Nghiên cứu nhân giống lan kim tuyến (anoectochilus setaceus blume) bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào tại viện nghiên cứu và phát triển lâm nghiệp

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM NGÔ THẾ CƯỜNG NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG LAN KIM TUYẾN Anoectochilus setaceus Blume BẰNG PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO TẠI VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

NGÔ THẾ CƯỜNG

NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG LAN KIM TUYẾN

(Anoectochilus setaceus Blume) BẰNG PHƯƠNG PHÁP

NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO TẠI VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN LÂM NGHIỆP, TRƯỜNG ĐẠI HỌC

NÔNG LÂM THÁI NGUYÊN

LUẬN VĂN THẠC SĨ LÂM NGHIỆP

Thái Nguyên – 2022

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

NGÔ THẾ CƯỜNG

NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG LAN KIM TUYẾN

(Anoectochilus setaceus Blume) BẰNG PHƯƠNG PHÁP

NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO TẠI VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN LÂM NGHIỆP, TRƯỜNG ĐẠI HỌC

NÔNG LÂM THÁI NGUYÊN

Ngành: Quản lý tài nguyên rừng

Mã số ngành: 8.62.02.11 LUẬN VĂN THẠC SĨ LÂM NGHIỆP

Người hướng dẫn khoa học: 1 TS DƯƠNG VĂN THẢO

Thái Nguyên - 2022

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan những số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trung thực và chưa được sử dụng để bảo vệ bất kỳ một học vị nào Nội dung tổng quan và thảo luận trong luận văn này có tham khảo và sử dụng các tài liệu, thông tin được đăng tải trên các tác phẩm, tạp chí theo danh mục tài liệu tham khảo của luận văn

Thái Nguyên, ngày 02 tháng 11 năm 2022

Học viên

Ngô Thế Cường

LỜI CẢM ƠN

Đề tài “Nghiên cứu nhân giống Lan Kim tuyến (Anoectochilus

setaceus Blume) bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào tại Viện nghiên cứu và Phát triển Lâm nghiệp” nay là Viện Lâm nghiệp và Phát triển bền

vững, Trường Đại Học Nông Lâm Thái Nguyên được hoàn thành theo chương trình đào tạo cao học chuyên ngành Quản lý tài nguyên rừng, khóa học K28 của Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên

Tác giả xin chân thành cảm ơn sự quan tâm, giúp đỡ của Ban Giám hiệu, Phòng Đào tạo sau đại học và các thầy, cô giáo Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên trong suốt quá trình học tập cũng như nghiên cứu và thực hiện luận văn này

Tác giả xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Dương Văn Thảo và TS Nguyễn Minh Chí đã tận tình hướng dẫn, truyền đạt kiến thức, kinh nghiệm quý báu, và hướng dẫn tác giả trong quá trình hoàn thành luận văn này

Tôi xin cảm ơn Viện Nghiên cứu và Phát triển Lâm nghiệp nay là Viện Lâm nghiệp và Phát triển bền vững, Trường Đại học Nông lâm Thái Nguyên

đã tạo điều kiện giúp tôi có cơ sở vật chất được nghiên cứu và hoàn thiện luận văn này

Cuối cùng tác giả xin chân thành cảm ơn người thân trong gia đình, các đồng nghiệp và bạn bè đã giúp đỡ, động viên tác giả trong suốt thời gian học tập và hoàn thành luận văn

Xin chân thành cảm ơn!

Thái Nguyên, tháng 11 năm 2022

Tác giả

Ngô Thế Cường

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU vi

DANH MỤC CÁC HÌNH viii

DANH MỤC VIẾT TẮT ix

MỞ ĐẦU 1

1 Đặt vấn đề 1

2 Mục tiêu nghiên cứu của đề tài 2

3 Ý nghĩa của đề tài 2

3.1 Ý nghĩa khoa học 2

3.2 Ý nghĩa thực tiễn 2

Chương 1 TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU 3

1.1 Tổng quan về nhân giống in vitro 3

1.1.1 Khái quát nuôi cấy mô tế bào 3

1.1.2 Tính toàn năng (Totipotence) của tế bào 3

1.1.3 Sự phân hóa và phản phân hóa tế bào 3

1.1.4 Cơ sở nuôi cấy mô tế bào thực vật 4

1.1.5 Thành phần môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật 4

1.1.6 Các giai đoạn của nhân giống vô tính 6

1.2 Tổng quan nghiên cứu về Lan Kim tuyến trên thế giới 9

1.2.1 Phân loại, đặc điểm hình thái và tình hình phân bố 9

1.2.2 Giá trị kinh tế 10

1.2.3 Giá trị dược liệu 10

1.2.4 Nhân giống Lan Kim tuyến 11

1.3 Tổng quan nghiên cứu về Lan Kim tuyến ở Việt Nam 12

1.3.1 Phân loại, đặc điểm hình thái và tình hình phân bố 12

1.3.2 Giá trị kinh tế 13

1.3.3 Giá trị dược liệu 13

1.3.4 Nhân giống Lan Kim tuyến 14

Chương 2 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19

2.1 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 19

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 19

2.1.2 Phạm vi nghiên cứu 19

2.2 Nội dung nghiên cứu 19

2.3 Phương pháp nghiên cứu 20

2.3.1 Hóa chất thiết bị phục vụ nghiên cứu 20

2.3.2 Phương pháp kế thừa tài liệu 21

2.3.3 Phương pháp nghiên cứu đặc điểm hình thái loài Lan Kim tuyến có xuất xứ tại Thái Nguyên 21

2.3.4 Phương pháp nghiên cứu nhân giống Lan Kim tuyến bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào 21

2.3.4.1 Phương pháp nghiên cứu khử trùng mẫu tạo vật liệu vô trùng 21

2.3.4.2 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất KTST (GA3, BAP) đến khả nhân nhanh chồi 23

2.3.4.3 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất kích thích ra rễ (IAA, NAA, IBA) đến khả ra rễ in vitro của Lan Kim tuyến 25

2.3.4.4 Phương pháp nghiên cứu giá thể thích hợp để ra ngôi cây Lan Kim tuyến sau giai đoạn in vitro 26

2.3.5 Phương pháp phân tích và xử lý số liệu 27

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 28

3.1 Đặc điểm hình thái loài Lan Kim tuyến có xuất xứ tại Thái Nguyên 28

3.2 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng HgCl2 0,1% đến khả năng tạo mẫu Lan Kim tuyến vô trùng 33

3.3 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất kích thích sinh trưởng (GA3, BAP) đến khả năng nhân nhanh chồi cây Lan Kim tuyến 36

a) Ảnh hưởng của GA3 đến khả năng nhân nhanh chồi cây Lan Kim tuyến 36

b) Ảnh hưởng của BAP đến khả năng nhân nhanh chồi của cây Lan Kim tuyến 38

c) Ảnh hưởng của nồng độ BAP kết hợp với GA3 đến khả năng nhân nhanh chồi mẫu Lan Kim tuyến 39

3.4 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất kích thích ra rễ (IAA, NAA, IBA) đến khả ra rễ in vitro Lan Kim tuyến 42

3.5 Kết quả nghiên cứu giá thể thích hợp để ra ngôi cây Lan Kim tuyến sau giai đoạn in vitro 46

3.6 Đề xuất giải pháp nhân giống loài Lan Kim tuyến có xuất xứ tại Thái Nguyên 49

KẾT LUẬN 52

1 Kết luận 52

2 Kiến nghị 53

TÀI LIỆU THAM KHẢO 54

KẾT QUẢ XỬ LÝ SỐ LIỆU 57

giai đoạn in vitro 27

Bảng 3.1 Ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng HgCl2 0,1% đến khả năng

tạo vật liệu vô trùng Lan Kim tuyến 34Bảng 3.2 Ảnh hưởng của GA3 đến khả năng nhân nhanh chồi Lan Kim tuyến 37Bảng 3.3 Ảnh hưởng của nồng độ BAP đến khả năng nhân nhanh chồi từ

mẫu Lan Kim tuyến 38Bảng 3.4 Ảnh hưởng của tổ hợp GA3 và BAP đến khả nhân nhanh chồi mẫu

Lan Kim tuyến 40Bảng 3.5 Ảnh hưởng của nồng độ IAA đến khả năng ra rễ của cây Lan Kim

tuyến in vitro 42

Bảng 3.6 Ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả năng ra rễ cây Lan Kim

tuyến in vitro 43

Bảng 3.7 Ảnh hưởng của nồng độ IBA đến khả năng ra rễ cây Lan Kim tuyến

Bảng 3.8 Ảnh hưởng của giá thể đến khả năng sinh trưởng và phát triển của

cây Lan Kim tuyến ở giai đoạn sau nuôi cấy mô ngoài vườn ươm 47

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 3.1 Hình ảnh mẫu Lan Kim tuyến phân bố ngoài tự nhiên tại thôn Cổ

Đình, xã Hoàng Nông, huyện Đại Từ, tỉnh Thái Nguyên 28

Hình 3.2 Hình ảnh mẫu Lan Kim tuyến xuất xứ Thái Nguyên được lữu trữ tại Viện Lâm nghiệp và Phát triển bền vững, Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên 30

Hình 3.3 Hình thái thân của loài Lan Kim tuyến xuất xứ Thái Nguyên 31

Hình 3.4 Hình thái lá của loài Lan Kim tuyến xuất xứ Thái Nguyên 32

Hình 3.5 Hình thái hoa của loài Lan Kim tuyến xuất xứ Thái Nguyên 32

Hình 3.6 Hình thái rễ của loài Lan Kim tuyến xuất xứ Thái Nguyên 33

Hình 3.7 Hình ảnh Lan Kim tuyến sau khử trùng và cấy trên môi trường MS 35 Hình 3.8 Mẫu Lan Kim tuyến cấy trên môi trường nhân nhanh có bổ sung 0,2 mg/l GA3 + 1,5 mg/l BAP 41

Hình 3.9 Hình ảnh cây Lan Kim tuyến được cấy trong môi trường có bổ sung IBA 1,0mg/l 45

Hình 3.10 Cây Lan Kim tuyến trồng trên giá thể rêu trắng Chile + xơ dừa (2:1) sau 1 tháng 48

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Họ Lan (Orchidaceae) là một trong những họ thực vật có các loài đa dạng nhất của Việt Nam, với 154 chi và 865 loài (Nguyễn Quốc Bình, 1994) Thông thường lan được sử dụng làm cảnh Ngoài ra, nhiều loài lan được sử dụng làm thuốc với khoảng 30-40 loài phân bố rộng khắp trên thế giới Chi

Lan kim tuyến (Anoectochilus) ở Việt Nam thống kê được 12 loài, trong đó loài Lan kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume) được biết đến bởi nhiều giá trị dược liệu quý

Hiện nay Lan Kim tuyến ở nước ta đang đứng trước nguy cơ bị tuyệt chủng hoạt động khai thác bừa bãi và buôn bán trái phép ra nước ngoài Do

đó việc nhân nhanh Lan Kim tuyến là hết sức cần thiết Từ xưa, các loài Lan

đã tiến hành nhân giống bằng nhiều phương pháp khác nhau như gieo hạt, tách mầm Tuy nhiên những phương pháp này vẫn còn có nhiều nhược điểm như tốn thời gian, chất lượng cây không đồng nhất, hệ số nhân giống thấp, cần nhiều nguồn vật liệu ban đầu, dễ bị thoái hoá qua nhiều thế hệ, khả năng lây bệnh cao, và việc nhân giống mang tính thời vụ Hơn nữa, hạt lan lại quá nhỏ, chỉ có một phôi, tỷ lệ nảy mầm rất thấp Để khắc phục được những nhược điểm này, hiện nay có nhiều phương pháp nhân giống mới như nuôi cấy mô tế bào thực, các cây con được tạo ra với số lượng lớn đồng nhất về kiểu hình, giá thành phù hợp, chất lượng đảm bảo, sạch bệnh và nhân giống không còn phụ thuộc vào mùa vụ Do đó đáp ứng được nhu cầu ngày càng tăng lên của thị trường… Đây là phương pháp nhân giống cải tiến hơn nhiều

so với phương pháp truyền thống Chính vì vậy, tôi đã tiến hành thực hiện đề

tài “Nghiên cứu nhân giống Lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus

Blume) bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào Tại Viện Nghiên Cứu Và Phát Triển Lâm Nghiệp nay là Viện Lâm nghiệp và Phát triển bền vững, Trường Đại Học Nông Lâm Thái Nguyên”

2 Mục tiêu nghiên cứu của đề tài

- Nghiên cứu đặc điểm hình thái loài Lan Kim tuyến có xuất xứ tại Thái Nguyên

- Xác định được thời gian xử lý mẫu Lan Kim tuyến bằng HgCl2 để

tạo vật liệu vô trùng phục vụ việc nuôi cấy in vitro

- Xác định được loại chất kích thích sinh trưởng và nồng độ thích hợp cho giai đoạn nhân nhanh chồi cây Lan Kim tuyến

- Xác định được loại chất kích thích ra rễ và nồng độ thích hợp cho

giai đoạn ra rễ in vitro loài Lan Kim tuyến

- Xác định được giá thể thích hợp để ra ngôi cây Lan Kim tuyến sau

giai đoạn in vitro

3 Ý nghĩa của đề tài

3.1 Ý nghĩa khoa học

Kết quả nghiên cứu của đề tài là những tư liệu, tài liệu tham khảo có giá trị và là cơ sở khoa học đề xuất các biện pháp bảo tồn và phát triển loài

cây Lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus) ở nước ta nói chung và tỉnh Thái

Nguyên nói riêng

3.2 Ý nghĩa thực tiễn

Từ kết quả nghiên cứu của đề tài nhận biết được kỹ thuật nhân giống

loài Lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus) bằng phương pháp cấy mô tế

bào góp phần vào việc nhân rộng và cung cấp giống cây Lan Kim tuyến có chất lượng tốt

Chương 1 TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU

1.1 Tổng quan về nhân giống in vitro

1.1.1 Khái quát nuôi cấy mô tế bào

Nuôi cấy mô tế bào thực vật là tạo nguồn vật liệu khởi đầu sạch bệnh để tiến hành nuôi cấy trên môi trường dinh dưỡng vô trùng Nhân

giống vô tính hay còn gọi là nhân giống in vitro tiến hành cắt nuôi đoạn

thân có mang chồi ở nách lá, đoạn rễ hay mảnh củ trên môi trường dinh dưỡng nhân tạo

Nuôi cấy mô tế bào thực vật được hình thành và phát triển từ những năm 80 của thế kỉ XX và được ứng dụng chủ yếu trong các lĩnh vực như:

tạo phôi vô tính, nhân giống vô tính in vitro và bảo quản nguồn gen in

(Trịnh Đình Đạt, 2009)

1.1.2 Tính toàn năng (Totipotence) của tế bào

Năm 1902, Haberlandt đã đưa ra khái niệm tính toàn năng của tế bào

là cơ sở lý luận cho phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật Ông là người đầu tiên đưa ra khái niệm mỗi tế bào bất kì của một cơ thể sinh vật

đa bào đều có khả năng phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh

Trong khi đó theo quan điểm cho sinh học hiện đại, khái niệm tính toàn năng của mỗi tế bào riêng rẽ sẽ phân hóa, và mang toàn bộ thông tin

di truyền cần thiết Gặp điều kiện thích hợp, mỗi tế bào sẽ phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh (Nguyễn Quang Thạch, 2009)

1.1.3 Sự phân hóa và phản phân hóa tế bào

Khái niệm sự phân hoá là sự chuyển hóa của tế bào dạng phôi sang tế bào chuyên hóa để đảm bảo chức năng sinh hóa và sinh lý khác nhau

Khái niệm sự phản phân hóa là sự chuyển hóa từ tế bào chuyên hóa sang tế bào phôi sinh để thực hiện chức năng phân chia

Các quá trình này chịu ảnh hưởng và tác động của các chất điều hòa sinh trưởng, các yếu tố nhiệt độ, ánh sáng, độ ẩm, môi trường

1.1.4 Cơ sở nuôi cấy mô tế bào thực vật

Các điều kiện nuôi cấy mô tế bào thực vật bao gồm:

- Điều kiện vô trùng:

Nuôi cấy in vitro cần phải đảm bảo điều kiện vô trùng cả mẫu nuôi cấy

lẫn môi trường và thao tác Điều kiện vô trùng sẽ giảm thiểu tình trạng nhiễm khuẩn của mẫu nuôi cấy Các phương pháp vô trùng thông dụng nhất hiện nay

là sử dụng các chất hoá học để loại bỏ nấm và vi khuẩn, hoặc sử dụng tia UV

- Điều kiện ánh sáng, nhiệt độ, pH

+ Ánh sáng: Sự phát triển và sinh trưởng của các mô nuôi cấy chịu

ảnh hưởng và chi phối của nhiều yếu tố của ánh sáng như chất lượng ánh sáng, thời gian chiếu sáng và cường độ ánh sáng Trong đó thời gian chiếu sáng tác động mạnh đến quá trình phát triển của mô nuôi cấy Nhìn chung các loài cây có thời gian chiếu sáng thích hợp dao động từ 12-18 giờ/ngày

+ Nhiệt độ: Trong quá trình nuôi cấy mô tế bào thực vật, yếu tố nhiệt

độ có ảnh hưởng quan trọng tới sự phân chia tế bào và các quá trình sinh hoá diễn ra ở trong cây Tuỳ thuộc vào xuất xứ, nguồn gốc của mẫu nuôi cấy mà

có thể điều chỉnh nhiệt độ cho phù hợp với sự phát triển của cây Nhiều loài cây có ngưỡng nhiệt độ thích hợp là 25±2ºC (Hoàng Thị Sản, 2009)

diễn ra trao đổi chất trong tế bào Đa số môi trường nuôi cấy có độ pH năm

ở khoảng 5,5-6 Nếu thấp hơn ảnh hưởng đến chuyển trạng thái gel của agar, lớn hơn sẽ làm agar bị cứng (Vũ Văn Vụ và cộng sự, 2009)

1.1.5 Thành phần môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật

Thành phần môi trường trong quá trình nuôi cấy là một trong những yếu tố quan trọng nhất ảnh hưởng đến sự phát triển, sinh trưởng của tế bào

và mô thực vật Tùy thuộc vào loài, loại tế bào hay bộ phân nuôi cấy sẽ có

môi trường nuôi cấy khác nhau Tuy nhiên, các loại môi trường vẫn gồm những thành phần chủ yếu sau: khoáng vi lượng, đa lượng, đường, các vitamin, các chất điều hòa sinh trường, kích thích sinh trưởng,… Ngoài ra

có thể bổ sung thêm một số loại khác như EDTA, nước dừa, dịch chiết nấm men, than hoạt tính,…

+ Nước: Nước chiếm 95% thành phần môi trường dinh dưỡng cho

cây, do đó cần phải chú ý đến thành phần này Không được sử dụng nước máy, nước mưa, hay nước giếng trong nuôi cấy mô tế bào thực do có thể chứa nguồn lây nhiễm hữu cơ và các loài vi khuẩn Chỉ nên sử dụng nước khử ion trong nuôi cấy (Nguyễn Quang Thạch, 2009)

+ Dinh dưỡng vô cơ: Đối với nuôi cấy mô tế bào thực vật đòi hỏi

nhu cầu về nguyên tố khoáng, cung cấp đầy đủ các chất dinh dưỡng cần thiết cho sự phát triển của cây

+ Đường: Một thành phần quan trọng cho môi trường nuôi cấy mô tế

bào thực vật là đường Trong đó loại đường được sử dụng chú yếu là

đường saccharose ở nồng độ 1-5% Đường saccharose được tổng hợp và

vận chuyển tự nhiên trong cây tạo điều kiện thuận lợi cho sự phát triển của các mô nuôi cấy Ngoài ra cũng có thể sử dụng đường glucose hoặc fructose trong nuôi cấy mô thực vật, nhưng chủ yếu vẫn là đường saccharose Loại và tuổi mẫu cấy sẽ ảnh hưởng đến nồng độ đường sử dụng

(Nguyễn Quang Thạch, 2009)

vật, thúc đẩy sinh trưởng, phát triển của mẫu nuôi cấy Các vitamin thường được sử dụng chủ yếu trong nuôi cấy mô là: nicotinic acid, Thiamin

(vitamin B1), myo-inositol và pyridoxine (vitamin B6)

thuộc vào mục đích nuôi cấy và độ tinh khiết của hóa chất, thông thường

trung bình từ 6-12 g/l Ở 80ºC agar ở trạng thái sol còn ở 40ºC thì agar ở trạng thái gel (Nguyễn Quang Thạch, 2009)

+ Chất điều hoà sinh trưởng (phytohormon): Chất điều hòa sinh

trưởng (ĐHST) là thành phần quan trọng trong môi trường nuôi cấy và

trong quá trình phát sinh hình thái thực vật trong nuôi cấy in vitro Chất

ĐHST phụ thuộc vào hoạt tính, nguồn gốc của mô nuôi cấy, nồng độ chất ĐHST sử dụng, … (Trịnh Đình Đạt, 2009)

Chất ĐHST được chia thành 2 nhóm là chất kích thích sinh trưởng (KTST) và nhóm ức chế sinh trưởng (ƯCST) Hai nhóm này có tác dụng sinh

lý trái ngược nhau Nhóm KTST gồm gibberellin, cytokinin và auxin Nhóm ƯCST như các chất diệt cỏ, etilen, ABA, các chất ức chế tổng hợp như

retardant, các hợp chất phenol,…

Ngoài ra trong môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật có thể bổ sung thêm các dung dịch hữu cơ khác như: chuối, nước ép khoai tây, dịch chiết nấm men, cazein thuỷ phân, than hoạt tính, nước dừa, … nhằm tăng cường sự sinh trưởng và phát triển của mô nuôi cấy (Nguyễn Quang Thạch, 2009)

+ Than hoạt tính: Than hoạt tính có tác dụng khử độc, hấp thụ các

chất màu và các hợp chất phenol, kích thích sự hình thành và sinh trưởng

của rễ, là chất chống oxy hóa tốt…

1.1.6 Các giai đoạn của nhân giống vô tính

Theo Trịnh Đình Đạt (2009), trong nuôi cấy mô tế bào thực vật gồm 5 giai đoạn như sau:

Giai đoạn chuẩn bị:

Giai đoạn này tạo ra nguồn nguyên liệu vô trùng để đưa vào nuôi cấy Có thể vô trùng mẫu nuôi cấy bằng một số chất có tác dụng diệt khuẩn như: H2O2, KMnO4, CaOCl2, HgCl2,NaOCl, …

Các mẫu ban đầu được lấy từ môi trường bên ngoài tự nhiên phải đảm bảo tỷ lệ sống cao, tỷ lệ nhiễm thấp, tốc độ sinh trưởng phát triển nhanh Để đảm bảo kết quả của giai đoạn này cần đảm bảo cách lấy mẫu, nồng độ chất khử trùng và thời gian xử lý mẫu Thường lựa chọn vật liệu ban đầu là các đỉnh sinh trưởng, chồi nách, hoặc đoạn thân mang chồi,…

Kết quả nghiên cứu của Sharma (2005) khi khử trùng bề mặt thân rễ cây Địa liền và cây Ngải máu bằng cồn 70%, sau đó sử dụng NaClO 1% hoặc HgCl2 0,2% trong 15 phút để tiêu diệt vi khuẩn và nấm bám trên mẫu Tương tự cũng sử dụng kết hợp giữa Cồn và HgCl2 đối với cây Sâm Ngọc Linh, tác giả Dương Tấn Nhựt và cộng sự (2011) đã thu được tỷ lệ mẫu sạch cao

Giai đoạn tái sinh mẫu nuôi cấy:

Giai đoạn tái sinh mẫu nuôi cấy là giai đoạn khử trùng đưa mẫu vào

nuôi cấy in vitro, mục đích tái sinh có định hướng cho sự phát triển của mô

nuôi cấy Yêu cầu giai đoạn này cần đảm bảo tỉ lệ sống cao, tỉ lệ nhiễm thấp

mô tồn tại sinh trưởng tốt Giai đoạn chịu tác động của các chất ĐHST, nồng

độ (tỷ lệ auxin/cytokinin) đưa vào môi trường nuôi cấy

Nayak và cộng sự (2011) đã nghiên cứu nồng độ BA từ 1-3 mg/l đến khả năng bật chồi của cây Riềng thì cho thấy ở nồng độ BA 3mg/l cho kết quả tốt nhất Behera và cộng sự (2010) sử dụng BAP 2 mg/l và NAA 0,5 mg/l để cảm ứng chồi cây nghệ vàng Mặt khác, phải quan tâm tới tuổi của mẫu đem nuôi cấy, thường sử dụng các mô non chưa phân hóa, có khả năng tái sinh sẽ cao hơn so với những mô đã chuyển hóa

Giai đoạn nhân nhanh chồi:

Giai đoạn nhân nhanh chồi kích thích phát sinh hình thái mô nuôi cấy và tăng sinh về số lượng thông qua việc tạo chồi bất định, hoạt hóa chồi nách và tạo phôi vô tính Mục đích của giai đoạn này là tạo hệ số cao nhất Do đó giai đoạn này góp phần quan trọng vào quá trình nuôi cấy mô

tế bào thực vật Để tăng hệ số nhân nhanh có thể bổ sung thêm vào môi trường nuôi cấy chất ĐHST như auxin, cytokinin,… hoặc nước dừa, dịch chiết nấm men, … Ngoài ra còn kết hợp thêm các điều kiện về nhiệt độ (25-27ºC), độ ẩm (60-80%), cường độ ánh sáng (2000-4000 lux) Mỗi loại mẫu nuôi cấy có thể kích thích nhân nhanh bằng việc kích thích phát triển chồi nách, kích thích sự hình thành cụm chồi, kích thích tạo cây từ phôi vô tính Ví dụ như kết quả nghiên cứu nhân nhanh đối với cây Giảo cổ lam, Jala và cộng sự năm 2012 cho kết quả khi kết hợp BA 1 mg/l và NAA 0,1 mg/l cho hệ số nhân chồi cao nhất đạt 6,8 chồi/mẫu sau 80 ngày nuôi cấy Như vậy nồng độ và loại chất ĐHST có ảnh hưởng tốc độ và chất lượng nhân nhanh của mẫu nuôi cấy

Giai đoạn tạo cây hoàn chỉnh:

Khi mẫu nuôi cấy trải qua giai đoạn nhân nhanh và đạt được kích thước nhất định, các mẫu chồi cây sẽ được chuyển sang môi trường ra rễ Trung bình sau khoảng 2-3 tuần, các chồi này sẽ được tách riêng lẻ và cấy vào môi trường ra rễ để kích thích ra rễ tạo thành cây hoàn chỉnh Giai đoạn này có thể

bổ sung thêm các chất ĐHST (nhóm auxin) vào môi trường nuôi cấy để kích thích sự hình thành và phát triển của rễ Nhóm auxin bao gồm các chất IAA, IBA, NAA, 2.4-D, là nhóm hormon thực vật có tác dụng tạo rễ phụ từ mô nuôi cấy

Giai đoạn cảm ứng cây in vitro ngoài điều kiện tự nhiên:

Giai đoạn cảm ứng cây in vitro ngoài điều kiện tự nhiên là giai đoạn

cuối cùng của quá trình nuôi cấy mô Giai đoạn này có vai trò quyết định

đến khả năng ứng dụng của quy trình nhân giống in vitro trong thực tiễn

sản xuất Trong giai đoạn này cây được chuyển từ môi trường dị dưỡng sang muôi trường tự dưỡng Yêu cầu ngoại cảnh thích hợp để cây có thể thích nghi và đạt tỷ lệ sống cao

Ví dụ trong nghiên cứu của Sen và cộng sự (2010) khi chuyển cây

nghệ in vitro sang đất vườn và cát cho thấy tỷ lệ 1:1 có kết quả 93% cây sinh

trưởng và phát triển được trong môi trường tự nhiên Kết quả nghiên cứu của Shahinozzaman (2013) lại cho thấy khi chuyển cây con sang môi trường hỗn

hợp đất vườn và phân ủ với tỷ lệ 1:1 cho thấy cây con in vitro có tỷ lệ sống cao

Như vậy, phương pháp nuôi cấy mô tế bào hiện nay được xem là giải pháp công nghệ quan trọng trong nhân giống thực vật Phương pháp nuôi cấy mô tế bào được thực hiện chỉ từ các mô hay các cơ quan thực vật có thể tái sinh thành cây hoàn chỉnh trong thời gian ngắn, tạo ra số lượng lớn các cây tương đồng về mặt sinh học và cấu trúc di truyền, góp phần nâng cao năng suất và chất lượng của cây trồng

1.2 Tổng quan nghiên cứu về Lan Kim tuyến trên thế giới

1.2.1 Phân loại, đặc điểm hình thái và tình hình phân bố

Vị trí phân loại của loài Lan kim tuyến được phân loại như sau: Giới (regnum): Plantae; Ngành (Phylum) : Magnoliophyta; Lớp (Class): Liliospida; Bộ (ordo): Asparagales; Họ (Family): Orchidaceae; Chi (genus):

Chi Lan Kim tuyến trên thế giới có khoảng 30-40 loài được phân bố rộng khắp ở các vùng nhiệt đới từ Đông Nam Á cho tới Ấn Độ, Trung Quốc,

thân, phủ lông màu nâu đỏ (Sherif et al., 2012)

1.2.2 Giá trị kinh tế

Lan Kim tuyến có nhiều tác dụng về giá trị dược liệu cũng như được làm cảnh, dẫn đến việc ngoài tự nhiên càng ngày càng bị thu hái đến mức cạn kiệt Trên thị trường thế giới, Lan Kim tuyến khô có giá bán là 3.200 USD/kg, cây tươi có giá từ 300-320 USD/kg Cây giống Lan Kim tuyến có thể nhân giống bằng nuôi cấy mô tế bào từ việc sử dụng các mắt ngủ trên thân, hạt giống và các bộ phận sinh dưỡng của cây Hiện nay nhiều nước chủ yếu sản xuất cây Lan Kim tuyến bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật Ở nhiều nơi trên thế giới đã trồng và xuất khẩu được Lan Kim tuyến mang lại nguồn thu lớn điển hình như Trung Quốc, Đài Loan, Nhật Bản

1.2.3 Giá trị dược liệu

Trung Quốc là nước có lịch sử lâu đời trong việc sử dụng các loài Lan Kim tuyến như một loại thảo dược quý Một số nghiên cứu chỉ ra rằng, Lan Kim tuyến có chứa các hợp chất hóa học như alkaloid, flavonoid, glycosides, axit 4-hydroxycinnamic, β-sitosterol, β-D-glucopyranoside, 3-glucosides

butanoic axit, kinsenoside (Sukamto et al., 2011)

Một số tài liệu nghiên cứu của Trung Quốc cũng cho thấy các kỹ thuật sắc ký cột, sắc ký lỏng, hay kỹ thuật quang phổ đã phân lập và xác định được cấu trúc hóa học của Lan Kim tuyến, cũng như xác định được hoạt tính sinh học của một số hợp chất có trong loài này Sử dụng kỹ thuật quang phổ đã xác định được 8 hợp chất hóa học có hoạt tính sinh học mạnh, khả năng làm giảm gốc tự do trong cơ thể, do đó có khả năng phòng bệnh Hai axít hữu cơ được phân lập ở cây Lan Kim tuyến là Olenolic acid và Ursolic acid có khả năng giảm cholesterol máu, kháng khuẩn, chống ung thư và chống tăng huyết áp

(Cheng et al., 2009)

Theo y học cổ truyền Đài Loan, Lan Kim tuyến tươi hoặc khô nấu nước uống có thể trị các chứng đau bụng, tiểu đường, viêm thận, sốt, huyết áp cao, liệt dương, các bệnh về gan, lá lách, tim, phổi Các hoạt chất trong Lan Kim tuyến có

khả năng kháng virus, kháng sưng viêm, bảo vệ gan và sử dụng để chữa các bệnh

về gan, chống khối u, ung thư, điều trị bệnh tim mạch, chống loãng xương, chống

mệt mỏi, chống lão hóa, tăng cường miễn dịch (Cheng et al., 2009) Hợp chất

3(R)-3-β-D glucopyranosyloxy butanolide hay còn gọi là kinsenoside được chiết xuất từ Lan Kim tuyến có tác dụng chống tăng huyết áp và chuyển hóa arachidonic acid có liên quan đến chức năng tim mạch Lan Kim tuyến chứa các nguyên tố vi lượng (Cu, Mn, Cr, Fe, Co) đóng vai trò quan trọng trong việc chống lão hóa, nâng cao khả năng miễn dịch trong cơ thể con người

Cây Lan Kim tuyến sau khi thu hoạch có thể được chế biến thành trà, thực phẩm chức năng Chiết xuất chất 3(R)-3-β-D-glucopyranosyloxy butanolide từ Lan Kim tuyến dùng để sản xuất biệt dược kinsenoside có giá trị

cao (Sukamto et al., 2011; Cheng et al., 2009)

1.2.4 Nhân giống Lan Kim tuyến

Loài Lan Kim tuyến đang phải đối mặt với các mối đe dọa lớn nhất do con người gây nên, mất môi trường sống, rừng bị phá hủy và suy thoái rừng Các mô hình phân bố loài lan thuốc tự nhiên theo địa hình, hay sự có mặt của chúng trong các khu bảo tồn đang là những vấn đề đặt ra cho các nhà khoa học Vì vậy nỗ lực của các nhà nghiên cứu là khám phá ra nơi tồn tại tự nhiên của những loài Lan Kim tuyến hay chính là những loại dược liệu quý này để phục vụ cho công tác bảo tồn và phát triển Hiện nay đã có nhiều công trình khoa học nghiên cứu nhân giống thành công Lan Kim tuyến trong điều kiện nhân tạo góp phần vào công tác phục hồi số lượng loài, nghiên cứu lai tạo

giống và đáp ứng mục tiêu y học

Hiện nay đã có nhiều công trình khoa học nghiên cứu nhân giống thành công chi Lan Kim tuyến, cụ thể như:

Sukamto và cộng sự (2011), đã so sánh sự khác nhau giữa 2 loài Lan

Kim tuyến A setaceus và A formosanus khi nhóm tác giả bổ sung TDZ trong môi trường nuôi cấy in vitro, họ đã tìm ra môi trường nuôi cấy A setaceus tốt

nhất với TDZ là 0,1mg/l, và A formosanus với TDZ là 0,5mg/l Số lá cao nhất của A setaceus khi nuôi cấy trong môi trường với hàm lượng TDZ 0,001mg/l, còn A formosanus với hàm lượng TDZ là 0,005mg/l Môi trường TDZ tạo ra số lượng chồi nhiều nhất đối với loài A setaceus là 0,01mg/l còn với A formosanus là 0,05mg/l Số rễ cao nhất của A setaceus trên TDZ là 0,001mg/l trong khi của A formosanus là 0,005mg/l

Sherif và cộng sự (2012) khi nghiên cứu nhân giống cho loài A elatus

Lindley và đã chỉ ra rằng ở nồng độ TDZ 3,0mg/l cho kết quả về số chồi tốt nhất và ở nồng độ KIN 3,5mg/l (với mắt đốt thân), ở 0,01mg/l đối với chồi đỉnh cho kết quả về chiều dài chồi đạt cao nhất Loài lan này ra rễ 100% ở môi trường có bổ sung than hoạt tính 0,3g/l

Nhìn chung, các nghiên cứu đã xác định được giá trị dược học và kinh

tế của Lan Kim tuyến Đồng thời các nghiên cứu nhân giống in vitro cho các

loài Lan Kim tuyến ở trên thế giới đã xác định được một số môi trường thích hợp Tuy nhiên, dù cùng một loài nhưng nguồn mẫu có xuất xứ khác nhau sẽ

có những yêu cầu cụ thể riêng về dinh dưỡng và các chế độ chăm sóc khi

nhân nuôi in vitro

1.3 Tổng quan nghiên cứu về Lan Kim tuyến ở Việt Nam

1.3.1 Phân loại, đặc điểm hình thái và tình hình phân bố

Chi Lan Kim tuyến (Anoectochilus) được phân bố rộng khắp ở Việt Nam

hiện thống kê được 12 loài Theo Sách đỏ Việt Nam (2007), Lan Kim tuyến có phân bố chủ yếu ở các tỉnh miền Bắc, miền Trung và khu vực Tây Nguyên như Lào Cai, Hà Tĩnh, Kontum, Quảng Trị, Lâm Đồng, Đắk Lắk Do số lượng Lan Kim tuyến mọc ít, mọc rải rác và bị khai thác quá nhiều (với hình thức khai thác thu hái cả cây) nên chúng đã được đưa vào Sách đỏ Việt Nam năm 2007 theo Nghị định 32/2006/NĐ-CP, xếp hạng EN A1 a, c, d và bị cấm khai thác sử dụng mục đích thương mại

Tác giả Nguyễn Hùng Mạnh cùng các cộng sự đã nghiên cứu đặc điểm

sinh thái của loài Lan Kim tuyến (A setaceus) tại vườn quốc gia Tam Đảo và

các vùng phụ cận Lan Kim tuyến phân bố tự nhiên ở kiểu rừng thứ sinh được phục hồi sau khai thác kiệt, ở độ cao xấp xỉ 405m so với mực nước biển, với tầng ưu thế sinh thái chủ yếu là loài Sặt (95%), xen lẫn một vài cây gỗ (5%); Lan Kim tuyến thích nghi với dạng địa hình núi đất có độ dốc từ 12-20º; độ

pH tầng A dao động từ 4,9-6,2; độ ẩm đất tầng A khoảng từ 18,5-65%; độ dày tầng A trung bình 19cm; tầng thảm mục (A0) trung bình khoảng 2,5cm; Hàm lượng mùn trung bình khoảng 4,653%, hàm lượng kali dễ tiêu (K20) trung bình khoảng 0,172%, hàm lượng nitơ (N20) dễ tiêu trung bình 0,185%, hàm lượng silic (SiO2) dễ tiêu trung bình khoảng 5,32%; cường độ ánh sáng tương đối tại khu vực phân bố tự nhiên của Lan Kim tuyến trung bình khoảng 0,01788; độ ẩm dao động khoảng từ 56-91%; Nhiệt độ trung bình tại khu vực phân bố tự nhiên của Lan Kim tuyến dao động khoảng từ 6-33oC (Nguyễn

Hùng Mạnh et al., 2015) Những kết quả này tương tự với những nghiên cứu trước đây về đặc điểm hình thái và phân bố loài Lan Kim tuyến A setaceus ở

Vườn Quốc gia Tam Đảo, Vĩnh Phúc của Phùng Văn Phê và cộng sự (2010)

1.3.2 Giá trị kinh tế

Lan Kim tuyến có tính dược liệu cao và có giá trị làm cảnh nên trên thị trường giá Lan Kim tuyến tại Việt Nam dao động từ 2-2,5 triệu/kg Lan Kim tuyến xuất xứ Việt Nam thu hái tự nhiên hiện được thương gia Đài Loan chào bán với giá 2800-4000 nhân dân tệ /1 kg (tương đương 8,5-12 triệu đồng/kg) Người dân đang ngày càng khai thác nguồn dược liệu Lan Kim tuyến cạn kiệt

để bán cho các thương nhân Hàn Quốc, Đài Loan, Trung Quốc (Trương Thị Bích Phượng và Phan Ngọc Khoa, 2013)

1.3.3 Giá trị dược liệu

Loài Lan Kim tuyến được xem là một loài cây có giá trị dược liệu cao trong y học Theo các nghiên cứu khoa học, sự có mặt của các hợp chất hóa

học tự nhiên trong sinh khối của chúng có tác dụng điều trị một số loại bệnh

về tim mạch, bệnh phổi, đặc biệt là phòng chống khối u, ung thư và chống một số nhóm virus, vi khuẩn gây bệnh ở người Ngoài ra, các nguyên tố vi lượng (Fe, Co, Cu, Mn, Zn, Cr) cũng được tìm thấy trong tất cả các cơ quan (thân, lá, rễ) của Lan Kim tuyến Các hợp chất này đóng vai trò quan trọng trong nâng cao hiệu quả chống lão hóa, chống loãng xương, đặc biệt chuỗi polysaccharide góp phần nâng cao hiệu lực của miễn dịch trong cơ thể con người

Năm 2019, Le Dinh Chac và cộng sự đã sử dụng phương pháp sắc

ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) để phân tích hàm lượng một số hợp chất có

trong dịch chiết khô của Anoectochilus setaceus Blume cho kết quả như

sau: hàm lượng quercetin là 106,8 µg, isorhamnetin là 187,2 µg và acid ferulic là 51,9 µg

Năm 2019, Nguyễn Nam Phương đã nghiên cứu thành phần hóa học có

trong cây Lan Kim tuyến Anoectochilus setaceus Blume được thu hái tại Thanh

Hóa có chứa các thành phần hoạt chất có dược tính cực kỳ quan trọng bao gồm: flavonoid (quercetin, isorhamnetin), steroid (24-isopropenyl cholesterol, sterol, ergosrol, stigmasterol, campesterol, sitosterol β), trierpenoids (friedelin, acid succinic, acid coumaric, acid ferulic, daocosterol, acid palmitic, acid aleanolic, acid bearberry), đường, alkaloid, glycoside, este, taurine, acid amin, nguyên tố vi lượng và các loại khoáng chất khác

1.3.4 Nhân giống Lan Kim tuyến

Trong tự nhiên loài Lan Kim tuyến có số lượng ít, lại phân bố rải rác trong rừng, khả năng tái sinh chậm Mà hoạt động khai thác vì mục đích thương mại đối với loại cây này ngày càng tăng làm cho chúng đang có nguy

cơ tuyệt chủng Lúc này, việc nghiên cứu nhân giống bảo tồn và phát triển loài lan dược liệu này đang là vấn đề cấp bách đặt ra cho các nhà khoa học

Trước thực trạng này, một số nghiên cứu khoa học đã thành công trong nhân

giống in vitro loài lan này

Phùng Văn Phê và cộng sự (2010), đã nghiên cứu loài Lan Kim tuyến

(A roxborghii và đưa ra kết quả khi nuôi cấy sử dụng mẫu từ phôi hạt chín và

chồi từ thể chồi cao từ 2-3 cm nuôi cấy trong môi trường nhân nhanh bao gồm Knud có bổ sung BAP 0,5 mg/l + Kinetin 0,3 mg/l + NAA 0,3 mg/l + ND 100 ml/l + dịch chiết khoai tây 100g/l + sucrose 20g/l + agar 7g/l + AC 0,5g/l

Nguyễn Quang Thạch và Phí Thị Cẩm Miên (2012) đã nghiên cứu quy

trình nhân nhanh in vitro loài Lan Kim tuyến (A setaceus) Kết quả thể chồi

và mắt đốt ngang thân có thể nuôi cấy trong môi trường nhân nhanh Knud có

bổ sung thêm BAP 0,5 mg/l + Kinetin 0,3 mg/l + αNAA 0,3 mg/l + sucrose 20g/l + than hoạt tính 0,5g/l + agar 7g/l cho hệ số nhân chồi là 6,55 chồi/mẫu Các chồi có chiều cao từ 3-4 cm được lựa chọn để cấy trong môi trường kích thích ra rễ tạo cây hoàn chỉnh Môi trường có bổ sung 1mg/l αNAA cho tỷ lệ

ra rễ là 100% và số rễ/chồi (4,21 rễ/chồi) là đạt cao nhất

Tác giả Trương Thị Bích Phượng và Phan Ngọc Khoa (2013), khi sử dụng vật liệu nghiên cứu là đỉnh sinh trưởng và đoạn thân mang chồi nách (2-3cm) sử dụng chất khử trùng HgCl2 0,1% trong 10 phút cho kết quả tốt nhất Đối với mẫu vật là quả lan Kim tuyến 40 ngày tuổi khử trùng bằng HgCl20,2% trong 10 phút đạt 75,62% tỷ lệ mẫu sống Môi trường MS cơ bản bổ sung 1,0mg/l Kinetin thích hợp cho đỉnh sinh trưởng và đoạn thân mang chồi nách tái sinh sau 8 tuần nuôi cấy (đạt 1,42 chồi/đỉnh sinh trưởng và 1,5 chồi/đoạn thân) và 12 tuần nuôi cấy để hạt lan nẩy mầm đạt tỷ lệ 88,3% Cụm protocorm được hình thành từ hạt được cấy chuyển trên môi trường MS bổ sung 1,0mg/l Kinetin sau 12 tuần đạt 5,62 chồi/cụm Đối với nhân chồi tốt nhất trên môi trường MS bổ sung 1,0mg/l Kinetin và 0,3 mg/l NAA, đạt 4,6 chồi/mẫu sau 12 tuần nuôi cấy Môi trường tạo rễ tốt nhất sau quá trình nhân nhanh chồi là môi trường MS cơ bản bổ sung 0,3mg/l NAA đạt 3,1 rễ/chồi

sau 8 tuần nuôi Tỷ lệ sống của cây con sau in vitro hoàn chỉnh ngoài vườn ươm đạt 70%

Trần Thị Hồng Thúy và cộng sự (2015) đã nghiên cứu nhân nhanh in

bodies Với mẫu lát cắt ngang thể chồi cho tỷ lệ cảm ứng tạo PLBs đạt 86,25%, sau 30 ngày nuôi cấy có khối lượng trung bình đạt 0,23 gram Các chồi hình thành và phát triển đến kích thước cho phép sẽ được tách riêng và chuyển sang môi trường tạo rễ Sau khoảng 60 ngày, trung bình các cây có khoảng 4,21±0,42 lá/cây; 3,20±0,67 rễ/chồi; chiều cao cây trung bình đạt 4,57±0,85 cm và hệ số nhân chồi đạt 29,66±4,04 chồi/cụm PLBs

Nghiên cứu của nhóm tác giả Đỗ Mạnh Cường và cộng sự (2015) cho thấy, sau 2 tháng nuôi cấy trên môi trường SH có bổ sung 1,0 mg/l BA loài

lan Kim tuyến (A setaceus) có sự khác biệt đáng kể về chiều cao chồi, khối

lượng tươi và khối lượng chất khô (tương ứng là 6,70cm; 1,41g và 0,1751g),

số đốt đạt cao nhất so với các công thức nghiên cứu khác (đạt 6,33 đốt/mẫu) Môi trường nhân nhanh chồi sau 2 tháng nuôi cấy là môi trường SH bổ sung 1,0mg/l BA kết hợp 1,0mg/l NAA Chồi sinh trưởng và phát triển tốt nhất, chiều cao chồi đạt 9,04cm và số đốt là 9,33 đốt/mẫu, khối lượng tươi và khô lần lượt tương ứng 2,63g và 0,2187g Chồi cây cho hệ rễ phát triển mạnh, đạt trung bình 7,33 rễ/mẫu với chiều dài 1,36cm

Nguyễn Quốc Đông và Phạm Văn Điển (2016), nghiên cứu lựa chọn môi trường thích hợp nhất để tạo cây hoàn chỉnh đối với giống Lan Kim tuyến được tiến hành ở phòng thí nghiệm tại Trường Đại học Nông lâm Thái Nguyên Kết quả cho thấy, việc khử trùng chồi Lan Kim tuyến bằng HgCl20,1% trong 10 phút cho kết quả mẫu sống không nhiễm cao nhất đạt 80% Môi trường thí nghiệm tái sinh MS + Inositol 100mg/l + đường 30g/l + GA3 0,3mg/l + BA 0,5mg/l + agar 5,2g/l, pH = 5,6-5,8 cho tỷ lệ mẫu tái sinh cao đạt 93,33 % Môi trường nhân nhanh MS + Inositol 100 mg/l + đường 30g/l +

BA 1mg/l + NAA 0,5mg/l + agar 5,2mg/l, pH từ 5,6-5,8 cho hệ số nhân nhanh đạt 5,9 lần Môi trường ra rễ MS + Inositol 100mg/l + đường 30g/l + NAA 1mg/l + agar 5,2g/l, pH = 5,6-5,8 cho khả năng ra rễ cây Lan Kim tuyến đạt cao nhất 3,6 rễ/cây Môi trường MS + Inositol 100mg/l + đường 30g/l + NAA 0,5mg/l + agar 5,2g/l, pH từ 5,6-5,8 cho chất lượng rễ mập, đều và dài

Theo nghiên cứu của nhóm tác giả Phan Xuân Huyên và cộng sự

(2016) đã nghiên cứu nhân giống in vitro và nuôi trồng loài A lylei Rolfe ex Downies ở điều kiện ex vitro Kết quả chỉ ra rằng môi trường MS có bổ sung

1 mg/l BA cho kết quả tái sinh chồi in vitro là tốt nhất; môi trường có bổ sung

0 – 2 mg/l NAA cho kết quả tái sinh rễ in vitro với tỉ lệ 100% Khi chuyển cây lan gấm in vitro ra điều kiện ex vitro sử dụng giá thể bao gồm 90% vụn

xơ dừa phối trộn 10% tro trấu là tốt nhất cho tỉ lệ sống đạt 100% Sau 20 ngày nuôi trồng, sử dụng phân Nitrophoska® Foliar với nồng độ 2 g/l cho kết quả sinh trưởng tốt

Kết quả nghiên cứu của nhóm tác giả Nguyễn Trọng Quyền và cộng sự

(2020) khi nghiên cứu nhân giống in vitro loài Lan Kim tuyến (Anoectochilus

thân khí sinh và thân rễ mang chồi ngủ hoặc chồi ngọn khử trùng bằng dung dịch bằng 0,1% (w/v) HgCl2 trong thời gian 7 phút và nuôi cấy trên môi trường MS bổ sung 0,5 mg/l BAP, 30 g/l sucrose cho tỷ lệ mẫu sạch tái sinh chồi 46,67% sau 4 tuần; hệ số nhân chồi đạt 8,75 chồi/mẫu, chồi hữu hiệu trung bình đạt 5,04 chồi/mẫu Chiều cao chồi đạt 2,45 cm sau 8 tuần nuôi cấy trên môi trường MS bổ sung 0,7 mg/l BAP, 0,2 mg/l Kinetin, 0,1 mg/l NAA

và 30 g/l sucrose Tỷ lệ chồi ra rễ tạo cây hoàn chỉnh đạt 100% và 3,64 rễ/chồi, chiều dài rễ trung bình 2,07 cm sau 6 tuần nuôi cấy trên môi trường

MS bổ sung 1,5 mg/l NAA, 20 g/l sucrose và 2 g/l than hoạt tính Bình cây con hoàn chỉnh được huấn luyện 1 tuần trong điều kiện ánh sáng tán xạ cho cây thích nghi với điều kiện tự nhiên, cây con được trồng trên giá thể dớn cho

tỷ lệ sống đạt 96,7%, tăng trưởng chiều cao 0,94 cm và tăng trưởng đường kính 0,034 mm sau 8 tuần ra ngôi, cây sinh trưởng, phát triển tốt

Nhìn chung, các nghiên cứu trong nước đã mô tả, phân loại các loài Lan Kim tuyến, đã xác định được giá trị kinh tế của mỗi loài Các kết quả

nghiên cứu nhân giống in vitro cho một số loài Lan Kim tuyến thu ở những

địa phương khác là cơ sở khoa học quan trọng để đề tài tham khảo trong nghiên cứu này Cũng giống như nhiều loài cây trồng khác, mỗi dòng (giống) trong cùng một loài đều cần có quy trình nhân giống với các chế độ dinh dưỡng và chăm sóc riêng Với nguồn mẫu Lan Kim tuyến thu tại Thái Nguyên chưa được nghiên cứu đầy đủ và cần có nghiên cứu sâu hơn để xác

định nhu cầu cụ thể về dinh dưỡng và các chế độ chăm sóc khi nhân nuôi in

Chương 2 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

- Đối tượng nghiên cứu: Lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus

Blume) thu thập tại tỉnh Thái Nguyên được lưu trữ tại Viện Nghiên cứu và Phát triển Lâm Nghiệp nay được đổi tên là Viện Lâm nghiệp và Phát triển bền vững, Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên

- Thời gian: từ tháng 6/2021 - 6/2022

2.2 Nội dung nghiên cứu

- Nghiên cứu đặc điểm hình thái của loài Lan Kim tuyến có xuất xứ ở Thái Nguyên

- Nghiên cứu phương pháp khử trùng mẫu Lan Kim tuyến bằng HgCl2 với các công thức thời gian xử lý khác nhau để tạo vật liệu vô trùng phục vụ việc tái sinh in vitro

- Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất kích thích sinh trưởng (GA3, BAP, GA3 kết hợp với BAP) với các nồng độ khác nhau đến khả năng nhân nhanh chồi cây Lan Kim tuyến

- Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất kích thích ra rễ (IAA, NAA, IBA)

với các nồng độ khác nhau đến khả ra rễ in vitro của cây Lan Kim tuyến

- Nghiên cứu giá thể thích hợp để ra ngôi cây Lan Kim tuyến sau giai

đoạn in vitro

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Hóa chất thiết bị phục vụ nghiên cứu

Các thí nghiệm nuôi cấy mô tế bào loài Lan Kim tuyến được nuôi cấy trên môi trường cơ bản MS (Murashige và Skoog, 1962)

Bảng 2.1 Thành phần cơ bản của môi trường MS

* Thiết bị

Các thiết bị dùng trong nuôi cấy mô tế bào: Bình tam giác 250ml, cốc thuỷ tinh định mức, nút cao su, pipet, bông, giấy làm nút, giấy thấm Bộ đồ cấy: pank cấy, đĩa cấy, kéo cắt, dao cấy, tủ cấy vô trùng, nồi hấp khử trùng, tủ sấy, máy đo pH, dàn nuôi cấy

2.3.2 Phương pháp kế thừa tài liệu

Kế thừa có chọn lọc các tài liệu, công trình nghiên cứu có liên quan của các nhà khoa học trong và ngoài nước đã nghiên cứu về nhân giống nuôi cấy

mô tế bào loài Lan Kim tuyến để bổ sung các thông tin cho luận văn

Kế thừa kết quả nghiên cứu về nhân giống các loài Lan nói chung và

chi Anoectochilus nói riêng của các tác giả trong và ngoài nước

Kế thừa mẫu vật liệu Lan Kim tuyến và kết quả ở dạng trung gian dự án khoa học công nghệ về quỹ gen cấp tỉnh “Bảo tồn nguồn gen cây dược liệu Lan Kim tuyến” do PGS.TS Trần Thị Thu Hà chủ trì năm 2020-2023

2.3.3 Phương pháp nghiên cứu đặc điểm hình thái loài Lan Kim tuyến có xuất xứ tại Thái Nguyên

Mô tả ngoài thực địa, kết hợp các tài liệu công bố loài và các mẫu đặt tại bảo tàng thực vật để giám định nhận dạng sơ bộ loài thông qua đặc điểm hình thái

Nghiên cứu, mô tả các đặc điểm sinh học loài Lan Kim tuyến: Quan sát hình dạng, màu sắc và tiến hành đo đếm các chỉ tiêu về kích thước, số lượng như: Chiều cao cây, kích thước thân, kích thức lá, đặc điểm rễ, hoa quả

2.3.4 Phương pháp nghiên cứu nhân giống Lan Kim tuyến bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào

2.3.4.1 Phương pháp nghiên cứu khử trùng mẫu tạo vật liệu vô trùng

Mẫu dùng cho nuôi cấy là phần thân cây có chứa các mắt ngủ của cây Lan Kim tuyến được thu thập tại Thái Nguyên

Mẫu khởi đầu (mẫu được lấy từ cây mẹ tại vườn giống gốc) được rửa

và loại bớt những bộ phận không cần thiết dưới vòi nước chảy Sau đó mẫu được ngâm trong nước xà phòng loãng trong 5 phút và rửa sạch dưới vòi nước cho hết sạch bụi bẩn và xà phòng Các mẫu Lan Kim tuyến được rửa lại bằng nước cất vô trùng 3 lần trước khi đem vào tủ cấy vô trùng để tiến hành khử trùng Trong tủ cấy, mẫu được rửa với cồn 70% trong khoảng 60 giây, sau đó

rửa lại bằng nước cất vô trùng 3 lần Sau đó mẫu tiếp tục được khử trùng bằng dung dịch HgCl2 0,1% ở những khoảng thời gian khác nhau

Sau khi khử trùng, cắt mẫu chứa chồi ngủ, cấy mẫu vào môi trường khởi động

Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng

HgCl2 0,1% đến khả năng tạo mẫu vô trùng Lan Kim tuyến

Bố trí thí nghiệm với 4 công thức HgCl2 0,1% tương ứng với các khoảng thời gian khác nhau: 0; 1; 2; 3; 5 phút

Bảng 2.2 Các công thức thí nghiệm ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng HgCl 2 0,1 % đến khả năng tạo vật liệu vô trùng Lan Kim tuyến Công thức (CT) Thời gian (phút)

Chỉ tiêu theo dõi:

- Tỉ lệ mẫu Lan Kim tuyến sống không nhiễm (%) = (Tổng số mẫu Lan Kim tuyến sống không nhiễm/tổng số mẫu cấy) x 100%

- Tỉ lệ mẫu Lan Kim tuyến sống bị nhiễm (%) = (Tổng số mẫu Lan Kim tuyến sống bị nhiễm/tổng số mẫu cấy) x 100%

- Tỉ lệ mẫu chết (%) = (Tổng số mẫu chết/tổng số mẫu cấy) x 100%

Các mẫu Lan Kim tuyến sống không nhiễm tiếp tục được sử dụng để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo

BAP) đến khả nhân nhanh chồi

Sau 2 tuần nuôi cấy trong môi trường khởi động, những mẫu sống

vô trùng sẽ được cấy chuyển sang môi trường tái sinh chồi, kích thích các chồi mới hình thành Môi trường tái sinh chồi là môi trường MS có bổ sung 30g saccarose/lít, 6g agar/l và các chất điều hòa sinh trưởng ở các nồng độ khác nhau

Thí nghiệm 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của GA3 đến khả năng nhân nhanh chồi của mẫu nuôi cấy

Bố trí thí nghiệm với 5 công thức tương ứng với GA3 ở các nồng độ khác nhau: 0; 0,2; 0,3; 0,5; 1,0 mg/l

Bảng 2.3 Các công thức thí nghiệm ảnh hưởng của nồng độ GA 3 đến khả

năng nhân nhanh chồi từ mẫu Lan Kim tuyến

Chỉ tiêu theo dõi:

- Tổng số chồi thu được

- Hệ số nhân chồi Lan Kim tuyến (lần) = Số chồi tạo thành/số chồi

- Chiều cao chồi trung bình (cm) = Tổng chiều cao của các chồi/số chồi

- Đánh giá chất lượng chồi:

Chồi tốt : Chồi mập, xanh đậm

Chồi trung bình : Chồi nhỏ, lá xanh

Chồi kém : Chồi nhỏ, lá vàng nhạt

Thí nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của BAP đến khả năng nhân

nhanh chồi của mẫu nuôi cấy Lan Kim tuyến

Bố trí thí nghiệm với 5 công thức tương ứng với BAP ở các nồng độ khác nhau: 0; 0,5; 1,0; 1,5; 2,0 mg/l

Bảng 2.4 Các công thức thí nghiệm ảnh hưởng của nồng độ BAP đến khả

năng nhân nhanh chồi từ mẫu Lan Kim tuyến

Chỉ tiêu theo dõi:

- Tổng số chồi thu được

- Hệ số nhân chồi Lan Kim tuyến (lần) = Số chồi tạo thành/số chồi

- Chiều cao chồi trung bình (cm) = Tổng chiều cao của các chồi/số chồi

- Đánh giá chất lượng chồi:

Chồi tốt : Chồi mập, xanh đậm

Chồi trung bình : Chồi nhỏ, lá xanh

BAP ở các nồng độ khác nhau: 0; 0,5; 1,0; 1,5 và 2,0 mg/l

Bảng 2.5 Các công thức thí nghiệm ảnh hưởng của tổ hợp GA 3 và BAP

đến khả nhân nhanh chồi mẫu Lan Kim tuyến Nồng độ GA 3 (mg/l) Nồng độ BAP (mg/l)

0,2

0,0 0,5 1,0 1,5 2,0

0,3

0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 Chỉ tiêu theo dõi:

- Tổng số chồi thu được

- Hệ số nhân chồi Lan Kim tuyến (lần) = Số chồi tạo thành/số chồi

- Chiều cao chồi trung bình (cm) = Tổng chiều cao của các chồi/số chồi

- Đánh giá chất lượng chồi:

Chồi tốt : Chồi mập, xanh đậm

Chồi trung bình : Chồi nhỏ, lá xanh

kích thích ra rễ (IAA, NAA, IBA) ở các nồng độ khác nhau Các thí nghiệm tạo rễ được bố trí 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại cấy 15 bình, mỗi bình cấy một mẫu Lan Kim tuyến Tiến hành theo dõi và đánh giá sau 30 ngày nuôi cấy, cụ thể như sau:

Thí nghiệm 5, 6, 7: Nghiên cứu ảnh hưởng của IAA, NAA, IBA đến

khả năng ra rễ của mẫu Lan Kim tuyến

Bảng 2.6 Các công thức thí nghiệm ảnh hưởng của IAA, NAA, IBA đến

khả năng ra rễ của mẫu chồi Lan Kim tuyến Công thức (CT) IAA (mg/l) NAA (mg/l) IBA(mg/l)

Chỉ tiêu theo dõi:

- Tỉ lệ chồi ra rễ (%) = (Tổng số chồi ra rễ/tổng số chồi cấy) x 100%

- Chiều dài rễ Lan Kim tuyến trung bình (cm) = Tổng chiều dài rễ/tổng số rễ

- Số rễ Lan Kim tuyến trung bình trung bình (cái) = Tổng số rễ/tổng

số mẫu theo dõi

- Chất lượng rễ:

+ Rễ tốt: Bề mặt rễ trơn nhẵn, màu trắng

+ Rễ trung bình: Bề mặt rễ trơn nhẵn, màu vàng nâu

+ Rễ kém: Bề mặt rễ sùi, màu vàng nâu

2.3.4.4 Phương pháp nghiên cứu giá thể thích hợp để ra ngôi cây Lan Kim tuyến sau giai đoạn in vitro

Cây Lan Kim tuyến con sau khi tạo cây hoàn chỉnh trong phòng thí nghiệm, cây con có chiều cao ≥ 4 cm, số rễ ≥ 3 rễ/cây, chiều dài rễ ≥ 2,0 cm,

chất lượng rễ tốt thì đem ra trồng trong các loại giá thể khác nhau, đặt trong vườn ươm và theo dõi sự phát triển của cây con trong vòng 30 ngày

Các bước đưa cây ra khỏi môi trường in vitro:

- Cây con đủ tiêu chuẩn được lấy từ trong các lọ tiêu chuẩn cấy

- Rửa bằng nước sạch cho hết phần thạch

- Nhúng vào dung dịch chống nấm rồi vớt ra

Sau đó đưa cây con vào từng môi trường giá thể nhất định, đặt cây trong vườn ươm, tưới nước đều đặn cho cây và che chắn cẩn thận

Cây giống Lan Kim tuyến được bố trí trên 4 công thức giá thể, mỗi công thức bố trí 45 cây con, lặp lại 3 lần, các công thức cụ thể như sau:

Bảng 2.7 Các công thức thí nghiệm giá thể để ra ngôi cây Lan Kim tuyến

sau giai đoạn in vitro

Chỉ tiêu theo dõi:

- Tỷ lệ sống (%) = Số cây sống/số cây ra ngôi

- Chiều cao cây trung bình (cm) = Tổng chiều cao/tổng số cây theo dõi

- Màu sắc thân, lá

2.3.5 Phương pháp phân tích và xử lý số liệu

Các số liệu được thu thập và xử lý theo phương pháp thống kê sinh học trên các phần mềm Excel và IRRISTAT 5.0