Nghiên cứu xây dựng quy trình tổng hợp cyclophosphamide làm thuốc điều trị ung thư

Các kết quả đã đạt được: • Đã tiến hành nghiên cứu và đề ra được quy trình khả thi có hiệu quả kinh tế và ứng dụng quy trình này để tổng hợp 4250 gam cyclophosphamide.. Lợi thế của giải

viện hoá học viện khoa học và công nghệ việt nam

18 Đường Hoàng Quốc Việt - Cầu Giấy - Hà Nội

Báo cáo tổng kết khoa học kỹ thuật

đề tài:

"nghiên cứu xây dựng quy trình tổng hợp cyclophosphamide làm thuốc điều trị ung thư"

GS TSKH Trần Văn Sung

6500

10/9/2007

Hà Nội, 4 - 2006

Bản quyền 2006 thuộc VHH - VAST

Đơn xin sao chép toàn bộ hoặc từng phần tài liệu này phải gửi đến Viện trưởng VHH - VAST trừ trường hợp sử dụng cho mục đích nghiên cứu

viện hoá học viện khoa học và công nghệ việt nam

18 Đường Hoàng Quốc Việt - Cầu Giấy - Hà Nội

Báo cáo tổng kết khoa học kỹ thuật

đề tài:

"nghiên cứu xây dựng quy trình tổng hợp cyclophosphamide làm thuốc điều trị ung thư"

GS TSKH Trần Văn Sung

Hà Nội, 4 - 2006

Bản thảo viết xong 1/ 2006

Tài liệu này được chuẩn bị trên cơ sở kết quả thực hiện Đề tài cấp Nhà nước, mã số KC 10 25

Danh sách cán bộ tham giathực hiện đề tài

Chủ nhiệm đề tài

1 GS.TSKH Trần Văn Sung Viện Hoá học, Viện KH và CNVN

Cán bộ tham gia nghiên cứu

2.2.1 Nghiên cứu quy trình tổng hợp cyclophosphamide 19

Quy trình tinh chế sản phẩm cyclophosphamide 28 2.2.2 Nghiên cứu khẳng định cấu trúc hoá học của sản phẩm

2.2.6.1 Đề cương nghiên cứu thử nghiệm lâm sàng 39 2.2.6.2 Kết quả nghiên cứu thử nghiệm lâm sàng 42 2.2.7 Nghiên cứu độ bền của cyclophosphamide 48 2.2.7.1 Nghiên cứu độ bền của nguyên liệu cyclophosphamide 48 2.2.7.2 Nghiên cứu độ bền của cyclophosphamide ở trong dung dịch

cứu xây dựng quy trình tổng hợp cyclophosphamide làm thuốc điều trị ung

thư" có mã số KC 10.25 đặt ra các mục đích sau đây:

• Nghiên cứu xây dựng quy trình tổng hợp cyclophosphamide có tính khả thi,

-• Các phương pháp tổng hợp được dựa theo patent của Đức, Liên minh Châu

Âu, Mỹ có kết hợp với các tài liệu tham khảo khác, được thực hiện tại trường

ĐHKHTN - ĐHQG Hà Nội và Viện Hoá học, Viện KH và CNVN

• Các phương pháp nghiên cứu về y dược được sử dụng là những phương pháp quy chuẩn của Bộ Y tế, được thực hiện tại các cơ quan khoa học do Bộ Y tế chỉ định như Viện Kiểm nghiệm, xí nghiệp Dược phẩm TW I và bệnh viện K

Hà Nội

1.3 Các kết quả đã đạt được:

• Đã tiến hành nghiên cứu và đề ra được quy trình khả thi có hiệu quả kinh tế

và ứng dụng quy trình này để tổng hợp 4250 gam cyclophosphamide

• Đã đưa ra được bộ phổ chuẩn của cyclophosphamide tổng hợp được gồm: IR,

MS, LC/ MS, 1H -, 13C - NMR

• Sản phẩm cyclophosphamide tổng hợp ra đã được nghiên cứu độc tính cấp và

độc tính bán cấp, được phân tích, kiểm nghiệm theo tiêu chuẩn Dược điển Anh BP 2001 Tất cả các tiêu chí đều đạt

• Cyclophosphamide đã được bào chế thành thuốc bột pha tiêm trên dây chuyền GMP của xí nghiệp Dược phẩm TW I Thuốc và nước cất pha tiêm

đạt tiêu chuẩn BP 2001

• Thuốc cyclophosphamide đã được nghiên cứu lâm sàng giai đoạn I đối với

bệnh nhân ung thư tình nguyện tại bệnh viện K Hà Nội

Kết quả: Với liều 750 mg/ m2 da cơ thể các bệnh nhân đều có đáp ứng một phần Liều 750 mg/ m2 da cơ thể là liều sử dụng an toàn

1.4 Kết luận và kiến nghị

• Đề tài đã hoàn thành tốt các mục tiêu đã đề ra và theo đúng tiến độ

• Thanh quyết toán tài chính theo đúng dự toán và quy định của nhà nước

• Đề nghị Bộ Khoa học và Công nghệ xem xét phê duyệt giai đoạn tiếp theo

của Đề tài để nghiên cứu lâm sàng giai đoạn II và III nhằm đánh giá hiệu

quả chống ung thư của thuốc và đưa ra sản xuất, đáp ứng nhu cầu trong nước, thay thế thuốc nhập khẩu

dễ tan trong cồn, tan vừa phải trong ete

2.1.1.1 Cơ chế tác dụng của cyclophosphamide

Cyclophosphamide được sử dụng nhiều trong lâm sàng với một phổ tác dụng rộng và hiệu quả đối với các bệnh ung thư ở người Ngoài lý do về tác dụng điều trị, cyclophosphamide còn có cơ chế tác dụng rất độc đáo và tính chọn lọc trong điều trị

Hiện nay cyclophosphamide là loại thuốc chống ung thư được sử dụng nhiều nhất trong điều trị hoá chất liều cao với tổng liều lượng dùng là 500 -700mg/m2 da người trong 1 đến 4 ngày Là một loại hoạt chất dễ mất nitơ, cyclophosphamide

đóng vai trò ankyl hoá ADN làm cho ADN không tháo rời được, do vậy không tạo thành ARN do đó dẫn tới việc tái sản xuất tế bào bị kìm hãm, trước hết là đối với

các hệ tế bào phát triển nhanh như các tuyến tiết, da, tuỷ xương và đặc biệt là các u

ác tính [1,2]

Các hợp chất có tính ankyl hoá sẽ tấn công vào quá trình trao đổi chất của a xít nucleic và kìm hãm sự phát triển hoặc tiêu diệt những tế bào bị bệnh Tuy nhiên, chúng cũng tấn công cả tế bào lành và ở liều hiệu dụng chúng cũng có độc tính đáng

-H + +H +

H 2 N P

- Cl

-H 2 N P

N

CH 2 CH 2 Cl

H 2 N P

H 2 N P

N

CH 2 CH 2 Nu

+ Nu + Nu -

-H 2 N P

Tuy nhiên, cơ chế chính xác của quá trình alkyl hoá của chất (A) vẫn là vấn

đề còn ít được biết Các bước theo trình tự trên bao gồm các chất azinidin trung gian

đã được minh chứng bằng các thí nghiệm đơtêrô hoá Nhưng liệu chất (A) sẽ tham gia phản ứng alkyl hoá nguyên vẹn hay liên kết P-N sẽ bị cắt trước khi alkyl hoá thì hiện vẫn còn tranh cãi [6]

Theo nguyên lý về ''dạng vận chuyển" (transport) và '' dạng hoạt tính '' (active form) của một biệt dược đối với các chất có tác dụng ankyl hoá thì một hoạt chất cần được đưa vào cơ thể ở ''dạng vận chuyển'' tức là ở dạng chưa có hoạt tính Dạng này sẽ chuyển thành ''dạng hoạt tính'' trong cơ thể và nếu có thể thì ngay tại vị trí

cần điều trị có nghĩa là làm tăng độ chọn lọc của thuốc Ví dụ: Đối với các chất dễ

bị loại nitơ thì hợp chất chứa nhóm oxit nitơ (N→O) là một '' dạng vận chuyển'' thực thụ Nguyên lý này đã được áp dụng với loại thuốc chữa ung thư tiền liệt tuyến

là stilbeoestroldiphosphate

Như đã biết thì trong cơ thể người bệnh, tại bộ phận bị ung thư có tồn tại một enzym dạng phosphamidasa và phosphatasa có thể thuỷ phân được liên kết phosphamide và este của axit phosphoric

Với ý tưởng là: độ chọn lọc của thuốc sẽ tăng đáng kể, nếu ''dạng hoạt tính''

được tạo thành trực tiếp tại vị trí cần điều trị, người ta đã tổng hợp ra chất

phosphamide este II để nghiên cứu động dược học của cyclophosphamide

Cl

II

2.1.1.2 Tổng hợp cyclophosphamide

Cyclophosphamide đã được Arnold, Bourseaux và Hirsch [3,4] tìm ra lần đầu

tiên năm 1956 trong phòng nghiên cứu của nhà máy Asta với ký hiệu là B518 Việc

tổng hợp ra chất này là kết quả của sự mong muốn áp dụng nguyên lý ''dạng vận chuyển" và '' dạng hoạt tính '' Cyclophosphamide được sử dụng trong điều trị ung thư từ năm 1958 hoặc 1970 [1] Ngoài ra, cyclophosphamide còn được sử dụng như một chất ức chế miễn dịch để điều trị các bệnh tự miễn như nhược cơ, thấp khớp, lupút ban đỏ và đặc biệt để chống thải ghép trong các ca ghép tạng [19, 24, 25]

Arnold, Bourseaux và Brock [7] đã nghiên cứu mối quan hệ giữa cấu trúc và hoạt tính kháng ung thư của hợp chất này Kết quả thu được ở chất cyclophosphamide là rất khả quan về mặt dược lý và lâm sàng [4]

Cơ chế biến đổi của cyclophosphamide trong cơ thể đã được C.L Roux và cộng sự tiếp tục nghiên cứu [6]

Một dẫn xuất khác của cyclophosphamide có nhóm thế ở mạch vòng cũng đã

được tổng hợp để nghiên cứu hoạt tính chống ung thư [7, 8, 25]

Cyclophosphamide còn được sử dụng làm độc tố cho sơn chống hà dùng cho các tàu biển [9]

Trong những năm gần đây, tính chất dược lý của cyclophosphamide vẫn còn

được tiếp tục nghiên cứu [10,11,12]

Kể từ khi tìm ra cyclophosphamide vào năm 1956 và bản quyền sáng chế (patent) đầu tiên được chấp nhận vào năm 1957 [26] cho đến nay vẫn luôn có các bản quyền sáng chế mới về tổng hợp cyclophosphamide được đăng ký Bản quyền sáng chế gần đây nhất mà chúng tôi có được là của Ulf Niemeyer và cộng sự vào cuối năm 2001 [28] Nhìn chung các patent về tổng hợp cyclophosphamide đều dựa theo sơ đồ như sau:

R 3

O N

R 1

R 2 HN

R 1

R 2

với R1 và R2 là chloroethyl, R3 và R4 là H Người ta thường áp dụng giải pháp kỹ

thuật tiên tiến được gọi là "phản ứng hai bước trong cùng một nồi phản ứng"

(two-stage one-pot reaction) Lợi thế của giải pháp kỹ thuật này là:

ư Hiệu suất tổng của phản ứng cao

ư Không phải tách sản phẩm trung gian

ư Chi phí cho thiết bị phản ứng thấp

ư Giảm thời gian sản xuất

ư Tiêu thụ ít nguyên liệu đầu

ư Không phải chạy sắc ký hoặc các bước tinh chế khác

ư Giảm lượng chất thải gây độc hại tới môi trường

Để thực hiện kỹ thuật này, người ta cho phosphoryl halogenid và hai chất amin là bis 2- chloroethyl amin và n- propylamin- 3- ol tác dụng với nhau trong một dung môi hữu cơ trơ với một chất kiềm hỗ trợ, tránh sự có mặt của nước và alcol,

không cần tách các sản phẩm trung gian Các tác nhân được cho lần lượt vào bình phản ứng

Điều đặc biệt quan trọng ở đây là hạn chế tối đa ảnh hưởng của nước hoặc hơi ẩm đối với các tác nhân, đặc biệt là POCl3 Nếu có mặt nước trong môi trường phản ứng thì sẽ có nhiều sản phẩm phụ và hiệu suất thu được cyclophosphamide bị giảm nhanh chóng Và như vậy sản phẩm chỉ kết tinh được sau khi phải có thêm bước tinh chế ví dụ chạy sắc ký cột Những quy trình tổng hợp cyclophosphamide trước năm 2001 chưa đánh giá được hết mức độ ảnh hưởng của nước đối với phản ứng này

Ngoài nước ra, thì các alcol cũng không được có mặt trong môi trường phản ứng Người ta đã chứng minh được rằng: sự có mặt lượng vết methanol hoặc ethanol trong dung môi sẽ tạo ra nhiều phản ứng phụ và làm giảm hiệu suất

Phản ứng được thực hiện trong một dung môi hoặc một hỗn hợp dung môi hữu cơ trơ Có thể sử dụng các dung môi như: dichlorometan, 1,2- dichloroetan, chloroform, dioxan, acetonitril, tetrahydrofuran và toluen

Nồng độ của hỗn hợp phản ứng, tức là tỷ lệ giữa các chất 1, 2, 3, với thể tích

dung môi có thể dao động từ 0,1 đến 6 mol/ lit

Các amin 1 và 2 được sử dụng theo tỷ lệ mol tương đương nhau Nếu amin 2

ít hơn amin 1 5% hoặc nhiều hơn 20% cũng không có vấn đề gì

Chất kiềm hỗ trợ (để kéo axit ra khỏi hỗn hợp phản ứng) có thể là triethylamin, pyridin, hoặc natri cacbonat Nhìn chung, tỷ lệ mol giữa các amin với chất kiềm là tương đương nhau

Ví dụ: Nếu amin 2 (n- propylamin- 3- ol) tham gia phản ứng ở dạng muối thì

cần hai đương lượng chất kiềm hỗ trợ, còn nếu nó ở dạng kiềm tự do thì chỉ cần một

đương lượng chất kiềm hỗ trợ là đủ

Phản ứng ngưng tụ của POCl3 với amin là phản ứng toả nhiệt Để kiểm soát

được nhiệt độ phản ứng ta phải cho các tác nhân vào từ từ và phải làm lạnh hỗn hợp

phản ứng Có nhiều cách khác nhau khi cho các tác nhân vào bình phản ứng được mô tả trong các bản quyền sáng chế

Ví dụ: Có thể nhỏ giọt từ từ POCl3 vào một amin ở dạng kiềm tự do; hoặc chất kiềm hỗ trợ như triethylamin được cho từ từ vào hỗn hợp gồm POCl3 và một amin ở dạng muối ở giai đoạn đầu của phản ứng nhiệt độ nhìn chung được giữ trong khoảng từ - 40 oC đến 20 oC, trong nhiều trường hợp người ta giữ phản ứng ở nhiệt độ giữa - 20 oC đến ± 10 oC Nhiệt độ có thể tăng tới 100 oC sau khi đã phản ứng được một nửa, hoặc tăng đến nhiệt độ sôi của dung môi nếu cần thiết bằng cách

đun nóng

Trong một trường hợp khác người ta cũng có thể tiến hành như sau:

• Bước một: Cho chất bis- 2- chloroethylamin vào bình, sau đó cho từ từ n- propylamin- 3- ol cùng với chất kiềm hỗ trợ (ví dụ: triethylamin) vào bình Chất n- propylamin- 3- ol có thể đưa vào bình phản ứng ở dạng muối và trong dung môi; chất bis- 2- chloroethylamin và kiềm hỗ trợ sẽ lần lượt được đưa từ

từ vào bình, hoặc cũng có thể được cho chảy cùng một lúc vào bình từ hai ngả sao cho chất kiềm hỗ trợ luôn luôn dư so với bis- 2- chloroethylamin

• Bước hai: POCl3 có thể được cho từ từ cùng với chất kiềm hỗ trợ vào hỗn hợp phản ứng của bước một, hoặc ngược lại, hỗn hợp của bước một được cho từ từ vào dung dịch POCl3 và chất kiềm hỗ trợ

Nhằm giảm thiểu tối đa lượng nước trong hỗn hợp phản ứng thì tất cả các hoá chất và thiết bị phản ứng đều phải khô tuyệt đối

Ví dụ: phải sấy nóng thiết bị phản ứng để loại hơi nước, làm khan dung môi

và các tác nhân trước lúc phản ứng POCl3 phải cất lại trong điều kiện khô trước khi dùng Hàm lượng nước trước lúc phản ứng không được vượt quá 0,5%, tốt hơn cả là trong khoảng từ 0,001% đến 0,1%

Các sản phẩm phụ sẽ được hạn chế nếu hỗn hợp phản ứng được xử lý với các chất phụ gia trước khi phản ứng Các chất phụ gia này có thể là: Rây phân tử; oxit nhôm ở các dạng khác nhau, chlorua canxi (dạng khan hoặc ngậm nước), P2O5 và

MgCl2 Lượng chất phụ gia nhìn chung dao động trong khoảng 5 đến 150 gam/ mol chất bis- 2- chlor ethylamin Hỗn hợp phản ứng có thể ở dạng dung dịch hoặc huyền phù và thường được khuấy từ

2

1

cho đến 3 giờ trước lúc phản ứng ngưng tụ được bắt đầu bằng việc cho thêm chất kiềm hỗ trợ hoặc POCl3 vào bình

Sau khi phân tử chlor thứ nhất hoặc thứ hai của POCl3 đã phản ứng, người ta

có thể lọc tách muối tạo thành hoặc rửa hỗn hợp phản ứng, sau đó cho phản ứng tiếp tục bằng cách bổ sung thêm amin và chất kiềm hỗ trợ

Xử lý hỗn hợp phản ứng sau khi phản ứng kết thúc được bắt đầu bằng việc lọc tách muối, hoặc/ và rửa với nước ở các độ pH khác nhau Cần chú ý tránh sự thuỷ phân hoặc tan vào nước của sản phẩm bằng cách cho thời gian tiếp xúc với pha nước ngắn và làm lạnh hỗn hợp

Có thể xử lý hỗn hợp phản ứng theo phương pháp khan, nghĩa là trung hoà hỗn hợp phản ứng bằng khí HCl cho tới pH = 4 - 6 Ngoài ra, sử dụng các axit yếu như axit acetic, axit oxalic cũng đem lại kết quả

2.1.1.3 Tiêu chuẩn của cyclophosphamide được mô tả trong các Dược điển

• Trong Dược điển Việt Nam, lần xuất bản thứ 3, Nhà xuất bản Y học,

năm 2002 chúng tôi không thấy có cyclophosphamide

• Trong Dược điển Anh BP 2001 trang 510, những tiêu chuẩn chính của

cyclophosphamide được mô tả như sau:

ư Cyclophosphamide có hàm lượng không dưới 98,0% và không quá

đương lượng của 102,0% (RS)- 2- [bis (2- chloroethyl) amino] tetrahydro- 2H- 1, 3, 2- oxaphosphorin- 2- oxit tính theo chất khan

ư Là bột tinh thể màu trắng hoặc gần trắng, tan trong nước, tan hoàn toàn trong cồn, tan ít trong ete

ư Điểm nóng chảy 51 oC Chênh lệch điểm nóng chảy không được quá 2

o

C

ư pH: Dung dịch của 0,50 gam cyclophosphamide trong 25 ml nước đã khử CO2 sẽ có pH từ 4,0 đến 6,0, đo ngay sau khi pha

ư Cl- (chlorid): Hoà tan 0,15 gam cyclophosphamide trong 15 ml nước

đã khử CO2 Hàm lượng ion Cl- của dung dịch vừa pha chế không được vượt quá 330 ppm

ư PO43- (phosphat): Hoà tan 0,10 gam cyclophosphamide trong 100 ml nước đã khử CO2 Hàm lượng ion phosphat của dung dịch không được vượt quá 100 ppm

ư Kim loại nặng: Không được quá 20 ppm tính theo chì

ư Nước: Từ 6,0 đến 7,0% xác định với lượng 0,300 gam cyclophosphamide theo phương pháp bán vi lượng

• Dược điển châu Âu (EP 1997) trang 697: cũng đưa ra các phương

pháp xác định và các tiêu chuẩn của cyclophosphamide tương tự như Dược điển Anh BP 2001

• Dược điển Mỹ (USP 25) trang 491 năm 2002:

ư Cyclophosphamide có hàm lượng không dưới 97,0% và không nhiều quá 103,0% tính theo sản phẩm khan

ư Lưu ý: Rất thận trọng khi làm việc với cyclophosphamide vì đó là chất gây độc tế bào mạnh

ư Đóng gói và bảo quản: Bảo quản trong thùng kín, ở nhiệt độ trong khoảng từ 2 oC đến 30 oC

ư pH: nằm giữa 3,9 và 7,1 trong một dung dịch (1 trong 100), đo 30' sau khi pha

ư Nước: Từ 5,7 đến 6,8%

ư Kim loại nặng: Hoà tan 1,0 gam cyclophosphamide trong 25 ml nước, nếu cần thiết thì lọc lại dung dịch Hàm lượng kim loại nặng không

được vượt quá 0,002%

• Dược điển Nhật Bản JP XIII trang 314:

ư Cyclophosphamide có hàm lượng không dưới 97,0%

ư Tinh thể trắng hoặc bột tinh thể

ư Tan rất tốt trong axit acetic băng, tan hoàn toàn trong cồn, trong anhydrit acetic và trong CHCl3, tan trong nước và ete

ư Điểm nóng chảy 45 o

C - 53 oC

ư Màu sắc dung dịch: Hoà tan 0,20 gam cyclophosphamide trong 10 ml nước, dung dịch phải trong suốt và không màu

ư Cl-: Kiểm tra với dung dịch của 0,40 gam cyclophosphamide ở nhiệt

độ không quá 20 oC Dung dịch chuẩn là: 0,40 ml 0,01 mol/ lit axit HCl Hàm lượng ion Cl- không quá 0,036%

ư Kim loại nặng: Kiểm tra với 1,0 gam cyclophosphamide Dung dịch so sánh được pha với 2,0 ml dung dịch chì tiêu chuẩn Hàm lượng kim loại nặng không quá 20 ppm

ư Nước: Từ 5,7 đến 7,0% (0,5 gam, chuẩn độ trực tiếp)

ư Đóng thùng và bảo quản: Thùng kín, bảo quản ở dưới 30 oC

2.1.1.4 Tình hình nghiên cứu, sử dụng cyclophosphamide tại Việt Nam

Khoa Hoá học trường Đại học Tổng hợp Hà Nội đã tiến hành nghiên cứu các phương pháp điều chế và cơ chế tác dụng của các hợp chất cơ phốt pho nhằm phục

vụ nông nghiệp và y tế [13-15]

Cyclophosphamide đã qua bước nghiên cứu cơ bản trong đề tài ''Tổng hợp một số hợp chất cơ kim có hoạt tính sinh lý mạnh'' cấp Bộ Đại học, Trung học

chuyên nghiệp, mã số 149/QĐ ngày 01/3/1972, nghiệm thu ngày 30/10/1975 và đề tài cấp nhà nước '' Tổng hợp các chất chống virus'' mã số 510801, Hà Nội 2002

Hiện nay cyclophosphamide đã và đang được sử dụng trong chương trình đa hoặc đơn hoá trị liệu để chữa các chứng bệnh sau:

• Các bệnh bạch cầu: Bệnh bạch cầu dạng lymphô bào và dòng tuỷ bào cấp hay mãn

• U hạch ác tính: Bệnh Hodgkin, ung thư hạch không Hodgkin, u tương bào

• U tạng đặc ác tính có di căn và không di căn: Ung thư buồng trứng, ung thư

cổ tử cung, nội mạc tử cung, ung thư tinh hoàn, ung thư vú, ung thư phổi tế bào nhỏ, u nguyên bào thần kinh, u nguyên bào võng mạc, sarcoma Ewing

• Các bệnh tự miễn tiến triển: Viêm khớp dạng thấp, bệnh khớp do vẩy nến, lupus ban đỏ hệ thống, sơ cứng bì, viêm mạch máu hệ thống (kèm hội chứng thận hư), một số thể viêm cầu thận (kèm hội chứng thận hư), bệnh nhược cơ nặng, thiếu máu tán huyết tự miễn, bệnh ngưng kết tố lạnh

• Điều trị ức chế miễn dịch trong ghép tạng

Cyclophosphamide có thể dùng được cả hai đường uống hoặc tiêm Sau khi uống, thuốc được hấp thụ tới 75% qua đường tiêu hoá, nó phân bố rộng rãi ở khắp các mô và đi qua hàng rào máu não Cyclophosphamide còn đi qua cả rau thai và sữa mẹ

Thời gian bán huỷ của cyclophosphamide là từ 4 đến 8 giờ Thuốc đạt nồng

độ đỉnh trong huyết thanh trong vòng 1 giờ sau khi uống Nó được thải trừ qua nước tiểu ở dạng không biến đổi dưới 10% và dạng chuyển hoá từ 85- 90%

Cyclophosphamide có thể gây ra các tác dụng phụ Tuy nhiên các tác dụng ngoại ý thường phụ thuộc vào liều dùng và hầu hết các trường hợp bị tác dụng phụ

đều có thể hồi phục được

Các tác dụng phụ có thể có của cyclophosphamide:

+ Về huyết học: Giảm bạch cầu kèm theo nguy cơ bị nhiễm trùng; giảm tiểu cầu kèm tăng nguy cơ xuất huyết; thiếu máu kèm giảm Hemoglobine (trên 2g/ 100ml so với giá trị ban đầu)

+ Về tiêu hoá: Buồn nôn và ói mửa

+ Đường niệu sinh dục: Viêm bàng quang

+ Đối với gan: ít gặp

ư Endoxan dạng viên bao và dạng bột pha tiêm của hãng Asta Medica [17],

ư Cytoxan dạng viên nén và bột pha tiêm của hãng Bristol - Myers Squibb

ư Neosar dạng bột pha tiêm của hãng Pharmacia & Upjohn

• Theo thống kê của Bộ Y tế, hàng năm nước ta có khoảng 150.000 người mới mắc bệnh ung thư cần được điều trị [16] Số lượng bệnh nhân ngày càng tăng

do tỷ lệ sống kéo dài của những bệnh nhân ung thư đã mắc từ 3 đến 5 năm Trong số đó khoảng 30% cần được điều trị tiếp ở giai đoạn cuối và giai đoạn

di căn

Như vậy, trong 1 năm có khoảng 50.000 bệnh nhân cần dùng cyclophosphamide đơn độc hay phối hợp với các loại thuốc khác Mỗi đợt điều trị cần sử dụng 500mg/ m2 da; trung bình cần 6 đợt điều trị cho một bệnh nhân Diện tích bề mặt da trung bình của người Việt Nam là 1,6m2

Giá thuốc hiện nay của Đức là: ≈ 45.000đ/ 200mg; của Hàn Quốc là: ≈ 22.000đ/ 200mg Như vậy nếu chỉ tính theo giá thuốc của Hàn Quốc thì số tiền Việt Nam cần phải chi để mua thuốc đã là: 22.000đ x 240.000.000 : 200 = 26.400.000.000đ (hai mươi sáu tỷ bốn trăm triệu đồng)

Số liệu trên cho thấy, cần gấp rút tổ chức nghiên cứu sản xuất cyclophosphamide trong nước để điều trị ung thư và các bệnh khác Ngoài việc sử dụng để điều trị ung thư thì cyclophosphamide còn được dùng nhiều để điều trị các bệnh khác như chống thải ghép (dùng cho các ca ghép gan, thận, da, v.v ), các bệnh thuộc về ức chế miễn dịch như lupút ban đỏ, vẩy nến, viêm khớp thể nhẹ

Điều đặc biệt quan trọng nữa là: cyclophosphamide có thể được bào chế bằng cách đóng viên nén dùng đường uống giá rẻ, dễ bảo quản và vận chuyển để phục vụ

đồng bào vùng sâu, vùng xa, người nghèo bị mắc bệnh ung thư và một số bệnh khác

2.1.2 Trích dẫn nội dung thuyết minh của đề tài

• Giới thiệu về chủ nhiệm đề tài và cơ quan quản lý đề tài:

Tên đề tài: "Nghiên cứu xây dựng quy trình tổng hợp

cyclophosphamide làm thuốc điều trị ung thư"

Thuộc chương trình: Khoa học và Công nghệ trọng điểm cấp nhà nước giai đoạn

2001-2005: "Khoa học và Công nghệ phục vụ bảo vệ và chăm sóc sức khỏe cộng đồng"

Chủ nhiệm đề tài: Họ và tên: Trần Văn Sung

Học hàm/học vị: GS TSKH

Chức danh khoa học: Nghiên cứu viên cao cấp (NCVCC)

Điện thoại: (CQ)/ 04-7564794; (NR) 04-8570894; Fax: 04-8361283; Mobile: 0913210527

E-mail: tvs@ich.ncst.ac.vn

Địa chỉ cơ quan: Viện Hoá học, Viện KH & CNVN

18 Đường Hoàng Quốc Việt, Cầu Giấy, Hà Nội

Địa chỉ nhà riêng: Số nhà 35, Ngõ 198, phố Thái Hà, Hà Nội

Cơ quan chủ trì đề tài: Viện Hoá học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Điện thoại: 04-7564312; Fax: 04- 8361283 E-mail: vpvhoa@ich.ncst.ac.vn

Địa chỉ: 18 Đường Hoàng Quốc Việt, Quận Cầu Giấy, Hà Nội

Mục tiêu của đề tài: Xây dựng được quy trình công nghệ tổng hợp và tinh chế

thuốc cyclophosphamide đạt tiêu chuẩn Dược điển Anh

(BP- 2001)

• Nội dung nghiên cứu:

+ Nghiên cứu quy trình tổng hợp và tinh chế cyclophosphamide

+ Kiểm tra độ tinh khiết của các hoá chất, dung môi sử dụng

+ Tinh chế các hoá chất, dung môi sử dụng

+ Nghiên cứu quy trình tổng hợp và tinh chế sản phẩm trung gian I

+ Nghiên cứu quy trình tổng hợp và tinh chế sản phẩm trung gian II

+ Nghiên cứu quy trình điều chế cyclophosphamide trong các điều kiện phản ứng khác nhau (dung môi, tác nhân)

+ Nghiên cứu tinh chế cyclophosphamide trong các điều kiện khác nhau

+ Xác định cấu trúc và kiểm tra độ tinh khiết của cyclophosphamide: Kiểm tra độ tinh khiết bằng các phương pháp sắc ký như sắc ký lớp mỏng, sắc ký khí, sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), sắc ký lỏng gắn khối phổ (LC/ MS)

và phân tích nguyên tố

+ Xác định cấu trúc của cyclophosphamide bằng các phương pháp phổ như

IR, MS, NMR, so sánh với phổ của chất chuẩn

+ Kiểm nghiệm cyclophosphamide: Theo tiêu chuẩn Dược điển Anh

BP-2001

+ Nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn cơ sở của cyclophosphamide

+ Xác định độc tính của cyclophosphamide: Xác định độc tính cấp trên chuột nhắt trắng và chó; LD50 trên chuột nhắt trắng, độc tính bán trường diễn + Báo cáo sơ kết

• Bào chế đóng lọ bột thuốc cyclophosphamide và ống nước cất pha tiêm:

+ Đóng 15.000 lọ thuốc bột pha tiêm đạt tiêu chuẩn trên dây chuyền GMP tại

xí nghiệp dược phẩm TW1

+ Đóng 15.000 ống nước cất để pha thuốc tiêm đạt tiêu chuẩn tại xí nghiệp dược phẩm TW1

• Nghiên cứu tác dụng lâm sàng của cyclophosphamide:

+ Xây dựng đề cương trình Hội đồng đạo đức của Bộ Y tế cho phép thử nghiệm lâm sàng

+ Lựa chọn bệnh nhân đạt tiêu chuẩn để thử nghiệm như sau

- Khám lâm sàng

- Các xét nghiệm cận lâm sàng ( phải có xét nghiệm mô bệnh học)

- Chẩn đoán xác định bệnh

- Chẩn đoán giai đoạn bệnh

- Các tiêu chuẩn lựa chọn bệnh nhân

+ Tiến hành thử nghiệm lâm sàng giai đoạn I sau khi đã được sự cho phép của

Bộ Y tế

- Tiến hành điều trị bệnh nhân theo phác đồ

- Đánh giá kết quả đáp ứng của bệnh

- Theo dõi các tác dụng phụ và độc tính của thuốc

- Báo cáo kết quả thử lâm sàng

• Tiến độ thực hiện

TT Các bước/công đoạn thực hiện Sản phẩm phải đạt Thời gian

1 Xây dựng thuyết minh chi

tiết của đề tài Bản thuyết minh chi tiết

1/ 1/ 2004 - 15/ 1/ 2004

2 Nghiên cứu quy trình tổng

hợp giai đoạn I (chất VIII) Quy trình tổng hợp giai đoạn I

1/ 2004 - 6/ 2004

3 Nghiên cứu quy trình tổng

hợp giai đoạn II (chất IX) Quy trình tổng hợp giai đoạn II

6/ 2004 - 12/ 2004

4 Nghiên cứu quy trình tổng

hợp cyclophosphamide cyclophosphamide thô

6/ 2004 - 12/ 2004

5 Nghiên cứu quy trình tinh

chế cyclophosphamide 4250g cyclophosphamide

1/ 2004 - 12/ 2004

6 Kiểm tra độ tinh khiết, xác

định cấu trúc các sản phẩm Bộ phổ chuẩn

6/ 2004 - 12/ 2004

cyclophosphamide Theo tiêu chuẩn của BP2001

6/ 2004 - 1/ 2005

cyclophosphamide Báo cáo kết quả

6/ 2004 - 1/ 2005

9 Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở

của cyclophosphamide TCCS

8/ 2004 - 12/2004

-11/2005

14 Viết báo cáo tổng kết đề tài,

11/2005 12/2005

-• Yêu cầu kỹ thuật, chỉ tiêu chất lượng đối với sản phẩm tạo ra

Dự kiến số lượng sản phẩm tạo

- Hàm lượng cyclophosphamide

-

Nước cất pha thuốc Khi soi dưới

bóng điện 40W trên nền đen phải

trong suốt Mối hàn ống không

Cl

CH 2 CH 2

• Kinh phí thực hiện đề tài phân theo các khoản chi

Đơn vị tính: Triệu đồng

Trong đó

TT Nguồn kinh phí Tổng số khoán Thuê

chuyên môn

Nguyên, vật liệu, năng lượng

Thiết bị máy móc

Xây dựng, sửa chữa nhỏ

Chi khác

Hợp tác quốc tế

2.2 Các kết quả nghiên cứu của Đề tài:

2.2.1 Nghiên cứu quy trình tổng hợp cyclophosphamide:

Qua công tác sưu tầm và tham khảo tài liệu về các phương pháp tổng hợp

cyclophosphamide của các nhà khoa học trên thế giới [18 - 24], thì việc tổng hợp

cyclophosphamide dựa theo bản quyền sáng chế của các nhà khoa học Đức [22 - 24]

là tương đối thuận lợi và có tính khả thi cao

Các cán bộ khoa học của Viện Hoá học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt

Nam và của trường Đại học Khoa học Tự nhiên thuộc Đại học Quốc gia Hà Nội đã

tiến hành nghiên cứu tổng hợp cyclophosphamide ở quy mô phòng thí nghiệm theo

HOCH2CH2

SOCl2+

CHCl3

NH HCl ClCH2CH2

ClCH2CH2

100 ml SOCl2 trong 100 ml CHCl3 được nhỏ từ từ (khoảng 30 phút) vào hỗn

hợp gồm 50 ml diethanol amine trong 100 ml CHCl Hỗn hợp phản ứng tự sôi lên,

sau đó chuyển dần về dạng trong suốt Đun hồi lưu nhẹ cho bay hết khí SO2 và HCl (khoảng 30 phút); giữ hỗn hợp phản ứng ở nhiệt độ phòng trong 1 giờ; hạ lạnh xuống 10 oC; sản phẩm phản ứng tự kết tinh, lọc, rửa sản phẩm bằng ete làm khô ở

áp suất thấp Kết tinh lại sản phẩm trong dung môi là aceton thu được 50g sản phẩm tinh: Đnc = 216 - 217 oC, hiệu suất 59%

2 Et 3 N

P O

+ Tổng hợp "Sản phẩm trung gian I"

Dung dịch gồm 76g (1 mol) 3-amino-1-propanol và 222g (2,2 mol) triethyl amine trong 1000 ml CH2Cl2 được làm lạnh tới -10 oC bằng hỗn hợp đá muối Sau

đó vừa khuấy vừa nhỏ vào dung dịch trên từng giọt dung dịch gồm 153g (1 mol) POCl3 trong 500 ml CH2Cl2 đãđược làm lạnh trước Quá trình nhỏ giọt diễn ra trong khoảng 2 giờ, sao cho phản ứng được duy trì ở nhiệt độ không vượt quá -10 oC Tiếp tục khuấy thêm 3 giờ nữa, ngừng khuấy, để qua đêm

+ Tổng hợp cyclophosphamide từ "Sản phẩm trung gian I"

Vừa khuấy vừa cho từ từ dung dịch đã được làm lạnh tới -5 oC bằng hỗn hợp

đá muối của 178,5g bis-(2-chloroethyl) amine hydrochloride hoà tan trong 1000 ml

CH2Cl2 vào hỗn hợp phản ứng trên Sau đó tiếp tục nhỏ thêm từng giọt của 222 g

Et3N Quá trình nhỏ giọt diễn ra trong khoảng 2 giờ, sao cho phản ứng được duy trì

ở nhiệt độ không vượt quá -5 oC Tiếp tục khuấy ở nhiệt độ phòng thêm 3 giờ nữa, ngừng khuấy, làm lạnh Lọc bỏ kết tủa Et3N.HCl, rửa lại với 500 ml CH2Cl2, thu lấy phần nước lọc, cô quay dưới áp suất thấp Phần cặn thu được được hoà tan trong 600

ml H2O, để qua đêm ở + 5 oC Lọc, rửa kết tủa bằng nước lạnh, thu được 218 g (78%) cyclophosphamide sạch: Đnc = 41 - 45 oC

+ Nghiên cứu ảnh hưởng của dung môi đến hiệu suất phản ứng

Phản ứng đã được tiến hành thử nghiệm với các loại dung môi khác nhau để tìm được dung môi thích hợp cho phản ứng Kết quả được chỉ ra ở bảng 1

Bảng 1: Kết quả nghiên cứu lựa chọn dung môi thích hợp để tổng hợp bis - (β -

chloroethyl) amine hydrochloride

+ Nghiên cứu khảo sát tìm điều kiện tối ưu của phản ứng

Tiến hành khảo sát ảnh hưởng của việc thay đổi tỷ lệ mol của các chất tham gia phản ứng với nhau, và thay đổi tỷ lệ giữa lượng chất tham gia phản ứng với lượng dung môi được dùng cho phản ứng đến hiệu suất thu hồi sản phẩm

cyclophosphamide Kết quả được chỉ ra ở các bảng 2.2 và 2.3

Bảng 2.2: Kết quả nghiên cứu khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ (mol : mol) giữa các

chất tham gia phản ứng với nhau tới hiệu suất thu hồi sản phẩm

TT Chất tham gia phản ứng Tỷ lệ (mol / mol) Hiệu suất (%)

Kết luận: Tỷ lệ giữa các chất tham gia phản ứng với nhau là 1:1 (mol / mol)

là thích hợp nhất để tổng hợp sản phẩm trung gian I

Bảng 2.3: Kết quả nghiên cứu khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ (mol / mol) giữa các

chất tham gia phản ứng với dung môi dùng cho phản ứng

TT Chất tham gia phản ứng Tỷ lệ (mol / mol) Hiệu suất (%)

3

Lượng chất tham gia phản ứng : Lượng

dung môi dùng cho phản ứng

Như vậy: Nếu dùng tỷ lệ giữa các chất tham gia phản ứng với dung môi dùng

cho phản ứng là 1:2,20 là thích hợp nhất bởi hiệu suất cao, tiết kiệm được dung môi

Nghiên cứu khảo sát ảnh hưởng của dung môi và tác nhân phản ứng tới hiệu

suất thu hồi sản phẩm Kết quả được chỉ ra ở các bảng 3.1 và 3.2

Bảng 3.1: Nghiên cứu lựa chọn dung môi thích hợp để tổng hợp cyclophosphamide

Bảng 3.1: Kết quả nghiên cứu lựa chọn tác nhân thích hợp để tổng hợp

cyclophosphamide

2 Et3N

CH 2 Cl 2

NH ClCH2CH2

ClCH2CH2

P

Cl O Cl

(Sản phẩm trung gian II)

+ Tổng hợp "Sản phẩm trung gian II"

153 g POCl3 đ−ợc cho thêm vào dung dịch huyền phù của 178 g chloroethyl) amine hydrochloride trong 1500 ml CH2Cl2, làm lạnh tới -5 oC bằng hỗn hợp đá muối Sau đó vừa khuấy vừa nhỏ vào huyền phù trên từng giọt dung dịch của 300 ml triethyl amine Quá trình nhỏ giọt diễn ra trong khoảng 2 giờ, sao cho phản ứng đ−ợc duy trì ở nhiệt độ không v−ợt quá -5 oC Khuấy tiếp 3 giờ ở nhiệt độ phòng

bis-(2-+ Tổng hợp cyclophosphamide từ "Sản phẩm trung gian II"

Hỗn hợp phản ứng tổng hợp "Sản phẩm trung gian II" đ−ợc làm lạnh xuống

-10 oC Sau đó vừa khuấy vừa nhỏ vào dung dịch trên từng giọt của dung dịch gồm

76 g (1mol) 3-amino-1-propanol trong 300 ml Et3N Quá trình nhỏ giọt diễn ra trong khoảng 3 giờ, sao cho phản ứng đ−ợc duy trì ở nhiệt độ không v−ợt quá -5 oC Tiếp

tục khuấy ở nhiệt độ phòng thêm 3 giờ nữa, ngừng khuấy, làm lạnh, để qua đêm Lọc bỏ kết tủa Et3N.HCl, thu lấy phần nước lọc, cô quay dưới áp suất thấp Phần cặn thu được được chiết bằng 4000 ml Et2O, bão hoà nước để qua đêm ở + 5 oC Lọc, rửa sản phẩm kết tinh bằng Et2O lạnh, thu được 212 g (76%) cyclophosphamide sạch:

Đnc = 41 - 45 oC

+ Khảo sát ảnh hưởng của thời gian và nhiệt độ tới hiệu suất phản ứng

Nghiên cứu khảo sát tìm điều kiện tối ưu để thu được sản phẩm trung gian II

với hiệu suất cao, dễ xử lý bằng cách thay đổi nhiệt độ phản ứng và thời gian phản

ứng Kết quả được nêu ở các bảng 4.1 và 4.2

Bảng 4.1: Kết quả nghiên cứu khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ phản ứng tới hiệu

suất thu hồi sản phẩm

khống chế nhiệt độ của phản ứng sẽ đơn giản hơn

Bảng 4.2: Kết quả nghiên cứu khảo sát ảnh hưởng của thời gian tiến hành phản ứng

tới hiệu suất quá trình tổng hợp sản phẩm trung gian II

TT Thời gian phản ứng (giờ) Hiệu suất (%) Ghi chú

Bảng 5.1: Kết quả nghiên cứu lựa chọn dung môi thích hợp để tổng hợp

cyclophosphamide từ sản phẩm trung gian II

Bảng 5.2: Kết quả nghiên cứu khảo sát ảnh hưởng của thời gian tiến hành phản ứng

tới hiệu suất thu hồi sản phẩm

Thời gian phản ứng (giờ)

khoảng 2 giờ, sao cho phản ứng được duy trì ở nhiệt độ không vượt quá -10 C Tiếp tục khuấy thêm 3 giờ nữa, ngừng khuấy, để qua đêm Lọc bỏ kết tủa Et3N.HCl, rửa lại với 500 ml CH2Cl2, thu lấy phần nước lọc, cô quay dưới áp suất thấp Kết tinh lại trong benzene, thu được 135g sản phẩm tinh: Đnc = 80 - 82 oC, hiệu suất 89%

2 Et3N

CH2Cl2 NH

P O

155 g sản phẩm trung gian I và 178,5g bis-(2-chloroethyl) amine

hydro-chloride được hoà tan trong 1000 ml CH2Cl2, làm lạnh tới -5 oC bằng hỗn hợp đá muối Sau đó vừa khuấy vừa nhỏ vào dung dịch trên từng giọt của 222 g Et3N Quá trình nhỏ giọt diễn ra trong khoảng 2 giờ, sao cho phản ứng được duy trì ở nhiệt độ không vượt quá -5 oC Tiếp tục khuấy ở nhiệt độ phòng thêm 3 giờ nữa, ngừng khuấy, làm lạnh Lọc bỏ kết tủa Et3N.HCl, rửa lại với 500 ml CH2Cl2, thu lấy phần nước lọc, cô quay dưới áp suất thấp Phần cặn thu được được hoà tan trong 600 ml

H2O, để qua đêm ở + 5 oC Lọc, rửa kết tủa bằng nước lạnh, thu được 192,5 g (69%) cyclophosphamide sạch: Đnc = 41 - 45 oC

Quy trình IV:

a/ Tổng hợp bis - (β - chloroethyl) amine hydrochloride

NH HOCH2CH2

HOCH2CH2

SOCl2+

CHCl3

NH HCl ClCH2CH2

ClCH2CH2

100 ml SOCl2 trong 100 ml CHCl3 được nhỏ từ từ (khoảng 30 phút) vào hỗn hợp gồm 50 ml diethanol amine trong 100 ml CHCl3 Hỗn hợp phản ứng tự sôi lên, sau đó chuyển dần về dạng trong suốt Đun hồi lưu nhẹ cho bay hết khí SO2 và HCl (khoảng 30 phút); giữ hỗn hợp phản ứng ở nhiệt độ phòng trong 1 giờ; hạ lạnh xuống 10 oC; sản phẩm phản ứng tự kết tinh, lọc, rửa sản phẩm bằng ete làm khô ở

áp suất thấp Kết tinh lại sản phẩm trong dung môi là aceton thu được 50g sản phẩm tinh: Đnc = 216 - 217 oC, hiệu suất 59%

b/ Tổng hợp sản phẩm trung gian II

POCl3 HCl HN

CH2CH2Cl

CH2CH2Cl +

2 Et3N

CH2Cl2

NH ClCH2CH2

ClCH2CH2

P

Cl O Cl

(Sản phẩm trung gian II)

+ 2 Et3N HCl

153 g POCl3 được cho thêm vào dung dịch huyền phù của 178 g chloroethyl) amine hydrochloride trong 1000 ml CH2Cl2, làm lạnh tới -5 oC bằng hỗn hợp đá muối Sau đó vừa khuấy vừa nhỏ vào huyền phù trên từng giọt dung dịch của 300 ml triethyl amine Quá trình nhỏ giọt diễn ra trong khoảng 2 giờ, sao cho phản ứng được duy trì ở nhiệt độ không vượt quá -5 oC Sau 3 giờ ngừng khuấy, để qua đêm Lọc bỏ kết tủa Et3N.HCl, rửa lại với 500 ml CH2Cl2, thu lấy phần nước lọc, cô quay dưới áp suất thấp Kết tinh lại trong hỗn hợp dung môi là acetone và ete dầu

bis-(2-mỏ, lọc thu được 232g sản phẩm trung gian II: Đnc = 54 - 56 oC, hiệu suất 90%

c/ Tổng hợp cyclophosphamide từ sản phẩm trung gian II

độ không vượt quá -5 oC Tiếp tục khuấy ở nhiệt độ phòng thêm 3 giờ nữa, ngừng khuấy, làm lạnh Lọc bỏ kết tủa Et3N.HCl, thu lấy phần nước lọc, cô quay dưới áp suất thấp Phần cặn thu được được chiết bằng 4000 ml Et2O, bão hoà nước để qua

đêm ở + 5 oC Lọc, rửa sản phẩm kết tinh bằng Et2O lạnh, thu được 191 g (68,5%) cyclophosphamide sạch: Đnc = 41 - 45 oC

So với các công trình khoa học đã được công bố bởi các nhà khoa học Đức, thì các quy trình tổng hợp cyclophosphamide mà Đề tài đã nêu ở trên đã được thay

đổi ở một số điểm cho phù hợp với điều kiện nóng, ẩm và thiếu trang thiết bị chuyên

Đề tài đã tiến hành thử nghiệm lặp lại nhiều lần từng quy trình tổng hợp cyclophosphamide đã nêu ở trên Các kết quả thu được là cơ sở cho việc phân tích,

so sánh và đánh giá độ ổn định và tính lặp lại của từng quy trình, từ đó đúc kết kinh

nghiệm và xây dựng Quy trình công nghệ tối ưu có thể áp dụng cho sản xuất để

tổng hợp lượng lớn cyclophosphamide

Quy trình tinh chế sản phẩm cyclophosphamide:

Để thu được cyclophosphamide dược dụng thì vẫn cần phải tinh chế lại sản phẩm cyclophosphamide mà Đề tài đã tổng hợp được

Qua quá trình nghiên cứu thử nghiệm Đề tài đã chọn được giải pháp tối ưu để tinh chế cyclophosphamide:

ư Loại bỏ tạp chất

ư Kết tinh lại cyclophosphamide trong hỗn hợp dung môi ethanol/ nước với tỷ

lệ 3 : 5 (v/v)

ư Làm khô ở nhiệt độ phòng dưới áp suất giảm (400 mm Hg)

Cụ thể như sau: 100 g cyclophosphamide được hoà tan trong 300 ml hỗn hợp dung môi [ethanol : nước (3: 5)], cho thêm vào dung dịch 1g than hoạt tính (được làm từ xương động vật), vừa khuấy vừa đun nóng trên bếp cách thuỷ ở nhiệt độ 50 -

55 o C trong khoảng 15 phút, lọc bỏ than hoạt tính Phần nước cái được để kết tinh qua đêm ở +5 o C, lọc, làm khô dưới áp suất thấp, thu được 60 g cyclophosphamide dược dụng: Đnc = 41 - 44 o C

Kết luận:

• Qua các thử nghiệm trên, Đề tài đã chọn Quy trình I là quy trình có độ ổn

định cao, ít sản phẩm phụ, dễ tinh chế, thời gian phản ứng ngắn và cho hiệu suất thu hồi cao để tổng hợp cyclophosphamide

• Quy trình này có thể áp dụng để tổng hợp cyclophosphamide ở lượng lớn

• Đã chọn được quy trình tinh chế sản phẩm đơn giản để thu được cyclophosphamide đạt tiêu chuẩn nguyên liệu để bào chế thuốc pha tiêm

• Giá thành của sản phẩm cyclophosphamide nếu sản xuất trong nước theo

Quy trình I sẽ vào khoảng 50 - 60 % giá thành của thuốc nhập khẩu (ở đây chỉ tính giá nguyên liệu)

2.2.2 Nghiên cứu khẳng định cấu trúc hoá học của sản phẩm

cyclophosphamide tổng hợp được:

• Viện Hoá học, Viện KH và CNVN đã tiến hành xác định các thông số vật

lý và đo các phổ của cyclophosphamide tổng hợp được, có so sánh với cyclophosphamide chuẩn của CHLB Đức như sau:

- Điểm chảy của cyclophosphamide: Đnc: = 42 - 44 oC, được đo trên máy

đo điểm chảy IA 9200 do hãng Electrothermal (Đan Mạch) sản xuất

- Kiểm tra độ tinh khiết bằng sắc ký lớp mỏng: Trên bản mỏng tráng sẵn của hãng Merck GF254 với hệ dung môi là: acid formic : aceton : nước : methylethylketon (2 : 4 : 12 : 80) Sản phẩm chỉ cho một vệt và hoàn toàn trùng với vệt của cyclophosphamide chuẩn của Đức

- Phổ khối va chạm electron (EI-MS) được đo trên máy Hewlett Packard 5989B MS Engine: Phổ (EI-MS) cho các đỉnh: m/z = 260 [M]+; 211 [M -

CH2Cl]+ ; 120 [M - Cl2C4H8N]+ ; 92 [M - ClC3H6N]+; 56 [C3H6N]+ Phổ này hoàn toàn trùng với phổ của cyclophosphamide chuẩn

Phổ khối (EI-MS) của cyclophosphamide do Đề tài tổng hợp được

- Ngoài ra, để kiểm tra độ tinh khiết của cyclophosphamide tổng hợp được chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu phổ LC/ MS (Sắc ký lỏng ghép nối khối phổ: LC/ MS được đo trên máy 1100 LC/ MSD Trap do hãng Agilent (Mỹ) sản xuất: Trên phổ đồ có một pic với thời gian lưu 18,4 phút, số khối m/z = 260,9 Pic 260,9 là pic của ion phân tử của cyclophosphamide Cyclophosphamide của Đề tài và cyclophosphamide chuẩn cho cùng thời gian lưu và phổ khối

Sắc ký lỏng/ khối phổ (LC/ MS) của cyclophosphamide do Đề tài tổng hợp được

- Phổ hồng ngoại (IR): Đo dạng viên nén KBr trên máy IMPACT - 410 của hãng Carl Zeiss Jena (CHLB Đức) Phổ IR cho các đỉnh ở ν*max = 3479,

3436, 3193, 2965, 1454, 1223, 1186, 1051, 743 cm -1, trùng với phổ của chất chuẩn

Phổ hồng ngoại (IR) của cyclophosphamide tổng hợp được

- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân phân giải cao H - và C - NMR được đo trong dung môi CDCl3; trên máy Bruker AVANCE 500 MHz

+ 1H - NMR: δ (ppm): 4,44 m (1H); 4,29 m (1H); 3,62 m (4H); 3,48 m (5H); 3,40 m (1H); 2,64 s br (1H); 1,95 m (1H);

Phổ 1 H - NMR của cyclophosphamide do Đề tài tổng hợp được

+ 13C - NMR: δ (ppm): 67,4; 48,7; 42,3; 41,5; 25,8 (m = đa bội; sbr = đơn bội tù)

Phổ 13 C - NMR của cyclophosphamide do Đề tài tổng hợp được

+ Kết luận: Tất cả các phổ của sản phẩm cyclophosphamide tổng hợp được

đã được so sánh với phổ của thuốc Endoxan (cyclophosphamide) do hãng

Baxter Oncology GmbH - CHLB Đức sản xuất, hiện đang được Bệnh viện

K sử dụng trong điều trị bệnh ung thư Kết quả cho thấy, các phổ của cả 2 sản phẩm này là hoàn toàn giống nhau (Xem phần phụ lục)

2.2.3 Kiểm nghiệm sản phẩm cyclophosphamide theo tiêu chuẩn Dược điển

Anh, BP 2001:

Viện Kiểm nghiểm, Bộ Y tế đã tiến hành phân tích sản phẩm cyclophosphamide của Đề tài theo tiêu chuẩn của Dược điển Anh, BP 2001

Kết quả được nêu dưới đây:

2 Định tính: Phải thể hiện phép thử định tính của

3 Độ trong và màu sắc của dung dịch: Phải đạt quy định Đạt

2.2.4 Nghiên cứu độc tính cấp và bán cấp của sản phẩm cyclophosphamide:

Sản phẩm cyclophosphmide do Đề tài tổng hợp được đã được tiến hành nghiên cứu tiền lâm sàng (tìm LD50, thử độc tính cấp, bán cấp, quan sát đại thể, soi

vi thể gan, thận của động vật thí nghiệm) tại Viện Kiểm nghiệm - Bộ Y tế và tại Bộ môn Giải phẫu bệnh, thuộc trường Đại học Y Hà Nội

Kết quả thu được như sau:

a/ Độc tính cấp:

• Thử trên chuột nhắt, đã xác định được liều gây chết 50% (LD50) là 485 mg/kg (414,5 -567,5 mg/kg) với P = 0,05 (theo cách tính của Litchfield- Wilcoxon)

• Thử trên chó để thăm dò liều tối đa dung nạp và liều gây chết áp dụng phương pháp cải tiến "Up and Down" để tìm liều tối đa dung nạp trên chó

Kết quả (khi tiêm tĩnh mạch trên chó) đã xác định được:

+ Liều tối đa không gây chết (dung nạp): 35 mg/kg

+ Liều gây chết chó: 50 mg/kg

+ Các triệu chứng ngộ độc trên chó quan sát được chủ yếu là nôn, buồn nôn, chán ăn, mệt mỏi Mức liều cao gây triệu chứng nặng hơn kèm theo xuất huyết đường tiêu hóa, đường niệu, xỉu dần rồi chết

được nuôi trong cùng điều kiện và cùng chế độ dinh dưỡng

+ Theo dõi, đánh giá các chỉ tiêu của thỏ trước và sau khi thí nghiệm

+ Sau 4 tuần mổ thỏ quan sát đại thể các tổ chức gan, thận, phổi, tim về hình dạng, màu sắc, thể chất, tình trạng xung huyết

+ Tiêu bản vi thể tổ chức gan, thận được thực hiện tại Bộ môn Giải phẫu bệnh, Đại học Y Hà Nội

+ So sánh thống kê theo test t các kết quả trước thí nghiệm và sau mỗi tuần của các nhóm thử, so sánh trước, giữa và sau thí nghiệm giữa nhóm chứng

và từng nhóm thử

Kết quả:

+ Với hai mức liều 20mg/ kg/ lần và 100mg/ kg/ lần so với nhóm chứng chưa nhận thấy biểu hiện sự khác nhau đáng kể ở nhóm thỏ dùng liều thấp (20mg/ kg)

+ Với nhóm dùng liều cao (100 mg/kg), hầu hết các chỉ số huyết học đều thay đổi và khác biệt rõ rệt, điển hình là các chỉ số tiểu cầu, hồng cầu, huyết sắc tố

+ Các chỉ số sinh hoá thay đổi không đáng kể hoặc thất thường ở cả nhóm thử 1 và nhóm thử 2 Hầu hết thỏ nhóm thử 2 đều có biểu hiện rụng lông

+ Quan sát đại thể các tổ chức tim, gan, thận sau khi thí nghiệm nhận

thấy:

ư Có sự xung huyết nhẹ ở thận trên một số thỏ ở nhóm 2 Nhưng sự khác

biệt giữa nhóm thử và nhóm chứng là chưa rõ ràng

+ Quan sát vi thể cho thấy:

ư Thỏ thực nghiệm bị nhiễm bệnh từ trước ở gan là 10 con (lô 1: 4 con, lô 2: 3 con, lô 3: 3 con)

Trong đó:

ư Tế bào gan ngoài vùng tổn thương bình thường: 5 con (lô 1: 2 con, lô 2: 1 con, lô 3: 2 con)

ư Tế bào gan thoái hoá thũng đục và thoái hoá hạt nhẹ: 5 con (lô 1: 2 con, lô 2: 2 con, lô 3: 1 con)

ư Số thỏ còn lại 20 con (lô 1: 6 con, lô 2: 7con, lô 3: 7 con)

Cụ thể như sau:

Gan:

ư Tế bào gan không có tổn thương: 16 con (lô 1: 5/6, lô 2: 6/7, lô 3: 5/7)

ư Tế bào gan thoái hoá hạt: 4 con (lô1: 1 con, lô 2: 1 con, lô 3: 2 con)

Như vậy:

Gan: Không có tổn thương ở cả 3 lô (16 con) tương tự nhau, chỉ gặp tổn

thương thoái hoá thũng đục, thoái hoá hạt ở mức độ nhẹ: 4 con và không có

sự khác biệt giữa 3 lô (Chi tiết xem phần phụ lục)

Thận: Phân tích cả 30 con, kết quả như sau:

ư Cầu thận, ống thận không có tổn thương: 24 con (lô 1: 8 con, lô 2: 7 con, lô 3: 9 con)

ư Xung huyết cầu thận và mô kẽ: 5 con (lô 1: 2 con, lô 2: 2 con, lô 3: 1

con)

ư Viêm cầu thận mãn tính: 1 con (lô 2)

Như vậy:

Thận: Không có biểu hiện tổn thương, 3 lô tương tự nhau, xung huyết cầu

thận và mô kẽ giữa 3 lô cũng không có sự khác biệt Một con ở lô 2 có viêm cầu thận mãn tính (Chi tiết xem phần phụ lục)