự tăng trưởng của chất khô tổng số, nhờ vào khả năng hòa tan và khuếch tán của polyphenols trong dung môi.
❖ Ảnh hưởng của sóng siêu âm đến hoạt tính kháng oxy hóa
Hình 4 15 Ảnh hưởng của sóng siêu âm đến giá trị IC 50
Ghi chú: Các ký tự khác nhau thể hiện sự khác nhau có nghĩa về mặt thống kê (p < 0,05)
Hình 4.15 thể hiện ảnh hưởng của thời gian ngâm của kỹ thuật chiết tách hỗ trợ sóng
Kết quả nghiên cứu cho thấy giá trị IC50 của ba mẫu dao động từ 641,04 đến 714,75 g/mL, không có sự chênh lệch lớn (p < 0,05) Hoạt tính kháng oxy hóa của dịch chiết củ sâm cau đen đạt cao nhất sau 15 phút ngâm chiết với giá trị 641,04 g/mL Điều này cho thấy 15 phút là thời gian ngâm tối ưu nhất khi sử dụng kỹ thuật chiết tách hỗ trợ sóng siêu âm cho dịch chiết củ sâm cau đen.
Nghiên cứu cho thấy thời gian ngâm 15 phút là tối ưu nhất để thu hồi tối đa polyphenols, chất khô tổng số và hoạt tính kháng oxy hóa từ củ sâm cau đen Việc chiết tách polyphenols tăng đáng kể khi sử dụng sóng siêu âm trong khoảng thời gian từ 2 đến 120 phút và nhiệt độ từ 20 đến 90 độ C (Tobón và cộng sự, 2020) Hàm lượng polyphenols và hoạt tính kháng oxy hóa sẽ gia tăng khi thời gian ngâm chiết kéo dài, phù hợp với các nghiên cứu trước đây về ảnh hưởng của kỹ thuật chiết tách bằng sóng siêu âm đối với quả nho (Porto và cộng sự, 2013) và lá hương thảo (Albu và cộng sự, 2004).
Ảnh hưởng của vi sóng đến hiệu quả chiết tách
❖ Ảnh hưởng của vi sóng đến hiệu quả chiết tách chất khô tổng số
Hình 4 16 Ảnh hưởng của vi sóng đến hiệu quả chiết tách chất khô tổng số
Ghi chú: Các ký tự khác nhau thể hiện sự khác nhau có nghĩa về mặt thống kê (p < 0,05)
Các thí nghiệm khảo sát sơ bộ cho thấy rằng việc chiết tách liên tục với sự hỗ trợ của vi sóng (MAE) giúp tăng nhiệt độ dịch chiết nhanh chóng đến mức sôi.
2018) Vì vậy, nghiên cứu thiết lập chu kì bức xạ vi sóng gián đoạn gồm 15s “on” và 45s
Nhiệt độ 60°C được chọn làm giới hạn cho quá trình chiết tách hỗ trợ vi sóng, nhằm kéo dài thời gian chiết tách Thí nghiệm sử dụng dung môi ethanol 80% với tỷ lệ dung môi/nguyên liệu là 10/1 và công suất vi sóng là 180W.
Biểu đồ Hình 4.16 cho thấy rõ ràng khả năng chiết tách chất khô tổng số của dịch chiết sâm cau đen khi được hỗ trợ bằng vi sóng Khi thời gian ngâm dịch chiết tăng, khả năng chiết tách chất khô tổng số cũng tăng, với hiệu quả cao nhất đạt được ở thời gian 540 giây.
Thời gian chiết tách tối ưu là 360 giây, trong khi 180 giây cho hiệu quả thấp nhất Tuy nhiên, hiệu quả chiết tách khi sử dụng vi sóng không có sự khác biệt đáng kể.
❖ Ảnh hưởng của vi sóng đến hiệu quả chiết tách polyphenols tổng số
Hình 4 17 Ảnh hưởng của vi sóng đến hiệu quả chiết tách polyphenols tổng số
Ghi chú: Các ký tự khác nhau thể hiện sự khác nhau có nghĩa về mặt thống kê (p < 0,05)
Hiệu quả chiết tách polyphenols tổng số với sự hỗ trợ của vi sóng cho thấy không có sự chênh lệch lớn ở ba mốc thời gian khác nhau Thời gian ngâm chiết kéo dài làm tăng khả năng trích ly polyphenols, với giá trị cao nhất đạt được ở 540 giây (5,18 mg GAE/g nguyên liệu) và thấp nhất ở 180 giây Sự gia tăng hiệu quả thu hồi polyphenols có thể được giải thích bởi việc tăng thời gian tiếp xúc vi sóng, giúp cải thiện khả năng thâm nhập vào chất nền thực vật và tương tác với các phân tử phân cực, dẫn đến gia nhiệt nguyên liệu và tăng áp suất bên trong tế bào, gây phá vỡ thành tế bào.
❖ Ảnh hưởng của vi sóng đến hoạt tính kháng oxy hóa
Hình 4 18 Ảnh hưởng của vi sóng đến giá trị IC 50
Ghi chú: Các ký tự khác nhau thể hiện sự khác nhau có nghĩa về mặt thống kê (p < 0,05)
Giá trị IC50 của dịch chiết sâm cau đen giảm theo thời gian ngâm khi có sự hỗ trợ bằng vi sóng, với IC50 cao nhất ở 180 giây và thấp nhất ở 540 giây (1912,31 àg/mL) Nhìn chung, giá trị IC50 khi chiết tách bằng vi sóng đều trên 1900 àg/mL, cao hơn so với các mẫu chiết tách thông thường và mẫu hỗ trợ bằng sóng siêu âm, cho thấy hoạt tính kháng oxy hóa của củ sâm cau đen khi chiết tách bằng vi sóng là khá thấp.
Nghiên cứu cho thấy, thời gian chiết tách hợp chất trong sâm cau đen tối ưu nhất là 540 giây khi sử dụng vi sóng, mang lại hiệu quả cao nhất cho việc chiết xuất chất khô tổng số, polyphenols tổng số và hoạt tính kháng oxy hóa Việc tăng thời gian chiết tách trong phương pháp chiết tách bằng vi sóng (MAE) không chỉ nâng cao hiệu quả lượng chất cần phân tích mà còn có thể dẫn đến sự phân hủy một số hợp chất.
So sánh hiệu quả thu hồi hợp chất của ba phương pháp chiết tách khác nhau trong chiết tách sâm cau đen:
Bảng 4 1 So sánh hiệu quả thu hồi hợp chất từ sâm cau đen theo các phương pháp khác nhau
Thông số Phương pháp chiết tách
Chiết tách thông thường Chiết tách hỗ trợ sóng siêu âm (UAE)
Chiết tách hỗ trợ vi sóng
(MAE) Thời gian ngâm chiết
Trong cùng một hàng, các số trung bình có chữ cái giống nhau phía sau không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức 5%.
Nghiên cứu so sánh ba phương pháp chiết tách: chiết tách thông thường trong 120 phút ở 60 °C, chiết tách hỗ trợ sóng siêu âm trong 15 phút ở 60 °C, và chiết tách hỗ trợ vi sóng trong 9 phút, tất cả đều sử dụng dung môi ethanol 80% với tỷ lệ 10/1 (ml dung môi/g nguyên liệu) Kết quả cho thấy phương pháp chiết tách hỗ trợ sóng siêu âm rút ngắn thời gian chiết tách gấp 8 lần so với phương pháp thông thường, đồng thời hiệu quả thu hồi các hợp chất và hoạt tính kháng oxy hóa của củ sâm cau đen vượt trội hơn Cụ thể, hàm lượng chất khô tăng 44% khi sử dụng sóng siêu âm, đạt 292,97 mg/g so với 202,67 mg/g của phương pháp thông thường Ngoài ra, tổng hàm lượng polyphenols cũng tăng đáng kể, với giá trị tương ứng là 23,73 và 22,42 mg GAE/g nguyên liệu Kỹ thuật chiết tách hỗ trợ sóng siêu âm còn cải thiện khả năng ức chế gốc tự do DPPH, với giá trị IC50 lần lượt là 641,04 và 741,25 µg/ml cho chiết tách sóng siêu âm và chiết tách thông thường.
Nghiên cứu đã chứng minh tác động tích cực của sóng siêu âm trong việc thu hồi các hợp chất sinh học, đặc biệt là polyphenols Cai và cộng sự (2012) cho biết hiệu quả thu hồi polyphenols từ củ khoai tây tím tăng 22% so với phương pháp chiết tách thông thường Patil và cộng sự (2012) cũng xác nhận chiết tách hỗ trợ sóng siêu âm là phương pháp tối ưu cho củ sâm cau đen Diouf và cộng sự (2009) nhấn mạnh rằng phương pháp này là “thân thiện với môi trường” hơn so với các kỹ thuật truyền thống Mặc dù phương pháp chiết tách hỗ trợ vi sóng (MAE) cho kết quả thu hồi thấp hơn so với ngâm chiết thông thường, nhưng thời gian chiết tách chỉ mất 9 phút, nhanh hơn 13 lần so với phương pháp thông thường và 1,6 lần so với sóng siêu âm Nghiên cứu của Li và cộng sự (2010) cũng cho thấy MAE tiết kiệm năng lượng và giảm lượng CO2 thải ra, mặc dù hiệu quả thu hồi polyphenols thấp hơn.