Nhiệm vụ của khóa luận: Thu nhận protein concentrate từ đậu đen và xác định các tính chất bao gồm a thành phần hóa học, b phổ hồng ngoại FTIR, c khối lượng phân tử, d thành phần amino a
TỔNG QUAN
Tổng quan về đậu đen
1.1 Tổng quan về nguồn gốc và giới thiệu chung về đậu đen
Cây đậu đen, có tên khoa học là Vigna cylindrical (L.) Skeels, thuộc họ đậu (Fabaceae) và có nguồn gốc từ dãy Andes ở Trung Mỹ cổ Theo Tổ chức Lương thực và Nông nghiệp (FAO), đậu đen chứa nhiều thành phần dinh dưỡng quan trọng như tinh bột, protein, chất xơ, khoáng chất, vitamin và các hợp chất hoạt tính sinh học, bao gồm phenolic Đặc biệt, hàm lượng protein trong đậu đen dao động từ 20-25%, làm cho chúng trở thành nguồn protein hấp dẫn cho việc chiết xuất và chế biến.
1.2 Thành phần hóa học của đậu đen
Các loại đậu là nguồn thực phẩm giàu protein và chất xơ, với hàm lượng cao gấp đôi so với ngũ cốc Chúng chứa nhiều hoạt chất sinh học và yếu tố phản dinh dưỡng, đồng thời là nguồn cung cấp tinh bột, protein, năng lượng và chất xơ quan trọng So với protein động vật, đậu có giá thành rẻ hơn Các hợp chất như phenolic, tocopherol, peptide, amino acid, chất xơ, acid béo không bão hòa và khoáng chất (Ca: 3g/kg; Fe: 40 mg/kg; Zn: 35mg/kg) trong đậu đóng vai trò quan trọng trong các hoạt động sinh học.
Nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng tiêu thụ đậu có thể cải thiện sức khỏe, bao gồm giảm nguy cơ bệnh chuyển hóa và tim mạch, hạ mức cholesterol trong huyết thanh, kiểm soát đường huyết, và ngăn ngừa ung thư đại tràng, vú và tuyến tiền liệt nhờ vào các chất phi dinh dưỡng có trong đậu (Los và cộng sự, 2018).
1.2.1 Protein Đậu đen cũng là một nguồn cung cấp protein dồi dào với hàm lượng protein trung bình từ 21,1 – 39,4% Cây họ đậu có thể sản sinh ra nhiều protein vì nhìn chung chúng được nuôi dưỡng và hấp thụ tốt với nitơ, ngay cả trong đất có chứa các loại nitơ phi protein Rễ cây họ đậu có khả năng hình thành các liên kết cộng sinh với các loài vi sinh vật cụ thể Sự cộng sinh này cho phép thực vật dễ dàng thu nhận nitơ trong khí quyển và sử dụng nó để tổng hợp các amino acid (Alain và cộng sự, 2013) Hàm lượng protein trong hạt họ đậu chịu sự chi
Peptide được hình thành từ sự phối hợp giữa kiểu gen và môi trường, được giải phóng trong cơ thể thông qua quá trình thủy phân protein trong tiêu hóa Ngoài ra, peptide cũng có thể được sản xuất bằng cách thủy phân protein có kiểm soát thông qua enzyme hoặc vi sinh vật phân giải protein, cũng như thông qua quá trình lên men.
Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng peptide trong đậu có khả năng kháng khuẩn, chống oxy hóa, chống huyết khối và hạ huyết áp Các nghiên cứu in vivo và in vitro cho thấy peptide có thể ức chế các enzyme liên quan đến bệnh mãn tính, như DPP-IV, α-amylase và α-glucosidase, có liên quan đến bệnh tiểu đường loại 2, cũng như men chuyển angiotensin (ACE), liên quan đến tăng huyết áp Đặc tính sinh học quan trọng của peptide là khả năng ức chế ACE, một enzyme quan trọng trong việc kiểm soát huyết áp.
Angiotensin II đóng vai trò quan trọng trong việc tăng huyết áp, vừa hoạt động như một chất co mạch, vừa làm giảm hoạt động của bradykinin, một chất giãn mạch Nghiên cứu của Ruiz-Ruiz và cộng sự cho thấy hoạt tính ức chế men của đậu cao hơn khi trọng lượng phân tử của peptide thấp hơn Ngoài ra, các peptide có trọng lượng phân tử thấp cũng thể hiện khả năng ức chế α-amylase và tính chống oxy hóa tốt hơn so với các peptide có trọng lượng phân tử cao.
Các peptide trong đậu cũng có thể liên quan đến việc kiểm soát bệnh tiểu đường loại
Các hormone DPP-IV, GIP và GLP-1 đóng vai trò quan trọng trong việc cân bằng nội môi glucose, làm chậm quá trình làm rỗng dạ dày và kiểm soát sự thèm ăn Nghiên cứu của Oseguera và cộng sự cho thấy peptide trong đậu có khả năng ức chế sự tích tụ lipid trong tế bào mỡ và hỗ trợ kiểm soát hấp thụ glucose bằng cách kích thích tuyến tụy tiết insulin.
Peptide đậu có khả năng ngăn ngừa tình trạng tăng đường huyết bằng cách ức chế các chất vận chuyển glucose như GLUT 2 và SGLT1, đồng thời giảm cholesterol máu thông qua việc ức chế thụ thể cholesterol Niemann-Pick C1 Like-1 (NPC1L1) Nghiên cứu của Mojica và cộng sự đã chỉ ra rằng protein đậu đen và peptide có tác động tích cực đến sự hấp thụ glucose, với mức đường huyết sau ăn giảm từ 22,7% đến 47,7% ở chuột Wistar mắc bệnh tiểu đường (Los và cộng sự, 2018).
1.2.2 Tinh bột và chất xơ
Các loại đậu thông thường là nguồn cung cấp chất xơ phong phú, với hàm lượng xơ gấp hai đến ba lần so với các thực phẩm khác trên 100g Tinh bột kháng và chất xơ trong đậu, cùng với các sản phẩm lên men, có vai trò quan trọng trong việc bảo vệ sức khỏe đường tiêu hóa, đặc biệt là ruột kết (Los và cộng sự, 2018).
Tinh bột đậu có hàm lượng amylose cao hơn so với hầu hết các loại tinh bột thông thường, ảnh hưởng đến khả năng tiêu hóa của nó Khả năng tiêu hóa tinh bột cũng bị ảnh hưởng bởi acid phytic, tannin và chất ức chế -amylase từ đậu Nghiên cứu của Demiate và cộng sự cho thấy hàm lượng amylose trong tinh bột từ các loại đậu khác nhau dao động từ 27,0% đến 35,9% Kết quả chỉ ra sự khác biệt về khả năng tiêu hóa tinh bột giữa các loại đậu, với đậu tây trắng có hàm lượng tinh bột kháng cao nhất (7,2%) và đậu đỏ có hàm lượng tinh bột tiêu hóa nhanh thấp nhất (89,7%) (Los và cộng sự, 2018).
Các loại đậu chứa một lượng lớn carbohydrate (55–65%), chủ yếu là tinh bột và oligosaccharides Trong đó, một phần polysaccharide được tiêu hóa chậm và một phần không được tiêu hóa, bao gồm tinh bột kháng và chất xơ có khả năng lên men trong ruột già So với ngũ cốc như ngô, lúa mì và gạo, đậu có lượng tinh bột kháng cao hơn đáng kể, điều này có thể liên quan đến hàm lượng amylose, chiều dài chuỗi nhánh amylopectin, mức độ kết tinh và kích thước hạt tinh bột Ngoài ra, hàm lượng chất xơ cao cùng với các chất ức chế amylase và phytate cũng góp phần làm giảm tốc độ và mức độ tiêu hóa tinh bột Sự hiện diện của chất xơ và tỷ lệ tinh bột tiêu hóa chậm cao hơn so với các thực phẩm giàu carbohydrate khác giúp đậu có chỉ số đường huyết thấp (Los và cộng sự, 2018).
Các hợp chất phenolic trong đậu bao gồm flavonoid, anthocyanins, flavonols, flavanols, isoflavone, flavanones, proanthocyanidins và tannin, cùng với nhiều acid phenolic Chúng tồn tại ở dạng tự do và được chiết xuất chủ yếu bằng dung môi ưa nước Ngoài ra, các hợp chất này có thể ở dạng liên hợp không hòa tan, kết hợp với oligosaccharide và peptide hòa tan, và dạng liên kết không hòa tan được ester hóa với polysaccharides của thành tế bào Nghiên cứu của Chen và cộng sự cho thấy flavonoid chủ yếu ở dạng tự do, trong khi acid phenolic thường ở dạng liên hợp và liên kết.
Hàm lượng các hợp chất phenolic trong các giống đậu dao động từ 7 đến 59%, từ 28 đến 76%, và từ 8 đến 18% cho phenolic tự do, liên hợp và liên kết Giusti và cộng sự đã xác định hàm lượng các hợp chất phenolic, bao gồm acid gallic (3,1–7,1 mg/kg), acid chlorogenic (24–239,2 mg/kg), catechin (10–614,3 mg/kg), epicatechin (17,7–279,2 mg/kg), acid syringic (3,7–12,6 mg/kg), kaempferol-3-glucoside (24,5–1486,3 mg/kg), và acid ferulic (1,7–21,5 mg/kg) Đặc biệt, chỉ có đậu đen chứa anthocyanins với tổng hàm lượng 649,5 mg/kg, bao gồm delphinidin 3,5-diglucoside và cyanidin-3-glucoside (Los và cộng sự, 2018).
López và đồng nghiệp cho biết đậu đen thô chứa hàm lượng hợp chất phenolic cao nhất, đặc biệt là anthocyanins Tuy nhiên, sau khi đun sôi, hàm lượng này giảm 68% Đáng chú ý, sau bảy ngày nảy mầm, tổng nồng độ anthocyanins trong đậu nảy mầm tương đương với đậu thô Guajardo-Flores và cộng sự cũng phát hiện rằng hàm lượng phenolic và hoạt tính chống oxy hóa trong hạt đậu đen nảy mầm đạt mức cao nhất vào ngày thứ ba của quá trình nảy mầm.
Các chế phẩm từ protein
Protein Concentrate là một loại chế phẩm protein với hàm lượng protein thấp nhất trong các sản phẩm phổ biến hiện nay Hàm lượng protein trong chế phẩm này thường dao động từ 60% đến 90%.
PC được sản xuất bằng cách loại bỏ carbohydrate hòa tan và một số hợp chất tạo hương từ bột đã khử chất béo thông qua ba quá trình chính: rửa trôi acid (pH đẳng điện 4,5), tách chiết trong dung dịch cồn (60-80%) và rửa với nước nhiệt ẩm Trong các phương pháp này, protein không hòa tan trong khi một phần carbohydrate vẫn hòa tan, cho phép tách chúng bằng ly tâm Chất rắn thu được chủ yếu là protein và carbohydrate không hòa tan, sau đó được phân tán trong nước, trung hòa đến pH 7,0 nếu cần, và được sấy phun để tạo ra PC (M Guo, 2009) Hiện nay, các dạng protein concentrate phổ biến bao gồm Whey protein concentrate (WPC), Leaf protein concentrate (LPC) và Fish protein concentrate (FPC).
Protein Isolate có hàm lượng protein > 85% bao gồm cả hàm lượng ẩm và do đó, là dạng protein tinh khiết hơn so với sản phẩm Protein Concentrate (Aluko, 2017)
Quy trình sản xuất PI bao gồm các bước quan trọng nhằm nâng cao độ tinh khiết của protein Đầu tiên, cần xác định và thu nhận nguồn protein, sau đó tiến hành chiết xuất từ nguồn đó.
Protein Isolate được tách khỏi các thành phần không phải protein như nucleic acid và lipid, sau đó phân tách thành các phần nhỏ chứa các protein khác nhau, sử dụng các kỹ thuật phân giải tốt như sắc ký để cung cấp sản phẩm cuối cùng (Grant, 2016) Với các đặc tính chức năng tốt như khả năng tạo nhũ, đặc tính tạo sợi và khả năng hòa tan trong nước, Protein Isolate từ hạt bông vải cho thấy tiềm năng ứng dụng lớn Hạt bông vải có thành phần 5,05% độ ẩm, 93,1% protein thô, 0,03% gossypol tự do, 0,27% gossypol tổng số, và tổng số vi khuẩn là 1295 cfu/g mà không có sự hiện diện của vi khuẩn gây bệnh Do đó, hạt bông vải có thể được sử dụng như một thành phần trong ngành công nghiệp thực phẩm, làm chất bổ sung cho các loại thực phẩm khác nhau, vì đã vượt qua tất cả các tiêu chuẩn chất lượng quan trọng theo Quy định Tiêu chuẩn và An toàn Thực phẩm, 2011 (Kumar và cộng sự, 2022).
Sản phẩm Protein Hydrolysates được tạo ra thông qua quá trình thủy phân toàn bộ nguồn protein bằng enzyme thích hợp trong điều kiện kiểm soát Sau đó, các peptide có hoạt tính sinh học mạnh được phân lập qua quá trình xử lý sau thủy phân (M Nasri, 2017).
Sản phẩm thủy phân protein thực phẩm có nhiều ứng dụng quan trọng, chẳng hạn như sử dụng làm chất tăng cường nitơ trong các loại đồ uống chuyên dụng và làm thành phần tiêu hóa trước cho dinh dưỡng qua đường tiêu hóa.
Các chế phẩm peptide được làm giàu cho chức năng sinh lý có lợi, được sử dụng trong môi trường nuôi cấy tế bào và sản phẩm chăm sóc sức khỏe, phụ thuộc vào tính đặc hiệu của enzyme và mức độ thủy phân đạt được Quá trình thủy phân không chỉ cải thiện tính chất hòa tan, nhũ tương, tạo bọt và gel hóa mà còn giảm khả năng gây dị ứng bằng cách phá hủy các biểu mô gây dị ứng Protein thực phẩm, ngoài giá trị dinh dưỡng, còn là nguồn peptide đa chức năng với hoạt động sinh học phong phú Nghiên cứu cho thấy việc bổ sung chất thủy phân protein capelin làm giảm sản phẩm oxy hóa thứ cấp và cải thiện đặc tính dinh dưỡng của thực phẩm Việc bổ sung chất thủy phân protein trong bánh mì trắng và kem cà rốt cũng dẫn đến sản phẩm có hoạt tính ức chế men chuyển tốt hơn, trong khi GPH xử lý bằng protease trong xúc xích thịt gà tây cải thiện hoạt tính chống oxy hóa.
Protein Hydrolysates được sử dụng để duy trì tình trạng dinh dưỡng cho những cá nhân có nhu cầu dinh dưỡng đặc biệt mà thực phẩm thông thường không đáp ứng Ngoài ra, chúng còn được áp dụng trong thể thao như một chất bổ sung năng lượng cao, giúp tối đa hóa quá trình đồng hóa protein cơ bắp cho các vận động viên khỏe mạnh.
Một số tính chất hóa lý của protein concentrate
Các đặc tính chức năng của protein được phân loại theo ba nhóm chính: (1) các đặc tính liên quan đến hydrate hóa, bao gồm khả năng hấp thụ nước và dầu, cũng như độ hòa tan; (2) các đặc tính liên quan đến cấu trúc protein; và (3) các đặc tính lưu biến, như độ nhớt.
Các đặc tính chức năng của protein trong chế biến thực phẩm bao gồm độ hòa tan, khả năng hấp thụ nước, hấp thụ béo, tính chất nhũ hóa, khả năng tạo bọt và tạo gel Những yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động chức năng của protein bao gồm kích thước, hình dạng, thành phần và trình tự amino acid, điện tích tổng, cấu trúc acid kỵ nước, và độ cứng của phân tử khi phản ứng với môi trường bên ngoài như độ ẩm, nhiệt độ và nồng độ muối Đặc biệt, tính hòa tan của protein là yếu tố quan trọng nhất, vì nó cần thiết để protein có thể được áp dụng trong hệ thống thực phẩm Các đặc tính chức năng như tạo nhũ tương, tạo bọt và tạo gel đều phụ thuộc vào khả năng hòa tan của protein (Klupšaitė và Juodeikienė, 2015).
3.1 Khả năng hấp thụ nước và dầu
Khả năng hấp thụ nước (WAC) là chỉ số phản ánh tổng lượng nước mà một gam bột protein có thể hấp thụ, dựa trên sự tương tác giữa các phân tử protein với nước và các chất hòa tan khác (Aryee và cộng sự, 2018).
Khả năng hấp thụ chất béo (FAC) đo lường lượng dầu hấp thụ trên mỗi đơn vị khối lượng bột protein Hàm lượng amino acid không phân cực cao trong protein thực vật rất quan trọng cho việc liên kết các chuỗi hydrocarbon, ảnh hưởng lớn đến FAC Các yếu tố như nguồn protein, kích thước, nồng độ, số lượng amino acid không phân cực, phương pháp chế biến và tương tác protein-lipid đều tác động đến FAC Bột protein có mật độ thấp và kích thước nhỏ có khả năng hấp thụ và giữ lại nhiều chất béo hơn so với bột protein mật độ cao và kích thước lớn (Aryee và cộng sự, 2018).
Mối quan hệ giữa nước/dầu và sản phẩm phụ thuộc vào các đặc tính chức năng của chúng Nhiều thí nghiệm đã chỉ ra rằng protein và polysaccharides có ảnh hưởng lớn đến khả năng hấp thụ nước Các yếu tố như nồng độ protein, thành phần dung dịch xung quanh và bề mặt phân cách đều tác động đến các đặc tính chức năng của protein Diện tích bề mặt cụ thể bị ảnh hưởng bởi các thông số cấu trúc như tổng thể tích lỗ, độ xốp, khoảng cách lỗ trung bình, kích thước trung bình của hạt, phân bố kích thước hạt và sự hiện diện của các hạt mịn (Kakar và cộng sự, 2022).
3.2 Độ hòa tan Độ tan mô tả khả năng hòa tan của một chất tan trong dung môi (Aryee và cộng sự,
Độ hòa tan của protein là một trong những đặc tính chức năng quan trọng nhất, vì nó cần thiết để protein có thể được sử dụng hiệu quả trong các hệ thống thực phẩm Ngoài ra, các đặc tính chức năng khác như khả năng tạo nhũ cũng đóng vai trò quan trọng trong ứng dụng của protein trong ngành thực phẩm.
Độ hòa tan của protein ảnh hưởng đến khả năng tạo bọt và tạo gel, được xác định bởi sự cân bằng giữa các tương tác ưa nước và kỵ nước Sự hòa tan này chủ yếu phụ thuộc vào thành phần bề mặt của protein, bao gồm tỷ lệ amino acid phân cực và không phân cực, từ đó ảnh hưởng đến nhiệt động học của các tương tác giữa protein với nhau và với dung môi.
Độ hòa tan của protein thường rất thấp trong khoảng pH từ 4 đến 6, nhưng sẽ tăng mạnh khi pH chuyển sang môi trường acid, trung tính hoặc kiềm Các yếu tố như pH, nhiệt độ, nồng độ ion, cũng như quá trình đông lạnh, gia nhiệt và làm khô đều ảnh hưởng đến độ hòa tan của protein (Klupšaitė và Juodeikienė, 2015) Ngoài ra, trình tự và thành phần amino acid, kích thước phân tử, cấu trúc và tỷ lệ phân cực của amino acid cũng có tác động đáng kể đến độ hòa tan của protein (Kakar và cộng sự, 2022).
3.3 Khả năng tạo bọt và tính nhũ hóa
Tính tạo nhũ và khả năng tạo bọt của protein trong thực phẩm là hai chức năng quan trọng, nhờ vào bản chất lưỡng tính của chúng với các amino acid phân cực và không phân cực Protein hoạt động như chất nhũ hóa bằng cách hấp phụ tại bề mặt phân cách, tạo ra màng ổn định và phân tán hai lớp Nhũ tương (dầu - nước) và bọt (không khí - nước) được hình thành khi các giọt dầu phân tán trong môi trường nước hoặc khi các bọt khí được bao quanh bởi màng Sự ổn định của cả hai hệ thống này phụ thuộc vào khả năng ngăn chặn sự kết tụ, keo tụ và lắng đọng trong nhũ tương, cũng như độ bền của các phân tử bọt khí trong hệ bọt (Kakar và cộng sự, 2022).
Tính chất nhũ hóa được xác định qua chỉ số hoạt động nhũ hóa (EAI) và chỉ số ổn định nhũ hóa (ESI) EAI đo lường lượng dầu có thể tạo nhũ tương trên mỗi đơn vị protein, trong khi ESI đánh giá khả năng kháng của nhũ tương theo thời gian Sự ổn định cao của nhũ tương thường liên quan đến sự hình thành các liên kết disulfide giữa các protein bị hấp phụ, trong khi sự ổn định yếu có thể do lực đẩy tĩnh điện giữa các phân tử hấp phụ, dẫn đến sự tách rời và hình thành các liên kết disulfide.
Sự tạo bọt được xác định bởi độ giãn nở, dung tích và độ ổn định của bọt, phụ thuộc vào cấu trúc và thành phần của protein Bọt hình thành qua sự thay đổi trạng thái và hấp thụ protein tại bề mặt phân cách giữa không khí và nước, cùng với sự hình thành màng xung quanh bọt khí Các loại protein khác nhau có khả năng tạo bọt và ổn định bọt khác nhau, và để đạt được đặc tính tạo bọt cao, protein cần có những đặc điểm nhất định.
Các protein cần có khả năng hòa tan cao trong pha lỏng và tạo màng nhanh chóng xung quanh bọt khí Đặc tính tạo bọt của chúng bị ảnh hưởng bởi các yếu tố bên ngoài như pH, nhiệt độ và nồng độ ion Ngoài ra, protein cũng cần hình thành các liên kết mạnh như liên kết hydro và tương tác kỵ nước (Kakar và cộng sự, 2022).
Sự tạo gel của protein đóng vai trò quan trọng trong thực phẩm, ảnh hưởng đến cấu trúc và độ đàn hồi Khả năng gel hóa được xác định bởi nồng độ gel hóa tối thiểu Gel hóa protein có thể xảy ra do nhiệt, hóa chất hoặc enzyme Khi gel hóa xảy ra ở nhiệt độ cao và pH trung tính, loại gel hình thành phụ thuộc vào tương tác tĩnh điện, với nồng độ ion thấp tạo gel dạng hạt và nồng độ cao tạo gel sợi mịn Kích thước mạng lưới gel ảnh hưởng đến các đặc tính chức năng khác của protein, với mạng lưới lớn có WAC thấp hơn.
Sự hình thành gel xảy ra khi các protein biến tính tập hợp và tạo thành mạng lưới có trật tự, với các liên kết không thể đảo ngược thông qua cầu nối disulfide, liên kết hydro và tương tác kỵ nước Khi nồng độ protein đủ cao, một mạng lưới ba chiều được hình thành, ổn định nhờ vào các tương tác hydro và kỵ nước Quá trình gel hóa chịu ảnh hưởng của trọng lượng phân tử, pH, nhiệt độ và cường độ ion, cũng như nồng độ protein trong trường hợp gel hóa do enzyme.
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
Vật liệu
Nghiên cứu này sử dụng đậu đen từ Công ty TNHH Thương mại dịch vụ Xuân Hồng, có địa chỉ đóng gói tại lô 97-105, 98-106, đường số 3, KCN Sóng Thần 1, Phường Dĩ An, Thị xã Dĩ An, Tỉnh Bình Dương.
Chế phẩm enzyme Celluclast 1.5L (700 EGU/g [endoglucanase unit/g], Novozyme, Đan mạch) từ nấm Trichoderma reesi Chế phẩm có hoạt tính cellulases Enzyme hoạt động ở pH 4.5 – 6, nhiệt độ 50 – 60 o C
Chế phẩm enzyme Pectinex Ultra SP-L (3300 PECTU/g [pectin lyase unit/g], Novozyme, Đan mạch) từ nấm Aspergillus aculeatus Chế phẩm có hoạt tính pectolytic Enzyme hoạt động ở pH 3.5 – 5.5, nhiệt độ 25 – 55 o C.
Phương pháp sản xuất protein concentrate từ đậu đen (PCBB)
2.1 Phương pháp sản xuất bột đậu đen thô
Hình 3.1 Quy trình sản xuất bột đậu đen
Bột đậu đen thô được sản xuất theo phương pháp đã công bố, với một số điều chỉnh để phù hợp với điều kiện nghiên cứu (Okafor và cộng sự, 2015) Quá trình sản xuất bắt đầu bằng việc ngâm hạt đậu đen trong nước với tỉ lệ 1:5 (w:v) trong 2 giờ, sau đó tiến hành loại bỏ vỏ hạt một cách thủ công.
Hạt đã được tách vỏ và sấy đối lưu ở nhiệt độ 55 độ C trong 24 giờ Sau đó, hạt được xay thành bột mịn bằng máy xay gia dụng và rây qua lưới 150 mesh với kích thước hạt khoảng 0,104 mm để thu được sản phẩm bột thô.
2.2 Phương pháp sản xuất bột đậu đen tách béo
Hình 3.2 Quy trình sản xuất bột đậu đen tách béo (deffated)
Bột đậu đen tách béo được sản xuất theo phương pháp đã công bố, với điều chỉnh phù hợp cho nghiên cứu (Okafor và cộng sự, 2015) Quá trình sản xuất bắt đầu bằng việc ngâm bột đậu đen thô trong ethanol 96% với tỉ lệ đậu:ethanol là 1:2 (w:v) và khuấy liên tục trong 12 giờ Sau đó, huyền phù được ly tâm ở 6000 rcf trong 15 phút để thu nhận phần cặn Cuối cùng, phần cặn này được xử lý thêm ba lần bằng cách ngâm với ethanol 96% theo tỉ lệ tương tự.
Trộn đều tỷ lệ 1:2 (w:v) và tiếp tục đảo trộn trong 30 phút, sau đó thực hiện ly tâm ở tốc độ 6000 rcf trong 15 phút để thu nhận phần cặn Cuối cùng, phần cặn thu được sẽ được sấy đối lưu ở nhiệt độ 55 độ C trong 24 giờ để tạo ra bột đậu đen tách béo.
2.3 Phương pháp sản xuất bột protein concentrate đậu đen (PCBB)
Phương pháp sản xuất Protein Concentrate đã được điều chỉnh dựa trên nghiên cứu của Okafor và cộng sự (2015) cùng Alain và cộng sự (2013) Bột đậu đen khử chất béo được trộn với dung dịch 0.15M NaCl theo tỷ lệ 1:10 (w:v), sau đó điều chỉnh pH về 11 bằng 1N NaOH và khuấy trong 2 giờ.
Mẫu được ly tâm ở tốc độ 6000 rcf trong 15 phút, sau đó phần dịch nổi phía trên được xử lý bằng ethanol 96% với tỷ lệ 1:2 (v:v) và điều chỉnh pH về 4.5 bằng 1N HCl Sau khi khuấy đều, mẫu được bảo quản ở nhiệt độ 5 °C trong 12 giờ Các protein kết tủa được thu hồi bằng cách ly tâm ở tốc độ 6000 rcf trong 15 phút và rửa lại với ethanol 70%, quy trình này được lặp lại 3 lần Cuối cùng, Protein Concentrate được sấy khô ở 55 °C trong 24 giờ trong tủ sấy đối lưu không khí.
Hình 3.3 Quy trình sản xuất protein concentrate đậu đen
2.4 Phương pháp nâng cao hàm lượng protein của Protein Concentrate từ đậu đen
Hình 3.4 Quy trình nâng cao hàm lượng protein của protein concentrate đậu đen
Huyền phù hóa PCBB trong 50 mM đệm citrate pH 4.5 với tỷ lệ PCBB:đệm citrate
= 1:10 (w:v) và được khuấy từ trong bể ổn nhiệt ở nhiệt độ 50 o C Enzyme được thêm vào để bắt đầu quá trình thủy phân với tỷ lệ enzyme cellulase:PCBB = 1:5 (v:w) và enzyme
Pectinase được sử dụng với tỷ lệ PCBB là 1:5 (v:w) trong thời gian phản ứng 8 giờ Hỗn hợp huyền phù được đun cách thủy ở 95 o C trong 30 phút để kết thúc phản ứng thủy phân enzyme, sau đó ly tâm ở 6000 rcf trong 15 phút Phần lắng sau ly tâm được xử lý bằng ethanol 96% với tỷ lệ phần lắng:ethanol là 1:2 (w:v) và pH được điều chỉnh về 4.5 bằng dung dịch 1N HCl, sau đó để ở 5 o C trong 12 giờ Các protein kết tủa được thu hồi bằng cách ly tâm ở 6000 rcf trong 20 phút, sau đó rửa lại với ethanol 70% và ly tâm ở 6000 rcf trong 15 phút, lặp lại quá trình rửa và ly tâm 3 lần Cuối cùng, protein concentrate tinh sạch được sấy khô ở 50 o C trong 48 giờ trong tủ sấy đối lưu không khí.
3 Phương pháp xác định hoạt độ enzyme
3.4.1 Xác định hoạt độ enzyme cellulase
Hoạt độ enzyme cellulase (Endoglucanase) được xác định qua quá trình thủy phân Carboxymethylcellulose (CMC) để giải phóng glucose Để thực hiện, 0,5 ml enzyme được pha loãng với dung dịch đệm Sodium citrate (50 mM, pH 4.5) và cho vào ống nghiệm Các nồng độ enzyme khác nhau sẽ giải phóng lượng glucose khác nhau, được xác định bằng phương pháp đo lượng đường khử với thuốc thử DNS Dịch enzyme được đun nóng trong nồi cách thủy ở 50°C trong 5 phút, sau đó thêm 0,5 ml dung dịch CMC 2% và ủ trong bể điều nhiệt ở 50°C trong 30 phút Sau khi thêm 3,0 ml thuốc thử DNS, hỗn hợp được đun sôi trong 5 phút Cuối cùng, các ống nghiệm được pha loãng với nước cất và độ hấp thụ được đo ở bước sóng 540 nm, sử dụng đường chuẩn glucose với nồng độ từ 0.2 – 1 mg/ml để xác định nồng độ enzyme thích hợp giải phóng 0,5 mg glucose từ CMC trong 30 phút.
3.4.2 Xác định hoạt độ enzyme pectinase
Hoạt độ pectinase được xác định theo phương pháp đã được công bố (Jalil và Ibrahim, 2021; Torimiro và cộng sự, 2019) Enzyme pectinase được pha loãng đến nồng độ 0.5 ml, sau đó thêm vào 1 ml pectin 1% trong đệm sodium citrate (50 mM, pH 4.5) trong ống nghiệm Hỗn hợp này được ủ ở nhiệt độ 50 °C trong 30 phút Sau khi ủ, 3 ml DNS được thêm vào để kết thúc phản ứng, và các ống nghiệm được đun cách thủy trong 5 phút trước khi làm nguội về nhiệt độ phòng.
Hoạt độ enzyme được xác định bằng cách đo độ hấp thụ ở bước sóng 540 nm, cho phép xác định lượng đường khử được giải phóng Để định lượng lượng đường khử, sử dụng D-galacturonic acid làm đường chuẩn Lượng enzyme cần thiết để giải phóng 1 µmol đường khử mỗi phút dưới điều kiện thí nghiệm được tính toán theo phương pháp này (Karthik và cộng sự, 2011).
Phương pháp phân tích thành phần hóa học của P-PCBB
Hàm lượng ẩm trong protein concentrate đậu đen được xác định theo phương pháp AOAC 925.09
Hàm lượng protein trong protein concentrate đậu đen được xác định theo phương pháp Kjeldahl AOAC 979.09
Hàm lượng các amino acid trong protein concentrate đậu đen được xác định theo phương pháp AOAC 994.12
Hàm lượng chất béo trong protein concentrate đậu đen tinh sạch được xác định theo phương pháp Soxhlet AOAC 4.5.01.16
Hàm lượng tro trong protein concentrate đậu đen tinh sạch được xác định theo phương pháp AOAC 923.03
Tổng hàm lượng carbohydrate trong protein concentrate đậu đen tinh sạch được xác định theo phương pháp AOAC 988.12.
Phương pháp điện di (SDS)
SDS-PAGE được thực hiện theo phương pháp đã được mô tả trước đây với một số điều chỉnh phù hợp với điều kiện thí nghiệm (Abdurrhman, 2014)
Khay đúc gel được lắp ráp bằng cách ghép các tấm kính với nhau qua một miếng đệm, trong đó một dải cao su được đặt ở đáy khay và các tấm kính được đặt lên trên Các vít trên khay được siết chặt để giữ cho các tấm kính ổn định, trong khi khoảng trống giữa chúng được đổ đầy nước để ngăn ngừa rò rỉ Cuối cùng, một chiếc lược được cắm vào giữa các tấm kính và được đánh dấu để đảm bảo gel được lấp đầy đến độ cao mong muốn.
To prepare the resolving gel (12.5%) for electrophoresis, mix 1.5 ml of 1.5M Tris-HCl buffer at pH 8.8, 1.9 ml of distilled water, 2.5 ml of 30% acrylamide solution, 60 µl of 10% SDS, 27 µl of 10% ammonium persulphate (APS), and 4.5 µl of N,N,N',N'-tetramethylethane-1,2-diamine (TEMED).
Lắc nhẹ để tạo thành dung dịch đồng nhất, sau đó dùng micropipette bơm dung dịch vào khuôn sao cho không tạo bọt khí, đến khi cao khoảng 5-8 cm Nhẹ nhàng cho một lớp nước cất lên gel và chờ cho gel cứng lại trong khoảng 15-20 phút Chuẩn bị gel gom (Stacking gel) ở cực âm với nồng độ 4%, bao gồm các thành phần: đệm Tris-HCL pH 6.8 (620 µl), nước cất 2 lần (1.37 ml), dung dịch acrylamide 30% (500 µl), dung dịch SDS 10% (25 µl), APS 10% (12.5 µl), và TEMED (2.5 µl) Lắc nhẹ cho tan hết thành dung dịch đồng nhất Sau khi gel phân tách đã đông cứng hoàn toàn, hút lớp nước bên trên ra và dùng micropipette bơm dung dịch lên trên lớp gel phân tách mà không tạo bọt khí Cuối cùng, đưa lược vào gel để tạo giếng và khi gel đông cứng hoàn toàn thì lấy lược ra.
Để tiến hành điện di, trước tiên lắp khuôn gel vào bộ điện di và cho dung dịch đệm vào buồng điện di Tiếp theo, cho 5-15 µl dung dịch mẫu vào các giếng theo thứ tự, sau đó đậy hộp điện di và đóng mạch ở điện thế 100 V Quá trình điện di diễn ra trong khoảng 2 giờ ở nhiệt độ phòng với dòng điện không đổi 30 mA Sau khi hoàn tất, lấy gel ra và ngâm trong dung dịch nhuộm màu protein (gồm 5% aluminum sulfat hydrat, 10% ethanol, 0.02% Coomassie Brilliant Blue-G250, và 2% orthophosphoric acid) qua đêm trên máy lắc, lắc nhẹ trong 30 phút đến 1 giờ Cuối cùng, chuyển gel sang dung dịch rửa mẫu, thay dung dịch vài lần cho đến khi gel trong suốt và xuất hiện các băng protein màu xanh lơ.
❖ Phương pháp xác định khối lượng phân tử các phân đoạn protein trên SDS-PAGE (Hames, 1998):
Bước 1: Xác định Rf bằng đồ thị
- Sử dụng thước đo để đo khoảng cách di chuyển từ đỉnh của gel phân giải đến từng điểm chuẩn
- Tính Rf của mỗi điểm chuẩn theo công thức:
Bước 2: Sử dụng chương trình vẽ biểu đồ Rf so với log MW (kDa) để xác định đường hồi quy bậc 1, với công thức log Mw = a × Rf + b Từ đường hồi quy này, có thể tính toán Mw của các phân đoạn protein trên SDS-PAGE.
Phương pháp xác định tính chất hóa lý và lưu biến của P-PCBB
Hiệu suất sản xuất (H) của P-PCBB được xác định bằng công thức: H (%) 𝑚 1
𝑚 0 × 100 Trong đó m1 và mo lần lượt là khối lượng đậu đen (g) và P−PCBB (g)
Hiệu suất protein (PY) của P-PCBB được xác định bằng công thức: PY (%) 𝐻×𝑃 1
𝑃 × 100 Trong đó H, P1, P là hiệu suất sản xuất của P-PCBB (%), hàm lượng protein của P-PCBB (%) và hàm lượng protein ban đầu của đậu đen (%)
Mật độ khối (BD) của mẫu P-PCBB được xác định theo phương pháp đã được công bố (Abdurrhman và Akasha, 2014) Để tính toán BD, mẫu P-PCBB được đổ đầy đến thể tích 10 ml trong ống đong, và thể tích này được sử dụng làm thể tích mẫu Sau đó, ống đong chứa mẫu P-PCBB được cân lại, và mật độ khối được tính toán dựa trên sự khác biệt về trọng lượng theo công thức: BD (g/ml).
𝑉 Trong đó, W2, W1 và V lần lượt là khối lượng của ống đong + mẫu (g), khối lượng ống đong (g) và thể tích của mẫu (ml)
6.3 Khả năng hấp thụ nước (WAC)
Khả năng hấp thụ nước được xác định theo phương pháp đã được công bố (Amza và cộng sự, 2011) với một số điều chỉnh cho phù hợp với điều kiện thí nghiệm Đầu tiên, cân 1,0 g P-PCBB cho vào ống nghiệm, sau đó thêm 10 ml nước cất vào mẫu và trộn đều trong 2 phút Hỗn hợp này được ủ trong 30 phút ở nhiệt độ phòng và sau đó được ly tâm ở mức 3000 rcf.
Khả năng hấp thụ nước được xác định sau 20 phút, với phần dịch nổi phía trên được thu lại và đo Công thức tính khả năng hấp thụ nước là: WAC = W1 – W2, trong đó WAC là độ hấp thụ nước (g/g), W1 là khối lượng nước cất ban đầu (g), và W2 là khối lượng nước cất thu được sau ly tâm (g).
6.4 Khả năng hấp thụ chất béo (FAC)
Khả năng hấp thụ chất béo được xác định theo phương pháp đã được điều chỉnh cho phù hợp với điều kiện nghiên cứu (Amza và cộng sự, 2011) Cụ thể, 1,0 g P-PCBB được khuấy trộn với 10 ml dầu olive trong 2 phút, sau đó hệ nhũ tương được ủ ở nhiệt độ phòng trong 30 phút Tiếp theo, mẫu được ly tâm ở mức 3000 rcf trong 20 phút và phần dịch nổi được thu lại Khả năng hấp thụ chất béo được tính theo công thức: FAC = W 1 − W 2.
21 đó W1, W2, W0 lần lượt là thể tích dầu ban đầu (ml), thể tích dầu thu được sau ly tâm (ml) và khối lượng của mẫu thử (g)
Chỉ số trương nở của P-PCBB được xác định theo phương pháp đã được mô tả bởi Ogunyinka và cộng sự (2017) Đầu tiên, 1.0 g P-PCBB được cân và cho vào ống đong 25 ml, sau đó san phẳng mẫu và ghi lại thể tích ban đầu Tiếp theo, 10 ml nước cất được thêm vào và để yên trong 1 giờ ở các mức nhiệt độ 30, 50, 70, và 90 °C Cuối cùng, thể tích của P-PCBB sau khi trương nở được ghi nhận và chỉ số trương nở được tính theo công thức: Chỉ số trương nở (ml/ml) = 𝐻 1.
H2 lần lượt là thể tích sau trương nở (ml) và thể tích ban đầu (ml) của mẫu
6.6 Khả năng tạo bọt và độ bền bọt
Khả năng tạo bọt được xác định dựa trên phương pháp đã được các tác giả trước đây công bố, với một số điều chỉnh để phù hợp với điều kiện nghiên cứu (Salvador và cộng sự).
Huyền phù P-PCBB được nghiên cứu với các nồng độ 0,5%; 1,0%; 1,5%; và 2% (w/v) Các huyền phù này được đồng hóa bằng thiết bị IKA T25 digital ULTRA-TURRAX® với tốc độ 9200 rpm trong 2 phút Khả năng tạo bọt được tính theo công thức: (%) Khả năng tạo bọt = V2 − V1.
V 1 x 100 là công thức tính thể tích dung dịch P-PCBB sau và trước khi đồng hóa (ml) Ảnh hưởng của pH đến khả năng tạo bọt được xác định bằng cách điều chỉnh pH của huyền phù 2% P-PCBB từ 2 đến 10 bằng HCl 0.1N (hoặc 1N) và NaOH 0,1N (hoặc 1N), sau đó tiến hành đo theo phương pháp đã mô tả.
6.7 Tính chất lưu biến của gel Protein Concentrate
Tính chất lưu biến của gel P-PCBB đã được nghiên cứu và điều chỉnh theo các phương pháp trước đó để phù hợp với đặc điểm của mẫu đo (Adebowale và Lawal).
2003 ; Tatar và cộng sự, 2015) Chuẩn bị huyền phù P-PCBB với các nồng độ 7, 10 và 13 (%, w/v) trong 10 ml đệm phosphate pH = 7.0 Các huyền phù protein được đun cách thủy
Gel protein được tạo ra bằng cách gia nhiệt ở 95 o C trong 60 phút, sau đó làm nguội về nhiệt độ phòng 30 o C Tính chất lưu biến của gel được đo bằng thiết bị Haake RheoStress1 (Thermo Scientific, Đức) với đầu đo PP 35Ti (đường kính 35 mm) và khoảng cách giữa đầu dò và đế là 1 mm.
Nghiên cứu được thực hiện với mẫu 22 ở các nhiệt độ 10, 30 và 60ºC, đo độ nhớt biểu kiến trong khoảng tốc độ trượt từ 1.0 đến 300 s\(^{-1}\) trong 180 giây Mối quan hệ giữa độ nhớt và tốc độ trượt được mô tả bằng mô hình Herschel Bulkley, với công thức: \(\sigma = K\dot{\gamma}^n + \sigma_o\), trong đó \(\sigma_o\) là ứng suất trượt (Pa), \(\dot{\gamma}\) là tốc độ trượt (s\(^{-1}\)), K là hằng số và n là hệ số dòng chảy.
Chỉ số hoạt động nhũ hóa (EAI) và chỉ số ổn định nhũ hóa (ESI) được xác định theo phương pháp đã công bố (Ogunwolu và cộng sự, 2009) Nhũ tương được tạo ra bằng cách trộn 5 g dung dịch P-PCBB 0,1g/100ml với 2 g dầu hạt cải trong ống ly tâm 50 mL, với pH được điều chỉnh ở các mức 2, 4, 6, 8, 10 bằng dung dịch HCl 0.1N và NaOH 0.1N Hỗn hợp này được đồng hóa ở tốc độ 6000 rpm trong 5 phút Sau đó, 50 μl nhũ tương được trộn với 5 ml dung dịch 0.1% Sodium Dodecyl Sulphate (SDS) và độ hấp thụ của hỗn hợp được đo ở bước sóng 500 nm bằng máy quang phổ UV-Vis (UH5300 Spectrophotometer, Hitachi – Nhật Bản) Chỉ số EAI (m²/g) được tính theo công thức: EAI = 2×2.303×𝐴₀ (Pearce và Kinsella, 1978).
Độ hấp thụ được xác định bằng công thức \(\Delta A = A_0 - A_{10}\), trong đó \(A_0\) là độ hấp thụ tại thời điểm 0 sau khi đồng hóa, \(W_0\) là khối lượng mẫu ban đầu (g), và \(A_{10}\) là độ hấp thụ sau 10 phút Thời gian thay đổi là \(\Delta t = 10\) phút.
Khả năng hòa tan được xác định theo phương pháp đã được công bố (Ogunwolu và cộng sự, 2009) Trong thí nghiệm, 100 mg P-PCBB được trộn với 10 ml nước cất, và pH của dung dịch được điều chỉnh ở các mức từ 2 đến 11 bằng dung dịch HCl 0.1N (hoặc 1N) và NaOH 0.1N (hoặc 1N) Hỗn hợp được khuấy ở nhiệt độ phòng trong 30 phút, sau đó ly tâm ở mức 7500 rcf trong 15 phút Hàm lượng protein trong dịch nổi thu được sau ly tâm được xác định bằng phương pháp Bradford (Bradford, 1976) Khả năng hòa tan được tính toán bằng công thức: (%) Khả năng hòa tan = Hàm lượng protein trong dịch nổi.
6.10 Xác định các nhóm chức bằng phép đo biến đổi hồng ngoại Fourier (FTIR)
Phương pháp đo quang phổ hồng ngoại được thực thiện theo phương pháp của Piotrowicz và Salas-Mellado (2017) Mẫu P-PCBB sẽ được đo phổ hồng ngoại FTIR bằng
Máy đo phổ hồng ngoại FTIR 4700 (Jasco, Nhật Bản) hoạt động trong dải số sóng từ 400 đến 4000 cm⁻¹, với quy trình vận hành và xử lý dữ liệu được điều khiển qua phần mềm trên PC Kết quả đo sẽ được trình bày dưới dạng biểu đồ sử dụng phần mềm Microsoft Excel 2016.
6.11 Phương pháp sắc kí lọc gel GPC
KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
Hiệu suất và thành phần hóa học
Bảng 4.1 Thành phần hóa học của PCBB và P-PCBB
Các số liệu có cùng chữ cái trong một hàng ngang không có sự khác biệt có ý nghĩa theo phân tích thống kê (p > 0,05) H đại diện cho hiệu suất sản xuất (%), trong khi PY biểu thị hiệu suất protein (%).
* Các chỉ tiêu hóa học được đo tại Công ty TNHH Eurofins Sắc Ký Hải Đăng
Hàm lượng protein của P-PCBB cao hơn PCBB lần lượt là 83.1% và 64.4% (p < 0.05), trong khi hiệu suất protein của P-PCBB (60.81%) thấp hơn PCBB (65.97%) (p < 0.05) Hàm lượng carbohydrate và xơ tổng của P-PCBB (7.8% và 5.55%) thấp hơn so với PCBB (18.4% và 12%) do quá trình thủy phân loại bỏ cellulose và pectin Protein của P-PCBB vượt trội so với protein concentrate đậu bắp (75.81%), đậu ngự (71.77%), đậu cô ve (62.83–78.15%) và đậu bambara (63.83–73.70%) Protein trong chế độ ăn uống rất quan trọng cho việc tổng hợp và duy trì mô cơ, enzyme và hormone (Ogunyinka và cộng sự, 2017) Với hàm lượng protein cao, P-PCBB có khả năng đáp ứng nhu cầu cung cấp protein cho con người Hàm lượng béo của P-PCBB và PCBB thấp hơn protein concentrate đậu que (2.39%) và đậu ngự (0.22%), điều này giúp giảm quá trình peroxide hóa (James và cộng sự, 2016) và có thể thay thế protein từ động vật có hàm lượng chất béo cao Hàm lượng tro tổng của PCBB (8.58%) cao hơn P-PCBB (p < 0.05).
Hàm lượng muối sau khi kết tủa protein có thể là nguyên nhân dẫn đến sự hiện diện của độ ẩm 1.06% trong P-PCBB, trong khi P-PCBB được rửa bằng ethanol nhiều lần giúp giảm hàm lượng tro Độ ẩm của P-PCBB và PCBB không khác biệt về mặt thống kê (p > 0.05) và đều thấp hơn so với protein concentrate đậu ngự (9.5%) (Pham và cộng sự, 2022) Độ ẩm thấp là yếu tố quan trọng trong việc bảo quản, vì nếu độ ẩm vượt quá 14%, sẽ có nguy cơ phát triển vi khuẩn và nấm mốc (Moses, 2012) Điều này cho phép protein concentrate được lưu giữ lâu dài mà không bị hư hỏng.
Sự thay đổi trong thành phần hóa học của protein concentrate từ các nguyên liệu khác nhau có thể bị ảnh hưởng bởi loài, yếu tố di truyền, điều kiện môi trường và loại đất trồng của các nguyên liệu (James và cộng sự, 2016).
Phổ hồng ngoại FTIR
Hình 4.1 Phổ hồng ngoại FTIR của PCBB và P-PCBB
Quang phổ hồng ngoại FTIR là công cụ quan trọng để định lượng và mô tả sự thay đổi tổ chức, cấu trúc hóa học của mẫu Phổ FTIR của PCBB và P-PCBB cho thấy không có sự khác biệt giữa các đỉnh hấp thụ, không có sự xuất hiện hay mất đi các đỉnh mới, chứng tỏ rằng mẫu P-PCBB sau thủy phân không tạo ra nhóm chức mới và vẫn giữ các nhóm chức đặc trưng của protein concentrate đậu đen Đỉnh cao nhất của cả hai mẫu nằm trong khoảng 1600-1700 cm -1, đặc trưng cho cấu trúc bậc hai của protein, với dải amide I chủ yếu là dao động kéo dãn của C=O và các nhóm amide Đỉnh amide I chính xuất hiện ở 1622 cm -1 cho cả PCBB.
Các dải amide I trong protein cây họ đậu thể hiện cấu trúc bậc hai như β−Sheet (1615–1640 và 1689–1698 cm -1), α−helix (1650–1659 cm -1), uốn cong ngẫu nhiên (1641–1649 cm -1), và β-turn (1660 đến 1688 cm -1) (Kudre, 2012) Cả PCBB và P-PCBB đều có vùng hấp thụ mạnh ở 1622 cm -1, liên quan đến cấu trúc anti-parallel β-sheet (Zheng và cộng sự, 2007), một thành phần cơ bản của protein tự nhiên (Ye và cộng sự, 2013) Đối với dải amide II, PCBB và P-PCBB có đỉnh ở 1525 và 1518 cm -1, với dao động amide II do sự kết hợp lệch pha giữa dao động NH uốn cong và CN kéo dãn (Kudre, 2012) Dải amide III được phát hiện ở 1230 cm -1, liên quan đến sự kết hợp trong pha giữa dao động NH uốn cong và CN kéo dãn (Kudre, 2012) Ngoài ra, các đỉnh ở 1040−1034 cm -1 cho thấy sự kéo dãn C−O do liên kết ester O=C−O và dao động của liên kết OH, CC.
Các cấu hình khác nhau của liên kết glycosidic dẫn đến sự khác biệt trong vùng 1000−920 cm -1 (Kudre, 2012; Hong và cộng sự, 2021) Phổ FTIR trong khoảng 900 đến 1200 cm -1 được coi là vùng “có dấu vết” của carbohydrate, giúp xác định các nhóm hóa học chính trong polysaccharides (Q Guo và cộng sự, 2018; Hong và cộng sự, 2021) Hàm lượng polysaccharide của PCBB cao hơn so với P-PCBB, dẫn đến độ hấp thụ của PCBB cao hơn trong khoảng 1200-900 cm -1, trong khi độ hấp thụ của P-PCBB rất thấp Đỉnh hấp thụ cao nhất của PCBB trong khoảng này là 1038 cm -1, đặc trưng cho cấu trúc cellulose (Hong và cộng sự, 2021).
Trong phổ FTIR của polysaccharide, vùng 3600–3000 cm -1 cho thấy sự hiện diện của các nhóm OH, đặc biệt là dải 3271 cm -1 liên quan đến tinh bột kết hợp với protein (Hong và cộng sự, 2021; Piotrowicz và Salas-Mellado, 2017) Các polysaccharide như gôm, tinh bột và cellulose chứa nhiều nhóm OH, với dải rộng và cường độ gần 3300 cm -1 do kéo dài liên kết O-H và gần 1080 cm -1 do kéo dài liên kết C-O Vùng 3400−3000 cm -1 cũng liên quan đến hydroxyl từ polyphenol và rượu, trong khi vùng 3600 cm -1 là đặc trưng cho các thành phần này.
Hàm lượng polysaccharides trong PCBB cao gấp hơn 2 lần so với P-PCBB, dẫn đến độ hấp thụ của PCBB vượt trội hơn P-PCBB trong khoảng 3000–3600 cm -1 (Piotrowicz và Salas-Mellado, 2017).
Khối lượng phân tử
Hình 4.2 Khối lượng phân tử protein dựa trên kết quả điện di SDS-PAGE của mẫu BBF,
Hình 4.3 Đường chuẩn khối lượng phân tử protein dựa trên kết quả điện di SDS-PAGE của mẫu chuẩn
Kết quả điện di protein SDS PAGE được thể hiện trong Hình 4.2 và được tính toán dựa trên Hình 4.3 Tất cả các mẫu đều cho thấy sự hiện diện của một số phân đoạn polypeptide Các mẫu BBF, DBBF và PCBB đều xuất hiện các phân đoạn protein với khối lượng phân tử (Mw) khoảng.
Các phân đoạn protein chủ yếu của đậu đen bao gồm 13, 18, 22-27, 31, 34, 44, 47 và 58, 77, 103 kDa, trong đó các phân đoạn 27, 44, 47 xuất hiện rõ trên gel polyacrylamide Mẫu P-PCBB chỉ cho thấy các phân đoạn mờ nhạt với Mw 18, 22, 27, 44, 47 kDa, và không có phân đoạn nào trên 50 kDa xuất hiện trong kết quả Điều này cho thấy các thành phần tiểu đơn vị của protein concentrate đậu đen đã bị thay đổi sau thủy phân, có thể do sự hình thành hoặc đứt gãy các liên kết disulfide trong quá trình chế biến, ảnh hưởng đến các đặc tính chức năng của chúng Tình trạng tương tự cũng được ghi nhận ở protein concentrate từ cám gạo sau quá trình thủy phân.
Protein đậu đen chủ yếu bao gồm Phaseolin và Vicilin (7–8S), với khối lượng phân tử từ 43-47 kDa (García-Cordero và cộng sự, 2021) Nghiên cứu của Piotrowicz và Salas-Mellado (2017) cho thấy protein concentrate từ cám gạo tách béo sau xử lý nhiệt có tiềm năng ứng dụng cao Mối quan hệ giữa các yếu tố trong nghiên cứu được thể hiện qua phương trình hồi quy y = -0.2441x + 2.4018 với hệ số xác định R² = 0.9864.
0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 lo g1 0 (Kh ối lư ợn g ph ân tử , k Da )
28 là một trong những protein quan trọng của cây họ đậu, cung cấp dinh dưỡng thiết yếu cho con người Đây là một glycoprotein trimeric 7S, được lưu trữ trong các thể protein của các loại đậu.
Nghiên cứu so sánh protein concentrate, protein isolate và protein hydrolysates từ đậu đen cho thấy các phân đoạn protein chính là 47 và 44 kDa (Evangelho và cộng sự, 2017) Tương tự, protein isolate từ đậu đen có các phân đoạn chính là 47.5 và 49.2 kDa, trong khi các loại đậu khác như đậu trắng, đậu pinto, đậu đỏ cũng nằm trong khoảng 47−50 kDa (Rui và cộng sự, 2011) Phân đoạn 18 kDa được xác định là β-subunit của chất ức chế α-amylase, và các tiểu đơn vị với Mw khoảng 27 đến 37 kDa đặc trưng cho phytohemaglutinin, một thành phần kháng dinh dưỡng phổ biến trong đậu (Rui và cộng sự, 2011) Hàm lượng lectin không giảm đáng kể khi xử lý ở nhiệt độ dưới 65 o C trong 12 giờ, nhưng có thể loại bỏ hoàn toàn lectin khi xử lý ở nhiệt độ 95 o C trong 1 giờ hoặc 100 o C trong 10 phút (Thompson).
Chúng tôi nhận thấy rằng các phân đoạn có Mw 27, 31, 34 kDa đặc trưng cho các thành phần kháng dinh dưỡng của BBF, DBBF và PCBB đều giống nhau và thể hiện rõ trong kết quả Hình 4.2, cho thấy không có sự thay đổi đáng kể trong suốt quá trình sản xuất ở điều kiện nhiệt độ thường Tuy nhiên, mẫu P-PCBB lại không có phân đoạn Mw 31 và 34 kDa như các mẫu BBF, DBBF, PCBB, và phân đoạn Mw 27 kDa xuất hiện rất mờ nhạt, điều này có thể do các thành phần kháng dinh dưỡng của P-PCBB đã giảm đáng kể sau khi xử lý ở nhiệt độ 95 °C trong 30 phút.
Kết quả thí nghiệm cho thấy các thành phần protein từ các nguồn nguyên liệu khác nhau tạo ra sản phẩm với kích thước, loại và liên kết khác nhau, ảnh hưởng đến sự ổn định cấu trúc của chế phẩm protein (Kudre và cộng sự, 2013) Nghiên cứu cũng chỉ ra rằng quá trình xử lý nhiệt có tác động mạnh mẽ đến cấu trúc protein và làm giảm đáng kể hàm lượng chất kháng dinh dưỡng trong protein concentrate đậu đen.
Hình 4.4 Sắc ký lọc gel GPC của các mẫu BBF, PCBB và P-PCBB
Sắc ký lọc gel GPC được áp dụng để xác định phân bố khối lượng phân tử protein của các mẫu BBF, PCBB và P-PCBB, với kết quả thể hiện trong Hình 4.4 Kết quả GPC cho thấy mẫu BBF có bốn đỉnh khối lượng phân tử phân bố trong các khoảng 1×10² − 4×10² Da, 3×10³ − 1×10⁴ Da, 2×10⁴ − 5×10⁴ Da và 6×10⁴ − 5×10⁵ Da Trong khi đó, mẫu PCBB có ba đỉnh khối lượng phân tử phân bố khoảng 3×10³ − 1.5×10⁴ Da.
Mẫu P-PCBB có hai đỉnh khối lượng phân tử phân bố trong khoảng 1×10³ − 5×10⁴ Da và 1.5×10⁵ − 4×10⁵ Da Kết quả cho thấy mẫu BBF và PCBB không có sự khác biệt lớn giữa các đỉnh khối lượng phân tử trong khoảng từ 3×10³ đến 1×10⁵ Da, và cả ba mẫu BBF, PCBB và P-PCBB đều có chung thành phần protein với đỉnh khối lượng phân tử trong khoảng 2×10⁴ − 5×10⁴ Da, tương tự như kết quả SDS-PAGE Các đỉnh cao nhất của mẫu BBF, PCBB và P-PCBB lần lượt là 218.2×10⁵, 2.9×10⁴ và 1.13×10⁴ Da, cho thấy khối lượng phân tử giảm dần theo thứ tự BBF > PCBB > P-PCBB, chứng tỏ sự thay đổi trong quá trình sản xuất Khối lượng phân tử protein khoảng 2×10⁵ Da của mẫu PCBB và P-PCBB có thể bị giảm sau quá trình xử lý kiềm và kết tủa đẳng điện.
Mẫu P-PCBB thể hiện đỉnh cao nhất với khối lượng phân tử 1.31×10⁴ Da, thấp hơn so với các mẫu khác Đặc biệt, mẫu P-PCBB không có các đỉnh khối lượng phân tử trong khoảng từ 6×10⁴ Da đến 1×10⁵ Da như mẫu BBF và PCBB Điều này cho thấy quá trình xử lý nhiệt đã làm biến tính và kết tụ protein thành các phân đoạn nhỏ hơn, dẫn đến đỉnh khối lượng phân tử 1.31×10⁴ Da cao nhất Kết quả này cũng giải thích tại sao SDS-PAGE của P-PCBB chỉ hiển thị mờ nhạt các phân đoạn protein có khối lượng dưới 5×10⁴ Da.
Thành phần amino acid
Bảng 4.2 Thành phần amino acid a của PCBB và P-PCBB
Amino acid PCBB P-PCBB FAO/WHO b
Amino acid có tính acid 1 16.44 26.2
Amino acid có tính kiềm 2 10.37 9.5
Amino acid không tích điên 6 10.66 15.6
Amino acid chứa lưu huỳnh có giá trị 7, 1.47 và 3.57 g/100g Tất cả các giá trị amino acid (AA) được biểu thị bằng g/100g Các số trong ngoặc đơn theo mẫu khuyến nghị của FAO/WHO (1990) đại diện cho amino acid thiết yếu cho người lớn, trong khi các số bên ngoài ngoặc đơn thể hiện amino acid thiết yếu cho trẻ trước tuổi đi học (2 ~ 5 tuổi).
Amino acid có tính acid: aspartic acid, glutamic acid
Amino acid có tính kiềm: lysine, arginine, histidine
Amino acid kỵ nước: alanine, isoleucine, leucine, methionine, phenylalanine, valine, proline
Amino acid ưa nước: serine, threonine, cysteine, tyrosine
Amino acid tích điện: aspartic acid, glutamic acid, lysine, arginine, histidine
Amino acid không tích điện: glycine, serine, tyrosine, cysteine, threonine
Amino acid chứa lưu huỳnh: cysteine, methionine
*: Hàm lượng trytophan= Hàm lượng Protein tổng- Hàm lượng amino acid còn lại
Thành phần amino acid là yếu tố quyết định giá trị dinh dưỡng của protein, với tổng hàm lượng amino acid của mẫu P-PCBB đạt 77.96 g/100g, cao hơn so với PCBB là 54.67 g/100g Các amino acid thiết yếu chiếm 45.66% và 42.95% tổng số amino acid của PCBB và P-PCBB, lần lượt cao hơn so với protein concentrate đậu bắp (36.31%) và protein isolate đậu đen (42.2%) Trong số các amino acid thiết yếu, lysine, leucine, arginine và phenylalanine là chủ yếu, trong khi mẫu P-PCBB giàu aspartic acid và glutamic acid hơn so với PCBB Tỷ lệ amino acid có tính acid và kiềm ảnh hưởng đến điện tích bề mặt protein, với P-PCBB có khả năng thể hiện điện tích âm cao hơn ở pH trung tính hoặc kiềm Sự khác biệt cũng được ghi nhận ở hàm lượng amino acid kỵ nước và không tích điện, với P-PCBB đạt 54.21% so với 50.96% của PCBB, cho thấy vai trò quan trọng của amino acid kỵ nước trong sự ổn định nhiệt và hình thành globulin Hàm lượng tryptophan thấp và cysteine không đáng kể trong tất cả các mẫu, trong khi amino acid chứa lưu huỳnh (cysteine và methionine) chiếm số lượng rất hạn chế.
So sánh thành phần amino acid của P-PCBB với giá trị khuyến nghị của FAO/WHO (1990) cho trẻ em từ 2 đến 5 tuổi cho thấy hàm lượng các amino acid thiết yếu như histidine, isoleucine và leucine của P-PCBB cao hơn mức khuyến nghị Đối với người lớn, hàm lượng amino acid thiết yếu của P-PCBB cũng vượt trội so với giá trị khuyến nghị của FAO/WHO (1990) Kết quả này cho thấy P-PCBB có thể là nguồn cung cấp amino acid thiết yếu tốt cho người trưởng thành, đồng thời khẳng định P-PCBB là nguồn protein thực vật phong phú, tương tự như protein đậu nành trong dinh dưỡng con người.
Mật độ khối
Hình 4.5 Mật độ khối của BBF và DBBF, so sánh với PCBB và P-PCBB
Mật độ khối (BD) là yếu tố quan trọng trong ngành công nghiệp thực phẩm và yêu cầu đóng gói, đặc biệt đối với sản phẩm protein Theo Barbosa-Cánovas và cộng sự (2005), mật độ khối của hầu hết các sản phẩm thực phẩm dạng bột nằm trong khoảng 0.2–0.8 g/ml, với các mẫu BBF, DBBF, PCBB và P-PCBB có giá trị BD từ 0.6−0.8 g/ml Mẫu BBF có mật độ khối cao nhất (0.74 g/ml), trong khi P-PCBB có giá trị thấp nhất (0.62 g/ml), cho thấy sự khác biệt đáng kể (p < 0.05) Sự giảm mật độ khối cũng được ghi nhận khi loại bỏ chất béo, như trong nghiên cứu của Fagbemi và cộng sự (2005) Thay đổi mật độ khối có thể liên quan đến hàm lượng polysaccharides, với hàm lượng cao hơn dẫn đến mật độ khối tăng (Godswill Awuchi và cộng sự, 2019) Mật độ khối cũng bị ảnh hưởng bởi các yếu tố như hình học, phương pháp đo, kích thước hạt và tính chất bề mặt P-PCBB có mật độ khối cao hơn so với protein concentrate hạt điều (0.25 g/ml) (Ogunwolu và cộng sự, 2009), cho thấy tiềm năng ứng dụng trong thực phẩm chế biến và làm chất làm đặc (Godswill Awuchi và cộng sự, 2019; Chandra, 2015).
Chỉ số trương nở
Hình 4.6 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến chỉ số trương nở của PCBB và P-PCBB
Sự trương nở là một đặc tính chức năng quan trọng trong các sản phẩm thực phẩm như thịt chế biến, bột nhào và sản phẩm sữa trứng, nơi protein hấp thụ và giữ nước mà không hòa tan Nghiên cứu cho thấy chỉ số trương nở của PCBB và P-PCBB tăng khi nhiệt độ từ 30 đến 90 °C, với PCBB có khả năng trương nở cao hơn (p < 0.05) so với P-PCBB Mức độ trương nở phụ thuộc vào nhiệt độ, lượng nước, loại bột, và mức độ biến tính của bột do nhiệt và cơ học, cũng như các thành phần như protein và carbohydrate Hàm lượng carbohydrate cao hơn ở PCBB có thể là nguyên nhân dẫn đến chỉ số trương nở cao hơn so với P-PCBB Khả năng trương nở của protein concentrate đậu đen có thể ứng dụng trong thực phẩm cần kết cấu cao và sản phẩm nướng, đồng thời sự thay đổi nhiệt độ ảnh hưởng đến các đặc tính chức năng của nó.
Khả năng hòa tan
Khả năng hòa tan của protein là một đặc tính chức năng quan trọng, ảnh hưởng đến nhiều tính chất chức năng khác Hình 4.7 minh họa khả năng hòa tan của PCBB và P-.
Ch ỉ số trư ơn g nở (m l/ m l)
Độ hòa tan của PCBB và P-PCBB thay đổi theo pH, với mức thấp nhất đạt 2.42% và 2.25% tại pH 4, và cao nhất là 46.12% và 61% tại pH 10 Điểm đẳng điện (pI) của cả hai loại protein này cũng được xác định tại pH 4 Sự gia tăng độ hòa tan diễn ra nhanh chóng ở cả hai phía của pI, cho thấy pH kiềm có hiệu quả hơn pH acid trong việc hòa tan protein Xu hướng hòa tan của PCBB và P-PCBB trong nước ở các mức pH khác nhau tương tự như kết quả nghiên cứu về độ hòa tan của protein concentrate đậu bắp (Nnamezie và cộng sự, 2021).
Hình 4.7 Ảnh hưởng của pH đến khả năng hòa tan của P-PCBB
Độ hòa tan tối thiểu của peptides gần điểm đẳng điện chủ yếu do sự tích điện, tăng khi pH nằm ngoài điểm này, trong khi tính bề mặt kỵ nước thúc đẩy sự kết tụ Khả năng hòa tan của protein phụ thuộc vào nồng độ muối, nhiệt độ và pH, với độ hòa tan tối thiểu của PCBB và P-PCBB tại pH 4 và tối đa tại pH 10 Việc phá vỡ các liên kết disulfide có thể cải thiện khả năng hòa tan của protein, làm cho P-PCBB có xu hướng hòa tan cao hơn ở pH 7−10 so với PCBB Tính hòa tan của protein liên quan đến cân bằng tính ưa nước/kỵ nước, phụ thuộc vào thành phần amino acid, và sự gia tăng độ hòa tan qua xử lý nhiệt có thể do sự gia tăng các phần tích điện do biến tính protein.
0 2 4 6 8 10 12 Đ ộ hò a ta n (% ) pHP-PCBBPCBB
Độ hòa tan tối đa của P-PCBB (35%) vượt qua giá trị độ hòa tan của protein concentrate (47,54%) và protein isolate (48,23%) từ hạt óc chó (Mao và Hua, 2012), cũng như protein concentrate đậu phộng (60,5%) (Yu và cộng sự, 2007) Độ hòa tan ở các giá trị pH khác nhau ngày càng được công nhận là một chức năng quan trọng của protein, vì nó liên quan trực tiếp đến nhiều tính chất thiết yếu như khả năng sử dụng trong đồ uống, nhũ hóa, tạo bọt và tạo gel (Adiamo và cộng sự, 2016).
Khả năng hấp thụ dầu (FAC) và hấp thụ nước (WAC)
Bảng 4.3 Độ hấp thụ nước và dầu của PCBB và P-PCBB
Chú thích: Các số liệu cùng nằm trong một hàng ngang mang chữ cái giống nhau thì khác biệt không có ý nghĩa theo phân tích thống kê (p>0,05)
Tương tác giữa nước, dầu và protein đóng vai trò quan trọng trong hệ thống thực phẩm, ảnh hưởng đến hương vị và kết cấu Kết quả độ hấp thụ nước (WAC) của PCBB và P-PCBB cho thấy sự khác biệt đáng kể (p < 0.05), với P-PCBB có khả năng hấp thụ nước thấp hơn (2.59 g/g) so với PCBB (3.36 g/g) Độ hấp thụ nước của protein phụ thuộc vào các yếu tố như kích thước, hình dạng, cấu trúc và sự cân bằng tính ưa nước và kỵ nước của amino acid Carbohydrate có thể làm tăng WAC nhờ vào các chuỗi phân cực hoặc tích điện Khả năng hấp thụ nước cao của PCBB có thể liên quan đến hàm lượng polysaccharides, trong khi hàm lượng xơ của P-PCBB giảm sau khi thủy phân, dẫn đến khả năng giữ nước kém hơn So với protein concentrate từ đậu kariya (2.06 g/g) và protein concentrate (1.74 g/g) cũng như protein isolate (2.20 g/g) từ hạt điều, PCBB và P-PCBB cho thấy độ hấp thụ nước cao hơn.
Nước cao của PCBB và P-PCBB là thành phần tiềm năng cho ngành công nghiệp thịt, bánh mì và bánh ngọt Độ hấp thụ chất béo (FAC) rất quan trọng trong thực phẩm vì nó giữ hương vị và kích thích vị giác (Aremu và cộng sự, 2007) Kết quả cho thấy P-PCBB có FAC cao hơn (1.12 ml/g) so với PCBB (1.01 ml/g) với sự khác biệt đáng kể (p < 0.05) Nasri và Tinay (2007) cho rằng diện tích bề mặt và tính kỵ nước cải thiện FAC, trong khi hàm lượng protein cao cũng cho thấy FAC cao Mặc dù FAC của PCBB và P-PCBB thấp hơn so với protein concentrate từ đậu ngự (2.86 ml/g) và hạt điều (3.32 ml/g), nhưng đặc tính hấp thụ chất béo của chúng vẫn có thể tăng cường hương vị trong chế biến thực phẩm Do đó, protein concentrate có thể được sử dụng làm thành phần chức năng trong các sản phẩm như kem, xúc xích và bánh (Chandra, 2013).
Ảnh hưởng của nồng độ và pH đến khả năng tạo bọt
Hình 4.8 Ảnh hưởng của nồng độ (A) và pH (B) đến khả năng tạo bọt của PCBB và
Khả năng tạo bọt là một trong những thông số quan trọng của protein, yêu cầu protein phải có độ hòa tan cao, mềm dẻo và tạo lớp kết dính quanh các bong bóng khí Để đảm bảo tạo bọt tốt, protein cần có độ bền cơ học ở mặt phân cách nước và không khí (Cano-Medina và cộng sự, 2011) Nghiên cứu cho thấy khả năng tạo bọt của P-PCBB đạt mức cao nhất ở nồng độ 2% (w/v) với thể tích 62,22%, cao hơn 14,74% so với mẫu PCBB chỉ đạt 47,48% Ở nồng độ 0,5% (w/v), khả năng tạo bọt của P-PCBB đạt mức thấp nhất là 27,78%.
T hể tí ch b ọt (% ) pH
Khả năng tạo bọt của P-PCBB đạt 6,31% so với mẫu PCBB là 21,47%, cho thấy độ hòa tan của protein ảnh hưởng lớn đến khả năng này So sánh độ hòa tan giữa PCBB và P-PCBB cho thấy P-PCBB có độ hòa tan cao hơn, dẫn đến khả năng tạo bọt tốt hơn Khả năng tạo bọt tăng dần khi nồng độ protein tăng, nhờ vào sự tương tác giữa các phân tử protein, làm tăng độ nhớt và hình thành màng protein nhiều lớp trên bề mặt phân cách Màng này giúp chống lại sự mất cân bằng của các bọt khí và có thể dày hơn khi nồng độ protein tăng, từ đó cải thiện khả năng tạo bọt Nghiên cứu của Adebowale và Lawal (2003) cũng xác nhận xu hướng này với protein concentrate từ đậu mèo rừng, trong khi Pham và cộng sự (2022) báo cáo tương tự với protein concentrate từ đậu ngự Ở nồng độ 2% (w/v), protein concentrate từ đậu đen cho thấy khả năng tạo bọt 62,22%, cao hơn so với 58% của đậu mèo rừng nhưng thấp hơn mức 105% của đậu ngự Ảnh hưởng của pH đến khả năng tạo bọt của P-PCBB được thể hiện rõ rệt, với hai vùng pH khác nhau: vùng 1 (pH4) Trong vùng 1, khả năng tạo bọt giảm từ pH 2 (77,78%) xuống pH 4 (40,56%), đạt mức thấp nhất tại pH 4.
Khả năng tạo bọt của P-PCBB tăng dần theo các mức pH, đạt tối đa 96,11% tại pH 10 Dữ liệu cho thấy khả năng tạo bọt kém tại pH đẳng điện (pH 4) nhưng cao ở pH acid và kiềm Kết quả này tương đồng với nghiên cứu của Adebowale và Lawal (2003) về protein concentrate từ đậu mèo rừng, với khả năng tạo bọt thấp nhất tại pH 4 (34%) và cao nhất tại pH 10 (134%) Ở vùng pH>4, khả năng tạo bọt cao hơn ở pH 2 so với pH 4 do các protein mang điện đẩy nhau Thay đổi pH của dung dịch protein dẫn đến proton hóa hoặc khử proton của amino acid, làm thay đổi điện tích bề mặt của protein (Dachmann và cộng sự, 2020) Điều này khiến các phân tử protein di động hơn, khuếch tán nhanh đến bề mặt không khí-lỏng để bọc các túi khí, từ đó tăng khả năng tạo bọt Ngược lại, khả năng tạo bọt thấp ở pH 4 có thể do tính hòa tan thấp.
Khả năng tạo bọt của P-PCBB cao ở vùng pH acid và pH kiềm, nhưng thấp nhất tại điểm đẳng điện, nơi protein có điện tích gần bằng 0, không cho phép phát triển các thuộc tính chức năng Tại pH kiềm (pH > 4), sự suy yếu của các tương tác kị nước giữa các phân tử protein dẫn đến sự gia tăng khả năng tạo bọt Khi pH tăng, các amino acid kỵ nước giảm tương tác, khiến protein mang điện tích dương và âm, tạo ra lực đẩy và tăng cường tính linh hoạt của chúng Điều này giúp hình thành lớp bề mặt ổn định, tăng tốc độ khuếch tán đến bề mặt không khí-nước, từ đó nâng cao khả năng tạo bọt Hơn nữa, hàm lượng lipid rất thấp trong P-PCBB cũng góp phần vào khả năng tạo bọt, vì lipid có thể làm suy yếu các tương tác protein-protein và gây cản trở sự tạo bọt Tóm lại, hệ bọt của P-PCBB ổn định hơn ở vùng pH acid so với vùng pH kiềm.
Ảnh hưởng của nồng độ và pH đến độ bền bọt
Hình 4.9 Ảnh hưởng của nồng độ đến độ bền bọt của (A) PCBB và (B) P-PCBB
Độ bền bọt của PCBB và P-PCBB chịu ảnh hưởng mạnh mẽ từ pH, với yêu cầu về các tính chất của màng protein như sự hình thành màng dính kết, độ nhớt và độ đàn hồi Bọt ổn định cao được tạo ra nhờ các protein hình cầu có trọng lượng phân tử cao, tạo ra màng hấp phụ dày (Zayas, 1997) P-PCBB cho thấy độ bền bọt cao nhất ở nồng độ 2% (w/v) với giá trị 26,11% sau 8 giờ quan sát, trong khi bọt kém bền nhất ở nồng độ 0,5% (w/v) chỉ đạt 13,89% Tương tự, PCBB có độ bền bọt cao nhất cũng ở nồng độ 2% (w/v) với giá trị 18,6%, nhưng vẫn thấp hơn 1.4 lần so với P-PCBB Bọt kém bền nhất của PCBB ở nồng độ 0,5% (w/v) chỉ đạt 7,8%, thấp hơn 1.8 lần so với P-PCBB, điều này cho thấy hàm lượng protein trong P-PCBB cao hơn.
Thời gian (h) pH = 2 pH = 4 pH = 6 pH = 8 pH = 10
Thời gian (h) pH = 2 pH = 4 pH = 6 pH = 8 pH = 10
Các mẫu PCBB với hàm lượng protein cao có khả năng tăng độ nhớt và hình thành màng protein nhiều lớp, từ đó cải thiện độ ổn định của hệ bọt (Mao và Hua, 2012) So với nghiên cứu của Pham và cộng sự (2022) về protein concentrate từ đậu ngự ở nồng độ 2% (w/v), thể tích bọt còn lại của đậu ngự đạt 26% Trong khi đó, nghiên cứu của Zayas (1997) về protein concentrate từ đậu mèo rừng ghi nhận thể tích bọt đạt 14% sau 8 giờ quan sát ở cùng nồng độ.
Sự xẹp bọt xảy ra do ba cơ chế chính: (i) sự không cân đối của các bọt khí; (ii) sự kết tụ của các bọt khí do sự không ổn định của lớp màng ngăn cách; và (iii) sự thoát nước từ bề mặt bọt khí xuống chất lỏng, dẫn đến việc loại bỏ protein khỏi màng xung quanh Tăng nồng độ protein giúp tăng cường tương tác giữa các protein, làm tăng độ nhớt và hình thành màng protein nhiều lớp, từ đó cải thiện khả năng chống lại sự mất cân đối và hợp bọt P-PCBB ở nồng độ 2% cho thấy độ bền cao hơn so với các nồng độ khác Độ bền của hệ bọt ở các pH khác nhau cho thấy hệ bọt ổn định nhất ở pH 4, trong khi ở pH 10 và 8, hệ bọt kém ổn định hơn Ở pH gần điểm đẳng điện, lực đẩy tĩnh điện giữa các phân tử protein giảm, tạo điều kiện cho lớp protein dày hơn hình thành, giúp hệ bọt ổn định hơn Sự hấp phụ protein tại bề mặt phân cách cũng tăng lên xung quanh pH đẳng điện, dẫn đến sự hình thành các lớp phân tử ổn định trong giao diện không khí - nước, mang lại sự ổn định cho bọt.
Độ ổn định bọt tối đa đạt được nhờ vào việc giảm sức căng bề mặt và tăng độ đàn hồi của màng (Zayas J F., 1997) Qua việc khảo sát độ tạo bọt và khả năng bền bọt, P-PCBB có thể được ứng dụng trong quy trình sản xuất bánh, đồ ngọt, công nghệ sản xuất bia và món tráng miệng, nhằm đáp ứng các yêu cầu công nghệ và tính chất sản phẩm.
Tính chất nhũ hóa
Hình 4.11 Ảnh hưởng của pH đến (A) chỉ số hoạt động nhũ hóa và (B) chỉ số ổn định nhũ hóa của PCBB và P-PCBB
Protein có đặc tính nhũ hóa tốt, đóng vai trò quan trọng trong việc nhũ hóa thực phẩm Chúng bao gồm các amino acid tích điện, amino acid phân cực không tích điện và amino acid không phân cực, cho phép protein hoạt động như chất nhũ hóa với tính chất ưa nước và kỵ nước, tương tác với cả nước và dầu trong hệ thống thực phẩm Nghiên cứu cho thấy chỉ số nhũ hóa của protein concentrate đậu đen (P-PCBB) thấp hơn so với PCBB ở các mức pH khác nhau Khả năng tạo nhũ của protein có xu hướng giảm khi nồng độ protein tăng lên, điều này cũng được xác nhận bởi các nghiên cứu trước đó về protein concentrate từ quả óc chó, hạt điều và đậu kariya Đặc biệt, tính chất nhũ hóa bị ảnh hưởng rõ rệt bởi độ pH, với chỉ số hoạt được nhũ hóa thấp nhất quan sát được ở pH 4.0, nơi protein có xu hướng kết tủa, dẫn đến giảm sự hình thành nhũ tương.
Độ pH có ảnh hưởng rõ rệt đến khả năng nhũ hóa của protein, với pH 10 cải thiện khả năng nhũ tương hơn so với pH acid Hoạt động nhũ hóa của protein hòa tan phụ thuộc vào sự cân bằng ưa nước−ưa béo, dẫn đến việc các protein ưa dầu định hướng vào pha dầu và các protein ưa nước vào pha nước, giảm sức căng bề mặt Ở pH 4, độ hòa tan của protein thấp, kiểm soát sự khuếch tán qua hấp phụ protein tại bề mặt phân cách dầu-nước Tuy nhiên, ở pH từ 6–10, độ hòa tan protein tăng lên, tạo điều kiện cho tương tác giữa pha dầu và pha nước Hoạt tính tạo nhũ của PCBB cao hơn P-PCBB trong khoảng pH 2-10, có thể do sự khác biệt về nồng độ protein Chỉ số ổn định nhũ hóa (ESI) của PCBB và P-PCBB giảm từ pH 2-4 và tăng lên tại pH 10, đạt giá trị cao nhất lần lượt là 235.46 phút và 306.67 phút Khi các giọt dầu hình thành, phần kỵ nước của protein hấp thụ trên bề mặt giọt, trong khi phần ưa nước nằm trong môi trường nước, tạo ra điện tích trên bề mặt giọt và ổn định nhũ tương Ở pH gần bằng pI, điện tích bề mặt giọt gần bằng 0, làm giảm ESI do lực đẩy giữa các giọt yếu Giá trị ESI thấp ở pH thấp có thể do sự tăng tương tác giữa các giọt nhũ hóa do sự hiện diện của các ion clorua.
Khi độ pH tăng lên, lực tĩnh điện giữa các giọt nhũ hóa và sự hydrate hóa của các phân tử protein tích điện cũng tăng, dẫn đến giảm năng lượng bề mặt và tăng chỉ số ổn định nhũ hóa ESI của P-PCBB cao hơn đáng kể so với PCBB ở tất cả các giá trị pH (2–10), cho thấy sự khác biệt về hàm lượng protein và tính kỵ nước bề mặt Sự tương tác kỵ nước giữa các protein tạo thành mặt phân cách dầu-nước mạnh, dẫn đến hệ nhũ tương ổn định So sánh EAI và ESI của PCBB và P-PCBB cho thấy ảnh hưởng của pH lên protein đậu đen rất khác nhau, phản ánh sự khác biệt về thành phần, độ hòa tan, cấu trúc và tính kỵ nước Hàm lượng cao các amino acid kỵ nước trong protein đã cải thiện tính kỵ nước trên bề mặt và tăng cường tương tác giữa protein và lipid Kết quả cho thấy các đặc tính tạo nhũ của protein concentrate đậu đen có thể được cải thiện đáng kể trong môi trường kiềm.
Tính chất lưu biến
Bảng 4.4 Phương trình hồi quy theo mô hình Herschel-Bulkley 1 của gel P-PCBB ở các nồng độ và nhiệt độ khác nhau Nhiệt độ Nồng độ (%) Chu kì 1 (1→300, s -
Hồi quy các đường biểu diễn tương quan giữa ứng suất trượt (\(\sigma\)) và độ biến dạng (\(\dot{\gamma}\)) được mô tả theo phương trình Herschel – Bulkley (\(\sigma = K(\dot{\gamma})^n + \sigma_0\)) Tỷ lệ R² thể hiện mức độ phù hợp của mô hình hồi quy với biến phụ thuộc.
Hình 4.12 minh họa sự thay đổi giữa ứng suất trượt và tốc độ trượt của gel P-PCBB ở các nồng độ 7% w/v, 10% w/v, và 13% w/v Dữ liệu được thu thập tại các mức nhiệt độ 10 o C (A), 30 o C (B), và 60 o C (C) trong chu kỳ 1, cũng như ở các mức nhiệt độ 10 o C (D), 30 o C (E), và 60 o C (F) trong chu kỳ 2.
Hình 4.13 minh họa sự thay đổi của độ nhớt và tốc độ trượt của gel P-PCBB ở các nồng độ 7% w/v, 10% w/v và 13% w/v tại các mức nhiệt độ 10 o C, 30 o C và 60 o C trong chu kỳ 1 và chu kỳ 2.
Các phép đo lưu biến là công cụ quan trọng để đánh giá trạng thái thực phẩm, giúp xác định khả năng xử lý nguyên liệu trong sản xuất và tính ổn định của sản phẩm lỏng và bán rắn trong các điều kiện bảo quản khác nhau (Pham và cộng sự, 2022) Các phương trình hồi quy chỉ ra mối quan hệ giữa ứng suất trượt (), độ nhớt () và tốc độ trượt (ɣ̇) của gel P-PCBB theo mô hình Herschel-Bulkley trong hai chu kỳ: chu kỳ 1 với tốc độ trượt tăng dần từ 1 đến 300 s⁻¹ và chu kỳ 2 với tốc độ trượt giảm dần từ 300 xuống 1 s⁻¹ Kết quả cho thấy gel P-PCBB có ứng suất trượt tỷ lệ thuận với tốc độ trượt trong cả hai chu kỳ, đồng thời độ nhớt của gel cũng được thể hiện rõ.
P-PCBB có xu hướng giảm khi tốc độ trượt tăng từ 1-300 s -1 Ngược lại, khi tốc độ trượt giảm dần từ 300−1s -1 thì độ nhớt của của gel P-PCBB có xu hướng tăng dần
Bảng 4.4 chỉ ra rằng các phương trình hồi quy của gel P-PCBB ở các nồng độ và nhiệt độ khác nhau đều có chỉ số động thái dòng chảy nằm trong khoảng 0 < n < 1, theo nghiên cứu của Steffe.
Chất lỏng phi Newton có hai dạng chính: shear-thinning và shear-thickening Theo Steffe (1996), nếu \$0 < n < 1\$, chất lỏng sẽ có tính chất shear-thinning, trong khi nếu \$1 < n < \infty\$, chất lỏng sẽ có tính chất shear-thickening Shear-thinning là dạng lưu chất phổ biến nhất của chất lỏng phi Newton không phụ thuộc thời gian.
Các mẫu P-PCBB có tính chất giả dẻo, nghĩa là độ nhớt giảm khi tốc độ trượt tăng Chất giả dẻo không có ứng suất ngưỡng, dẫn đến xu hướng chảy lỏng khi có lực tác dụng Sau chu kỳ 1, trạng thái gel có thể bị phá hủy và không phục hồi hoàn toàn, làm giảm ứng suất cắt trong chu kỳ 2.
Sự tạo gel của protein bị ảnh hưởng bởi khối lượng phân tử, nhiệt độ, pH và lực ion (Aryee và cộng sự, 2018) Ở pH 7.0 và không có muối, độ nhớt của gel P-PCBB giảm khi nhiệt độ tăng Cụ thể, tại 10 o C và 30 o C, gel P-PCBB có ứng suất trượt và độ nhớt cao hơn so với 60 o C do sự cắt đứt các liên kết hydro khi gia nhiệt, dẫn đến sự phân ly của các tập hợp và mạng lưới protein (Hong Lin, 2012) Khi hạ nhiệt độ, các polypeptide liên kết lại thông qua các liên kết kỵ nước, liên kết hydro, tương tác ion và có thể là các liên kết disulfide để tạo thành gel (Kinsella, 1979).
Độ nhớt và ứng suất trượt của gel P-PCBB chịu ảnh hưởng bởi nồng độ mẫu và nhiệt độ Khi nồng độ protein đạt mức đủ cao, mạng lưới không gian ba chiều sẽ hình thành, tạo ra một hệ gel hoàn chỉnh (Aryee và cộng sự, 2018) Kết quả cho thấy, độ nhớt và ứng suất trượt của gel P-PCBB tăng khi nồng độ P-PCBB tăng từ 7% đến 13% Tuy nhiên, ở nồng độ mẫu dưới 10%, đặc tính tạo gel của P-PCBB chưa phát triển đầy đủ, dẫn đến độ nhớt và ứng suất trượt thấp.
Đường cong độ nhớt biểu kiến và ứng suất trượt của các mẫu gel P-PCBB cho thấy sự ổn định khi giảm tốc độ trượt, không khác biệt nhiều so với khi tăng tốc độ Điều này chứng tỏ khả năng phục hồi tốt của các mẫu gel P-PCBB, mở ra cơ hội ứng dụng trong các sản phẩm như sốt táo, puree và nước ép cam cô đặc.