Luận án tiến sĩ khảo sát đột biến precore và basal core promoter ở bệnh nhân viêm gan siêu vi b mạn

Đa số tác giả cho rằng khi chủng đột biến trở nên ưu thế trong quần thể, vai trò kiểm soát miễn dịch của người nhiễm mạn tính đối với HBV không còn hiệu quả, siêu vi tái hoạt và kích thí

NGUY ỄN THỊ CẨM HƯỜNG

PRECORE VÀ BASAL CORE PROMOTER

Ở BỆNH NHÂN VIÊM GAN SIÊU VI B MẠN

LU ẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC

TP H Ồ CHÍ MINH – Năm 2018

NGUY ỄN THỊ CẨM HƯỜNG

PRECORE VÀ BASAL CORE PROMOTER

Ở BỆNH NHÂN VIÊM GAN SIÊU VI B MẠN

CHUYÊN NGÀNH: TRUY ỀN NHIỄM VÀ CÁC BỆNH NHIỆT ĐỚI

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các kết quả nghiên cứu được trình bày trong luận án là trung thực, khách quan và chưa từng được công bố ở bất kỳ nơi nào

Tác giả luận án

Nguyễn Thị Cẩm Hường

MỤC LỤC

Trang

Danh mục các chữ viết tắt iv Danh mục đối chiếu thuật ngữ Anh - Việt vi

Danh mục các biểu đồ, sơ đồ xi

MỞ ĐẦU 1

Chương 1 TỔNG QUAN 4

1.1 Đặc điểm dịch tễ học nhiễm HBV 4

1.2 Bốn giai đoạn diễn tiến tự nhiên của nhiễm HBV mạn 9

1.3 Cấu trúc hình thái và bộ gen của HBV 13

1.4 Các kỹ thuật chẩn đoán đột biến vùng Precore và Basal core Promoter 17

1.5 Đột biến Precore và đột biến Basal core promoter 21

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 33

2.1 Thiết kế

2.2 Dân số đích

33 33 2.3 Dân số chọn mẫu 33

2.4 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 33

2.5 Cỡ mẫu 33

2.6 Tiêu chuẩn chọn bệnh và loại trừ 35

2.7 Biến số nghiên cứu 36

2.8 Định nghĩa biến số chính dùng trong nghiên cứu 37

2.9 Kỹ thuật đo lường biến số 39

2.10 Thu thập và phân tích số liệu

2.11 Vấn đề y đức

42 43 Chương 3 KẾT QUẢ 46

3.1 Đặc điểm của dân số nghiên cứu 47

3.2 Đặc điểm đột biến vùng Precore, Basal Core Promoter củadân số

3.6 Liên quan giữa đột biến vùng precore và basal core promoter với biến

chứng ung thư biểu mô tế bào gan (HCC)

65

Chương 4 BÀN LUẬN 70 4.1 Về phương pháp nghiên cứu 70 4.2 Về đặc điểm dân số nghiên cứu và đặc điểm nhiễm HBV 71 4.3 Về đặc điểm đột biến ở vùng precore và basal core promoter của dân số nghiên cứu

77

4.4 Về yếu tố liên quan với đột biến A1762T/G1764A và G1896A 81 4.4 Về liên quan giữa đột biến A1762T/G1764A, G1896A và thể bệnh viêm gan B mạn bùng phát

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

Phụ lục 1: Bảng thu thập số liệu

Phụ lục 2: Trang thông tin nghiên cứu và Phiếu đồng thuận

Phụ lục 3: Giấy chấp thuận của Hội đồng đạo đức

Phụ lục 4: Danh sách bệnh nhân

ALT Alanine transaminase

APRI Aspartate aminotransferase to Platelet Ratio index ARFI Acoustic Radiation Force Impulse Imaging

AST Aspartate transaminase

Anti HBc anti Hepatitis B core

Anti HBe anti Hepatitis B e

Anti HBs anti hepatitis B surface

ARMS - PCR Amplifications refractory mutation system

BCP Basal core promoter

CHBe(+) Chronic Hepatitis B HBeAg positive

CHBe(-) Chronic Hepatitis B HBeAg negative

CI Confidence interval

CTL Cytotoxic T lymphocyte

DNA DeoxyRibo Nucleic acid

dNTP deoxy Nucleotide triphosphate

DNMD Dung nạp miễn dịch

EN Enhancer

HBcAg Hepatitis B core antigen

HBeAg Hepatitis B e antigen

HBsAg Hepatitis B virus surface antigen

HBV Hepatitis B virus

HCC Hepato-cellular carcinoma

IC Inactive carrier

IDU Intravenous drug user

PCR Polymerase chain reaction

pgRNA pregenomic Ribo Nucleic acid

rcDNA relaxed circular DeoxyRibo Nucleic acid

TDF Tenofovir disoproxil fumarate

ULN Upper limit normal

VEM Vaccin escape mutant

DANH MỤC ĐỐI CHIẾU THUẬT NGỮ ANH – VIỆT

Từ viết tắt Thuật ngữ tiếng Anh Thuật ngữ tiếng Việt

APRI Aspartate aminotransferase to

Platelet Ratio index Chỉ số tỷ số AST trên tiểu cầu Anti HBc anti Hepatitis B core Kháng thể chống kháng nguyên lõi Anti HBe anti Hepatitis B e Kháng thể chống kháng nguyên e

Anti HBs anti hepatitis B surface Kháng thể chống kháng nguyên bề

mặt ARMS -

PCR

Amplifications refractory mutation system Hệ thống khuếch đại chịu nhiệt

CHBe(+) Chronic Hepatitis B HBeAg

positive Viêm gan B mạn HBeAg dương

CHBe(-) Chronic Hepatitis B HBeAg

negative Viêm gan B mạn HBeAg âm

CI Confidence interval Khoảng tin cậy

CTL Cytotoxic T lymphocyte Tế bào lympho T gây độc

EN Enhancer Tăng cường

HBcAg Hepatitis B core antigen Kháng nguyên lõi của HBV

HBeAg Hepatitis B e antigen Kháng nguyên HBe

HBsAg Hepatitis B virus surface

antigen Kháng nguyên bề mặt HBV HBV Hepatitis B virus Siêu vi viêm gan B

HCC Hepato cellular carcinoma Ung thư biểu mô tế bào gan

IC Inactive carrier Mang siêu vi không hoạt tính IDU Intravenous drug user Người tiêm chích ma tuý

IU International unit Đơn vị quốc tế

MLPA Multiplex ligation-dependent

probe amplification

Kỹ thuật khuếch đại phụ thuộc mẫu dò

mRNA Messenger RiboNucleic acid RNA thông tin

OR Odd Ratio Tỉ số chênh

ORF Open reading frame Khung đọc mã mở

PCR Polymerase chain reaction Phản ứng khuếch đại chuỗi gen

pgRNA pregenomic Ribo Nucleic acid RNA tiền gen

rcDNA relaxed circular DeoxyRibo

Nucleic acid DNA vòng thẳng

RE Restriction enzyme Enzym cắt giới hạn

RFLP Restriction Fragment Length

Polymorphism

Nghiên cứu đa hình đoạn gen sử dụng Enzym cắt giới hạn

RT Reverse transcriptase Men sao mã ngược

SD Standard deviation Độ lệch chuẩn

SNP Single nucleotide

polymorphism Đột biến một nucleotide ULN Upper limit normal Giới hạn trên so với bình thường VEM Vaccin escape mutant Đột biến trốn thoát vac-xin

DANH M ỤC CÁC BẢNG

Trang Bảng 2.1: Tỷ lệ ước tính của đột biến G1896A ở các nhóm nghiên cứu và cỡ mẫu

cần thiết để so sánh với tỷ lệ ở nhóm dung nạp miễn dịch ………

34 Bảng 2.2: Danh mục mồi xác định HBV genotype sử dụng trong nghiên cứu……… 41

Bảng 3.1 Đặc điểm của dân số nghiên cứu ……… 47

Bảng 3.2: Đặc điểm dấu ấn nhiễm HBV của dân số nghiên cứu ……… 48

Bảng 3.3: Phân bố giới theo nhóm giai đoạn nhiễm HBV ……… 49

Bảng 3.4: Phân bố genotype theo nhóm giai đoạn nhiễm HBV ……… 50

Bảng 3.5: Tỉ lệ đột biến vùng BCP của dân số nghiên cứu ……… 52

Bảng 3.6: Tỉ lệ đột biến vùng Precore và vùng Core ……… 53

Bảng 3.7: Phân bố đột biến A1762T/G1764A theo tuổi, giới, đặc điểm nhiễm HBV 57 Bảng 3.8: Các yếu tố liên quan với đột biến với A1762T/G1764A-Phân tích đa biến 58 Bảng 3.9: Phân bố đột biến G1896A theo tuổi, giới, đặc điểm nhiễm HBV ……… 59

Bảng 3.10: Các yếu tố liên quan với đột biến Precore – Phân tích đa biến ………… 60

Bảng 3.11: Phân bố thể bệnh viêm gan hoạt tính theo tình trạng đột biến G1896A và A1762T/G1764A ………

60 Bảng 3.12: Phân bố đột biến G1896A trong các thể viêm gan ở bệnh nhân viêm gan có hoạt tính phân tầng theo đột biến A1762T/G1764A ………

62 Bảng 3.13: Liên quan giữa các tổ hợp đột biến G1896A, A1762T/G1764A với thể bệnh viêm gan B mạn bùng phát – Phân tích đơn biến ………

61 Bảng 3.14: Phân bố tuổi và giới, dấu ấn nhiễm HBV ở nhóm có và không có xơ gan 62 Bảng 3.15: Phân bố đột biến vùng Basal core promoter ở hai nhóm có và không có xơ gan ………

63 Bảng 3.16: Phân bố đột biến vùng Precore và core ở hai nhóm có và không có xơ gan ………

64 Bảng 3.17: Các yếu tố liên quan độc lập với biến chứng xơ gan – Phân tích đa biến 65 Bảng 3.18: Đặc điểm tuổi, giới, tình trạng xơ hoá gan, dấu ấn nhiễm HBV giữa hai nhóm có và không có HCC ………

66

Bảng 3.19: Phân bố đột biến vùng Basal core promoter ở nhóm có và không có HCC 67 Bảng 3.20: Phân bố đột biến vùng Precore, core ở nhóm có và không có HCC …… 67 Bảng 3.21: Các yếu tố liên quan độc lập với biến chứng HCC – Phân tích đa biến … 68

DANH MỤC CÁC HÌNH

Trang

Hình 1.1: Phân bố địa lý của nhiễm HBV trên thế giới 5

Hình 1.2: Phân bố genotype của HBV trên thế giới 6

Hình 1.3: Diễn tiến tự nhiên nhiễm HBV mạn 10

Hình 1.4: Cấu trúc của HBV 14

Hình 1.5: Cấu trúc bộ gen của HBV 15

Hình 1.6: Kỹ thuật RFLP 18

Hình 1.7: Kỹ thuật giải trình tự DNA 20

Hình 1.8: Kết quả giải trình tự gen tìm đột biến Precore G1896A 20

Hình 1.9: Kết quả giải trình tự gen tìm đột biến A1762T/G1764A 20

Hình 1.10: Liên quan giữa đột biến precore và genotype của HBV 23 Hình 3.1: Có đột biến G1896A, T1753C, A1762T/G1764A, C1766T/C 56

DANH M ỤC CÁC BIỂU ĐỒ, SƠ ĐỒ

Trang

Sơ đồ 2.1: Sơ đồ thực hiện ……… 44

Sơ đồ 2.2: Mô hình nghiên cứu ……… 45

Sơ đồ 3.1: Thu nhận mẫu nghiên cứu ……… 46

Biểu đồ 3.1: Phân bố tuổi theo nhóm giai đoạn nhiễm HBV ……… 49

Biểu đồ 3.2: Tải lượng HBV theo giai đoạn nhiễm HBV ……… 50

Biểu đồ 3.3: Lượng HBsAg theo nhóm giai đoạn nhiễm HBV ……… 51

Biểu đồ 3.4 Phân bố đột biến T1753V, A1762T/G1764A, G1896A ở các nhóm tuổi ………

54 Biểu đồ 3.5: Phân bố đột biến G1896A, A1762T/G1764A ở các nhóm giai đoạn diễn biến nhiễm HBV mạn ………

55

MỞ ĐẦU

Nhiễm siêu vi viêm gan B (HBV) mạn là vấn đề sức khoẻ quan trọng của toàn cầu và Châu Á Thái Bình Dương Trên người, kết cục của nhiễm HBV mạn thay đổi theo tuổi nhiễm HBV và các đặc điểm siêu vi, là kết quả của quá trình tương tác giữa siêu vi và đáp ứng của ký chủ Tại các vùng lưu hành cao như châu Á và Việt Nam, nhiễm HBV thường xảy ra sớm từ tuổi sơ sinh, nguy cơ diễn tiến mạn tính cao, vì thế nhiễm HBV mạn có liên quan có ý nghĩa đến tần suất cao của bệnh gan mạn, xơ gan

và ung thư biểu mô tế bào gan (HCC) Liên quan đến yếu tố siêu vi, y văn đã thừa nhận đột biến G1896A ở vùng Precore (PC) và đột biến kép A1762T/G1764A ở vùng Basal core promoter (BCP) gây giảm biểu lộ HBeAg và có ảnh hưởng quan trọng trong quá trình diễn biến tự nhiên này

Tuy vậy, các dữ kiện về HBeAg và các đột biến liên quan này vẫn còn chưa được chú ý trong nhiều đồng thuận của các khu vực trên thế giới, làm cho việc đánh giá ảnh hưởng của các đột biến này chưa được đúng mức trong thực hành lâm sàng Mức độ phổ biến của các đột biến ở từng khu vực phân bố của genotype vẫn chưa được nghiên cứu đủ Theo các nghiên cứu đã thực hiện, đột biến G1896A chiếm ưu thế hơn ở vùng phân bố của genotype B và D (93% ở Trung Đông, 52% ở Châu Á Thái Bình Dương) [48]; đột biến A1762T/G1764A ưu thế hơn ở vùng lưu hành của genotype C [28]

Cho đến nay, vẫn còn nhiều ý kiến trái chiều về chủng đột biến vùng PC, BCP

là có lợi hay có hại Đa số tác giả cho rằng khi chủng đột biến trở nên ưu thế trong quần thể, vai trò kiểm soát miễn dịch của người nhiễm mạn tính đối với HBV không còn hiệu quả, siêu vi tái hoạt và kích thích miễn dịch như một chủng HBV mới, gây nên những đợt thải trừ miễn dịch mới làm cho diễn tiến bệnh gan trở nên không ổn định, diễn biến suy gan và biến chứng [83], [156] Các nhận định này dựa trên các tỷ

lệ các đột biến vùng PC, BCP thấp được tìm thấy ở người lành mang HBV và cao hơn ở người có viêm gan hoạt tính, xơ gan và ung thư biểu mô tế bào gan (HCC) [148, 163], [12, 170] Ngược lại, có tác giả lại cho rằng các đợt viêm gan cấp liên

quan với hình thành chủng đột biến tạo nên cơ hội thải trừ HBV hiệu quả hơn, chuyển huyết thanh HBeAg, thậm chí có thể chuyển huyết thanh HBsAg [159]

Từ năm 2010, đột biến G1896A và A1762T/G1764A được Chu và cộng sự đề nghị xem là một trong các tiêu chí để phân biệt trạng thái mang HBV không hoạt tính

và viêm gan B mạn tái hoạt [32]; đột biến A1762T/G1764A còn được Kao và cộng

sự đề nghị sử dụng trong thang điểm đánh giá nguy cơ HCC khi quản lý bệnh nhân nhiễm HBV mạn năm 2014 [70]

Cho đến nay, dữ liệu được công bố về tỷ lệ đột biến khác nhau nhiều giữa các nghiên cứu có lẽ do sự khác biệt về phân bố nhóm tuổi, genotype, mức độ bệnh lý gan, giai đoạn diễn biến nhiễm HBV, tải lượng HBV và giai đoạn có biến chứng xơ gan, HCC Tại Việt Nam, tỷ lệ G1896A trong nghiên cứu của tác giả Trần Thiện Tuấn Huy (năm 2004) là 32,8% [60] và của tác giả Dunford L 8 năm sau đó (năm 2012) vẫn là 34% [100] và tỷ lệ A1762T/G1764A trong 2 nghiên cứu này là 33,3% và 22% Các nghiên cứu sau năm 2010 tại Việt Nam cũng tìm thấy đột biến G1896A và A1762T/G1764A phổ biến hơn ở giai đoạn viêm gan B hoạt tính, nhất là trong giai đoạn chuyển huyết thanh HBeAg và ở giai đoạn có biến chứng HCC [4], [147],[1], [2] Các nghiên cứu này đã bắt đầu cho thấy ảnh hưởng của đột biến vùng PC, BCP trên diễn biến nhiễm HBV nhưng các công bố này dựa trên dữ liệu với cỡ mẫu còn nhỏ, và chưa đề cập đến ảnh hưởng của các kết hợp đột biến trên người nhiễm HBV mạn

Qua các nghiên cứu đã thực hiện trên có thể nhận ra rằng sự phân bố đột biến vùng PC hay BCP có khác nhau ở các giai đoạn diễn biến tự nhiên của nhiễm HBV mạn; là có lợi hay có hại cho tiến triển bệnh; có liên quan thế nào đến viêm gan bùng phát, xơ gan và HCC còn là những câu hỏi cần được trả lời tiếp Các dữ liệu này rất quan trọng để làm cơ sở đưa ra các quyết định thích hợp trong quản lý bệnh nhân nhiễm HBV tại Việt Nam

M ỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

1 Mô tả và so sánh tỷ lệ đột biến A1762T/G1764A và G1896A ở bệnh nhân nhiễm siêu vi viêm gan B mạn thuộc các giai đoạn của diễn tiến tự nhiên (dung nạp miễn dịch, viêm gan B mạn HBeAg dương, mang HBV không hoạt tính, viêm gan B mạn HBeAg âm) và ở bệnh nhân nhiễm HBV có biến chứng xơ gan và Ung thư biểu mô

tế bào gan (HCC)

2 Xác định các yếu tố liên quan đến đột biếnA1762T/G1764A và G1896A

3 Phân tích liên quan giữa đột biến vùng Precore và vùng Basal core promoter với thể bệnh viêm gan B mạn bùng phát, biến chứng xơ gan và HCC ở bệnh nhân nhiễm HBV mạn

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 ĐẶC ĐIỂM DỊCH TỄ HỌC NHIỄM HBV

1.1.1 Tỷ lệ nhiễm HBV trên thế giới

Nhiễm HBV là một trong các vấn đề sức khoẻ toàn cầu quan trọng Theo thống

kê của Tổ chức Y tế Thế giới, toàn thế giới có khoảng 2 tỉ người, tương đương với một phần ba dân số đã từng nhiễm HBV (anti HBc dương), gây khoảng 257 triệu người nhiễm HBV mạn [154] Tỷ lệ nhiễm HBV mạn tính (có dấu ấn HBsAg dương tính) trong cộng đồng thay đổi từ 2-20% [69, 94] Về phân bố của nhiễm HBV, thế giới được chia thành 3 vùng lưu hành Vùng lưu hành cao có ≥ 8% dân số mang HBsAg Vùng lưu hành trung bình có 2-7% dân số và vùng lưu hành thấp có < 2% dân số mang HBsAg

Khoảng 45% dân số thế giới sống ở châu Phi, châu Á, vùng Amazon và Trung Đông là vùng lưu hành cao của HBV với nguy cơ nhiễm HBV trong suốt cuộc sống

là hơn 60% Đường lây truyền HBV trong vùng lưu hành cao chủ yếu là bị lây qua chu sinh hay lây qua đường dọc, nghĩa là lây từ mẹ sang con hoặc trong lứa tuổi nhỏ hơn 2 tuổi qua đường xuyên qua da do tiếp xúc với máu và dịch tiết của người nhiễm HBV [39]

Chỉ khoảng 12% dân số thế giới sống ở vùng lưu hành thấp như Mỹ, Tây Âu và

Úc, là những nơi có tỷ lệ mang HBsAg < 1% với nguy cơ nhiễm HBV trong suốt cuộc sống < 20% Đường lây truyền chủ yếu trong vùng lưu hành thấp là lây truyền ngang ở tuổi trưởng thành qua quan hệ tình dục, qua sử dụng bơm tiêm nhiễm khuẩn hay sử dụng chất gây nghiện qua đường tĩnh mạch [39]

Phần còn lại của dân số thế giới sống ở vùng lưu hành trung bình như Đông và Nam Âu, Nga, Trung và Nam Mỹ với tỷ lệ mang HBsAg từ 1-7% và nguy cơ nhiễm HBV trong suốt cuộc sống từ 20-60% [39]

1.1.2 Tình hình nhiễm HBV ở Việt Nam

Việt Nam thuộc vùng tây Thái Bình Dương và Đông Nam Á (vùng lưu hành cao của HBV) với tỷ lệ mang HBsAg từ 7-12% Năm 1993, nhóm nghiên cứu Nakata và

Phạm Song khảo sát 1754 bệnh nhân ở Hà Nội và TP HCM ghi nhận tỷ lệ mang HBsAg (+) lần lượt là 16% và 10%, không khác biệt ở nhóm nguy cơ thấp và cao

Tỷ lệ mang HBsAg ở trẻ < 1 tuổi cao khoảng 10% được sinh từ mẹ nhiễm HBV có HBeAg (+) [111] Trong khảo sát 1200 mẫu máu từ những người cho máu ở tỉnh Quảng Trị năm 2007, tác giả Le Viet ghi nhận có 11,4% có HBsAg (+), 51,7% anti HBc (+) [151] Năm 2012, nhóm nghiên cứu gồm có tác giả Dunford và cộng sự khảo sát 8654 mẫu máu ở Hà Nội, Hải Phòng, Khánh Hòa và Cần Thơ cũng ghi nhận tỷ lệ mang HBsAg trong dân số nghiên cứu là 10,7%, tỷ lệ mang HBsAg trong nhóm nguy

cơ thấp (phụ nữ có thai, người nhập ngũ, người bệnh phẫu thuật, người cho máu) là 9,4% và cao hơn ở nhóm IDU là 17,4%, nhóm chạy thận nhân tạo là 14,3% [38]

Hình 1.1: Phân bố địa lý của nhiễm HBV trên thế giới

“Nguồn: WHO, 2015” [154]

1.1.3 Phân bố dịch tễ genotype của HBV trên thế giới và Việt Nam

Dựa trên trình tự bộ gen vào mức độ khác biệt về trình tự acid amin của gen S (> 8% hoặc từ 4-8%), người ta đã xác định 10 genotype (từ A tới J) và phụ type khác nhau của HBV Phân bố genotype và phụ type của HBV khác nhau theo vùng địa lý [36] Genotype A có tỷ lệ nhiễm cao ở vùng Châu Phi cận Sahara (phụ type A1), Bắc

Âu (phụ type A2), và Tây Phi (phụ type A3), Ấn Độ và một số khu vực ở Nam Mỹ

Genotype B và C thường gặp ở vùng châu Á Thái Bình Dương Tuy nhiên tỷ lệ genotype B và C thay đổi khác nhau giữa các nước châu Á [69] HBV Genotype C phổ biến hơn genotype B ở Trung Quốc, Nhật và Hàn Quốc, trong khi đó genotype

B chiếm ưu thế tại Đài Loan và Việt Nam

Genotype D thường gặp ở vùng phía nam châu Âu, vùng Trung Đông và các vùng tiểu lục địa Ấn Độ Genotype E và F thường gặp theo thứ tự ở Tây Phi và Nam

Mỹ Genotype G có thể gặp ở Pháp, Đức, Trung Mỹ, Mexico và Mỹ Genotype H lưu hành riêng ở Trung Mỹ Genotype I là tái tổ hợp từ genotype A, C, G, được phát hiện

ở Việt Nam năm 2008 [59] Genotype I này gặp ở bệnh nhân Lào, Trung Quốc, Ấn

Độ và người Việt Nam di cư hoặc trẻ em được nhận nuôi sống ở Pháp và Canada Tuy nhiên vẫn còn nhiều tranh cãi vì sự khác biệt về trình tự gen < 8% ở bệnh nhân người Việt có tái tổ hợp A/C/G so với trình tự gen của genotype C Genotype J được tìm ra từ một bệnh nhân nam người Nhật [143]

Khả năng chuyển thành mang HBV mạn tính, đáp ứng với kháng siêu vivà khả năng có biến chứng xơ gan và HCC khác nhau giữa các genotype [134], [122]

Hình 1.2: Phân bố genotype của HBV trên thế giới

“Nguồn: Gerlich W H., 2013” [49]

Các nghiên cứu về phân bố genotype của HBV tại Việt Nam

Tác giả Trần Thiện Tuấn Huy và cộng sự (năm 2004), bằng kỹ thuật PCR sử dụng đoạn mồi đặc hiệu cho vùng từ preS1 đến S để phát hiện genotype từ A đến F, ghi nhận genotype B và C có tỷ lệ tương đương nhau (51% và 48,7%) trong nghiên cứu quan sát trên 76 bệnh nhân viêm gan B mạn đến khám ở bệnh viện Bạch Mai và Chợ Rẫy [60] Năm 2009, tác giả Long H Nguyen dùng kỹ thuật giải trình tự khảo sát genotype của 475 bệnh nhân gốc Việt nhiễm HBV mạn tại bệnh viện khu vực Bắc

Mỹ ghi nhận genotype B chiếm đến 75%, cao hơn nhiều so với công bố của Trần Thiện Tuấn Huy có thể do dân số nghiên cứu gồm nhóm tuổi và các giai đoạn tiến triển bệnh khác nhau [100] Nhóm nghiên cứu của Dunford L và cộng sự thực hiện

đa trung tâm ở Việt Nam năm 2009 ở Hà Nội, Hải Phòng, Đà Nẵng, Khánh Hòa và Cần Thơ, trên 372 bệnh nhân nhiễm HBV thuộc nhóm có nguy cơ cao và thấp, mắc bệnh lây truyền qua đường máu và quan hệ tình dục cũng nhận thấy đến 85% nhiễm genotype B (genotype B4 ưu thế 82,6%, genotype B2 chiếm 2,7%) và gần 15% genotype C (trong đó C1 (14,6%), C5 (0,5%) [38] Hầu hết các nghiên cứu trên bệnh nhân nhiễm HBV Việt Nam đều cho thấy genotype B là nhóm genotype ưu thế, chiếm

≥ 2/3 bệnh nhân

Gánh nặng bệnh tật do nhiễm HBV

Khoảng 15-40% bệnh nhân nhiễm HBV mạn sẽ phát triển bệnh lý xơ gan, bệnh gan giai đoạn cuối hay HCC trong suốt đời sống Trên thế giới nhiễm HBV được ước tính là nguyên nhân gây ra 30% xơ gan và 53% HCC Mặc dù nhiễm HBV đã có vắc xin phòng ngừa hiệu quả > 20 năm và tỷ lệ nhiễm HBV đang có xu hướng giảm dần nhưng các bệnh lý gan liên quan đến HBV (đặc biệt là xơ gan và HCC) vẫn còn tiếp tục tăng thêm nhiều thập niên qua và còn tiếp tục là vấn đề sức khoẻ quan trọng cho đến năm 2025 theo các phân tích dự báo Theo số liệu tính toán của thế giới, có khoảng 600.000 người tử vong hàng năm do bệnh lý có liên quan đến HBV, hầu hết (94%) tử vong do biến chứng của xơ gan mất bù, suy gan và HCC [39]

Tiêm chủng mở rộng phòng ngừa bệnh viêm gan siêu vi B được áp dụng ở Việt Nam từ 2003 và giúp giảm 90% nhiễm HBV ở trẻ sơ sinh, tuy nhiên theo mô hình

toán học thì Việt Nam vẫn phải chịu đựng gánh nặng bệnh tật trong nhiều thập kỷ nữa Theo ước tính năm 2005, Việt Nam có khoảng 8,4 triệu người nhiễm HBV mạn

và khoảng 23.300 người tử vong do bệnh lý liên quan đến HBV [150] Theo mô hình

dự đoán của tác giả Nguyễn Thị Thúy Vân, vào năm 2025 số lượng người nhiễm HBV sẽ giảm còn 8 triệu người, số bệnh nhân xơ gan là 58.650, HCC là 25.000 và số

ca tử vong có liên quan đến HBV sẽ tăng đến 40.000 [150]

Ở vùng Đông Nam Á, vùng lưu hành cao của chủng HBV genotype B và C Nhiễm HBV genotype B ở tuổi trưởng thành thường có diễn biến cấp tính và dễ thải trừ hơn so với genotype C Ngược lại, nhiễm HBV genotype C thường có diễn biến kéo dài và mạn tính sau khi nhiễm cấp, chuyển đổi huyết thanh HBeAg chậm hơn và

có nguy cơ xơ gan và HCC nhiều hơn so với nhiễm genotype B [139]

Ngày nay, nhờ hiệu quả của các biện pháp theo dõi và điều trị các biến chứng của xơ gan như điều trị dãn tĩnh mạch thực quản, phòng ngừa vỡ dãn tĩnh mạch thực quản, điều trị báng bụng, phòng ngừa viêm phúc mạc nguyên phát, chất lượng sống

và tuổi thọ của bệnh nhân xơ gan ở các nước phát triển ngày càng cải thiện Tuy vậy, những bệnh nhân xơ gan kèm theo có yếu tố nguy cơ HCC khi được kéo dài tuổi thọ

sẽ tăng cơ hội phát triển HCC theo thời gian

HCC là loại ung thư phổ biến, đứng hàng thứ năm trên thế giới và là nguyên nhân gây tử vong do ung thư đứng hàng thứ ba Trong các nguyên nhân gây HCC, nhiễm HBV mạn là nguyên nhân của 50% HCC của thế giới và là nguyên nhân của 80% HCC xảy ra ở bệnh nhân sống ở vùng lưu hành cao Tỷ lệ có xơ gan ở bệnh nhân HCC khoảng 80-90%, tỷ lệ mới mắc cộng dồn sau 5 năm của HCC ở những bệnh nhân châu Á đã có xơ gan là 15% [46] Vì thế ở những vùng lưu hành cao của HBV, những người có xơ gan có nguy cơ HCC cao gấp 3 lần người viêm gan B mạn không

có xơ gan, và nguy cơ cao gấp 16 lần người mang HBV mạn không hoạt tính Nguy

cơ xuất hiện HCC tăng gấp 4 lần khi tuổi lúc chẩn đoán xơ gan > 50, khi HBV DNA

>105-106 copies/ml, hay HBeAg dương Bệnh nhân nhiễm HBV mạn, thải trừ HBeAg, kiểm soát siêu vi kéo dài, ALT không tăng thì thuộc nhóm nguy cơ HCC thấp Tuy nhiên trong các nghiên cứu đoàn hệ cũng ghi nhận HCC có thể xảy ra ở

bệnh nhân xơ gan ngay cả khi đã mất HBsAg tự nhiên mà không có đồng thời yếu tố nguy cơ HCC khác [46] Vai trò của genotype và các yếu tố liên quan với HCC như đột biến G1896A hay A1762T/G1764A vẫn còn nhận được nhiều chú ý và tranh cãi Nghiên cứu thực hiện ở bệnh nhân Đài Loan cho thấy genotype B tăng nguy cơ HCC [20], nghiên cứu phân tích gộp của tác giả Wong (2013) chứng minh nguy cơ HCC cao hơn ở genotype C so với genotype A và D [155] Trong khi đó, trong các nghiên cứu ở bệnh nhân người Nhật hay Trung Quốc thì nguy cơ HCC không liên quan với genotype B hay C Những hiểu biết sau khi có ứng dụng sinh học phân tử cho thấy đột biến kép A1762T/G1764A gây tăng nguy cơ HCC ở những bệnh nhân nhiễm HBV trên các genotype khác nhau Bệnh nhân nhiễm HBV mạn có uống rượu tăng nguy cơ HCC gấp 2 lần Trong nghiên cứu đoàn hệ REVEAL thực hiện ở Đài Loan (năm 2007) ở 22.472 người nhiễm HBV mạn, ghi nhận bệnh nhân nhiễm HBV có tỷ

lệ sống còn thấp hơn người không nhiễm, nguy cơ tử vong do nguyên nhân bất kỳ tăng 1,7 lần, nguy cơ tử vong do HCC tăng 22,4 lần, nguy cơ tử vong do bệnh gan mạn, xơ gan tăng 5,4 lần so với người không nhiễm HBV [62]

1.2 BỐN GIAI ĐOẠN DIỄN TIẾN TỰ NHIÊN CỦA NHIỄM HBV MẠN

Diễn tiến tự nhiên của viêm gan B mạn có thể được chia thành 4 giai đoạn theo hoạt tính của miễn dịch với HBV: giai đoạn dung nạp miễn dịch (immune tolerance), giai đoạn thải trừ miễn dịch (immune clearance); giai đoạn kiểm soát miễn dịch (immune control); giai đoạn trốn thoát miễn dịch (immune escape) có tái hoạt siêu vi trở lại hay có thể được thay bằng giai đoạn hồi phục (resolution) [91] Diễn tiến bệnh

lý gan là hậu quả của quá trình tác động lẫn nhau giữa siêu vi và đáp ứng miễn dịch của cơ thể chủ với các kháng nguyên của siêu vi B được mã hóa riêng biệt (encoded antigens) [103], giải thích cho mối liên quan rõ rệt với tổn thương gan và hoạt tính sao chép của siêu vi [71] Những yếu tố đã được biết như các đặc điểm siêu vi HBV như genotype, tải lượng siêu vi, đặc điểm bộ gen (hay đột biến của HBV) hay những yếu tố của cơ thể chủ như giới tính, việc uống rượu bia, đồng nhiễm siêu vi khác, mức độ suy giảm miễn dịch, đồng nhiễm siêu vi viêm gan C có liên quan chặt chẽ với tiến triển và dự hậu của bệnh gan [105] Tỷ lệ diễn tiến sang xơ gan hàng năm

khoảng 2-6% ở bệnh nhân HBeAg (+) và 8-10% ở bệnh nhân HBeAg âm Tỷ lệ xuất hiện mới HCC mỗi năm < 1% ở bệnh nhân không có xơ gan và 2-3% ở bệnh nhân xơ gan [44, 72]

Hình 1.3: Diễn tiến tự nhiên nhiễm HBV mạn

“Nguồn: Liaw Y.F., 2009” [92]

1.2.1 Giai đoạn dung nạp miễn dịch hay nhiễm HBV mạn HBeAg dương

Giai đoạn đầu tiên của nhiễm HBV ở người mắc phải từ mới sinh là giai đoạn dung nạp miễn dịch (DNMD) Trong huyết thanh có dấu ấn HBsAg, HBeAg và HBV DNA ở mức độ cao (> 2x106- 2x107 IU/ml), lượng kháng nguyên bề mặt HBsAg dao động từ 4,5-5 log IU/ml [74] Vì thế người nhiễm HBV ở giai đoạn này còn được phân loại là người lành mang HBV Giai đoạn này HBeAg dương và có mật độ cao trong máu gây dung nạp miễn dịch, chủng siêu vi hoang dại chiếm ưu thế tuyệt đối, các phản ứng miễn dịch chống HBV gần như rất ít hay bị ức chế, bệnh nhân không

có biểu hiện lâm sàng, men gan không tăng và mô học gan gần như không biểu hiện tổn thương Trong trường hợp lây nhiễm HBV từ chu sinh thì giai đoạn này có thể kéo dài nhiều thập kỷ 20-30 năm và tỷ lệ chuyển đổi huyết thanh tạo antiHBe trong giai đoạn này rất thấp Tỷ lệ thải trừ HBeAg tự nhiên được ước tính khoảng 2% trong

suốt 3 năm đầu tiên và khoảng 15% sau 20 năm ở người nhiễm HBV mạn tính lây qua đuờng chu sinh [23] Ngược lại ở người nhiễm HBV ở tuổi trưởng thành và có tình trạng miễn dịch bình thường thì giai đoạn này chỉ xảy ra rất ngắn trong giai đoạn

ủ bệnh của nhiễm HBV cấp, kéo dài 2-4 tuần và nhiều khi không nhận biết được [43]

1.2.2 Giai đoạn thải trừ miễn dịch hay viêm gan B mạn HBeAg dương

Trong giai đoạn thứ hai của nhiễm HBV mạn tính, giai đoạn viêm gan B mạn HBeAg dương (CHBe(+), Chronic Hepatitis B HBeAg positive) hay giai đoạn miễn dịch thải trừ siêu vi do gia tăng đáp ứng miễn dịch gây tổn thương gan, biểu hiện là men gan tăng và biến đổi mô học biểu hiện thành hình ảnh viêm ở nhu mô gan và giảm tải lượng HBV dần dưới áp lực miễn dịch, với HBV DNA > 2.000 IU/ml, lượng HBsAg thấp hơn giai đoạn DNMD (4,3 log IU/ml) [74] Dưới áp lực miễn dịch, chủng siêu vi đột biến sẽ được chọn lọc dần nhưng chủng hoang dại vẫn còn ưu thế hơn ở giai đoạn này

Ở người nhiễm HBV khi tuổi lớn thì giai đoạn này sẽ diễn biến bệnh cảnh viêm gan siêu vi B cấp có hay không có triệu chứng Ngược lại ở người nhiễm HBV lúc sơ sinh sau 2 thập kỷ yên lặng sẽ có biểu hiện thành từng đợt tăng men gan, có lúc > 5 ULN, có biến đổi mô học gan và giảm tải lượng HBV tương tự, nhưng đáp ứng miễn dịch không đủ mạnh để thải trừ được siêu vi, không gây chuyển đổi được HBeAg sau nhiều đợt viêm gan Có < 3% trường hợp có thể diễn biến bệnh cảnh viêm gan bùng phát đưa đến bệnh gan mất bù Giai đoạn viêm gan có hoạt tính này có thể kéo dài nhiều thập kỷ, khoảng 65% bệnh nhân thải trừ được HBeAg và ức chế kéo dài được HBV Số còn lại mang HBeAg kéo dài và có thể tiến triển đến xơ gan [45]

Trong trường hợp nhiễm HBV lúc sơ sinh qua lây truyền mẹ con, giai đoạn này thường xảy ra ở tuổi 20-30 hay có thể nhỏ hơn Ở trẻ nhỏ, khả năng chuyển đổi huyết thanh khoảng 2% trong 3 năm đầu Ở trẻ lớn hơn có thể tăng đến 4-5% trong 3 năm đầu [103] Ở người lớn có tăng men gan, chuyển đổi huyết thanh HBeAg tự nhiên có thể xảy ra nhiều hơn, tỷ lệ 10-15% mỗi năm [43]

1.2.3 Giai đoạn kiểm soát miễn dịch hay mang HBV không hoạt tính (hay nhiễm HBV mạn HBeAg âm)

Các chủng đột biến HBV được áp lực miễn dịch chọn lọc và thay thế dần chủng hoang dại, người nhiễm HBV mạn sẽ chuyển sang giai đoạn 3 là giai đoạn mang HBV không hoạt tính (IC- Inactive carrier) hay giai đoạn kiểm soát miễn dịch Giai đoạn này bắt đầu từ dấu hiệu có chuyển đổi huyết thanh gây mất HBeAg, tạo antiHBe đi kèm với men gan trở về bình thường, HBV DNA thấp (<2000 IU/ml) thể hiện siêu vi được miễn dịch kiểm soát, chủng đột biến ưu thế, tổn thương gan ổn định, đa số bệnh nhân tự duy trì trạng thái kiểm soát miễn dịch kéo dài, một số ít bệnh nhân mất kiểm soát miễn dịch Tuy nhiên sau nhiều thập kỷ, lượng HBsAg và HBV DNA vẫn còn tồn tại ở mức độ thấp

Thải trừ HBsAg xảy ra khoảng <1% mỗi năm ở bệnh nhân người lớn (khoảng 0,05%-0,8%/năm nếu nhiễm HBV xảy ra vào tuổi nhũ nhi hoặc trẻ nhỏ) Khi chưa có

xơ gan, tiên lượng của các bệnh nhân đến giai đoạn này thường tốt Tuy nhiên, bệnh nhân có thể có những đợt tái hoạt siêu vi khi miễn dịch bị suy yếu [103]

1.2.4 Giai đoạn trốn thoát miễn dịch hay viêm gan B mạn HBeAg âm (hay viêm gan B mạn tái hoạt):

Một số ít bệnh nhân nhiễm HBV mạn diễn tiến qua giai đoạn siêu vi tăng sinh trở lại thể hiện bằng HBV DNA tăng trở lại từ 2000 IU/ml đến 20 triệu IU/ml (104-

108 copies/ml), lượng HBsAg cũng tăng trở lại dù không cao như giai đoạn có hoạt tính mạnh trước đó (khoảng 3,5 log IU/ml) nhưng dấu ấn HBeAg âm Trên bộ gen của siêu vi trong giai đoạn này, đột biến ở vùng PC và/hoặc BCP đã được hình thành

và dần trở nên ưu thế hay chiếm dân số tuyệt đối, gây giảm hoặc ngưng hẳn tổng hợp HBeAg Tình trạng hiện diện chủng HBV đột biến gây nên phản ứng thải trừ miễn dịch nhắm vào chủng HBV mới hình thành là nguyên nhân hình những đợt viêm gan tái hoạt, dẫn đến biến chứng xơ gan hay HCC [103]

Giai đoạn này còn được gọi là giai đoạn viêm gan tái hoạt hay viêm gan B mạn

HBeAg âm (CHB(e-), chronic Hepatitis B HBeAg negative), bản chất là giai đoạn

miễn dịch mất kiểm soát hay giai đoạn trốn thoát miễn dịch Vì thế, bệnh nhân ở giai

đoạn này thường lớn tuổi hơn, đã có thể trải qua nhiều đợt bệnh gan tiến triển hay đã

có biến chứng do tổn thương gan trong giai đoạn thải trừ miễn dịch trước đó Bệnh nhân có thể biểu hiện xơ gan ngay lần đầu tiên biểu hiện triệu chứng bệnh gan với HBeAg âm Về mô học gan có thể có nhiều mức độ tổn thương khác nhau Những đợt viêm gan bùng phát nặng và thường xuyên ở giai đoạn tái hoạt sẽ dễ đưa bệnh nhân tới kết cục xơ gan và HCC hơn Tổn thương gan thường ít khả năng hồi phục hoàn toàn ở giai đoạn này mặc dù không có biểu hiện lâm sàng [44]

Nguy cơ tiến triển thành xơ gan, suy gan và HCC ở người mang HBV mạn từ 15% đến 40% [31] Người lớn tuổi, phái nam, nhiễm genotype C hay D của HBV, người có HBeAg dương kéo dài, người có nhiều đợt viêm gan tái hoạt cấp và nặng với hoại tử bắc cầu có nguy cơ tiến triển đến xơ gan cao hơn Khả năng tiến triển thành xơ gan mất bù ở bệnh nhân xơ gan sau 5 năm là 15-20% Ở bệnh nhân viêm gan có hoạt tính nguy cơ diễn biến thành xơ gan cao hơn gấp 4 lần so với bệnh nhân không có viêm gan hoạt tính Tỷ lệ diễn tiến sang xơ gan hàng năm khoảng 2-6% ở bệnh nhân HBeAg (+) và 8-10% ở bệnh nhân HBeAg âm Tỷ lệ sống còn của bệnh nhân xơ gan còn bù và mất bù sau 5 năm lần lượt là 30-50% và 80-85% Tỷ lệ chuyển sang HCC trên người nhiễm HBV trong suốt đời sống là 4% Tỷ lệ chuyển HCC trên người mang HBsAg là 0,1%/năm, trên người viêm gan mạn là 1%/năm, và trên bệnh nhân xơ gan là 3-10%/năm [31, 44] Tuy nhiên HCC có thể xảy ra ngay trên người nhiễm HBV chưa có xơ gan [54], [93]

1.3 CẤU TRÚC HÌNH THÁI VÀ BỘ GEN CỦA HBV

1.3.1 Đặc điểm hình thái

HBV là siêu vi hình cầu có đường kính 45nm, thuộc gia đình Hepadnaviridae

Dưới kính hiển vi điện tử, người ta tìm thấy ba loại phân tử cấu trúc của HBV trong mẫu huyết thanh người bệnh: hạt virion hoàn chỉnh (hạt tử Dane), phân tử HBsAg hình trụ và phân tử hình cầu

- Cấu trúc hình cầu có đường kính 20 nm và cấu trúc hình ống cũng có đường kính tương tự nhưng chiều dài thay đổi Cấu trúc hình ống có thể do các cấu trúc hình cầu chồng lên nhau mà tạo thành Hai cấu trúc này chính là phần kháng nguyên bề mặt của HBV được sản xuất dư thừa tại bào tương của tế bào gan Do hai cấu trúc này không chứa chất liệu di truyền của siêu vi nên không có tính lây nhiễm

1.3.2 Đặc điểm bộ gen của HBV

Bộ gen của HBV được cấu tạo từ một phân tử DNA chuỗi đôi dạng vòng, độ dài 3.200 đôi base

Trong nhân của tế bào gan, sợi DNA của HBV hiện diện ở dạng sợi DNA vòng tháo xoắn (rcDNA), gồm 2 sợi:

- Sợi DNA âm nằm bên ngoài, có chiều dài đầy đủ gồm 3.200 nucleotide, mang toàn bộ thông tin di truyền của HBV

- Sợi DNA dương hay sợi DNA chưa hoàn chỉnh nằm bên trong, có chiều dài xấp xỉ 2/3 chiều dài sợi DNA âm và có thể thay đổi do khi được tổng hợp tiếp phía đầu 3’

Hình 1.5: Cấu trúc bộ gen của HBV

“Nguồn: Hunt C.M., 2000” [58]

Thông tin di truyền trên sợi âm mã hóa cho 4 khung đọc mã mở (ORF-opening reading frame) S, C, P và X nằm gối chồng lên nhau, với 6 codon bắt đầu, 4 promoter (preS1, preS2, core và X) và 2 thành phần enhance (EN-I và EN-II) vị trí phía trên so với vùng core promoter Bộ gen của HBV có chứa tín hiệu được polyadenyl hóa trong gen core và một số tín hiệu đồng vận (cis-acting) cần cho sự sao chép của siêu vi

ORF-P: hay gen P là khung đọc mở lớn nhất của HBV, mã hóa cho DNA

polymerase Enzym vừa có hoạt tính DNA polymerase phụ thuộc DNA, vừa có hoạt tính của enzyme sao chép ngược phụ thuộc RNA DNA polymerase tham gia vào quá trình tổng hợp nên sợi DNA từ cấu trúc RNA tiền gen (pregenomic RNA hay pgRNA) Cấu trúc RNA tiền gen được tạo ra từ khuôn DNA của HBV dưới tác dụng của RNA polymerase của tế bào gan Ngoài ra, DNA polymerase còn tham gia tạo nên cấu trúc capsid bao bọc bên ngoài sợi RNA tiền gen Khởi đầu từ khuôn DNA của cấu trúc DNA vòng đóng liên kết đồng hoá trị (cccDNA) trong nhân, cấu trúc RNA tiền gen được tạo ra dưới tác dụng của RNA polymerase trong nhân của tế bào gan

ORF-C: hay gen Core, nằm gối chồng một phần lên ORF-P, mã hóa cho kháng

nguyên lõi HBcAg (Hepatitis B core antigen) và HBeAg (Hepatitis B e antigen) Đầu 5’ của gen Core có hai codon khởi đầu cho quá trình đọc mã tại vị trí nucleotide 1814

và 1901 Đoạn nucleotide nằm giữa 2 codon này còn được gọi là gen Precore (PC) Đoạn nucleotide từ sau vùng PC đến hết chiều dài của gen Core được gọi là gen Core Vùng Basal core promoter có trình tự nucleotide từ 1744 đến 1804, điều khiển sản

xuất core RNA và Precore RNA Vùng core RNA mã hóa tổng hợp các cấu trúc

protein core - protein capsid chính - và cấu trúc RNA tiền gen (pgRNA) Các cấu trúc này sẽ được bọc vỏ tạo thành lõi của siêu vi PgRNA cũng mã hóa cho DNA

polymerase trong phản ứng sao mã ngược tạo bộ DNA chuỗi đôi Precore RNA mã

hóa cho protein Precore là tiền chất của HBeAg Precore protein chứa toàn bộ trình

tự gồm mã hóa protein core và trình tự dẫn đầu chứa tín hiệu cần cho hoạt động tiết HBeAg vào lưới nội bào Nếu quá trình đọc mã bắt đầu từ codon thứ nhất ở vị trí

1814 và đọc suốt chiều dài của đoạn gen PC và Core sẽ tổng hợp nên HBeAg Sau khi được tổng hợp, HBeAg sẽ gắn với hệ thống lưới nội bào tương của tế bào gan thông qua một peptid tín hiệu gồm 19 acid amin được mã hóa bởi các nucleotide đầu tiên của vùng pre-C để được bài tiết vào hệ tuần hoàn Nếu quá trình đọc mã bắt đầu

từ codon thứ nhì ở vị trí 1901 và đi suốt đoạn gen C sẽ tổng hợp nên HBcAg HBcAg

là protein cấu trúc chính của nucleocapsid nhưng do không có đoạn peptid tín hiệu nên không được bài tiết ra khỏi tế bào gan như HBeAg mà chỉ hiện diện ở gan

ORF-S hay gen S: nằm gối chồng lên gen P và mã hóa cho kháng nguyên bề

mặt HBsAg (Hepatitis B surface antigen) Dựa vào cấu trúc và chức năng, đoạn gen

S này được chia thành 3 vùng: preS1, preS2 và preS Vùng S và các PreS là vị trí tương tác và liên kết chủ yếu giữa các thụ thể trên bề mặt tế bào gan trong quá trình xâm nhập của siêu vi vào tế bào gan

ORF-X: vị trí nằm gối lên ORF-P trên sợi DNA âm, mã hóa cho protein HBx

Chức năng của protein này vẫn chưa được biết chính xác, nhưng có lẽ giữ vai trò điều hòa sự tăng trưởng của HBV trong quá trình sao chép của siêu vi Vì vậy protein này được xem là có vai trò trong cơ chế sinh u của HBV

Các vùng khởi động (hay các promoter) và vùng tăng cường (enhancer):

ở mỗi đầu của các khung đọc mở Vùng khởi động là vị trí gắn của bộ gen của HBV với RNA polymerase của tế bào khi quá trình tổng hợp RNA từ khuôn mẫu DNA được khởi phát Nằm kế cận vùng khởi động là vùng tăng cường Chính tại vị trí gen kích hoạt này, các protein của siêu vi hoặc của tế bào gắn kết vào và kích hoạt gen khởi động để khởi động quá trình sao chép

1.4 CÁC KỸ THUẬT CHẨN ĐOÁN ĐỘT BIẾN VÙNG PRECORE, BASAL CORE PROMOTER

1.4.1 Kỹ thuật PCR đa hình chiều dài đoạn cắt giới hạn (PCR-RFLP, Polymerase Chain Reaction - Restriction Fragment Length Polymorphism)

Đây là kỹ thuật nghiên cứu tính đa hình của các đoạn DNA dựa trên nguyên lý

sử dụng các enzyme cắt giới hạn (Restriction Enzyme - RE) Phương pháp này xác định sự biến đổi của gen thông qua sự vắng mặt của các vị trí cắt giới hạn

Nguyên tắc của kỹ thuật này dựa trên tính đặc hiệu của các enzyme cắt giới hạn tại

vị trí nhận biết của chúng trên DNA Khởi đầu, bộ gen DNA sẽ được cắt bằng các

RE, kế đến sản phẩm cắt được chạy điện di qua gel agarose, được thấm qua màng lai

và lai với một mẫu dò DNA (được đánh dấu phóng xạ) liên kết với một trình tự đặc biệt Sự khác biệt vị trí cắt giữa hai cá thể sẽ tạo ra những đoạn cắt khác nhau để cho

ra các sản phẩm lai riêng biệt và được nhận diện bằng cách so với sản phẩm chuẩn

Kỹ thuật RFLP có ưu điểm vì là chỉ thị sinh học đồng trội cho phép phân biệt được

cá thể đồng hợp và dị hợp Do kích thước DNA khảo sát trong RFLP lớn vì vậy cần

số lượng marker nhiều đủ đáp ứng nhu cầu nghiên cứu Ngoài ra, do các hạn chế như quy trình thực hiện phức tạp; ảnh hưởng của đánh dấu phóng xạ có thể gây nhiễm xạ cho người nghiên cứu và yêu cầu DNA có chất lượng cao nên kỹ thuật này được sử dụng rất hạn chế Sau khi có kỹ thuật PCR, Kỹ thuật RFLP trở nên đơn giản hơn với ứng dụng PCR Người ta dùng phản ứng PCR để khuếch đại vùng gen cần khảo sát, sau đó sản phẩm khuếch đại được cắt bằng các enzyme cắt giới hạn, sản phẩm cuối cùng được qua phản ứng điện di để đọc kết quả PCR-RFLP bỏ qua bước lai phóng

xạ nên giá thành rẻ hơn, ít nguy hiểm hơn và thường được sử dụng để tạo dòng, xác định tình trạng dị hợp tử hay sự methyl hóa các gen [101]

Hình 1.6: Kỹ thuật RFLP “Nguồn: Mahdieh N., 2013” [101]

1.4.2 Kỹ thuật ARMS-PCR, Amplifications refractory mutation system-PCR):

Trong một dạng khác của kỹ thuật allele - specific PCR, cặp mồi được thiết kế sao cho tồn tại một vị trí nucleotide sai khác tại phần mở rộng của đầu 3’, khi thực hiện phản ứng PCR, cặp mồi này chỉ bắt cặp với trình tự DNA có đột biến và khuếch đại tạo thành sản phẩm, sau đó điện di sản phẩm PCR để so kết quả với trình tự chuẩn

1.4.3 Kỹ thuật giải trình tự gen:

Phương pháp giải trình tự cổ điển hay giải trình tự Sanger, phương pháp này dùng các đoạn mồi bổ sung đặc hiệu với trình tự mục tiêu, thêm vào ống phản ứng DNA polymerase, deoxynucleotide-dNTPs và một lượng giới hạn các nucleotide tận cùng (terminator, là dideoxynucleotide - ddNTP) Phản ứng được thực hiện trong bốn ống, mỗi ống cho một loại ddNTP khác nhau Bắt đầu từ đoạn mồi, DNA polymerase kéo các dNTP để tổng hợp mạch đơn bổ sung với mạch DNA gốc Sự tổng hợp mạch đơn sẽ bị dừng tại vị trí ddNTP (thay vì sẽ tiếp tục kéo dài với dNTP) do ddNTP bị mất gốc OH tại carbon thứ 3 nên không thể gắn dNTP tiếp theo Vì vậy trong ống phản ứng sẽ hình thành các mạch đơn DNA có chiều dài khác nhau tương ứng vị trí

trình tự các nucleotide trên đoạn DNA gốc Kết quả được ghi nhận bằng điện di trên gel polyacrylamide biến tính [6]

Ngày nay, phản ứng giải trình tự được thực hiện trên máy tự động có bước đánh dấu huỳnh quang các mạch DNA đơn Trong quá trình điện di, mỗi khi có một vạch điện di đi qua chùm tia laser thì vạch điện di sẽ phát sáng Sự phát sáng này được bộ phận mắt cảm quang ghi nhận và lưu lại thành một đỉnh cường độ sáng trong biểu đồ Máy sẽ so dòng tự động các đỉnh sáng tương ứng với các màu để phân tích thành trình tự của đoạn DNA Hiện nay, 4 màu huỳnh quang khác nhau được dùng

để đánh dấu 4 loại ddNTP, nhờ vậy phản ứng giải trình tự có thể được thực hiện chỉ trong một ống nghiệm và khi giải trình tự chỉ cần điện di trên một hàng mà không phải thực hiện điện di trên 4 hàng khác nhau như trước đây Nếu sử dụng điện di mao quản thì tùy thuộc vào số mao quản mà người làm thí nghiệm có thể chạy số mẫu nhiều hay ít cùng một lúc Phương pháp giải trình tự phát hiện các thay đổi trình tự nucleotide của một đoạn DNA và đây là cơ sở để phát hiện các đột biến gen, đa hình nucleotide đơn (Single nucleotide polymorphism-SNP) trong cá nhân hoá các liệu pháp điều trị, định danh các vi khuẩn, vi nấm dựa trên giải trình tự DNA của gen qui định RNA của ribosome [6]

Một bước tiến mới của giải trình tự gen thế hệ mới là giải trình tự nguyên bộ gen, bao gồm 3 giai đoạn chính: tách rời và tóm bắt các mảnh DNA được giải trình

tự lên các giá bám, dùng PCR với mồi đặc hiệu adapter để khuếch đại các mảnh DNA trên giá bám thành từng clone, thực hiện giải trình tự tổng hợp Các trình tự của các mảnh DNA từ hàng trăm ngàn clone sẽ được phần mềm của các thiết bị nối lại với nhau bằng cách so chuỗi tìm các trình tự trùng lặp nhau ở hai đầu và như vậy sẽ có kết quả giải trình tự nguyên bộ gen [6] Với các tiến bộ về thiết bị và thuốc thử, giải trình tự bộ gen có thể thực hiện tại phòng thí nghiệm trung bình có thiết bị giải trình

tự thế hệ mới và có kết quả trong vài ngày với chi phí thấp hơn, có thể phát hiện được các tác nhân nhiễm trùng bí mật, có thể phát hiện được các đột biến với tỷ lệ rất thấp Giải trình tự thế hệ mới là công cụ không thể thiếu được để phát hiện và định lượng các đột biến trong ung thư, bệnh di truyền [6]

Hình 1.7: Kỹ thuật giải trình tự DNA

Hình 7A: Polymerase chain reaction Hình 7B: Kỹ thuật giải trình tự chuỗi gen

“Nguồn: Mahdieh N., 2013” [101]

Hình1.8: Kết quả giải trình tự gen tìm đột biến G1896A

Hình1.9: Kết quả giải trình tự gen tìm A1762T/G1764A “Nguồn: Qin, 2009” [123]

G1896A thể hoang dại (TGG)

G1896A hỗn hợp/chưa hoàn toàn (TGG+TAG) hoàn toàn G1896A

(TAG)

A1762T/G1764A thể hoang dại

A1762T/G1764A hỗn hợp

A1762T/G1764

A hoàn toàn

1.4.4 Kỹ thuật Real-time PCR sử dụng mẫu dò DNA:

Nhằm phát hiện các đột biến đã biết trên các mẫu bệnh phẩm Các đột biến được phát hiện bằng cách sử dụng các đoạn dò đặc hiệu có đánh dấu huỳnh quang Đoạn dò là những đoạn oligonucleotides sợi đơn có trình tự có thể bắt cặp bổ sung với một trình tự đặc hiệu trên DNA đích Khi có mặt sản phẩm khuếch đại đặc hiệu trong ống phản ứng thì sẽ có sự bắt cặp của probe lên trình tự đặc hiệu của sản phẩm khuếch đại và khi có sự khuếch đại này thì sẽ có sự phát huỳnh quang từ ống phản ứng khi nhận được nguồn sáng kích thích

1.5 ĐỘT BIẾN PRECORE VÀ ĐỘT BIẾN BASAL CORE PROMOTER 1.5.1 Đặc điểm đột biến Precore:

1.5.1.1 Sơ lược quá trình nhận biết đột biến Precore:

Tình trạng bệnh gan do HBV nặng với tải lượng HBV hiện diện với mật độ cao nhưng không mang dấu ấn HBeAg đã được chú ý từ lâu và được chẩn đoán là “viêm gan B mạn do chủng HBeAg âm” Trạng thái bệnh lý này được tác giả Carman và cộng sự mô tả đầu tiên vào cuối thập niên 1980 với tên gọi “viêm gan B mạn HBeAg âm” do chủng HBV có đột biến ở vùng Precore không hoặc giảm sản xuất HBeAg, chiếm tỷ lệ 7-30% trong số những người nhiễm HBV [19]

Bộ gen của HBV thay đổi dần trong suốt quá trình nhiễm trùng dưới áp lực của miễn dịch của cơ thể chủ chống lại siêu vi và các điều trị kháng siêu vi đặc hiệu Các đột biến trên bộ gen của siêu vi có thể gây thay đổi các biểu lộ kháng nguyên quan trọng, ảnh hưởng trên hoạt động nhận biết của hệ miễn dịch [58] Những báo cáo về các trường hợp đột biến được cho là có liên quan đến viêm gan bùng phát và tăng sao chép siêu vi đã được ghi nhận tiếp sau đó trong thập niên 1990, đột biến Precore ở các giai đoạn của viêm gan B mạn cũng được mô tả từ 1995 [89], [53] Đột biến Precore được xác định tỷ lệ cao hơn ở giai đoạn HCC và liên quan HCC từ năm

2004 qua những nghiên cứu mô tả hàng loạt bệnh nhân [60], [145], [146] và được khẳng định qua nghiên cứu phân tích gộp [90]

1.5.1.2 Phân bố đột biến vùng Precore:

Tần suất đột biến Precore (G1896A) thay đổi tùy theo khu vực trên thế giới, liên quan đến phân bố genotype của HBV Tỷ lệ đột biến G1896A ưu thế ở bệnh nhân

viêm gan HBeAg âm, cao nhất ở Trung Đông (93%) - vùng lưu hành của genotype

D, kế đến là ở Châu Á Thái Bình Dương (52%) và thấp nhất ở Mỹ và các nước Bắc

Âu (24%) [166] Vùng Precore đóng vai trò quan trọng trong sao chép của siêu vi vì hoạt động gắn cấu trúc thân vòng (chứa tín hiệu encapsidation e) với polymerase là bước đầu của quá trình bọc vỏ pgRNA vào phần lõi [9] Hơn nữa hoạt động sao mã ngược thành chuỗi âm DNA cũng xuất phát từ cấu trúc thân vòng này Vì vậy cấu trúc thân vòng này cần được giữ ổn định để bảo đảm quá trình sao chép

Về mặt cấu tạo, cấu trúc thân vòng của HBV - gồm đoạn gen các nucleotide từ

1855 đến 1858 bắt cặp với các nucleotide từ 1896 đến 1899 - các mối bắt cặp là liên kết chặt ở các genotype có nucleotide C ở vị trí 1858 và G ở vị trí 1896 Genotype A

có liên kết chặt C1858 và G1896 giúp cấu trúc tín hiệu e ổn định và khó xuất hiện đột biến Ngược lại, tín hiệu này kém ổn định ở genotype D hay các genotype khác genotype A với liên kết không bền T1858 và G1896 Vì thế genotype D có khuynh hướng có tỷ lệ G1896A cao hơn, chuyển G1896 thành A1896, tạo liên kết bền vững T-A, làm cho tính ổn định của cấu trúc e ở genotype D được tăng cường [106], [108], [135], [11], [10], [7], [15], [132] Đột biến G1896A vì vậy phân bố thay đổi tùy theo

sự phân bố địa lý của genotype 60-80% người nhiễm HBV mạn ở châu Á, châu Phi

và vùng trung đông (genotype B, C, D, E) có nucleotide T ở vị trí 1858 [58] Genotype

B, D, E và genotype F ở Trung Mỹ, genotype C ở Nhật có T ở vị trí 1858 Genotype

C và F có thể có C hoặc T ở vị trí 1858 Genotype A, H và genotype C ở Đông Nam

Á có C ở vị trí 1858 [78]

Đột biến thường gặp ở vùng Precore với sự thay đổi base Guanosine thành Adenine ở vị trí 1896 của gen Precore (được định danh là G1896A hay A1896) gây chuyển đổi codon 28 (TGG) mã hóa cho tryptophan thành bộ mã dừng sớm (translation stop codon) TAG dẫn đến ngưng tổng hợp HBeAg, trong khi quá trình tổng hợp HBcAg vẫn diễn ra và siêu vi vẫn tiếp tục sao chép Ngoài ra còn các đột biến khác có tác dụng kiểu hình tương tự (ngưng tổng hợp HBeAg) gồm: đột biến mất ba nucleotides sao mã khởi đầu tổng hợp protein core/precore (ATG thành ACG

hay CUG), đột biến ở bộ mã thứ hai thành bộ mã dừng, đột biến lệch khung và đột biến mất đoạn dẫn đến tổng hợp protein không có chức năng [9]

Hình 1.10: Liên quan giữa đột biến Precore và genotype của HBV

HBV genotype A có Cytosine ở vị trí 1858 ngăn xuất hiện G1896A Genotype B, C,

D và E có Thymine ở vị trí 1858 sẽ dễ bắt cặp với Adenine ở vị trí 1896

ưu thế dần (khoảng 60% trong quần thể giai đoạn HBeAg (-)) [48], [75], [68], [113]

1.5.2 Đặc điểm đột biến Basal core promoter:

1.5.2.1 Sơ lược quá trình nhận biết đột biến Basal core promoter:

Vùng Basal core promoter có trình tự nucleotide từ 1744 đến 1804, đột biến Basal core promoter phổ biến nhất là đột biến kép đồng thời ở hai vị trí 1762 và 1764 với thay đổi cùng lúc, đồng thời base A thành T ở vị trí 1762 cùng với G thành A ở

vị trí 1764, ký hiệu là A1762T/G1764A Hai tác giả Okamoto (1994) [114] và Sato (1995) mô tả đột biến kép ở bệnh nhân Nhật Bản viêm gan B mạn thể tối cấp có liên

quan với thể bệnh HBeAg âm Đột biến kép có thể ngăn biểu hiện HBeAg [129] Cũng trong cùng thời gian này, tác giả Lakus (1995) ghi nhận 2 đột biến kép này khá thường gặp nhưng không liên quan với tình trạng HBeAg [81] Nhóm nghiên cứu Takahashi (1995) cho rằng chủng đột biến này gây giảm tổng hợp HBeAg chứ không ngừng hẳn tổng hợp HBeAg và gọi tên đột biến kép A1762T/G1764A này là đột biến giảm tổng hợp HBeAg [138]

Chủng HBV đột biến kép A1762T và G1764A được cho là tăng khả năng thích nghi và tăng cường khả năng sao chép HBV DNA Tác giả Buckwold và cộng sự (1996) chứng minh kết hợp đột biến kép A1762T và G1764A làm siêu vi không có khả năng kết nối với yếu tố phiên mã, gây giảm Precore RNA và làm giảm 70% hoạt động tổng hợp kháng nguyên HBeAg so với chủng hoang dại Đột biến kép không ảnh hưởng đến core RNA và RNA bề mặt Đột biến kép A1762T/G1764A cũng không ảnh hưởng đến mức độ tạo nên cấu trúc pgRNA nhưng làm gia tăng phản ứng đóng gói của pgRNA thành cấu trúc lõi và gia tăng sao chép các thế hệ siêu vi con cháu [8, 18]

1.5.2.2 Phân bố đột biến Basal core promoter:

Theo các dữ liệu đã công bố, đột biến A1762T/G1764A hiện diện khá phổ biến ở Châu Á - Thái Bình Dương nhưng còn ít dữ liệu ở các vùng khác [49] Đột biến A1762T/G1764A thường gặp ở bệnh nhân nhiễm genotype C có nucleotide C tại vị trí 1858 [22], [40], [57] Đột biến kép A1762T/G1764A gặp cả ở bệnh nhân HBeAg dương và âm Theo Karayiannis (2012), trong quá trình diễn tiến tự nhiên của nhiễm HBV mạn, đột biến A1762T/G1764A có xu hướng xuất hiện sớm hơn đột biến G1896A và A1762T/G1764A thường xuất hiện dần từ giai đoạn DNMD, nhiều năm trước khi chuyển sang giai đoạn thải trừ miễn dịch - CHBe(+) Vì vậy, tỷ lệ có hiện diện A1762T/G1764A có thể đến khoảng 30% bệnh nhân HBeAg (+), tiếp tục tích lũy thêm sau khi mất HBeAg làm tỷ lệ này tiếp tục gia tăng nhiều năm sau khi HBeAg chuyển âm, có thể tăng đến 77% trong dân số viêm gan B mạn HBeAg âm [75]

Các đột biến khác ở vùng Basal core promoter:

Ở bệnh nhân HBeAg âm, đột biến kép thường đi kèm với thay đổi nucleotide

ở vị trí 1753, từ T thành A hay C hay G (gọi chung là T1753V) Đột biến đơn lẻ T1753V, A1762T/G1764A, A1846T, G1896A, G1899A và G1913A cũng như bộ ba đột biến T1753C/A1762T/G1764A và A1762T/G1764A/C1766T hay T1768A thường gặp ở bệnh nhân suy gan cấp trên nền viêm gan mạn và liên quan nhiều hơn

ở genotype B so với genotype C [77] Những kết hợp đột biến như C1766T/T1768A, A1762T/G1764A/C1766T và T1753C/A1762T/G1764A đã được ghi nhận liên quan với tình trạng giảm biểu hiện HBeAg, tăng khả năng sao chép của siêu vi, và đi kèm với bệnh gan hoạt tính nặng nhiều hơn so với chỉ có A1762T/G1764A, trong khi đó chủng đột biến T1753C/A1762T/G1764A không khác so với A1762T/G1764A [64]

Đột biến mất đoạn (thường từ 1 đến 21 bp) ở vùng BCP được mô tả ở bệnh

nhân viêm gan tối cấp, HCC, suy thận, đồng nhiễm HIV, bệnh máu ác tính Các chủng siêu vi có đột biến mất đoạn thường có tải lượng siêu vi thấp, vì vậy để tồn tại chúng vẫn cần sự hỗ trợ của chủng siêu vi hoang dại Đột biến mất đoạn thường hiện diện kết hợp với đột biến G1896A gây ảnh hưởng đến hoạt tính sao chép, biểu hiện HBeAg và tính sinh bệnh [79, 82, 108]

Đột biến chèn đoạn vùng BCP được mô tả ở bệnh nhân xơ gan, bệnh nhân

ghép gan và bệnh nhân viêm gan bùng phát sau ghép tim Đột biến chèn đoạn tạo ra vùng kết nối với yếu tố HNF1, HFN3 gây viêm gan bùng phát hay tối cấp ở bệnh nhân suy giảm miễn dịch [50] Đột biến mất đoạn và đột biến chèn đoạn vào vùng BCP cùng đột biến xảy ra tự nhiên ở gen X cũng được mô tả ở bệnh nhân Hàn Quốc

có biến chứng xơ gan hay HCC [85]

1.5.3 Ảnh hưởng của đột biến G1896A và A1762T/G1764A qua những nghiên cứu đã công bố:

1.5.3.1 Ảnh hưởng trên biểu hiện HBeAg và lượng HBsAg:

Đột biến Precore G1896A tạo ra bộ mã dừng gây chấm dứt sao mã đoạn gen mã hóa cho protein Precore làm ngừng sản xuất HBeAg [19] Đột biến vùng BCP A1762T/G1764A ở đoạn trước và kế cận vùng Precore có vai trò trong khởi phát hoạt

động sao chép của siêu vi Các nghiên cứu trong phòng thí nghiệm và thực nghiệm cho thấy A1762T/G1764A ức chế tổng hợp preC-mRNA 50-70%, gây điều hòa ngược quá trình sản xuất HBeAg gây giảm sản xuất HBeAg, nhưng lại tăng cường hoạt tính sao chép và tăng sản xuất protein core [18] Giảm biểu lộ HBeAg còn phụ thuộc vào điều hòa mức độ sao mã dựa trên tỷ lệ của chủng đột biến với chủng hoang dại của cả 2 loại đột biến G1896A và A1762T/G1764A [165]

Hai đột biến này bắt đầu xuất hiện ở bệnh nhân viêm gan B mạn từ khi HBeAg còn dương, giảm dần biểu lộ HBeAg trong thời gian trước khi xảy ra chuyển đổi huyết thanh HBeAg Tác giả Fukuda (2001) [49], và tác giả Tabernero (2010) [138] cùng ghi nhận 2 đột biến G1896A, A1762T/G1764A xảy ra trước khi chuyển đổi huyết thanh và tỷ lệ đột biến tăng dần sau khi chuyển huyết thanh HBeAg Tác giả Yan ghi nhận ở bệnh nhân HBeAg dương tỷ lệ đột biến A1762T/G1764A và G1896A lần lượt là 42,7% và 32,39%, 61,6%, bệnh nhân có A1762T/G1764A có trạng thái đột biến hỗn hợp hay chưa hoàn toàn tức là có hiện diện đồng thời chủng hoang dại

và chủng đột biến [157] Tỷ lệ hai chủng đột biến so với chủng hoang dại trong quần thể siêu vi thay đổi theo thời gian theo chiều hướng chủng đột biến ưu thế dần Theo Yan tình trạng hiện diện đồng thời và thay đổi tỷ lệ giữa chủng đột biến và chủng hoang dại giúp cho HBV uyển chuyển hơn trong việc đối phó với sự thay đổi áp lực của miễn dịch nhằm vào HBV

Các nghiên cứu quan sát về tỷ lệ của chủng đột biến G1896A và A1762T/G1764A trong quần thể HBV trước và sau chuyển đổi huyết thanh HBeAg chứng minh tỷ lệ chủng đột biến thay đổi khác nhau Cũng theo Yan, sự điều hòa biểu hiện HBeAg liên quan với 3 cơ chế: (i) Hoạt động điều hòa sao mã thuận chiều của A1762T/G1764A; Tác động ngưng sao mã do G1896A; (iii) Điều hòa mức độ sao

mã dựa trên tỷ lệ của chủng đột biến với chủng hoang dại của cả 2 loại đột biến G1896A và A1762T/G1764A [157]

Điều này cho thấy sự xuất hiện đột biến xảy ra trước, tình trạng không biểu lộ HBeAg hay chuyển đổi huyết thanh HBeAg xảy ra muộn hơn nhiều Nói cách khác, đột biến báo hiệu cho tình trạng chuyển đổi huyết thanh HBeAg Dưới áp lực của

miễn dịch và theo thời gian, chủng siêu vi có đột biến G1896A và A1762T/G1764A dần dần thay thế chủng siêu vi hoang dại làm dẫn đến mất HBeAg [163]

Hai đột biến G1896A, A1762T/G1764A còn có tác dụng cộng hưởng đến biểu hiện HBeAg Khi đã xảy ra cả hai đột biến, khả năng mất HBeAg cao hơn rất nhiều

so với nhóm chỉ mới có một đột biến G1896A hoặc A1762T/G1764A Giải thích cho việc biểu lộ HBeAg giảm nhiều hơn khi có hiện diện đồng thời 2 loại đột biến G1896A và A1762T/G1764A, Qin (2009) cho rằng có 2 cơ chế gây giảm HBeAg: hoặc do 2 đột biến hiện diện đồng thời ở 2 tế bào gan khác nhau hay đồng hiện diện

ở 2 dòng siêu vi khác nhau trong quần thể siêu vi (quasispecies) Vì vậy hai đột biến cùng hiện diện có tác dụng cộng hưởng trên kết cục giảm biểu lộ HBeAg [123]

Về lượng HBsAg, theo Moucari và Marcellin lượng HBsAg trong huyết thanh

là kết quả của cân bằng phức tạp giữa siêu vi và hệ thống miễn dịch của cơ thể chủ,

là sản phẩm của hoạt động sao mã mRNA của protein bề mặt và độc lập với hoạt động của pgRNA, với hoạt động sao chép nên sợi DNA [109].Nhóm nghiên cứu của tác giả Pivert (năm 2014) nhận xét: nhóm có đột biến G1896A có HBV DNA và HBsAg thấp hơn, nhóm tuổi tăng dần thì HBsAg giảm dần Ngược lại Pivert cho rằng không có khác biệt có ý nghĩa lượng HBsAg ở nhóm có và không có đột biến A1762T/G1764A [121] Tuy vậy, theo Yan và cộng sự (năm 2012), bệnh nhân HBeAg dương, nhóm đột biến A1762T/G1764A thường lớn tuổi, có ALT cao hơn, lượng HBsAg và HBeAg thấp hơn [157] Kamijo và cộng sự (2015) ghi nhận ở nhóm bệnh nhân HBeAg dương, lượng HBsAg thấp hơn ở nhóm có ít nhất 1 đột biến G1896A hoặc A1762T/G1764A so với nhóm không có đột biến Kamijo cũng ghi nhận rằng lượng HBsAg cao hơn ở bệnh nhân có đột biến G1896A nhưng không có đột biến A1762T/G1764A [68]

1.5.3.2 Đột biến G1896A và A1762T/G1764A gây giảm sao chép HBV:

Theo Buckwold và cộng sự, đột biến kép A1762T/G1764A ức chế sao mã PC mRNA và biểu hiện HBeAg nhưng tăng tổng hợp pgRNA và làm siêu vi tăng sao chép [17] Theo Chun, tải lượng HBV được xác định bằng kết quả tương tác giữa hai quá trình thải trừ siêu vi của hệ miễn dịch và hiệu quả của quá trình sao chép của siêu