Chúng tôi đã tiến hành khảo sát các điều kiện tối ưu để sinh tổng hợp enzyme cellulase từ vi khuẩn Bacillus pumilus và dùng enzyme đó xử lý trên cà phê nhân để tăng khả năng trích ly ch
TỔNG QUAN
Giới thiệu chung về cà phê
2.1.1 Lịch sử phát triển cà phê
Cà phê, một loài thực vật bản địa của Ethiopia (Coffea arabica), được phát hiện vào khoảng năm 850 sau Công nguyên Việc trồng cà phê bắt đầu vào khoảng năm 1870 ở lưu vực Congo Từ thế kỷ thứ 8, hạt cà phê đã được vận chuyển từ Ethiopia đến Yemen và được gieo trồng cho đến cuối thế kỷ 14 Đến đầu thế kỷ 17, cà phê đã được đưa đến châu Âu nhờ một thương nhân Hà Lan.
Cà phê vối (Coffea canephora) có nguồn gốc từ Trung Phi và được trồng ở Tây Phi vào thế kỷ 20 Đầu những năm 1900, giống cà phê này đã được đưa đến đảo Java - Indonesia, nơi trở thành trung tâm chọn lọc và nhân giống, cung cấp giống Robusta cho Uganda, Congo và Brazil Hầu hết giống Robusta hiện nay ở Việt Nam đều có nguồn gốc từ Java Cà phê chè (Arabica) được ghi nhận lần đầu ở Việt Nam vào năm 1857 tại Quảng Trị và Bố Trạch Sau khi Pháp chiếm Việt Nam vào năm 1888, họ đã thành lập các đồn điền cà phê ở Xuân Mai, Sơn Tây với năng suất cao nhất đạt 400–500 kg/ha, nhưng sau đó giảm xuống còn 100–150 kg cà phê nhân/ha Để cải thiện tình hình, năm 1905, Pháp đã đưa cà phê vối (C Robusta) và cà phê mít (C excelsa Chari) vào Việt Nam, thay thế cho cà phê chè ở vùng thấp, và đến năm 1910, các đồn điền cà phê mới lại tiếp tục được thành lập ở Hà Tĩnh.
1911 ở Thanh Hóa, năm 1915 ở Nghệ An Đồng thời cũng thăm dò khả năng thích nghi của cà phê ở Tây Bắc Năm 1925 cà phê được phát triển ở Tây Nguyên (Hoàng, 1983)
2.1.2 Tình hình sản xuất, tiêu thụ cà phê tại Việt Nam
Việt Nam sản xuất chủ yếu tập trung vào hạt Robusta chiếm 92,9% tổng diện tích trồng cà phê, còn Arabica chỉ chiếm không quá 5% tổng sản lượng
Diện tích trồng cà phê đã giảm 2% vào năm 2020 so với năm 2019, đạt 680.000 ha, và tiếp tục giảm xuống còn 675.000 ha vào năm 2021 Nguyên nhân chủ yếu là do giá cà phê thấp trong những năm qua, khiến người dân chuyển sang trồng xen canh với các loại cây khác (ICO, 2020).
Niên vụ 2020 - 2021 thành công với sản lượng cà phê duy trì ở mức 26 - 27 triệu bao nhờ thời tiết thuận lợi Theo Tổng Cục Hải quan, xuất khẩu cà phê trong tháng 10/2021 đạt hơn 99 nghìn tấn, tương đương 217 triệu USD, giảm 1,1% về lượng nhưng tăng 3,5% về giá trị Trong 10 tháng đầu năm, xuất khẩu cà phê ướt đạt 1,3 triệu tấn, trị giá 2,4 tỷ USD, giảm 4,2% về khối lượng nhưng giá trị tăng 5,4% so với cùng kỳ năm trước (ICO, 2021).
Trong tháng 12/2021, sản lượng đạt 169,3 nghìn tấn với giá trị 378,86 triệu USD, tăng 57,6% về lượng và 56,9% về trị giá so với tháng 11/2021 So với tháng 12/2020, sản lượng tăng 21,8% và giá trị tăng 49,6%.
Trong năm 2021, xuất khẩu cà phê của Việt Nam đạt 1,56 triệu tấn, với giá trị 3,07 tỷ USD Mặc dù lượng xuất khẩu giảm 0,2% so với năm 2020, nhưng giá trị xuất khẩu lại tăng 12,1%.
2.1.3 Tầm quan trọng của ngành chế biến cà phê
Trong nhiều thập kỷ qua, sản xuất cà phê Việt Nam đã trở thành một ngành công nghiệp xuất khẩu quan trọng, với vị thế là nhà sản xuất và xuất khẩu cà phê lớn thứ hai thế giới Nhiều công ty hiện đang áp dụng công nghệ lên men ướt để tách vỏ và lớp nhớt cà phê, nhằm đạt tiêu chuẩn xuất khẩu Tuy nhiên, thành phần pectin và cellulose cao trong hạt chưa được tách triệt để gây khó khăn trong quá trình sấy khô và làm giảm chất lượng cà phê Để xử lý lớp nhớt này, có nhiều phương pháp khác nhau, trong đó phương pháp sinh học sử dụng enzyme như pectinase và cellulase đang được chú trọng Phương pháp lên men với vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp enzyme được xem là giải pháp tiềm năng, mang lại hiệu quả kinh tế cao và tính chủ động trong sản xuất.
Trái cà phê
2.2.1 Cấu tạo trái cà phê
Quả cà phê gồm có những phần sau:
Cấu trúc chính của quả cà phê được thể hiện trong Hình 2.1
Hình 2.1 Quả cà phê và cấu trúc của nó
Vỏ cà phê chè là lớp vỏ bên ngoài mềm, có màu vàng hoặc đỏ, và mềm hơn so với cà phê vối và cà phê mít Theo nghiên cứu của Trịnh (2009), vỏ quả này chứa khoảng 31,5 – 30% chất khô.
Vỏ thịt cà phê chè mềm nằm dưới lớp vỏ mỏng, chứa nhiều chất ngọt và dễ xay xát Trong khi đó, vỏ thịt cà phê mít cứng và dày hơn, cũng chứa nhiều đường và pectin.
Lớp nhớt này không tan trong nước, thành phần chủ yếu của lớp nhớt là pectin, chiếm
Cà phê chứa 5 – 6% trọng lượng nguyên liệu tươi, bao gồm protein, chất béo, khoáng chất lipid, tannin, polyphenol và caffeine (Janissen & Huynh, 2018) Lớp nhớt dính chặt vào vỏ trấu gây khó khăn cho việc phơi sấy khô và bảo quản cà phê Ngoài ra, lớp nhớt này còn chứa một lượng đường lớn, tạo điều kiện thuận lợi cho sự phát triển của nấm, vi khuẩn, đặc biệt là nấm mốc và vi sinh vật có hại, dẫn đến tình trạng lên men (Trịnh, 2009).
Bao bọc bên ngoài nhân là lớp vỏ cứng, nhiều chất sơ gọi là lớp vỏ trấu tức là nội bì
Vỏ trấu của cà phê chè mỏng và dễ vỡ hơn so với cà phê vối và cà phê mít Sau khi loại bỏ các chất nhờn và phơi khô, hạt cà phê được gọi là cà phê thóc.
Thành phần chính của vỏ trấu là cellulose, ngoài ra còn có hemicellulose và đường,…
Lớp vỏ lụa (Silver Skin) là một lớp vỏ mỏng và mềm nằm sát nhân cà phê, có màu sắc và đặc tính khác nhau tùy thuộc vào loại cà phê Vỏ lụa của cà phê chè có màu trắng bạc, rất mỏng và dễ bong ra khỏi hạt trong quá trình chế biến Trong khi đó, vỏ lụa của cà phê vối có màu nâu nhạt, còn vỏ lụa của cà phê mít lại có màu vàng nhạt và bám sát vào nhân cà phê.
Nhân cà phê là lớp trong cùng của quả cà phê, được bao bọc bởi một lớp tế bào cứng chứa các tế bào nhỏ chứa dầu Bên trong, nhân cà phê có các tế bào lớn và mềm hơn Mỗi quả cà phê thường chứa 1, 2 hoặc 3 nhân, nhưng phổ biến nhất là 2 nhân.
Bảng 2.1 Thành phần khối lượng của quả cà phê (Nguyễn và cộng sự, 2010)
Thành phần Cà phê chè (%) Cà phê vối (%)
2.2.2.1 Thành phần hóa học của vỏ quả
Là chất altoxian trong đó có các vết của alkaloid, tannin, caffeine và các loại men, vỏ quả có từ 21,5 – 30% chất khô
Bảng 2.2 Thành phần hóa học của vỏ quả (Nguyễn và cộng sự, 2010)
2.2.2.2 Thành phần hóa học của lớp nhớt
Lớp nhớt là những tế bào mềm không có caffeine, tannin, có nhiều đường và pectin
Bảng 2.3 Thành phần hóa học của lớp nhớt (% chất khô) (Nguyễn và cộng sự, 2010)
Thành phần Cà phê chè (%) Cà phê vối (%)
Pectin 33 38,7 Đường khử 30 45,8 Đường không khử 20 -
2.2.2.3 Thành phần hóa học của vỏ trấu
Bảng 2.4 Thành phần hóa học của vỏ trấu (Nguyễn và cộng sự, 2010)
Thành phần Cà phê chè (%) Cà phê vối (%)
Nhân cà phê
Hình dạng của các giống cà phê nhân có hình dáng bầu dục (Abdel, 2008)
Hạt cà phê nhân lẻ có khối lượng dao động từ dưới 100 mg đến hơn 200 mg, với sự tương đồng rõ rệt giữa hai loại Arabica và Robusta Sự khác biệt chủ yếu nằm ở nguồn gốc địa lý của chúng (Clifford, 1985).
Giá trị tối thiểu, tối đa và trung bình của khối lượng hạt cà phê nhân chế biến khô lần lượt là 0,11g, 0,18g và 0,15g Trọng lượng tối thiểu của tất cả các giống cà phê là 0,11g.
Giống Sende từ Haru có trọng lượng tối đa hạt cà phê là 0,18 g, trong khi trọng lượng trung bình của các giống khác là 0,15 g, thấp hơn so với 0,19 g trong nghiên cứu trước của Chandrasekar và Viswanathan (1999) Sự khác biệt này có thể được giải thích bởi các yếu tố giống khác nhau.
Trọng lượng riêng của hạt cà phê có ảnh hưởng lớn đến hiệu suất phân loại bằng sức gió; hạt có trọng lượng riêng lớn hơn sẽ rơi xuống, trong khi hạt có trọng lượng riêng nhỏ hơn sẽ bay lên Độ ẩm của hạt cà phê là yếu tố chính quyết định trọng lượng riêng, thường dao động trong khoảng (1,1 – 1,3) kg/m³ (Ramalakshmi, 2007).
Hạt cà phê Arabica có màu xanh đậm hơn so với hạt Robusta Tổng hàm lượng chất rắn hòa tan trong hạt cà phê Arabica dao động từ 29% đến 34% Giống Robusta cung cấp nhiều chất rắn hòa tan hơn so với Arabica, bất kể phương pháp chế biến nào.
2.3.2 Thành phần hóa học của nhân cà phê
Hạt cà phê nhân chủ yếu được cấu tạo từ polysaccharide không hòa tan như cellulose và hemicellulose, chiếm khoảng 50% khối lượng Ngoài ra, chúng còn chứa các carbohydrate hòa tan như fructose, glucose, galactose, arabinose, sucrose, raffinose, stachyose và các polyme của galactose, mannose, arabinose và glucose, có vai trò quan trọng trong việc tạo mùi thơm, ổn định bọt, tạo cặn và tăng độ nhớt của dịch chiết Hạt cà phê cũng chứa các acid béo không bay hơi như acid citric, malic và quinic, cùng với các acid dễ bay hơi như acid acetic, propanoic, butanoic, isovaleric và hexanoic Bên cạnh đó, dầu và sáp là những thành phần quan trọng, chiếm từ 8-18% khối lượng khô, cùng với protein và acid amin tự do (9-12% khối lượng) và chất khoáng (3-5% khối lượng).
Bảng 2.5: Thành phần hóa học của nhân cà phê (Nguyễn và cộng sự, 2010)
Tinh bột 5,0 – 23,0 Acid cafetanic 8,0 – 90 Đường 5,0 – 10,0 Acid cafeic 1,0
Trong nhân cà phê có chứa khoảng 30 – 40 cấu tử thơm, thành phần và tính chất của các cấu tử chính như sau:
Bảng 2.6: Các cấu tử thơm của nhân cà phê (Nguyễn và cộng sự, 2010)
Cấu tử Tỷ lệ (%) Khối lượng phân tử
Cà phê nhân chứa nhiều loại cacbohydrate, được phân loại thành polysaccharide và đường có trọng lượng phân tử thấp như monosaccharide, disaccharide và trisaccharide Các loại đường này có thể được chia thành đường khử và đường không khử (L C Trugo, 1989).
Sucrose là loại đường chính có trong cà phê nhân, với hàm lượng thay đổi tùy thuộc vào loài và nguồn gốc cà phê Cà phê Arabica thường chứa nhiều sucrose hơn so với Robusta Tuy nhiên, ngay cả trong cùng một loài, hàm lượng sucrose cũng có thể khác nhau do các yếu tố như giống cây trồng, trạng thái trưởng thành, và điều kiện chế biến cũng như bảo quản.
Bảng 2.7 Hàm lượng phần trăm của các đơn vị monosaccharide cấu thành trong polysaccharide của cà phê nhân Arabica Đơn vị Monosaccharide %
Thành phần nitơ gồm ba nhóm hợp chất chính: alkaloids, trigonelline cùng với acid nicotinic, aminos acid và protein (R Macrae, 1989)
Caffeine là một hợp chất màu trắng, nóng chảy ở 236°C và thăng hoa ở 178°C Hàm lượng caffeine trong cà phê nhân rất khác nhau, với sự khác biệt về loài là yếu tố quan trọng nhất Cà phê Robusta có hàm lượng caffeine cao hơn, trung bình khoảng 2,2% db, trong khi cà phê Arabica có giá trị khoảng 1,2% db Các loài cà phê ít quan trọng hơn như Liberica có hàm lượng caffeine trung bình là 1,35% db.
Arabusta (giá trị trung bình 1, 72% db) (R Macrae, 1989)
Trong quá trình rang cà phê, nhiệt độ hạt cà phê tăng lên trên 200 °C nhờ vào gia nhiệt bên ngoài và các phản ứng hóa học tỏa nhiệt Nhiệt độ này vượt quá điểm thăng hoa của caffeine, dẫn đến sự thất thoát đáng kể của chất này (R Macrae, 1989).
Tác dụng sinh lý của Caffeine
Cà phê, và đặc biệt là chất caffeine trong nó, đã được công nhận là có nhiều tác dụng sinh lý đối với cơ thể con người (R Macrae, 1989)
Caffeine được hấp thu nhanh chóng và bài tiết qua nước tiểu dưới dạng methylxanthine Nồng độ caffeine trong máu tăng lên phụ thuộc vào lượng thức ăn trong dạ dày; sau khi tiêu thụ 150 – 160 mg caffeine sau khi nhịn ăn qua đêm, nồng độ đạt tối đa sau 25 – 30 phút Caffeine là một chất kích thích hệ thần kinh trung ương, đã được chứng minh là làm tăng hoạt động trí tuệ, đặc biệt khi người dùng cảm thấy mệt mỏi hoặc buồn chán (R Macrae, 1989).
Caffeine có thể gây ra sự “chậm trễ của giấc ngủ” và ảnh hưởng đến hệ tim mạch bằng cách thư giãn các cơ trơn của mạch máu, đồng thời tăng lưu lượng tim Tuy nhiên, sự gia tăng huyết áp sẽ không còn sau khi sử dụng liều lượng giống nhau (3 lần một ngày trong 7 ngày) (R Macrae, 1989).
Caffeine có thể kích thích tăng tiết acid dạ dày, và mặc dù chưa có bằng chứng rõ ràng về mối liên hệ giữa việc tiêu thụ quá nhiều cà phê và tỷ lệ mắc bệnh loét dạ dày tá tràng, nhưng việc uống cà phê không được khuyến khích cho những người đang bị loét (R Macrae, 1989).
Acid quinic tự do có mặt trong hạt cà phê nhân với một lượng nhỏ, trong khi một lượng lớn acid quinic tồn tại dưới dạng các este, thường được gọi là acid chlorogenic (CGA).
Chlorogenic acid (CGA) có công thức hóa học là C16H18O9
Hình 2.2 Công thức hóa học của Chlorogenic acid
Cà phê Robusta chứa hàm lượng acid chlorogenic (CGA) cao hơn đáng kể so với Arabica, với tỷ lệ từ 6,0 – 11,5% ở Robusta so với 4,0 – 8,0% ở Arabica (Navarra, 2017) Trong quá trình rang, cả acid chlorogenic và caffeine đều bị mất đi, tuy nhiên, lượng acid chlorogenic mất đi nhiều hơn so với caffeine (Ludwig, 2014).
Những sản phẩm sau khi rang của CGA thông thường là: Acid quinic catechol, quinol, pyrogallol và 1, 2, 4-trihydroxyl benzene
Chế phẩm vi sinh sử dụng trong quá trình lên men cà phê
Cellulose là polyme tự nhiên phong phú nhất trong sinh quyển, với sản lượng toàn cầu khoảng 1,5 x 10^{12} tấn mỗi năm, tương đương với trữ lượng của các nguồn hóa thạch và khoáng sản chính.
Cellulose là một hợp chất tự nhiên phổ biến, có mặt trong thực vật, động vật, tảo, nấm và khoáng chất Các nguồn cellulose chủ yếu bao gồm gỗ, tre, bông, rơm và bã mía, trong đó khoảng 30% là màng tế bào thực vật với thành phần chính là cellulose Gỗ chứa từ 40-50% cellulose, trong khi bông là nguồn cellulose tinh khiết, chiếm hơn 90% trọng lượng.
Cellulose là một polymer mạch thẳng, được cấu thành từ hàng nghìn đơn vị -glucose liên kết với nhau qua các liên kết -1,4-O-glycosidic, với trọng lượng phân tử dao động từ 50.000 đến 2.500.000 Da Chuỗi cellulose dài khoảng 7.000 – 15.000 đơn vị -glucose Để hình thành liên kết -1,4-O-glycosidic, mỗi phân tử -glucose cần phải xoay 180 so với phân tử kế tiếp, giúp cellulose duy trì cấu trúc thẳng và không bị cuộn lại Các nhóm -OH glycoside nằm trên mặt phẳng ngang của các phân tử glucose.
Do cấu trúc mạch thẳng của cellulose, nhiều chuỗi có thể xếp song song, dẫn đến sự gần gũi của các nhóm hydroxyl (-OH) Kết quả là các liên kết hydro hình thành giữa các nhóm hydroxyl trên các chuỗi liền kề, tạo ra liên kết chéo giữa các chuỗi cellulose Các chuỗi cellulose kết hợp để tạo thành các bó sợi nhỏ, sau đó liên kết với nhau để hình thành các bó sợi lớn hơn Cuối cùng, cellulose tạo ra cấu trúc tinh thể, hình thành vách tế bào thực vật và các sợi gỗ (Heinze, T., 2015).
Hình 2.3 Hình ảnh mô hình sự sắp xếp các chuỗi cellulose trong thành tế bào thực vật (Heinze, T., 2015)
Cellulose có cấu trúc không đồng nhất gồm hai vùng:
Vùng kết tinh có trật tự cao
Vùng vô định hình của cellulose có cấu trúc lỏng lẻo, các mạch liên kết với nhau nhờ lực Van der Waals và dễ bị ảnh hưởng bởi yếu tố bên ngoài Khi tiếp xúc với nước, vùng này có khả năng hấp thụ nước và trương phồng, tạo điều kiện thuận lợi cho enzym cellulase hoạt động Ngược lại, vùng kết tinh có cấu trúc chặt chẽ hơn, với các mạch cellulose liên kết theo trật tự nhờ liên kết hydrogen giữa các nhóm –OH, ngăn cản sự trương phồng và làm cho enzym cũng như các phân tử khác khó xâm nhập vào để phân hủy cellulose.
Cellulose không tan trong nước nhưng có khả năng hấp thụ nước và trương phồng Khi tiếp xúc với acid hoặc kiềm ở nồng độ cao và nhiệt độ cao, cellulose sẽ bị phân hủy Ngoài ra, cellulose cũng có thể bị thủy phân bởi enzyme cellulase ở nhiệt độ từ 40-50 độ C.
Vi sinh vật trong tự nhiên có khả năng phân hủy cellulose trong cả điều kiện hiếu khí và yếm khí, tạo ra sản phẩm cuối cùng là β-glucose, tuy nhiên quá trình này thường diễn ra chậm và không triệt để Bên cạnh cellulose, hemicellulose cũng có mặt trong tế bào thực vật, chiếm từ 20-40% và liên kết chặt chẽ với cellulose Hemicellulose chứa nhiều loại monosaccharide như galactose, mannose, glucose, xylose, arabinose và các nhóm acetyl, và do cấu trúc tinh thể không chặt chẽ, nó dễ dàng bị thủy phân hơn.
Quá trình thủy phân cellulose bằng acid hoặc kiềm kém hiệu quả hơn so với việc sử dụng enzyme cellulase Enzyme cellulase hoạt động hiệu quả hơn ở nhiệt độ 50 o C.
Kể từ năm 1956, cellulase “tốt hơn” đã được phát hiện, cho phép xử lý trước chất nền và tăng cường khả năng phân hủy Quá trình thủy phân bằng enzyme đặc biệt hiệu quả trong việc thủy phân các liên kết -(1-4), trong khi acid tấn công tất cả các loại liên kết glycosidic và polysaccharide Tuy nhiên, nhiệt độ và nồng độ acid cần thiết cho quá trình thủy phân lại kém hiệu quả đối với cellulose có cấu trúc tinh thể hoặc trật tự bậc cao, dẫn đến sự phân hủy glucose và hình thành các sản phẩm độc hại cho quá trình lên men, đòi hỏi phải sử dụng chất kháng acid đắt tiền.
Cellulose là một nguyên liệu đa năng, được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực như vật liệu tổng hợp, lưới, vải bọc, lớp phủ, bao bì và giấy Trong y tế, cellulose được sử dụng để sản xuất màng lọc máu, mạch máu, màng trị thương, trị bỏng, bọc thuốc và các sản phẩm tương tự.
Cellulose được sử dụng rộng rãi trong các ngành công nghiệp như giấy, dệt may và dược phẩm
Cellulose vi tinh thể được dùng trong bào chế làm tá dược rã nhờ khả năng dính và trơn, làm ổn định các nhũ dịch và hỗn dịch
Cellulose và các dẫn xuất của nó như Hydroxypropylcellulose, Methylcellulose, và Microcrystalline cellulose được sử dụng rộng rãi trong ngành thực phẩm Chúng có mặt trong các sản phẩm như mousses, bánh nướng, nhân bánh, kem, đồ chiên, nước sốt và món tráng miệng đông lạnh Ngoài ra, cellulose còn đóng vai trò là chất bổ sung chất xơ, giúp giảm calo và làm chất nhũ hóa.
Cellulose là thành phần quan trọng có mặt trong vỏ ngoài, các lớp bên trong và nhân của hạt cà phê Hàm lượng cellulose trong vỏ quả cà phê dao động từ 13% đến 27%, tùy thuộc vào loại cà phê Mặc dù pectin chiếm ưu thế trong lớp nhớt, cellulose vẫn đóng góp khoảng 17% Đặc biệt, trong lớp vỏ trấu, cellulose chiếm tỷ lệ cao từ 61% đến 67%, và nhân cà phê cũng chứa một lượng lớn cellulose.
Hàm lượng cellulose trong trái cà phê thay đổi từ giai đoạn trái non đến khi trái già, với mức cellulose có thể đạt tới 18% ở trái chín Cellulose là thành phần chính tạo nên sự rắn chắc trong cấu trúc của trái cà phê, và nó rất khó bị phá vỡ (Clarke R.J và cộng sự, 1998).
Enzyme là chất xúc tác sinh học được tổng hợp bởi các cơ thể sinh vật, có bản chất protein và hòa tan trong nước cũng như dung dịch muối loãng Chúng đóng vai trò quan trọng trong các phản ứng hóa học diễn ra trong cơ thể (Đặng và cộng sự, 2012).
Enzyme có khả năng xúc tác mạnh mẽ, với hoạt độ xúc tác cao gấp hàng trăm, hàng nghìn hoặc hàng triệu lần so với các chất xúc tác vô cơ và hữu cơ khác Đặc biệt, enzyme có tính đặc hiệu cao, chỉ xúc tác cho một hoặc một số cơ chất nhất định theo các kiểu liên kết hóa học và phản ứng cụ thể.
Enzyme tác dụng trong điều kiện “êm dịu” thường tác dụng thích hợp ở nhiệt độ 30-
Chế phẩm vi sinh được nghiên cứu trong bài
Cellulase là enzyme thủy phân được sản xuất bởi vi sinh vật trên vật liệu cellulosic Hiện nay, cellulase chủ yếu được chiết xuất từ nấm do hoạt tính enzyme cao, nhưng vi khuẩn có tiềm năng lớn hơn Vi khuẩn phát triển nhanh hơn nấm, cho phép sản xuất enzyme với tốc độ cao hơn Chúng cũng ổn định nhiệt hơn và dễ dàng hơn trong việc di truyền Một số chi vi khuẩn như Bacillus và Clostridium đã được báo cáo có khả năng phân giải tế bào.
Cellulomonas Rumminococcus, Alteromonas, Acetivibrio, v.v… Trong số các vi khuẩn, các loài Bacillus nổi tiếng với việc sản xuất CMCase trong môi trường nuôi cấy lỏng (Maidul,
Hầu hết các chủng vi khuẩn hiếu khí có khả năng tiết ra cellulase từ sinh khối lignocellulosis, với cellulose là nguồn năng lượng quan trọng cho vi sinh vật Trong số đó, các loài Bacillus, như Bacillus subtilis và Bacillus megaterium, nổi bật với khả năng sản sinh cellulase hiệu quả.
Bacillus pumilus là một loại vi khuẩn gram dương, hình que, có khả năng sản xuất cellulase và được tìm thấy trong nhiều môi trường sống như đất và nước Các đặc điểm tế bào của B pumilus tương tự như các loài khác trong chi Bacillus, bao gồm B subtilis, B megaterium và B cereus.
2.5.2 Hình thái vi khuẩn Bacillus pumilus
Bacillus pumilus là vi khuẩn gram dương, hình que, sinh bào tử và hiếu khí, có kích thước từ 2,0 – 3,0 x 0,6 – 0,7 𝜇m Loại vi khuẩn này thường cư trú trong đất và ở vùng rễ của một số loài thực vật, nơi nó thể hiện hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm.
B pumilus chứa một nhiễm sắc thể hình tròn bao gồm khoảng 4.000 gen và 3.600 –
3.900 protein với chiều dài thay đổi trong khoảng 3,7 đến 3,8 Mbp 41% cặp bazơ DNA ở
B.pumilus là G-C Cấu trúc tế bào của B.pumilus tương tự như các loài Bacillus khác như B.subtilis, B.megaterium và B.cereus, lớp ngoài của các liên kết chéo peptidoglycan ở B.pumilus được bao phủ bởi acid teichoic và lipoteichoic giống như hầu hết các vi khuẩn gram dương khác (Trung tâm công nghệ sinh học quốc gia, 2008)
B pumilus có vòng đời tương tự như các Bacilli khác, với ba giai đoạn sống: túi bào tử, tế bào sinh dưỡng và bào tử tự do Khi gặp điều kiện không thuận lợi, nó sẽ hình thành bào tử và giải phóng ra môi trường Bào tử thường nảy mầm khi gặp điều kiện thuận lợi, và thời gian nảy mầm cùng với sự thay đổi nhiệt độ ổn định hoặc chất dinh dưỡng là yếu tố quan trọng cho sự phát triển của nó (Ammini, 2009).
Do khả năng hình thành bào tử và chịu được nhiều điều kiện môi trường thay đổi,
Bacillus spp có khả năng thích nghi tốt với nhiều môi trường sống khác nhau, bao gồm cả môi trường biển và ven biển Trong số các loài Bacillus, B cereus, B subtilis và B pumilus là những thành phần chính của quần xã vi khuẩn biển Vi khuẩn B pumilus nổi bật với khả năng chịu đựng cao trong các điều kiện khắc nghiệt như thiếu dinh dưỡng, độ ẩm thấp, chiếu xạ, H2O2 và hóa chất khử trùng Vai trò sinh thái của B pumilus được thể hiện qua khả năng sản xuất các hợp chất có tác dụng đối kháng với nấm và vi khuẩn gây bệnh.
Chủng B pumilus không độc, không gây bệnh cho người và động vật có vú (Nanchi,
Chủng B pumilus có khả năng ngăn chặn sự nảy mầm của bào tử nấm trên thực vật bằng cách tạo ra một rào cản vật lý giữa lá và bào tử sâu bệnh, đồng thời xâm chiếm các bào tử này Nghiên cứu cho thấy chủng B pumilus có thể tăng cường khả năng kháng bệnh cho cây trồng, giúp cây chống lại nhiều loại mầm bệnh khác nhau.
Nghiên cứu cho thấy Bacillus có khả năng cải thiện năng suất tăng trưởng, chức năng miễn dịch và phát triển đường ruột của động vật, đồng thời điều chỉnh cộng đồng vi sinh vật đường ruột Bacillus pumilus, được sử dụng làm phụ gia thức ăn chăn nuôi, có tác dụng chống oxy hóa và viêm nhiễm, thúc đẩy hiệu suất tăng trưởng và các chỉ số miễn dịch, kích thích sự phát triển của vi khuẩn có lợi và ngăn chặn vi khuẩn có hại.
Cellulase là enzyme được sản xuất bởi nhiều loại vi sinh vật, với ứng dụng đa dạng trong các ngành công nghiệp như thực phẩm, thức ăn chăn nuôi, bia, rượu vang, và bột giấy (Samley, 2017) Các loài Bacillus ngày càng trở nên phù hợp để sử dụng làm chế phẩm sinh học hoặc phụ gia thức ăn chăn nuôi nhờ tính ổn định nhiệt, giúp chúng tồn tại trong chất nền thực phẩm và bảo quản lâu dài ở nhiệt độ môi trường (Kotowicz, 2019).
Bacillus pumilus đã được nghiên cứu về khả năng sản xuất cellulase (Kotchoni,
2002) Cellulase được sản xuất bởi B.pumilus, một loại vi khuẩn GRAS (Generally
B pumilus được công nhận là an toàn (GRAS) và có sản lượng cellulase cao nhất trong môi trường lỏng, do đó có tiềm năng ứng dụng trong ngành công nghiệp nhiên liệu sinh học cellulosis.
Bacillus pumilus được nghiên cứu cho thấy có khả năng tạo ra hoạt độ cellulase cao hơn so với các loại nấm nhờ vào tốc độ phản ứng nhanh và khả năng duy trì hoạt động trong phạm vi nhiệt độ và pH rộng.
2.5.6 Tổng quan điều kiện nuôi cấy thu nhận chế phẩm cellulase từ vi khuẩn Bacillus pumilus
Các điều kiện nuôi cấy tối ưu cho vi khuẩn trong môi trường sản xuất bao gồm việc bổ sung các nguồn carbon và nitơ khác nhau, điều chỉnh pH, nhiệt độ và thời gian nuôi cấy Glucose và muối ammonium sulphate là nguồn carbon và nitơ phù hợp, trong khi pH 6,5 là lý tưởng cho vi khuẩn sản xuất cellulase Ngoài ra, carboxymethyl cellulose ở nồng độ 0,5% trong môi trường kích thích sản xuất hoạt tính cellulase cao hơn (M Sakthivel, 2010).
Môi trường sử dụng để nuôi cấy vi khuẩn sản xuất cellulase là môi trường dịch malt
Môi trường nuôi cấy 10 ml được lấy từ bình Erlenmeyer 50 ml và được hấp tiệt trùng ở 121°C trong 15 phút Sau khi làm nguội, bình được cấy vi khuẩn và ủ ở nhiệt độ 37°C trong 48 giờ Cuối giai đoạn lên men, môi trường nuôi cấy được ly tâm ở tốc độ 6000 vòng/phút trong 15 phút để thu được dịch chiết thô, sử dụng làm nguồn enzyme.
Các phương pháp chế biến cà phê
Quả cà phê chín được thu hoạch và chọn lọc bằng tay, sau đó được xử lý để loại bỏ cùi, tạo ra hạt cà phê xanh (cà phê thóc) Tiếp theo, hạt cà phê được sấy khô và rang Quá trình chế biến hạt cà phê được thực hiện bằng ba phương pháp khác nhau: khô, ướt hoặc nửa ướt.
Chế biến khô là phương pháp lâu đời và đơn giản nhất, thường được áp dụng ở các quốc gia có lượng mưa thấp và thời gian nắng dài như Brazil, Ethiopia, Haiti, Indonesia và Paraguay Phương pháp này không sử dụng quá trình lên men vi sinh vật và chủ yếu dành cho cà phê Robusta Trong chế biến khô, quả cà phê được để chín trên cây trước khi thu hoạch, sau đó được phơi nắng cho đến khi đạt độ ẩm khoảng 10-11% Ngoài ra, quả cũng có thể được làm khô ngay sau khi thu hoạch bằng cách rải trên mặt đất vào ban ngày và chất thành đống vào ban đêm Quá trình này kết hợp giữa lên men và sấy khô, kéo dài từ 10 đến 25 ngày tùy thuộc vào điều kiện thời tiết Sau khi hoàn tất, quả cà phê khô vẫn còn lớp vỏ ngoài và được bóc vỏ bằng máy.
Trong phương pháp ướt, cho cà phê có chất lượng cao hơn, quả cà phê được lên men
Phương pháp ướt trong chế biến cà phê bao gồm việc phân loại quả cà phê bằng cách ngâm trong nước, trong đó quả chưa chín nổi lên và được loại bỏ, trong khi quả chín chìm xuống đáy Sau đó, quả cà phê được đưa vào máy xát tươi để loại bỏ vỏ ngoài, và lớp nhớt (trung bì) được loại bỏ thông qua quá trình lên men kéo dài từ 12 đến 36 giờ Cuối cùng, hạt cà phê được rửa sạch và sấy khô trong khoảng 5 đến 10 ngày, tùy thuộc vào điều kiện thời tiết, với độ ẩm còn lại của hạt khô đạt 12% (Silva và cộng sự).
Phương pháp bán ướt là kỹ thuật kết hợp giữa chế biến ướt và khô, trong đó quả cà phê được xát tươi để tách vỏ và sau đó được sấy khô hoặc phơi trong 2-3 ngày Sau đó, hạt cà phê được phơi thêm 7-10 ngày và đánh sạch lớp nhớt, trong khi bước lên men bị bỏ qua (Hunch M và cộng sự, 2015) Phương pháp chế biến ướt không chỉ mang lại hiệu quả kinh tế mà còn giúp hạt cà phê đạt chất lượng cao nhất Quá trình lên men trong chế biến ướt giúp tách lớp nhớt, loại bỏ pectin và cellulose, vì lớp nhớt này cản trở quá trình sấy khô và làm hạt cà phê dễ hút ẩm, khó bảo quản Hơn nữa, lớp nhớt chứa hàm lượng đường lớn, tạo điều kiện thuận lợi cho sự phát triển của nấm, vi khuẩn, đặc biệt là nấm mốc và vi sinh vật gây hại trong quá trình lên men.
Có nhiều phương pháp tách lớp nhớt: phương pháp sinh hóa, phương pháp hóa học, phương pháp cơ học, phương pháp cơ hóa học
Phương pháp lên men sinh hóa, hay còn gọi là phương pháp lên men bằng chế phẩm sinh học, sử dụng enzyme tự nhiên có trong nguyên liệu hoặc vi sinh vật cấy vào để phân giải lớp nhớt thành các chất hòa tan trong nước Nghiên cứu đã xác định hơn 50 loại nấm men và vi khuẩn tham gia vào quá trình lên men cà phê (Pereira, 2014) Theo Silva và cộng sự (2010), vi sinh vật trong quá trình này tạo ra etanol, acid lactic, butyric, acetic và các acid cacboxylic Coughlan và Mayer cũng báo cáo rằng nhiều enzyme ngoại bào từ các loài Bacillus có khả năng phân giải cellulose, giúp phân hủy cellulose và pectin trong vỏ, thịt quả và lớp nhớt của cà phê.
Giới thiệu về xử lý cà phê nhân bằng chế phẩm
Cà phê nhân được xử lý bằng chế phẩm enzyme thân thiện với môi trường, giúp tăng hàm lượng chất hòa tan Việc xử lý này làm giảm lượng nguyên liệu cần thiết để sản xuất cà phê hòa tan, từ 3-3,2 kg xuống chỉ còn khoảng 2,4 kg cho mỗi kg sản phẩm Sản phẩm cà phê hòa tan hiện nay mang lại giá trị kinh tế cao, nhờ vào việc cải thiện hiệu suất trích ly chất hòa tan từ cà phê nhân.
Nhiều nghiên cứu đã tập trung vào khả năng bóc tách lớp nhớt ở cà phê tươi, nhưng rất ít nghiên cứu xem xét khả năng trích ly chất hòa tan từ cà phê nhân Trần và cộng sự (2009) đã nghiên cứu việc sử dụng enzyme cellulase và pectinase từ hai chủng nấm Trichoderma viride và Aspergillus niger để xử lý nhanh vỏ cà phê Việc áp dụng hai chủng nấm này giúp tăng tốc độ phân hủy, cải thiện hiệu quả trong quá trình xử lý cà phê.
Các nghiên cứu về vi khuẩn Gram âm Tamutella ptyseos, Pseudomonas putrefaciens,
Enterobacter aerogenes, Acinetobacter sp và Providencia mirabilis sản xuất pectinase và cellulase, giúp tăng tốc quá trình lên men bằng cách phân hủy pectin và cellulose trong lớp nhớt và vỏ quả cà phê (Silva và cộng sự, 2013) Các loài nấm men như Pichia burtonii, Debaryomyces polymorphus, Arxula adeinivorans, Pichia holstii và Pichia anomala, được phân lập từ quá trình lên men cà phê chế biến khô, cũng cho thấy hoạt tính pectinase và cellulase (Silva và cộng sự, 2013) Nghiên cứu đã chỉ ra rằng việc bổ sung hỗn hợp ba loài Saccharomyces (gồm S marxianus, S bayanus và S cerevisiae var.) có thể cải thiện hiệu quả lên men.
Ellipsoideus) đã tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình lên men bằng cách làm nhanh sự thoái hóa của lớp nhầy
Năm 2016, một nghiên cứu sản xuất cellulase và pectinase bằng cách sử dụng
Aspergillus oryzae trong rỉ mật có ứng dụng quan trọng trong việc tăng khả năng chiết xuất hàm lượng chất rắn hòa tan từ cà phê Nghiên cứu của Nguyễn và cộng sự (2016) đã xác định điều kiện tối ưu để sản xuất cellulase và pectinase, cũng như điều kiện tối ưu để ứng dụng enzyme trên hạt cà phê, góp phần nâng cao hiệu quả chiết xuất chất rắn hòa tan.
Việc sử dụng chế phẩm sinh học trong xử lý cà phê nhân mang lại nhiều lợi ích tích cực, đặc biệt là tăng hiệu suất trích ly chất hòa tan Cà phê hạt được khảo sát là loại đã phơi khô, và hệ vi sinh vật tạo ra các enzyme như pectinase, hemicellulase, cellulase được bổ sung vào khối nhân cà phê để thủy phân cellulose, pectin và hemicellulose Quá trình này làm nới lỏng vách tế bào của nhân cà phê, giúp giải phóng các chất hòa tan mà vẫn giữ được hương vị đặc trưng của cà phê (Phú, 2012).
Quá trình lên men làm tăng sự đa dạng của hương thơm cà phê Farah và cộng sự,
Năm 2006, đã có hơn 700 hợp chất dễ bay hơi và không bay hơi được xác định là góp phần tạo nên hương vị cà phê Trong quá trình lên men, vi sinh vật sản sinh ra nhiều chất chuyển hóa, ảnh hưởng đến nồng độ đường và các acid amin tự do, từ đó tạo ra các hợp chất Maillard và chất bay hơi trong quá trình rang Các nghiên cứu của Pederson và Breed cho thấy cà phê chế biến ướt có hương thơm vượt trội hơn so với cà phê chế biến khô nhờ vào các hợp chất thơm sinh ra trong quá trình loại bỏ lớp màng nhầy Việc lựa chọn vi sinh vật phù hợp và kiểm soát quá trình lên men là rất quan trọng để cải thiện vị và hương thơm của cà phê.
Nhân cà phê sau quá trình lên men có bề mặt bóng và màu ngà voi, đạt tiêu chuẩn hình thái Cần kiểm tra nguy cơ nhiễm độc tố aflatoxin trong cà phê sau lên men, và nếu phát hiện nhiễm, phải loại bỏ ngay Nhiều loại nấm tự nhiên trên hạt cà phê có khả năng hình thành độc tố nấm mốc, trong đó Ochratoxin A (OTA) là độc tố quan trọng nhất, gây hại cho thận, ung thư, quái thai và ức chế miễn dịch (WHO, 2001) OTA lần đầu tiên được báo cáo trong hạt cà phê xanh bởi Levi và cộng sự (1974) và có thể tồn tại trong hạt cà phê rang thương mại Nồng độ OTA trong hạt cà phê xanh dao động từ 0,2 đến 360 μg/kg, chủ yếu do A ochraceus và Aspergillus carbonarius sản sinh Độ ẩm cao (> 20%) tạo điều kiện thuận lợi cho sự phát triển của nấm sản xuất OTA, thường xuất hiện trên quả chín quá hoặc bị hư Quá trình làm khô trong môi trường ẩm ướt có nguy cơ ô nhiễm OTA cao nhất, trong khi chế biến ướt ít bị nhiễm nấm mốc hơn nhờ vào việc loại bỏ cùi và lớp nhớt Hoạt độ nước dưới 0,8 có thể ngăn cản sản xuất OTA trong cà phê nhân (Schillinger và cộng sự, 2010).
Vi khuẩn sản xuất cellulase hiệu quả hơn nấm, mặc dù nấm có xu hướng tạo ra nhiều cellulase hơn Cellulase từ vi khuẩn là chất xúc tác tốt hơn do ít bị ức chế phản hồi Vi khuẩn phát triển nhanh chóng, cho phép sản xuất enzyme tái tổ hợp cao hơn Chúng có khả năng sống sót trong nhiều môi trường khắc nghiệt như nhiệt độ cao và pH kiềm, giúp tạo ra chất xúc tác sinh học ổn định Cellulase của vi khuẩn có hoạt tính cao chống lại cellulose kết tinh và hoạt động tốt ở pH kiềm, vượt trội hơn so với cellulase của nấm (Somen, 2012).
Trong bài nghiên cứu này, chúng tôi tập trung vào việc tối ưu hóa điều kiện sản xuất enzyme cellulase từ vi khuẩn Bacillus pumilus, một vấn đề quan trọng trong việc thu enzyme và nâng cao hiệu quả kinh tế Các yếu tố như nguồn dinh dưỡng, nhiệt độ, pH và thời gian nuôi cấy đều ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp enzyme Việc tối ưu hóa các yếu tố trong quá trình lên men không chỉ giúp thu được lượng enzyme cao nhất mà còn tăng quy mô sản xuất, điều này có ý nghĩa quan trọng trong ứng dụng công nghiệp Đề tài cũng nghiên cứu khả năng trích ly các chất hòa tan từ nhân cà phê bằng chế phẩm sinh học, điều này rất cần thiết cho ngành công nghiệp sản xuất cà phê hòa tan.
NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Nguyên vật liệu
Chủng giống vi khuẩn Bacillus pumilus sử dụng trong nghiên cứu được mua tại
Trung tâm Công nghệ sinh học TP.HCM Số hiệu chủng giống: HBCM B0037
Giống: Cà phê vối (Coffea robusta)
Nguồn gốc: Cà phê được mua ở xã Quảng Tín, huyện Đắk R’lấp, tỉnh Đắk Nông
3.1.3 Môi trường sử dụng trong nghiên cứu
Môi trường giữ giống được sử là môi trường thạch malt (MEA – Malt Extract Agar)
Bảng 3.1 Thành phần môi trường MEA
Môi trường malt được bổ sung thêm (NH4)2SO4 1% để cung cấp nguồn Nitơ cho vi khuẩn
Môi trường nhân giống vi khuẩn được sử dụng tương tự như môi trường giữ giống Tuy nhiên, thành phần Agar đã bị loại bỏ
Môi trường thí nghiệm nuôi cấy enzyme cellulase được sử dụng là malt bổ sung 0,5% CMC để kích thích quá trình tạo enzyme Đặc biệt, thành phần agar đã được loại bỏ khỏi môi trường này.
3.1.4.1 Hóa chất sử dụng cho môi trường
3.1.4.2 Hóa chất sử dụng để xác định hoạt tính enzyme
• Muối potassium sodium tartrate tetrahydrate C4H4O6KNa
- Dụng cụ đo độ Brix
- Bể điều nhiệt, tủ ủ, tủ sấy, tủ lạnh, tủ cấy
- Máy đo quang phổ UV-Vis
- Cân điện tử, cân phân tích
- Nhiệt kế, ống nghiệm, đĩa petri
- Bình định mức các loại, ống đong các loại
- Pipette các loại, phễu lọc, giấy lọc
- Đèn cồn, que cấy, đũa thủy tinh
- Khay, vải mùng, rây lọc
Phương pháp nghiên cứu
Quá trình cấy chuyền được thực hiện trong tủ cấy vô trùng để đảm bảo điều kiện vô trùng Đối với vi khuẩn, phương pháp cấy được sử dụng là phương pháp zigzag Đầu tiên, que cấy vòng được tiệt trùng, sau đó lấy một ít sinh khối vi khuẩn từ đĩa petri chứa giống Bacillus pumilus và chuyển vào các ống nghiệm thạch nghiêng có chứa môi trường MEA (Malt Extract Agar).
Sau 7 – 10 ngày, tiến hành cấy chuyền giống vi khuẩn Bacillus pumilus từ ống nghiệm cũ sang ống nghiệm thạch nghiêng mới có chứa môi trường MEA Ủ ở điều kiện
37 o C trong tủ ủ vi sinh để giữ giống
Sử dụng bình erlen 250 mL chứa môi trường tương tự môi trường giữ giống, tiến hành cấy vòng để chuyển một lượng nhỏ sinh khối vi khuẩn từ ống thạch nghiêng vào erlen trong tủ cấy vô trùng Sau đó, đặt bình erlen lên máy khuấy từ và nhân giống cho đến khi mật độ tế bào đạt 10^6, khoảng 48 giờ.
Mật độ tế bào được xác định bằng công thức:
A = 5 × a × n × 10 4 A: Tổng số tế bào trong 1ml dung dịch mẫu a: Tổng số tế bào trong 5 ô vuông lớn của buồng đếm hồng cầu n: Độ pha loãng
3.2.1.4 Phương pháp đánh giá khả năng phát triển của vi khuẩn bằng phương pháp đo mật độ quang
Theo định luật Lambert-Beer, tín hiệu hấp phụ tỷ lệ thuận với nồng độ chất phân tích, và mỗi chất sẽ hấp thụ tốt ở các bước sóng khác nhau Trong quá trình nuôi cấy vi sinh vật, sự phát triển của chúng sẽ làm thay đổi độ hấp thụ quang của môi trường, từ đó cho phép đánh giá khả năng sinh trưởng của vi khuẩn.
Công thức định luật Lambert-Beer:
Trong đó: a: hằng số hấp thụ
C: nồng độ chất hấp thụ l: Bề dày cuvet Độ truyền qua: T= It/I0 = 10 -aCl Độ hấp thụ quang: A =log1/T =log 1/10 aCl
Mức độ sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn có thể được xác định gián tiếp thông qua độ đục của môi trường nuôi cấy, với độ đục tỷ lệ thuận với mật độ tế bào Khi số lượng tế bào tăng cao, độ đục cũng tăng theo Hệ huyền phù chứa cấu tử không tan sẽ cản trở ánh sáng, làm giảm độ sáng của chùm ánh sáng tới Do đó, độ đục là một chỉ số quan trọng để khảo sát khả năng sinh trưởng của vi khuẩn.
Khảo sát khả năng sinh trưởng của vi sinh vật cho thấy tế bào vi sinh vật hấp thụ tốt ở bước sóng 620 nm Giá trị mật độ quang đo tại bước sóng này giúp đánh giá tổng lượng tế bào vi sinh vật trong mẫu phân tích Phương pháp này được sử dụng để xác định khả năng sinh trưởng của vi sinh vật theo từng khoảng thời gian nuôi khác nhau (Lương, 2004).
Sử dụng loại ống ly tâm 50 mL đã tiệt trùng để tiến hành quá trình lên men tạo enzyme cellulase
Môi trường lên men được bổ sung (NH4)2SO4 1% để cung cấp nitơ và CMC 0,5% nhằm kích thích sản xuất enzyme cellulase Sau đó, 10 mL môi trường MEA được chuyển vào các ống ly tâm và tiệt trùng ở 121°C trong 15 phút Sau khi tiệt trùng, môi trường được làm nguội và 1 mL huyền phù vi sinh vật từ bình nhân giống được thêm vào Cuối cùng, môi trường được ủ ở nhiệt độ 37°C trong 48 giờ.
3.2.1.6 Phương pháp thu nhận enzyme
Sau khi hoàn tất quá trình lên men, enzyme thô được thu nhận thông qua phương pháp ly tâm ở tốc độ 6000 vòng/phút trong 15 phút, sau đó được lọc bằng giấy lọc tiệt trùng với kích thước lỗ 0,2 μm để loại bỏ hoàn toàn xác vi sinh vật.
3.2.2.1 Phương pháp xác định hoạt tính enzyme cellulase
Xác định hoạt tính cellulase
Hoạt độ enzyme cellulase được xác định bằng phương pháp định lượng đường khử Nelson/Samogi Đơn vị hoạt độ được tính dựa trên lượng enzyme phân giải cơ chất CMC thành đường khử tương đương với 1 µmol glucose trong 1 phút dưới điều kiện thí nghiệm.
Phương pháp này dựa trên nguyên tắc thủy phân CMC (carboxymethyl-cellulose) bằng enzyme ở nhiệt độ 40℃ và pH 5,0 Quá trình thủy phân tạo ra một lượng đường khử, sau đó phản ứng với thuốc thử DNS (acid 3,5 dinitrosalicylic) để đo độ hấp thu.
OD phức thuốc thử DNS với đường khử bằng máy đo mật độ quang ở bước sóng 540 nm
Lập đường chuẩn glucose xây dựng mối quan hệ tuyến tính giữa nồng độ glucose và độ hấp thụ quang
Tiến hành dựng đường chuẩn: Pha dung dịch glucose 1 mg/ml bằng cách hòa tan
100 mg glucose monohydrate với 80 ml nước cất và chuyển vào bình định mức 100 ml, thêm nước cất đến vạch và lắc đều
Bảng 3.2: Dựng đường chuẩn Ống 0 1 2 3 4 5 6 7 8
Nồng độ dung dịch glucose chuẩn
Dung dịch glucose 1 mg/ml (ml) 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8
Hình 3.1 Sơ đồ dựng đường chuẩn Tính hệ số glucose (Lê, 2012)
Hiệu chuẩn độ hấp thu OD của dung dịch glucose chuẩn bằng hiệu số:
Với AG: độ hấp thu OD của dung dịch glucose chuẩn
AW: độ hấp thu OD của ống số 0 (phản ứng với nước cất)
Tính toán hệ số glucose bằng công thức:
CG: nồng độ dung dịch glucose chuẩn (mg/mL)
AG – AW: hiệu số hiệu chuẩn độ hấp thu OD của dung dịch glucose chuẩn
Đo nồng độ Chia (mg/mL) để xác định độ hấp thu OD của từng dung dịch glucose chuẩn nhằm tính toán hệ số glucose Sau đó, tính hệ số trung bình và đo độ hấp thụ của phản ứng enzyme cùng với phản ứng thử không.
Mỗi phản ứng thực hiện 3 ống nghiệm riêng biệt và lặp lại thí nghiệm 3 lần
Hình 3.2 Sơ đồ phản ứng enzyme
Hình 3.3 Sơ đồ phản ứng thử không enzyme
Xác định hoạt độ enzyme cellulase Định nghĩa đơn vị hoạt độ enzyme [U]
Một đơn vị hoạt động của enzyme cellulase được định nghĩa là lượng enzyme cần thiết để sinh ra 1 àmol đường khử glucose từ phản ứng với cơ chất CMC ở nhiệt độ 40°C trong vòng 1 phút.
Hoạt độ enzyme được xác định theo công thức (Hoang và cộng sự, 2015):
1 mL × D Với AT: độ hấp thu OD của phản ứng enzyme
AB: độ hấp thu OD của phản ứng thử không
F: hệ số glucose trung bình (mg/mL)
1000: chuyển từ mg sang àg (1 mg glucose = 1000 àg)
180: trọng lượng phõn tử của glucose (chuyển từ àg àmol)
10 phút: thời gian phản ứng
1 ml: thể tích dịch mẫu (dịch enzyme)
Thí nghiệm 1: Nồng độ đường glucose tối ưu cho sinh tổng hợp cellulase
Thí nghiệm được thực hiện trong 48 giờ với độ pH môi trường là 5,5 nhằm xác định nồng độ đường tối ưu để đạt được hoạt tính cellulase cao nhất Nghiên cứu được tiến hành ở các mức độ Brix 5, 6, 7, 8 và 9, và thí nghiệm được lặp lại 3 lần để xác định hàm lượng chất khô hòa tan tối ưu cho quá trình sinh tổng hợp enzyme cellulase.
Thí nghiệm 2: Nồng độ muối tối ưu cho sinh tổng hợp cellulase
Trong thí nghiệm này, nồng độ đường ban đầu sẽ được cố định để khảo sát nồng độ muối (NH4)2SO4 bổ sung tối ưu nhằm đạt được hoạt tính cellulase cao nhất Các nồng độ muối (NH4)2SO4 được khảo sát bao gồm 0,07%; 0,09%; 0,11%; 0,13%; và 0,15%.
Thí nghiệm 3: pH tối ưu cho sinh tổng hợp cellulase
Trong thí nghiệm này, nồng độ đường và nồng độ muối ban đầu được cố định để khảo sát pH ban đầu tối ưu cho hoạt tính cellulase cao nhất Các giá trị pH được nghiên cứu bao gồm 5, 5,5, 6, 6,5 và 7.
Thí nghiệm 4: Thời gian tối ưu cho sinh tổng hợp cellulase
Trong nghiên cứu này, ba yếu tố được khảo sát là nồng độ đường, nồng độ muối và pH ban đầu sẽ được giữ cố định Mục tiêu của thí nghiệm là xác định thời gian nuôi vi sinh vật tối ưu để đạt được chế phẩm có hoạt tính cellulase cao nhất Thời gian khảo sát được thực hiện từ 24 giờ đến 72 giờ, với khoảng cách 12 giờ giữa các lần đo.
Thí nghiệm 5: Nhiệt độ tối ưu cho sinh tổng hợp cellulase trong điều kiện nuôi cấy tĩnh
Bốn yếu tố vừa được khảo sát bao gồm nồng độ đường, nồng độ muối, pH và thời gian ban đầu sẽ được cố định
Trong thí nghiệm này nhằm khảo sát nhiệt độ 25 o C, 30 o C, 37 o C thực hiện trong tủ ấm
Thí nghiệm 6: Nhiệt độ tối ưu cho sinh tổng hợp cellulase trong điều kiện nuôi cấy có đảo trộn
Bốn yếu tố vừa được khảo sát bao gồm nồng độ đường, nồng độ muối, pH và thời gian ban đầu sẽ được cố định
Trong thí nghiệm này nhằm khảo sát nhiệt độ 25 o C, 30 o C, 37 o C thực hiện trong tủ ấm có đảo trộn (150 vòng/ phút)
3.2.2.2 Khảo sát chất lượng chế phẩm theo thời gian bảo quản