tóm tắt LA: Thiết kế và tổng hợp các acid hydroxamic mang khung quinazolin hướng tác dụng kháng tế bào ung thư.

Thiết kế và tổng hợp các acid hydroxamic mang khung quinazolin hướng tác dụng kháng tế bào ung thư.Thiết kế và tổng hợp các acid hydroxamic mang khung quinazolin hướng tác dụng kháng tế bào ung thư.Thiết kế và tổng hợp các acid hydroxamic mang khung quinazolin hướng tác dụng kháng tế bào ung thư.Thiết kế và tổng hợp các acid hydroxamic mang khung quinazolin hướng tác dụng kháng tế bào ung thư.Thiết kế và tổng hợp các acid hydroxamic mang khung quinazolin hướng tác dụng kháng tế bào ung thư.Thiết kế và tổng hợp các acid hydroxamic mang khung quinazolin hướng tác dụng kháng tế bào ung thư.Phụ lục II BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI ĐOÀN THANH HIẾU THIẾT KẾ VÀ TỔNG HỢP CÁC ACID HYDROXAMIC MANG KHUNG QUINAZOLIN HƯỚNG TÁC DỤNG KHÁNG TẾ BÀO UNG THƯ Chuyên ngành Hóa.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

ĐOÀN THANH HIẾU

THIẾT KẾ VÀ TỔNG HỢP CÁC ACID HYDROXAMIC MANG KHUNG QUINAZOLIN HƯỚNG TÁC DỤNG KHÁNG TẾ BÀO UNG THƯ

Chuyên ngành: Hóa dược

Mã số: 62720403

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC

Hà Nội, năm 2023

Công trình được hoàn thành tại: Trường Đại học Dược Hà Nội

Người hướng dẫn KH: PGS TS Phạm Thế Hải

GS TS Sang-Bae Han

Phản biện 1: ………

………

Phản biện 2: ………

………

Phản biện 3: ………

………

Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án cấp Trường họp tại: ………

……… Vào hồi ………… giờ ……… Ngày …… tháng …… năm 20

Có thể tìm hiểu luận án tại: Thư viện Quốc gia Việt Nam

Thư viện trường ĐH Dược HN

I MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của luận án

Thiết kế cấu trúc dựa trên mục tiêu phân tử đang trở thành hướng

đi chủ yếu trong nghiên cứu thuốc điều trị ung thư Enzym histon deacetylase (HDAC) là mục tiêu phân tử quan trọng, nhiều hợp chất mới đã được phát hiện và nghiên cứu hoạt tính ức chế HDAC, nổi bật nhất là nhóm các dẫn chất của acid hydroxamic với bốn thuốc đã được cấp phép điều trị Dẫn chất hydroxamic có khung cấu trúc chung gồm

ba phần: (1) nhóm gắn kẽm là acid hydroxamic, (2) cầu nối là mạch hydrocarbon thân dầu, và (3) nhóm nhận diện bề mặt là cấu trúc vòng thơm giàu electron Khung quinazolin giàu điện tử rất phù hợp với vai trò là nhóm nhận diện bề mặt Cấu trúc này có mặt trong nhiều hợp chất mang hoạt tính đa dạng và được ứng dụng trong thiết kế kháng sinh mới, thuốc chống viêm, giảm đau, thuốc tác động lên hệ thần kinh hoặc tế bào ung thư theo các cơ chế khác nhau Tuy nhiên, tác dụng

ức chế HDAC chưa có nhiều nghiên cứu khảo sát Luận án “Thiết kế

và tổng hợp các acid hydroxamic mang khung quinazolin hướng tác dụng kháng tế bào ung thư” được thực hiện nhằm tìm kiếm các

chất ức chế HDAC mới có hoạt tính kháng tế bào ung thư

2 Mục tiêu luận án

(1) Thiết kế và tổng hợp được khoảng 50 acid hydroxamic mới mang khung quinazolin hướng ức chế enzym HDAC và tác dụng kháng tế bào ung thư

(2) Đánh giá tác dụng ức chế enzym HDAC và tác dụng kháng tế bào ung thư của các chất tổng hợp được

3 Những đóng góp mới của luận án

Về thiết kế cấu trúc, tổng hợp hóa học và khẳng định cấu trúc: Đã

thiết kế và tổng hợp được 55 dẫn chất acid hydroxamic mang khung quinazolin mới hướng ức chế HDAC và kháng tế bào ung thư, những dẫn chất này chưa được công bố trong các tài liệu trước đó

Về đánh giá tác dụng sinh học: Tất cả dẫn chất được đánh giá tác

dụng ức chế HDAC theo phương pháp huỳnh quang; tác dụng kháng

tế bào ung thư trên ba dòng tế bào SW620, PC3 và NCI-H23 theo phương pháp SRB Kết quả, cả 55 chất có khả năng ức chế HDAC, một số chất có tác dụng tương đương hoặc mạnh hơn SAHA, 54/55 chất có hoạt tính ức chế tế bào đáng kể, 50/55 chất gây độc ba dòng tế

bào mạnh hơn SAHA, hai chất IVb và IVc có độc tính tế bào mạnh

nhất (gấp 30 lần SAHA) Phân tích liên quan cấu trúc – tác dụng sử dụng kết quả docking phân tử của các chất với HDAC khẳng định các

cấu trúc tốt cho hoạt tính: khung quinazolin hoặc quinazolin-4(3H)-

on, mang nhóm thế kích thước nhỏ ở các vị trí 2, 6 và/hoặc 7 cho phần nhận diện bề mặt; cấu trúc benzamid, cinnamamid hoặc heptanamid cho phần cầu nối Kết quả dự đoán một số thông số dược động học –

độc tính của vài chất có hoạt tính nổi bật cho thấy VIIIc là chất có

tiềm năng nhất cho các nghiên cứu tiếp theo để phát triển thành thuốc

Về phương pháp nghiên cứu: Việc sử dụng linh hoạt kỹ thuật

docking phân tử ở các giai đoạn thiết kế cấu trúc và bàn luận về liên quan cấu trúc – tác dụng khi thực hiện luận án là một công cụ hữu hiệu gắn kết giữa cơ sở lý thuyết với kết quả thực nghiệm, giúp luận án đạt được mục tiêu đề ra là tìm kiếm các cấu trúc tiềm năng

4 Bố cục luận án

Luận án có 149 trang, bố cục gồm các phần: Đặt vấn đề (1 trang); Tổng quan (41 trang); Nguyên liệu, trang thiết bị, nội dung và phương pháp nghiên cứu (12 trang); Kết quả nghiên cứu (50 trang); Bàn luận (43 trang); Kết luận và kiến nghị (2 trang); Danh mục các công trình

đã công bố liên quan đến luận án (1 trang) Luận án có 179 tài liệu tham khảo (15 trang), 292 phụ lục (177 trang)

II NỘI DUNG LUẬN ÁN

Chương 1 TỔNG QUAN

Chương Tổng quan đã trình bày về:

- Histon deacetylase (HDAC) và các chất ức chế histon deacetylase (HDACi): HDAC và vai trò đối với ung thư; Cấu trúc chung của HDACi, các chất ức chế chọn lọc HDAC nhóm I và HDAC6

- Quinazolin và dẫn chất: Cấu trúc, hoạt tính sinh học, các phương

pháp tổng hợp quinazolin và dẫn chất

- Protein docking và ứng dụng trong thiết kế thuốc

Chương 2: NGUYÊN LIỆU, TRANG THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên liệu, trang thiết bị

Cấu trúc của các chất dự kiến, cấu trúc tinh thể tia X của HDAC2, HDAC6 Các nguyên liệu, hóa chất, dung môi có xuất xứ từ Đức, Trung Quốc Các dụng cụ thí nghiệm thông thường dùng trong tổng hợp hữu cơ Máy tính, các phần mềm, ứng dụng tin sinh học Các máy

đo nhiệt độ nóng chảy, phổ hồng ngoại, phổ khối, phổ cộng hưởng từ hạt nhân, máy đo độ hấp thụ huỳnh quang, tủ nuôi cấy, máy điện di Dịch chiết HDAC (HeLa), các dòng tế bào ung thư người

2.2 Nội dung và phương pháp nghiên cứu

- Thiết kế cấu trúc: Thiết kế cấu trúc của các acid hydroxamic mới

mang khung quinazolin hướng ức chế HDAC và kháng tế bào ung thư dựa vào cấu trúc của các chất dẫn đường, sử dụng quinazolin làm hợp phần chính cho phần nhận diện bề mặt Dự đoán tương tác của các chất dự kiến với mô hình cấu trúc trung tâm hoạt động của enzym

HDAC2 bằng phương pháp docking protein

- Tổng hợp và xác định cấu trúc: Tổng hợp acid hydroxamic mới

mang khung quinazolin có cấu trúc đã được thiết kế và được dự đoán

là có tương tác tốt với HDAC2, sử dụng các phản ứng cơ bản của tổng hợp hữu cơ Tinh chế Khẳng định cấu trúc của các dẫn chất tổng hợp dựa trên phân tích dữ liệu phổ hồng ngoại (IR), phổ khối lượng (MS)

và phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H-NMR, 13C-NMR)

- Đánh giá hoạt tính sinh học: Đánh giá tác dụng ức chế HDAC

tổng chiết từ tế bào HeLa của các chất tổng hợp bằng phương pháp định lượng huỳnh quang, tác dụng kháng ung thư trên một số dòng tế bào ung thư người bằng phương pháp SRB Phân tích liên quan cấu trúc – tác dụng của các dẫn chất, sử dụng kết quả docking phân tử Dự đoán đặc tính dược động học – độc tính của một số chất có tác dụng sinh học nổi bật bằng một số công cụ tin sinh học

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

3.1 Kết quả thiết kế cấu trúc, dự đoán tương tác, tổng hợp hóa học và khẳng định cấu trúc

Khung cấu trúc dự kiến của các chất và kết quả thiết kế cấu trúc

các dãy chất theo 3 nhóm (gồm 3 bước) được thể hiện trên Hình 3.1

Hình 3.1 Kết quả thiết kế cấu trúc của các dẫn chất

Bảng 3.1 Năng lượng liên kết dự đoán của các chất với HDAC2

liên kết (kcal/mol)

liên kết (kcal/mol)

thấp hơn hoặc tương đương SAHA, Bảng 3.1) Đây là cơ sở để luận

án tổng hợp các dẫn chất theo cấu trúc thiết kế, tinh chế và thử tác

dụng sinh học của các dẫn chất trên các mô hình in vitro

Kết quả tổng hợp hóa học

Các dẫn chất được tổng hợp theo các qui trình sau:

Dãy chất VIIa-i

Dãy chất VIIIa-i

Luận án đã tổng hợp được 55 chất, đều ở thể chất rắn (Phụ lục 1)

Phụ lục 1 Tóm tắt kết quả tổng hợp hóa học của các dẫn chất

Kết quả phân tích dữ liệu phổ

Các kết quả phân tích dữ liệu phổ để khẳng định cấu trúc của các

dẫn chất được trình bày trong Chương 4 Bàn luận

3.2 Kết quả thử tác dụng ức chế enzym, độc tính tế bào và dự đoán một số thông số dược động học – độc tính

Các kết quả thử hoạt tính sinh học và dự đoán các thông số dược động học – độc tính (ADMET) của các dẫn chất được trình bày trong

Chương 4 Bàn luận

quinazolin-4(3H)-V, VII-VIII, dựa trên phản ứng Niementowski (Sơ đồ 4.1) Giai đoạn

đầu là sự ngưng tụ loại một phân tử nước giữa dẫn chất acid aminobenzoic và formamid, xảy ra ở nhiệt độ thấp nhờ xúc tác của chính acid, tạo chất trung gian imin Nhờ nhiệt độ cao, cặp điện tử tự

2-do trên nguyên tử N của formamid ban đầu tấn công vào carbon của nhóm chức carboxylic, sự trao đổi proton loại một phân tử nước và hỗ

biến keto-enol sẽ tạo ra vòng quinazolin-4(3H)-on

Formamid là chất tham gia đồng thời là dung môi Giai đoạn tạo liên kết amid cần nhiệt độ cao, tuy nhiên, nhiệt độ quá cao có thể phân hủy sản phẩm, giảm hiệu suất Vì vậy phản ứng được thực hiện ở 120-

130 ℃, xảy ra hoàn toàn trong 5 – 6 giờ, cho hiệu suất cao (85-96 %)

Sản phẩm dẫn chất quinazolin-4(3H)-on bị kết tủa khi rót hỗn hợp

phản ứng vào nước lạnh, vì vậy NaHCO3 được thêm vào để tạo muối của acid 2-aminobenzoic dư tan trong nước, giúp loại bỏ tạp dễ dàng

Sơ đồ 4.1 Cơ chế phản ứng Niementowski ngưng tụ tạo vòng

quinazolin-4(3H)-on

Phản ứng tạo vòng 2-methylquinazolin-4(3H)-on qua trung gian benzoxazinon: Là phản ứng đầu tiên trong qui trình tổng hợp dãy II

và VI Phản ứng one-pot gồm 2 giai đoạn Giai đoạn 1: Ngưng tụ loại

nước giữa quinazolin-4(3H)-4-on và anhydrid acetic, tạo trung gian methyl-4H-benzo[d][1,3]oxazin-4-on Anhydrid acetic là tác nhân

2-đồng thời là xúc tác, phản ứng xảy ra hoàn toàn sau khi đun hồi lưu trong 1 - 2 giờ Giai đoạn 2: Amoni acetat được thêm vào hỗn hợp phản ứng (giai đoạn 1) với lượng dư (khoảng 2 đương lượng so với acid anthranilic ban đầu) để tạo liên kết amid mới thay cho liên kết

este của nhân oxazin-4-on, tạo khung quinazolin-4(3H)-on Nhiệt độ

cần duy trì ở 80 – 100 ℃ Theo dõi tiến trình để kết thúc phản ứng ở thời điểm phù hợp (khoảng 3 giờ) NaHCO3 được thêm vào hỗn hợp sản phẩm để loại bỏ tạp acid acetic sinh ra trong phản ứng

Sơ đồ 4.2 Cơ chế phản ứng tạo vòng 2-methylquinazolin-4(3H)-on

qua trung gian benzoxazinon

Phản ứng N-alkyl hóa khung quinazolin-4(3H)-on: Để tổng hợp ester trung gian của dãy chất I-VI, theo cơ chế thế ái nhân (Sơ đồ 4.3)

Tác nhân alkyl hóa là alkyl-, allyl- hay benzyl- halogenid

Quinazolin-4(3H)-on có tính ái nhân yếu, cần được hoạt hóa bằng một base yếu

Theo các tài liệu tham khảo, phản ứng thực hiện trong môi trường base, sử dụng muối carbonat (Na2CO3, K2CO3, Cs2CO3), hydrid (LiH, NaH, CaH2), triethanolamin (TEA), … làm xúc tác, dung môi aceton, DMF, DMA, MeCN, NMP hay DMSO Luận án lựa chọn và sử dụng

K2CO3 làm xúc tác, dung môi aceton hoặc DMF, tác nhân alkyl hóa là các alkyl- hoặc benzoyl- bromid Thêm một lượng nhỏ KI để tăng tốc

độ và hiệu suất phản ứng Sau khi khảo sát, các phản ứng được tiến hành ở 50-60 ℃ trong 24 giờ

Sơ đồ 4.3 Cơ chế phản ứng N-alkyl hóa quinazolin-4(3H)-on

Đối với quinazolin-4(3H)-on, phản ứng alkyl hóa bằng tác nhân alkyl bromid có thể xảy ra ở N 1 , N 3 hoặc OH tùy theo điều kiện phản

ứng Các kết quả phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton và carbon, đối chiếu với các tài liệu tham khảo giúp khẳng định chắc chắn

các dẫn chất đã tổng hợp trong luận án đều là sản phẩm N 3-alkyl hóa

Phản ứng C 4 -amin hóa khung quinazolin-4(3H)-on: Là phản ứng

để tổng hợp các chất trung gian của các dãy VII -VIII (Sơ đồ 4.4)

Sơ đồ 4.4 Cơ chế phản ứng C 4

-amin hóa khung quinazolin-4(3H)-on

Phản ứng one-pot tạo liên kết C-N theo cơ chế thế ái nhân giữa hợp chất vòng có hỗ biến keto – enol với tác nhân ái nhân có chứa amin, cần môi trường base để chuyển dạng keto (dạng lactam) của các dị vòng thơm sang dạng enol (dạng phenol) ái nhân hơn Tương tự phản

ứng N-alkyl hóa quinazolin-4(3H)-on, có thể sử dụng các xúc tác base

như DBU, TEA, muối carbonat, dung môi MeCN, DMF, aceton Xúc tác kim loại (như Pd, Cu, Ni), hoặc các chất có cấu trúc là muối của phospho (như BOP, PyBOP, BroP, PyBroP) làm tăng tốc độ phản ứng Dựa vào các tài liệu tham khảo và kết quả khảo sát, các điều kiện được luận án sử dụng là DBU và PyBOP (khoảng 1,3 đương lượng PyBOP

và 3 đương lượng DBU so với quinazolin-4(3H)-on), dung môi

acetonitril, nhiệt độ phòng (PyBOP không bền với nhiệt), trong khoảng 24 giờ Sản phẩm có độ tinh khiết tốt, hiệu suất 83 -94 %

Phản ứng N-acyl hóa tạo acid hydroxamic: Là phản ứng cuối

cùng của mỗi qui trình tổng hợp để tạo acid hydroxamic (Sơ đồ 4.5)

Sơ đồ 4.5 Cơ chế phản ứng N-acyl hóa tạo acid hydroxamic

Phản ứng acyl hóa theo cơ chế thế ái nhân vào nhóm amin, chỉ có thể xảy ra trong môi trường kiềm mạnh (pH > 10) Hydroxylamin là tác nhân quan trọng, dạng tự do không bền, dễ phân hủy, dễ gây nổ và khó bảo quản, vì vậy được dùng dưới dạng muối HCl (khoảng 10 đương lượng so với ester) Dạng muối được chuyển hoàn toàn thành dạng base tự do trong dung dịch NaOH bão hòa NaOH dư còn tạo muối natri của acid hydroxamic mới tạo thành, giúp sản phẩm tan hết trong dịch phản ứng, nhưng có thể làm ester bị thủy phân thành acid

carboxylic rất khó để loại bỏ Vì vậy, phản ứng thực hiện ở nhiệt độ thấp (0 ℃, sử dụng hỗn hợp đá muối), đồng thời nhỏ từ từ dung dịch NaOH bão hòa đã được làm lạnh vào bình phản ứng (tránh nhiệt độ tăng đột ngột làm phân hủy hydroxylamin tự do), các yếu tố nhiệt độ

và pH được kiểm tra và duy trì Theo dõi bằng sắc ký lớp mỏng và thuốc thử hiện màu sắt (III) clorid để xác định thời điểm kết thúc phản ứng, thu được sản phẩm có hiệu suất khá cao (78 - 96 %)

4.1.2 Khẳng định cấu trúc

Tất cả các dẫn chất đã thiết kế sau khi tổng hợp và tinh chế được

đo các phổ IR, MS, 1H-NMR và 13C-NMR để xác định cấu trúc Các

chất trung gian trong quá trình tổng hợp IVa, Va và VIa là 3.8a, 3.9a

và 3.10a cũng được đo phổ khối lượng

H sp3; Khoảng từ 1695-1624 cm-1 xuất hiện đỉnh hấp thụ với cường

độ mạnh và sắc nét giúp nhận biết được dao động hóa trị của liên kết C=O của nhóm chức amid và nhóm chức acid hydroxamic; Khoảng từ 1651-1614 cm-1 xuất hiện đỉnh hấp thụ với cường độ mạnh và sắc nét giúp nhận biết được dao động hóa trị của liên kết C=N của nhóm chức imin trong khung quinazolin; Khoảng từ 1616-1520 cm-1 có thể nhận

ra dao động hóa trị của liên kết C=C của vòng benzen và mạch alken Phổ đồ của 27/55 chất có dao động hóa trị của C=N trong khoảng 1651-1614 cm-1 Cầu nối alkyl được khẳng định nhờ dao động hóa trị bất đối xứng CH2 (2999-2913 cm-1) và dao động hóa trị đối xứng CH2

(2883-2806 cm-1) Các dữ liệu phổ IR giúp sơ bộ xác định khung cấu

trúc của các chất mới tổng hợp được có vòng thơm, alken, cầu nối alkyl, các nhóm chức carbonyl, imin, amid và acid hydroxamic

4.1.2.2 Phổ khối lượng

Phổ khối lượng là dữ liệu quan trọng để khẳng định cấu trúc của chất tổng hợp, dựa trên việc xác định khối lượng phân tử và khối lượng của các mảnh ion trên phổ đồ, đối chiếu với khối lượng phân tử và số khối của các mảnh phân tử trong cấu trúc của chất dự kiến Trên phổ

đồ khối lượng của tất cả dẫn chất được tổng hợp, pic có cường độ cao nhất tương ứng với giá trị pic ion phân tử của các chất, bao gồm pic [M+H]+ với chế độ đo positive và [M-H]- với chế độ đo negative Như vậy, phổ khối lượng là cơ sở để khẳng định các chất tổng hợp được trong luận án đều có công thức phân tử đúng như thiết kế ban đầu

4.1.2.3 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân

* Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton 1 H-NMR

a Phổ cộng hưởng từ proton của dãy chất Ia-h, IIa-d và IIIa-d

Khung cấu trúc của dãy chất IIa-d tương tự dãy Ia-h, chỉ khác ở

nhóm thế methyl ở vị trí C3 trên khung quinazolin-4(3H)-on, khung

cấu trúc của dãy chất IIIa-d tương tự dãy Ia-h nhưng có thêm vinylen

ở phần cầu nối Vì vậy, trên phổ đồ 1H-NMR của các dẫn chất dãy I -

III, xuất hiện các pic tương ứng với các proton của khung

quinazolin-4(3H)-on, của cầu nối methylen, nhân benzen, vinylen và acid

hydroxamic với độ dịch chuyển, độ bội của tín hiệu phù hợp với cấu trúc dự kiến, cụ thể:

+ Khung quinazolin-4(3H)-on có các proton ở vị trí 2ʺ, 5ʺ, 6ʺ, 7ʺ

và 8ʺ được xác định rõ ràng trên phổ đồ Đặc điểm của các tín hiệu có thể khác nhau phụ thuộc vào sự xuất hiện và đặc điểm của các nhóm thế ở các vị trí 2ʺ, 6ʺ và 7ʺ:

- Proton ở vị trí 2ʺ (H-2ʺ) trên phổ đồ của 12 dẫn chất Ia-h và

IIIa-d đều có tín hiệu cộng hưởng IIIa-dạng singlet với độ IIIa-dịch chuyển ổn định,

khoảng 8,64-8,47 ppm Các dẫn chất IIa-d có nhóm thế ở vị trí 2ʺ nên

không có tín hiệu này trên phổ đồ