Bài giảng Kỹ thuật thu hồi và hoàn thiện sản phẩm: Chương 8 - Quá trình hấp phụ và kết tủa protein

Bài giảng Kỹ thuật thu hồi và hoàn thiện sản phẩm: Chương 8 - Quá trình hấp phụ và kết tủa protein được biên soạn với các nội dung chính sau đây: Quá trình kết tủa protein; Tính tan của protein; Quá trình hấp phụ protein; Ứng dụng salting out để kết tủa protein; Ảnh hưởng của dung môi đến tính tan củaprotein. Mời quý thầy cô và các em cùng tham khảo!

Quá trình hấp phụ và kết tủa protein

Câu hỏi ôn tập phần trích li

1 Khái niệm trích li?

2 Phân biệt trích li rắn lỏng, dung môi, 2 pha lỏng chứa nước

Quá trình kết tủa protein

• Là một quá trình tinh sạch bước đầu

• Ưu điểm: rẻ, thiết bị đơn giản, có thể thực hiện liên tục,

có thể bảo quản được lâu

• Mục đích: cô đặc và đôi khi tinh sạch 1 phần

Tính tan của protein

• Salting in

– Nồng độ ion tăng làm tăng tính

tan của protein

– Các ion chắn các điện tích và

cho phép protein gấp nếp tạo

cấu trúc (fold)

• Salting out

– Các ion cạnh tranh với nước để

liên kết với các protein Khi nồng

độ muối cao protein sẽ kết tủa

Hiện tượng Salting-in

Hiện tượng Salting-in

• Phân tử protein không tan nếu không có muối tại pI

nhưng nếu thêm ít muối trở nên tan (euglobulin)

• Một số protein lại tan trong nước cũng như trong dịch cónồng độ muối cao (albumin)

Hiện tượng salting-out

Ứng dụng salting out để kết tủa protein

• Là pp phổ biến

– để thu hồi protein từ hỗn hợp protein

– Để thu hồi protein từ dịch ngoại bào

• Cách dùng:

– dùng muối vô cơ (sulfat amon, sulphat natri )

– Dùng dung môi hữu cơ: axeton, etanol

Dùng sulphate amon

Kết tủa phân đoạn

• Add ammonium sulfate to a point below which the protein of

Bảng kết tủa ammonium sunphate

Kết tủa phân đoạn

Ảnh hưởng của dung môi đến tính tan của

protein

Dung môi kết tủa

• Nhiệt độ dưới 10oC tránh biến tính protein

• PEG với nồng độ thấp hơn

Quá trình hấp phụ

Phần tử hấp phụ

Thể tích trống30-50%

Kích thước lỗ

<0.01 mm

Bản chất của chất hấp phụ

• Vật liệu xốp – Diện tích bề mặt/khối lượng lớn– kích

thước, hình dạng và điện tích giữ 1 số các hạt trong cáclỗ

• Tốc độ chuyển khối phụ thuộc vào thể tích trống trong cáclỗ

• Dạng viên (đường kính 50μm - 12 mm)

• Thường nhồi trong cột

Dạng hấp phụ

• Vật lí

– Kết quả của lực giữa các phân tử gây nên liên kết của

1 vài chất đến chất hấp phụ

– Thuận nghịch do nhiệt (hơi, khí nóng, lò)

– Gắn vào lớp ngoài của vật liệu hấp phụ

• Hóa học

– Trao đổi ion, ái lực

• Năng lực hấp phụ: lượng chất tan hấp phụ lớn nhất/đơn

vị chất hấp phụ

• Phụ thuộc vào:

– Tính chất chất hấp phụ: loại nhóm chức, số lượng nhóm chức, tính chất bề mặt

– Tính chất chất lỏng: pH, nhiệt độ, chất tan, nồng độ ion

Ứng dụng

• Trong sắc kí dựa vào khả năng hấp phụ và nhả hấp phụchọn lọc để tinh sạch sản phẩm

• Dạng quan trọng nhất của vận hành cột hấp phụ cho

CNSH là Fixed-bed adsorption và stirred tank adsorption

– Loại hệ thống các hạt ceramic

• Fixed bed adsorption: thường dùng hơn cả

Stirred tank

Ưu điểm

– Chuyển khối nhanh

– Dùng cho chất lỏng có chứa cặn (sẽ làm tắc trong fixed bed) – Có thể xử lí thể tích dịch lớn hơn trong khoảng thời gian ngắn hơn

Nhược điểm:

Chất hấp phụ ít hơn

Xử lý phức tạp hơn do yêu cầu sự khuấy trộn và tách rắn lỏng

Hấp phụ

• Hấp phụ: đợi cân bằng

• Nồng độ của sản phẩm cần phải lớn hơn 1/K eq

• Trong thưc tế ít khi đợi đến khi cân bằng do sự hạn chếcủa quá trình chuyển khối

• Có thể vẽ sự phụ thuộc của nồng độ SP ở dòng ra – thờigian Khi nồng độ SP ra bằng vào→ ko có sự hấp phụ

nữa

• Loại các chất tan bám trên cột

• Loại các liên kết không đặc hiệu

• Có thể mất sản phẩm

Rửa giải

• Thu sản phẩm

• Có thể thay đổi pH

• Có thể tăng lực ion

Các dạng chất hấp phụ

• Có 2 dạng nguyên liệu chính: nhựa polimer và silica

• Silica: có lớp vỏ bọc kị nước và thường dùng cho sắc kíđảo pha

• Nhựa polimer: thường dùng cho ứng dụng cho pha lỏng: trao đổi ion, liên kết kị nước, ái lực

Nhựa Silica

• Dùng cho hợp chất kị nước

• Không bền ở pH quá cao hay quá thấp

• Bề mặt hấp phụ lớn, kích thước hạt nhỏ, rất bền không

vỡ khi áp suất cao

• Có thể làm biến tính protein hay liên kết ko thuận nghịch

• Có kích thước lớn hơn (10-100 m) nhựa silica (1-25 m)

• Không bền bằng nhựa silica và ko chịu áp suất cao (>4 bar)

• 2 polimer tổng hợp hay dùng là styrene divinylbenzene vàpolyacrylamid

• Là styrene divinylbenzene bền ở pH khắc nghiệt

– Hay dùng cho nhựa trao đổi ion

– Do mạch chinh kị nước nên có thể xảy ra liên kết ko đặc hiệu – Rất bền

• Polyacrylamide: dùng ít hơn

– Hay dùng cho sắc kí lọc gel

Nhựa polimer tổng hợp

Nhựa polimer tự nhiên

• Agarose và dextran: dùng cho áp suất thấp

• Kị nước tự nhiên và tương thích với protein và các vật liệu

sinh học khác

• Agarose tạo liên kết khá bền chịu áp suất 4 bar

• Dextran: ít bền hơn giống polyacrylamide dùng trong sắc kí lọc gel

– Có thể tạo các lỗ lớn cho các phân tử kháng thể và hạt virut , có thể tạo các dẫn xuất với các nhóm trao đổi ion, nhóm phenol, kháng

thể, kim loại nặng, thuôc nhuộm và các epitop cho phép liên kết đặc hiệu với phân tử đích

Nhựa trao đổi ion

• Tạo dẫn xuất với các nhóm ion

• Các nhóm thường gặp là: sulphoxyl(SO3-)-strong acidic, Carboxyl (COO-)-weak acidic, Dimethylaminoethyl

(DEAE)-weak basic, quaternary ethylamine (QAE)-strong basic

• Thường dùng để tinh sạch protein, peptit, nucleic acid…

Sắc kí đảo pha

• Ngược với sắc kí thường

• Trong sắc kí thường: SP ưa nước hấp phụ nhiều hơn

• Sắc kí đảo pha: SP kị nước hấp phụ nhiều hơn

Hấp phụ ái lực (Affinity adsorption)

• Liên kết sinh học: kháng thể, kháng nguyên, thuốc nhuộmđược gắn vào nhựa polimer để lôi kéo các protein đích từhỗn hợp