Tóm tắt TV: Nghiên cứu PCR đa mồi trong chẩn đoán sớm tác nhân gây bệnh và hướng dẫn điều trị trong viêm phổi bệnh viện.

Nghiên cứu PCR đa mồi trong chẩn đoán sớm tác nhân gây bệnh và hướng dẫn điều trị trong viêm phổi bệnh viện.Nghiên cứu PCR đa mồi trong chẩn đoán sớm tác nhân gây bệnh và hướng dẫn điều trị trong viêm phổi bệnh viện.Nghiên cứu PCR đa mồi trong chẩn đoán sớm tác nhân gây bệnh và hướng dẫn điều trị trong viêm phổi bệnh viện.Nghiên cứu PCR đa mồi trong chẩn đoán sớm tác nhân gây bệnh và hướng dẫn điều trị trong viêm phổi bệnh viện.Nghiên cứu PCR đa mồi trong chẩn đoán sớm tác nhân gây bệnh và hướng dẫn điều trị trong viêm phổi bệnh viện.Nghiên cứu PCR đa mồi trong chẩn đoán sớm tác nhân gây bệnh và hướng dẫn điều trị trong viêm phổi bệnh viện.Nghiên cứu PCR đa mồi trong chẩn đoán sớm tác nhân gây bệnh và hướng dẫn điều trị trong viêm phổi bệnh viện.Nghiên cứu PCR đa mồi trong chẩn đoán sớm tác nhân gây bệnh và hướng dẫn điều trị trong viêm phổi bệnh viện.Nghiên cứu PCR đa mồi trong chẩn đoán sớm tác nhân gây bệnh và hướng dẫn điều trị trong viêm phổi bệnh viện.Nghiên cứu PCR đa mồi trong chẩn đoán sớm tác nhân gây bệnh và hướng dẫn điều trị trong viêm phổi bệnh viện.Nghiên cứu PCR đa mồi trong chẩn đoán sớm tác nhân gây bệnh và hướng dẫn điều trị trong viêm phổi bệnh viện.Nghiên cứu PCR đa mồi trong chẩn đoán sớm tác nhân gây bệnh và hướng dẫn điều trị trong viêm phổi bệnh viện.Nghiên cứu PCR đa mồi trong chẩn đoán sớm tác nhân gây bệnh và hướng dẫn điều trị trong viêm phổi bệnh viện.Nghiên cứu PCR đa mồi trong chẩn đoán sớm tác nhân gây bệnh và hướng dẫn điều trị trong viêm phổi bệnh viện.Nghiên cứu PCR đa mồi trong chẩn đoán sớm tác nhân gây bệnh và hướng dẫn điều trị trong viêm phổi bệnh viện.Nghiên cứu PCR đa mồi trong chẩn đoán sớm tác nhân gây bệnh và hướng dẫn điều trị trong viêm phổi bệnh viện.BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI ĐINH THỊ THU HƢƠNG NGHIÊN CỨU PCR ĐA MỒI TRONG CHẨN ĐOÁN SỚM TÁC NHÂN GÂY BỆNH VÀ HƢỚNG DẪN ĐIỀU TRỊ TRONG VIÊM PHỔI BỆNH VIỆN Chuyên ngành Hồi s.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI

ĐINH THỊ THU HƯƠNG

NGHIÊN CỨU PCR ĐA MỒI TRONG CHẨN ĐOÁN SỚM TÁC NHÂN GÂY BỆNH VÀ HƯỚNG DẪN ĐIỀU TRỊ TRONG VIÊM PHỔI BỆNH VIỆN

Chuyên ngành: Hồi sức cấp cứu và chống độc

Mã số : 9720103

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC

HÀ NỘI - 2023

CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI

Vào hồi: giờ phút, ngày tháng năm 202

Có thể tìm hiểu luận án tại các thư viện

- Thư viện Quốc gia

- Thư viện Trường Đại học Y Hà Nội

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ

VÀ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN

1 Đinh Thị Thu Hương, Bùi Vũ Huy, Đỗ Ngọc Sơn (2019) Đánh giá các yếu tố liên quan tỷ lệ tử vong ở bệnh nhân viêm phổi thở

máy Tạp chí y học Việt nam tháng 9/2019, Tập 482: 124 – 130

2 Đinh Thị Thu Hương, Bùi Vũ Huy, Đỗ Ngọc Sơn (2019) Khả năng phát hiện vi khuẩn gây bệnh viêm phổi liên quan thở máy thường gặp của phương pháp nuôi cấy thường quy và multiplex

realtime PCR Tạp chí y học Việt nam tháng 12/2019, Tập 485:

345 – 352

các khoa Hồi sức tích cực là các vi khuẩn (VK) Acinetobacter baumannii, Klebsiella

pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Staphylococus aureus Do đó

nghiên cứu của chúng tôi sẽ tập trung phát hiện 5 căn nguyên vi khuẩn thường gặp gây VPBV, VPLQTM này

Thực tế đòi hỏi cần sử dụng kỹ thuật multiplex realtime PCR trong chẩn đoán nhanh 5 loại VK gây VPBV, VPLQTM giúp định hướng sử dụng kháng sinh nhanh, phù hợp vi kỹ thuật này có những ưu điểm độ nhạy cao, không cần một VK sống, thời gian trả kết quả ngắn Tuy nhiên, cho đến nay không nhiều các nghiên cứu đánh giá cụ thể vai trò multiplex realtime PCR trong chẩn đoán và điều trị VPBV, VPTQTM Xuât

phát từ nhu cầu thực tế lâm sàng chúng tôi thực hiện nghiên cứu “Nghiên cứu PCR đa

mồi trong chẩn đoán sớm tác nhân gây bệnh và hướng dẫn điều trị trong viêm phổi bệnh viện”

Mục tiêu nghiên cứu:

(1) Nghiên cứu giá trị của multiplex realtime PCR trong chẩn đoán tác nhân gây VPBV, VPLQTM

(2) Phân tích vai trò của multiplex realtime PCR trong điều trị VPBV, VPLQTM

2 Tính cấp thiết của nghiên cứu

Bệnh nhân (BN) phải nhập viện, duy trì thở máy đa số là những BN rất nặng, có nhiều bệnh nền phối hợp phải thở máy để duy trì sự sống và phục hồi Tuy nhiên, các bác sỹ hồi sức đều biết rằng thở máy thì phải đối mặt với nguy cơ VPBV, VPLQTM và phải chấp nhận mà không có quyền lựa chọn Đã có quá nhiều nghiên cứu về các phương pháp phòng ngừa VPLQTM, các trang thiết bị, thuốc, kháng sinh thế hệ mới ra đời, tuy

tỷ lệ mắc và tỷ lệ tử vong do VPLQTM có giảm nhưng vẫn còn ở mức cao Mặt khác, trong tình hình vi khuẩn kháng thuốc như hiện nay, việc định hướng sử dụng kháng sinh đúng và phù hợp là vô cùng cần thiết giúp cứu sống người bệnh và giảm tỷ lệ kháng thuốc của vi khuẩn

Như vậy, vẫn cần nghiên cứu tìm kiếm một phương pháp đủ độ nhạy, thời gian trả kết quả ngắn, giúp định hướng sử dụng kháng sinh phù hợp với vi khuẩn gây bệnh giúp giảm tỷ lệ tử vong và giảm nguy cơ vi khuẩn kháng thuốc Và đó chính là phương pháp sinh học phân tử multiplex realtime PCR Trên thế giới cũng như ở Việt nam cho đến nay có rất ít nghiên cứu so sánh khả năng phát hiện vi khuẩn gây VPLQTM giữa multiplex realtime PCR và các phương pháp nuôi cấy kinh điển; đánh giá hiệu quả điều trị khi dùng kết quả multiplex realtime PCR định hướng sử dụng kháng sinh trong điều trị VPLQTM Chính vì vậy, nghiên cứu này là thực sự cần thiết

3 Những đóng góp mới của nghiên cứu:

Đây là nghiên cứu đầu tiên ở Việt nam nghiên cứu sử dụng multiplex realtime PCR để phát hiện 5 VK gây bệnh thường gặp trong VPLQTM Nghiên cứu thực hiện trên số lượng bệnh nhân rất lớn, lựa chọn ngẫu nhiên nên kết quả đáng tin cậy Đề tài

2

đã cho thấy khả năng phát hiện được vi khuẩn gây bệnh thường gặp VPLQTM của multiplex realtime PCR cao hơn hẳn so với nuôi cấy thường quy ở các mẫu bệnh phẩm đờm, dịch phế quản Mặt khác, thời gian trả kết quả multiplex realtime PCR ngắn hơn hẳn nuôi cấy Đề tài đưa ra được độ nhạy, độ đặc hiệu, giá trị dự đoán dương tính, giá trị dự đoán âm tính của kỹ thuật multiplex realtime PCR trong chẩn đoánVPBV, VP:QTM Nếu áp dụng kết quả của kỹ thuật multiplex realtime PCR sẽ giảm được tỷ

lệ sử dụng kháng sinh không phù hợp giúp giảm nguy cơ phơi nhiễm đề kháng kháng sinh; giảm thời gian thở máy, thời gian nằm điều trị tại khoa Hồi sức tích cực, thời gian nằm viện giúp giảm chi phí điều trị, giảm gánh nặng về kinh tế cho mỗi gia đình và xã hội Tuy không giảm được tỷ lệ tử vong do viêm phổi khi so sánh với nhóm chứng nhưng nghiên cứu cũng chỉ ra rằng cứ áp dụng của kỹ thuật multiplex realtime PCR cho 6 bệnh nhân sẽ giúp giảm 1 bệnh nhân tử vong do VPLQTM

4 Bố cục của nghiên cứu

Nghiên cứu gồm 130 trang, gồm: Đặt vấn đề (2 trang), Chương 1: Tổng quan (37 trang), Chương 2: Đối tượng và phương pháp nghiên cứu (28 trang), Chương 3: Kết quả nghiên cứu (28 trang) Chương 4: Bàn luận (32 trang) Kết luận: (2 trang) Tài liệu tham khảo (20 trang)

Trong báo cáo có 40 bảng, 7 biểu đồ, 2 sơ đồ

Báo cáo có 145 tài liệu tham khảo (9 tài liệu tiếng Việt; 136 tài liệu tiếng Anh)

Chương 1 TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về viêm phổi bệnh viện, viêm phổi liên quan thở máy

1.2.1 Tỷ lệ mắc viêm phổi bệnh viện, viêm phổi liên quan thở máy:

Viêm phổi bệnh viện (VPBV) năm 2014 đứng hàng thứ hai trong các nhiễm khuẩn bệnh viện thường gặp ở Mỹ, chỉ sau nhiễm khuẩn tiết niệu Mặt khác nghiên cũng cho thấy VPBV xảy ra ở 150.000- 200.000 BN/ năm, cứ 1000 BN nhập viện có 5- 10 BN VPBV chiếm 25% trong số các nhiễm khuẩn bệnh viện, có đặt nội khí quản chiếm 9- 27% VPBV không liên quan thở máy là 3,63/1000 ngày điều trị Theo Trung tâm kiểm soát bệnh tật Hoa kỳ (CDC) trong năm 2012, tỷ lệ mắc VPLQTM ở Hoa Kỳ dao động từ 0,0- 4,4/1000 ngày thở máy

Báo cáo ở châu Á từ 1999- 2017 ở 22 quốc gia, tần suất mắc VPLQTM 15,1/1000 ngày thở máy (95% CI là 12,1- 18,0) Tỷ lệ VPLQTM là 2,7%; trong đó VPLQTM cao nhất là ở Mông cổ (43,7/1000 ngày thở máy) và tỷ lệ mắc VPLQTM cao nhất ở Hồng Kông (48,1%)

Ở Trung Quốc, từ 2010- 2015 tần suất mắc VPLQTM là 22,83/1000 ngày thở máy và tỷ lệ mắc VPLQTM tích lũy chung là 23,8%

1.1.2 Căn nguyên vi khuẩn gây VPBV, VPLQTM:

Loại vi khuẩn gây ra VPBV, VPLQTM thường phụ thuộc thời gian ở BV, thời gian thở máy VPLQTM sớm (< 5 ngày) VK gây bệnh thường là nhạy cảm kháng sinh VPLQTM khởi phát muộn ( ≥ 5 ngày) thường là do VK đa kháng và sẽ gặp khó khăn hơn trong việc điều trị bệnh Thủ phạm gây VPBV, VPLQTM muộn gồm:

Staphylococcus aureus kháng với Methicillin, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa, và vi khuẩn thuộc họ VK đường ruột kháng beta-lactamaza sinh ESBL phổ rộng, nổi lên đó là Klebsiella pneumoniae và Eschericheria coli Chính vì vậy,

trong khuôn khổ nghiên cứu và điều kiện kinh tế, chúng tôi chỉ tập trung phát hiện các

VK gây bệnh thường gặp này VPLQTM có thể do nhiều loại VK gây ra, tuy nhiên VPLQTM do nấm và vi rút có tỷ lệ rất thấp, đặc biệt với những người có hệ miễn dịch bình thường

1.1.3 Tỷ lệ tử vong do VPBV, VPLQTM::

Kết cục xấu nhất là tử vong do VPBV, VPLQTM tăng đều hàng năm đối với các nước thu nhập thấp, không giảm hoặc giảm chậm trong thập kỷ này ở các nước thu nhập cao Theo CDC (2012), thì tỷ lệ tử vong (TLTV) riêng ở những BN bị tổn thương

3 phổi cấp tính khi thở máy từ 24% ở người 15- 19 tuổi đến 60% ở những BN 85 tuổi trở lên Tại Thổ Nhĩ Kỳ (2017) trên BN VPLQTM thì TLTV chung là 39,8% Phân tích đơn biến cũng như phân tích hồi quy đa biến cho thấy các yếu tố như: thời gian nằm

HSCC kéo dài, nhiễm A.baumannii được xác định là yếu tố dự báo tăng TLTV Một

nghiên cứu ở Trung quốc (2020), TLTV 30 ngày 42,7% Các yếu tố liên quan đến TLTV trong 30 ngày do VPLQTM là do nhiễm VK đa kháng Tại khoa ĐTTC BV Bạch mai những BN được xác định VPLQTM, từ 11/ 2015 đến 5/ 2016, TLTV ở ngày

thứ 7 là 13% và ở ngày thứ 31 là 43,1% Những BN bị nhiễm A.baumannii đa kháng

thì TLTV ở ngày 31 với những BN không bị nhiễm lần lượt là 56,2% và 25% với p=0,041 và cũng kéo dài thời gian nằm điều trị 16 ngày và 9 ngày với p= 0,024

1.2 Tổng quan tình hình nghiên cứu multiplex realtime PCR chẩn đoán VPBV, VPLQTM

1.2.1 Tổng quan về multiplex realtime PCR

Đây là một kỹ thuật sinh học phân tử Nguyên lý kỹ thuật dựa trên nguyên lý tổng hợp DNA trong tế bào, trong đó DNA được nhân lên theo cơ chế bán bảo tồn Để bắt đầu quá trình tổng hợp DNA, hai sợi DNA làm khuôn mẫu bị tách ra dưới tác dụng của nhiệt độ Hai đoạn mồi oligonucleotide từ 20-40 nucleotide sẽ gắn vào các vị trí bổ sung trên đoạn DNA mẫu Trong điều kiện của PCR, hai mồi sẽ được kéo dài về hai phía, tạo ra đoạn DNA mới bổ sung với đoạn khuôn mẫu Quá trình khuếch đại xảy ra

dưới sự xúc tác của enzym Taq polymerase, với một cặp mồi đặc hiệu một đoạn DNA

nào đó sẽ được tổng hợp sau mỗi chu kỳ của PCR Có thế cho thêm huỳnh quang được thêm vào hỗn hợp phản ứng để phát huỳnh quang tại bất kỳ thời điểm nào của phản ứng, cường độ huỳnh quang sẽ giúp phát hiện nồng độ DNA mẫu bệnh phẩm ban đầu (realtime PCR), cũng như sử dụng nhiều cặp mồi trong cùng một phản ứng giúp phát hiện nhiều loại VK (multiplex realtime PCR)

Việc phát hiện các VK trong đường hô hấp không có nghĩa là chúng là thủ phạm gây bệnh, chúng cũng có thể tồn tại là VK cư trú Chính vì vậy, để có thể khẳng định căn nguyên gây bệnh phải định lượng được số lượng các chủng loại căn nguyên có mặt trong đường hô hấp, từ đó kết hợp với lâm sàng để có thể đưa ra chẩn đoán phù hợp Multiplex realtime PCR các mẩu DNA trong bệnh phẩm dịch phế quản của các VK đích từ đó dẽ giúp đưa ra kết luận VK gây bệnh

1.2.2 Tình hình nghiên cứu multiplex realtime PCR trong VPBV, VPLQTM

Năm 2016, Clavel (Pháp) đã công bố một nghiên cứu so sánh multiplex realtime PCR và nuôi cấy ở BN nghi ngờ VPLQTM Mẫu dịch rửa phế quản phế nang (BAL)

và dịch hút qua NKQ (ETA) cùng đồng thời thực hiện multiplex realtime PCR và nuôi

cấy VK thường quy Đích phát hiện là 3 loại VK Staphylococcus aureus, Pseudomonas

aeruginosa và Haemophilus influenzae Kết quả phù hợp cho cả BAL và ETA ở nuôi

cấy thường qui và multiplex realtime PCR tướng ứng là 55,5% và 57,0% tất cả các

VK mục tiêu Riêng đối với Staphylococcus aureus, khả năng kết quả phù hợp đối với

nuôi cấy tốt hơn multiplex realtime PCR, tỷ lệ tương ứng 77,8% và 69,0%

Một nghiên cứu khác thực hiện từ 5/ 2017 đến 11/ 2018 ở Pháp Trong đó, multiplex realtime PCR phát hiện 21 VK và 19 gen kháng kháng sinh trên mẫu BAL hoặc mẫu sử dụng chổi quét có bảo vệ (PTC) Thời gian trung bình cho kết quả của multiplex realtime PCR là 4,6 giờ; 104 mẫu phát hiện VK bằng multiplex realtime PCR, chỉ 128 mẫu được phát hiện bằng nuôi cấy thường qui Kết quả multiplex realtime PCR làm thay đổi kháng sinh 66% BN: sử dụng kháng sinh sớm và hiệu quả ở 21%; giảm leo thang 39%; tối ưu hóa 3% So với nuôi cấy thường quy thì multiplex realtime PCR có độ nhạy 80% (CI 95%,71-88%) và độ đặc hiệu 99% (CI 95%, 99- 100%); multiplex realtime PCR phát hiện VK Gram âm tốt hơn Gram dương

4 Nghiên cứu ở Hy lạp (2017) ở khoa HSCC nhi, sử dụng hút đờm thông thường qua NKQ nuôi cấy định lượng và xác định là VK gây bệnh khi kết quả định lượng là 105cfu/ml; Kết quả của nghiên cứu: multiplex realtime PCR độ nhạy 76%, độ

đặc hiệu 97%, PPV 90%, NPV 93% so với nuôi cấy tương ứng là 24%, 92%, 55%, 79% Ưu điểm của multiplex realtime PCR là thời gian cho kết quả ngắn do đó sẽ giảm

kê đơn thuốc kháng sinh không phù hợp Và mặc dù giá thành multiplex realtime PCR còn cao nhưng so với việc sử dụng kháng sinh không phù hợp, thời gian nằm điều trị

kéo dài và phụ thuộc thở máy thì multiplex realtime PCR vần đem lại nhiều lợi thế

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng và địa điểm nghiên cứu:

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu:

2.1.1.1 Tiêu chuẩn chọn:

- BN ≥ 18 tuổi được nhập viện và/hoặc đặt ống NKQ hoặc MKQ ≥ 48 giờ

- BN được chẩn đoán VPBV, VPLQTM theo tiêu chuẩn của Mỹ CDC 2018,

2.1.1.2 Tiêu chuẩn loại trừ:

- BN tử vong trong 48 giờ sau nhập viện hoặc sau khi đặt NKQ và hoặc không đồng ý tham gia nghiên cứu

2.1.1.3 Tiêu chuẩn chẩn đoán VPBV, VPLQTM của CDC 2018:

Tiêu chuẩn chẩn đoán VPBV: BN nhập viện ≥ 48 giờ và có các dấu hiệu sau

 Lâm sàng: Có ít nhất một triệu chứng sau:

 Sốt (> 38o

C) không có nguyên nhân khác.Giảm bạch cầu (< 4000BC/mm3) hoặc tăng bạch cầu (≥ 12000BC/mm3) hoặc bạch cầu đa nhân trung tính chiếm ≥ 50%

 Suy giảm tình trạng ý thức không biết nguyên nhân ở BN ≥ 70 tuổi

Và có ít nhất hai triệu chứng sau:

 Xuất hiện đờm mủ mới hoặc thay đổi tính chất đờm (màu sắc, mùi và tăng số lượng đờm hoặc tăng số lần phải hút đờm)

 Xuất hiện ho khởi phát mới hoặc ho nặng hơn, khó thở, hoặc thở nhanh

 Nghe thấy ran ở phổi hoặc ran phế quản

 Tình trạng trao đổi khi xấu đi (Độ bão hòa oxy giảm ; PaO2/FiO2 ≤ 240), tăng nhu cầu oxy hoặc cần thở máy

 Hình ảnh X-quang ngực:

Có ≥ 2 X-quang hoặc chỉ có 01 phim nếu BN không có các bệnh nền ở phổi hoặc

tim với ít nhất một trong các tiêu chuẩn sau:

 Thâm nhiễm mới

 Tổn thương đông đặc

 Tổn thương hang

Các tổn thương này tiến triển và dai dẳng

Có thể có một số hình ảnh XQuang ngực như: “cây phế quản chứa khí”, “đám mờ tập trung”, “ vùng tăng mật độ”

* Xét nghiệm vi sinh: có ít nhất một trong các tiêu chí dưới đây:

 Xác định được vi khuẩn từ máu

 Xác định được vi khuẩn từ màng phổi

 Cấy định lượng hoặc bán định lượng dương tính từ mẫu đờm, dịch phế quản

 Cấy định lượng hoặc bán định lượng nhu mô phổi dương tính

5

Tiêu chuẩn chẩn đoán VPLQTM ở người bình thường:

 BN được chẩn đoán VPBV và có đặt ống nội khí quản hoặc mở khí quản ≥ 48 giờ

 Tình trạng trao đổi khi xấu đi (Độ bão hòa oxy giảm; PaO2/FiO2 ≤ 240), tăng nhu cầu oxy hoặc tăng phụ thuộc máy thở

Nhóm tiêu chuẩn chẩn đoán VPLQTM ở người suy giảm miễn dịch:

Có các tiêu chuẩn lâm sàng, cận lâm sàng và XQ ngực ở nhóm BN VPLQTM bình thường kết hợp với tiểu chuẩn suy giảm miễn dịch như sau:

* Tiêu chuẩn suy giảm miễn dịch:

 Giảm bạch cầu đa nhân trung tính được xác định là số lượng BCTT tuyệt đối hoặc tổng số lượng bạch cầu < 500/mm3

 Mắc bệnh bạch cầu, ung thư hạch, HIV (+) với số lượng BCCD4 < 200/mm3

 Cắt lách, đang sử dụng steroid (trừ steroid dạng hít) hàng ngày > 2 tuần

2.1.2 Địa điểm nghiên cứu: Khoa Cấp cứu bệnh viện Bạch mai, Khoa Hồi sức tích

cực bệnh viện Thanh Nhàn

2.1.3 Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 08/2018 đến tháng 02/2021

2.2 Phương pháp nghiên cứu:

2.2.1 Thiết kế nghiên cứu :

Nghiên cứu can thiệp, tiến cứu, có so sánh nhóm chứng

2.2.2 Cỡ mẫu nghiên cứu:

Áp dụng công thức tính cỡ mẫu cho hai tỷ lệ:

Trong đó:

o n số bệnh nhân của mỗi nhóm nghiên cứu

o z α/2 là trị số z của phân phối chuẩn cho xác suất α/2 (α = 0,05 thì zα/2 = 1,96)

o zβ là trị số z của phân phối chuẩn cho xác suất β (β = 0,02 thì Zβ = 0,842)

o p2 là tỷ lệ tử vong do VPLQTM đã được nghiên cứu Theo các nghiên cứu trong và ngoài nước đến thời điểm hiện tại chúng tôi ước lượng tỷ lệ này là p2

= 0,35

o p1 là tỷ lệ tử vong do VPLQTM ở nhóm nghiên cứu mà nghiên cứu mong muốn Chúng tôi mong muốn giảm được tỷ lệ tử vong ở nhóm BN này sau can thiệp 17% (p1 = 0,18)

o ∆ hiệu số của p2 và p1

Từ đó, tính được cỡ mẫu cho mỗi nhóm trong nghiên cứu là n ≈ 105 BN

BN được chia ngẫu nhiên chia thành 2 nhóm:

o Nhóm nghiên cứu: được thực hiện kỹ thuật multiplex realtime PCR đối với 5 VK

trên bệnh phẩm đờm, dịch khí phế quản: Acinetobacter baumanii, Klebsiella

pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa,Escherichia coli, Staphylococus aureus

o Nhóm chứng: không thực hiện kỹ thuật multiplex realtime PCR

2.3 Kỹ thuật multiplex realtime PCR thực hiện trong nghiên cứu:

2.3.1 Vật liệu nghiên cứu:

+ Bệnh phẩm: đờm, dịch phế quản, dịch rửa phế quản phế nang dược bảo quản lạnh và vận chuyển ngay tới phòng xét nghiệm

6

Bảng 2.1 Trình tự Primer-Probe sử dụng trong nghiên cứu

Chủng mục tiêu Tên Trình tự (5'->3') Chiều dài Tm GC%

Bảng 2.2 Danh sách các chủng vi khuẩn được sử dụng

A baumannii Chủng chuẩn ATCC@19606 Viện VSDTTW

P aeruginosa Dịch khuẩn BV Thanh Nhàn

K pneumoniae Dịch khuẩn BV Thanh Nhàn

+ Mẫu amplicon: Được tổng hợp bởi Intergrated DNA Technologies Amplicon được

pha loãng về các nồng độ thấp hơn theo bậc pha loãng 10 bằng TE 1X

137

2 glytA

5’- AAGCG GAGCC GGCGG CAAAG ACAAG CCGGC GACGT CCTTA TAGGC CGAAT ATGAC GAATT CAAAA CTACC GTCAC CCGCC ACACC ATGAT TCATG AGCAG ATCAC CCCGG TGTTG ATGGC ATGGC GCCAG TTTA TCA -3’

138

3 GryB

5’- TTTAT CAAGA TTTAG CTCGT CGTAT TGGAC TTGAA CTCAT GTCTA ATGGC GCCAG TTTAT CATAC ATAAC CTGAC CATCC GTCGC CACAA CAAGG TCTGG GAACA GGTCT ACCAC CACGG CGTTC CGCAG TTCCC ACTGC GCGAA GTGGG CGAGA CCGAT GGCTC CGGCA CCGAA GTTCA CTTCA AGCCG TCCCC GGAGA CCTTC AGCAA CATCC ACTTC AGTTG GGACA TCCTG GCCAA GCGCA TCCGC GAGCT GTCCT TCCTC AACTC CGGCG TCGGC ATCCT GCTGC GAGTG GCGAT GACTC TGGAA-3’

415

- Thiết bị nghiên cứu, dụng cụ, vật tư tiêu hao: giống như các phòng xét nghiệm sinh

học phân tử thông thường khác

2.3.2 Các bước tiến hành kỹ thuật

 Xử lý mẫu: đờm, dịch phế quản làm tan loãng và loại bỏ tạp chất, máu sau đó bảo

quản ngăn đá tủ lạnh chờ tách chiết

 Tách chiết: DNA được tách chiết theo hướng dẫn của nhà sản xuất

 Thực hiện phản ứng PCR:

Chuẩn bị các thành phần của hỗn hợp phản ứng realtime PCR

Việc thực hiện multiplex realtime PCR cho 5 VK được chia 2 hỗn hợp phản ứng:

o Hỗn hợp 1: A.baumannii, E.coli và K.pneumoniae

o Hỗn hợp 2: P.aeruginosa và S.aureus

Chứng âm được sử dụng là nước PCR tinh sạch

8 Hai hỗn hợp phản ứng realtime PCR tương ứng để phát hiện 5 loại VK, thể tích hỗn hợp cuối cùng là 25l, bao gồm các thành phần theo hướng dẫn của nhà sản xuất

Bổ sung DNA mẫu vào hỗn hợp phản ứng realtime PCR:

Hỗn hợp thành phần phản ứng đã bổ sung DNA và chứng được đưa vào máy realtime PCR

- Thực hiện phản ứng PCR trên máy luân nhiệt:theo 2 bước

B1 Thực hiện phản ứng realtime PCR định tính: cài đặt chương trình định dạng vị trí

các mẫu, chứng dương PCR, chứng âm PCR trong block nhiệt của máy (Plate setup), chọn màu huỳnh quang phát hiện đặc trưng cho từng tác nhân theo bảng dưới đây:

Bảng 2.4 Màu huỳnh quang phát hiện đặc trưng cho từng tác nhân

Màu huỳnh quang phát

*DNA chứng nội ngoại sinh

- Thiết lập chu kỳ nhiệt thích hợp, cả 2 hỗn hợp phản ứng đều được thực hiện ở cùng

một chu trình nhiệt như dưới đây:

Bảng 2.5 Chu kỳ nhiệt thực hiện trên máy PCR

- Kết thúc chu kỳ nhiệt, thực hiện các bước phân tích kết quả, những tác nhân có giá trị

Ct xác định được xác định là “Dương tính với DNA VK đích”; Ct không xác định

(N/A) được xác định là “Âm tính với DNA VK đích”

B2 Thực hiện phản ứng realtime PCR định lượng: cài đặt chương trình định dạng vị trí

các mẫu, chứng âm PCR trong block nhiệt của máy (Plate setup), chọn màu huỳnh

quang phát hiện đặc trưng cho từng tác nhân theo Bảng 2.4

Khai báo định dạng mẫu cho các giếng chứng dương là Standard, khai báo nồng độ DNA chứng dương trên máy khi sử dụng cho từng tác nhân đích lần lượt theo E2- 102

, E3- 103, E5-

105, E7- 107 Thiết lập chu kỳ nhiệt như Bảng 2.5

2.3.3.Kết quả và biện luận:

* Kết quả và biện luận phản ứng reatime PCR đa mồi định tính

Kiểm tra đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang của các mẫu theo trình tự sau:

- Tín hiệu huỳnh quang của mẫu chứng dương PCR đều vượt ngưỡng ở tất cả các kênh màu Tín hiệu huỳnh quang chứng âm tách chiết và chứng âm PCR dưới ngưỡng ở tất

cả các kênh màu

9

- Đọc kết quả ở mẫu xét nghiệm theo nguyên tắc: lên tín hiệu nào đọc đối tượng tương ứng với tín hiệu đó (theo các Bảng 2.6 và Bảng 2.7) Kết quả cuối cùng của mẫu là kết quả tổng hợp từ cả hỗn hợp phản ứng 1 và 2

Bảng 2.6 Phân tích kết quả trong hỗn hợp phản ứng 1

nhân E.coli, K.pneumoniae

Trường

Đồng dương tính cả 3 tác nhân

A.baumannii, E.coli, K.pneumoniae Thực hiện phản

ứng realtime PCR định lượng

với cả 3 VK A.baumannii,

E.coli, K.pneumoniae

10

Bảng 2.7 Phân tích kết quả trong hỗn hợp phản ứng 2

Phản ứng 2 Trường

- Nhận định kết quả của nghiên cứu: Kết quả dương tính khi có số lượng ≥ 103

DNA/ml dịch rửa phế quản phế nang; ≥ 104 DNA/ml đờm/ dịch hút qua NKQ/ MKQ

2.4 Tiến hành nghiên cứu:

2.4.1 Quy trình nghiên cứu:

 BN sau khi nhập viện và/hoặcđặt NKQ, thở máy ≥ 48 giờ nghi ngờ VPBV,

VPLQTM sẽ được:

- Thăm khám lâm sàng phát hiện: Ho, sốt, khó thở, khạc đờm mủ hoặc tăng số lượng đờm, nghe phổi có thể thấy ran ẩm, tiếng thổi ống…

- Thực hiện các xét nghiệm: tế bào máu ngoại vi, chức năng gan thận, khí máu động

mạch, chụp XQuang ngực, chụp CT Scanner ngực nếu cần thiết…

 BN đủ tiêu chuẩn, đồng ý tham gia nghiên cứu sẽ được đưa vào nghiên cứu:

* Nhóm nghiên cứu: thực hiện multiplex realtime PCR 2 lần

- Lần 1: ngay khi chẩn đoán lâm sàng VPBV, VPLQTM BN sẽ được lấy bệnh phẩm (đờm, dịch hút NKQ/MKQ hoặc dịch phế quản phế nang) thực hiện thực hiện đồng thời:

+ Nuôi cấy định lượng VK và kháng sinh đồ thường qui

+ Và multiplex realtime PCR xác định 5 loại VK: A.baumannii, K.pneumonia, P.aeruginosa,

E.coli, S.aureus

 Khi có kết quả multiplex realtime PCR (3-7 giờ) phù hợp lâm sàng BN sẽ được điều trị theo phác đồ áp dụng của nghiên cứu dựa theo kết quả multiplex realtime PCR cho đến khi có

kết quả nuôi cấy (Bảng 2.8)

 Khi có kết quả nuôi cấy VK và kháng sinh đồ (2-4 ngày):