Bài giảng Kỹ thuật thu hồi và hoàn thiện sản phẩm: Chương 4.1 - Các phương pháp sắc ký

Bài giảng Kỹ thuật thu hồi hoàn thiện sản phẩm: Chương 4.1 tìm hiểu về các phương pháp sắc ký gồm: Sắc ký trao đổi ion, sắc kí ái lực, sắc kí lọc gel, sắc kí đảo pha, sắc kí tương tác kỵ nước. Mời quý thầy cô và các em cùng tham khảo!

Chương IV Các phương pháp tinh

4.1.Sắc ký trao đổi ion

4.1.1Sắc ký trao đổi ion ION EXCHANGE CHROMATOGRAPHY

1 Nguyên tắc trao đổi ion

2 Các dạng sắc ký trao đổi ion

3 Nhựa trao đổi ion

- Tính chất của nhựa

- Cách lựa chọn nhựa

4 Thao tác thực hiện quá trình

- lựa chọn dung dịch đệm

3

1 Nguyên tắc trao đổi ion

• Protein là phân tử tích điện Có thể ở dạng

điện tích dương hoặc điện tích âm, cũng có

thể trung hòa về điện

pH tăng

4

2 Các dạng sắc ký trao đổi ion

• Có 2 dạng tích điện (+) và (-) của phân

3 Nhựa trao đổi ion

-

-

7

The charged groups linked to ion

exchange matrices

Anion exchangers Functional group

diethyl-aminoethyl (DEAE) -OCH2CH2N + H(CH2CH3)2

quaternary aminoethyl (QAE) -OCH2CH2N + (C2H5)2CH2CH(OH)CH3quaternary ammonium (Q) -CH2N + (CH3)3

Cation exchangers Functional group

carboxymethyl (CM) -OCH2COO

-sulfopropyl (SP) -CH2CH2CH2SO3

-methylsulfonate (S) -CH2SO3

-10

trao đổi ANION VÀ CATION

Khả năng và dung lượng trao đổi ion

• Khả năng xác định bởi nhóm chức, trao đổi

mạnh hay yếu tùy theo khả năng ion hóa khi thay đổi pH

• khả năng mạnh: ion hóa trong dải pH rộng

Ví dụ DEAE:- trao đổi ion yếu

SP: trao đổi ion mạnh

Định lượng khả năng trao đổi ion để liên kết ion Tùy thuộc vào số nhóm chức

13

Carboxymethyl Sephadex®

( CM Sephadex®)

Properties

• bead size: 40-125 μm (dry)

• pore size: ~200,000 Da exclusion limit

DEAE Sephadex®,

Properties

• Bead size: 40-125 μm (dry)

• pore size: ~30,000 Da exclusion limit

• operating pH: 2 - 9

• Capacity: 3-4 meq/g ion exchange capacity

• Compatibility: mode of use mixed weak and

strong anion exchange chromatography

meq- miliequivalent

15

Sulfopropyl Sephadex®

PROPERTIES:

• bead size: 40-125 μm (dry)

• pore size: 200,000 exclusion limit (av mol wt.)

• operating pH: 2 - 10

• Capacity: 2.0-2.6 meq/g ion exchange capacity

• Compatibility: mode of use strong cation

exchange chromatography

16

Tính chọn lọc của nhựa trao đổi ion

• Tính chọn lọc biểu hiện ở ái lực của nhựa với các ion Nhựa có thể trao đổi với ion này trong dung dịch dễ hơn ion kia Ái lực tương đối của các ion với nhựa có thể sắp xếp thành dãy đối với từng loại nhựa:

17

a/ Nhựa sunfon:

• Trong dung dịch loãng ở nhiệt độ thường thì :-ái lực của cation với nhựa tăng khi điện tích của cation tăng: Na+<Ca 2+< Al3+

- Với các cation có cùng điện tích thì ái lực trao đổi tăng khi bán kính của các ion tăng:

Li+<H+<Na+< NH4+< K+

Mg 2+< Ca2+< Sn2+< Ba2+

18

b/ Nhựa có nhóm cacboxylic,

aminoaxetat

• Các loại nhựa này có nhóm chức có khả năng tạo phức với các cation kim loại Sự phụ thuộc cùng chiều của ái lực của nhựa với các cation kim loại theo độ bền của phức các nhóm chức với ion kim loại.

H + >Ca 2+ >Mg 2+ >Li + >Na + >K + >Rb +

• Đối với các ionit nhóm chức aminoaxetat:

Fe 2+ >Mn 2+ >Ca 2+ >Mg 2+ >Ba 2+ >Sn 2+ Li + Na + >K +

• Đối với anionit bazơ mạnh:F - <OH - <Cl - <NO3- <Br - <I

-<SO4

2-• Đối với anionit bazơ yếu: F - < Br - <I - <NO3 - <SO4 2- <OH

-19

MECHANISM OF ION-EXCHANGE CHROMATOGRAPHY OF AMINO ACIDS

20

Cách lựa chọn nhựa trao đổi ion

1/ Dựa vào độ bền của protein

- Nếu bền ở giá trị pH thấp hơn pI thì dùng cationit

- Nếu bền ở giá trị pH cao hơn pI thì dùng anionit

2/ Dựa vào kích thước phân tử protein

- Nhỏ hơn 10 000 Da, sử dụng nhựa có kích thước lỗ nhỏ

- Từ 10000 Da đến 100 000 Da- loại tương đương

sepharose

3/ Lưu ý: Lựa chọn buffer phù hợp

21

4 Cách tiến hành sắc ký trao đổi ion

4.1 Cột trao đổi ion

• Người ta thực hiện trên cột có chứa ionit

• Ionit sau khi đã ngâm trương trong nước được đưa

vào cột cùng với nước để tránh bọt khí giữa các

hạt Lượng ionit chiếm 2/3 thể tích cột Cột thường có kích thứớc: D:H= 1:810 Trên cùng đổ 1 lớp

bông thủy tinh dày 3-5 mm và một lớp bi thủy tinh dày 1-2 cm để lớp ionit không bị xáo trộn.

22

qua có tính axit Khi làm thay đổi pH sẽ làm

thay đổi khả năng trao đổi ionit

23

Các giai đoạn (2)

- giải hấp ion bị hấp thu

Ion bị hấp thu được tách ra khỏi ionit bằng

dung dịch thích hợp như dung dịch axit ở nồng độ khác nhau

- rửa ionit để loại trừ hết dung dịch giải hấp

nằm giữa khe hở của hạt ionit

24

Lựa chọn đệm, chọn đúng

*Đối với anionit (DEAE) dùng :

- Tris, imidazole, pyridine

* Đối với cationit (CM) dùng đệm :

-axetat, citrat, phosphat

pH:

Đối với cationit pH= pI-1

Đối với anionit pH=pI+1

Sử dụng muối: NaCl và KCl

25

Table 1 Buffers for cation exchange

Table 2 Buffers for anion exchange

Table 2 Buffers for anion exchange

Các giai đoạn (3)

- tái sinh ionit: Giai đoạn này đưa ionit về dạng

ban đầu bằng cách cho chảy qua cột dung dịchHCl 2-4% , NaCl, đối với cationit hoặc NaOH 2-

4% đối với anionit

• rửa ionit sau khi đã tái sinh: bằng nước cất

* Có thể sử dụng nhiều cột và thực hiện liên

tục

29

Các yếu tố ảnh hưởng tới vận tốc

• Tốc độ dòng và kích thước hạt ảnh hưởng đếnđộ phân giải và khả năng tách như thế nào?

31

Quá trình trao đổi ion có thể sử dụng sau khi

kết tủa muối hoặc sau khi lọc gel

-Nếu kết tủa muối thì cần thẩm tích trước khi

sắc ký

Có thể dùng trực tiếp ngay sau khi lọc gel

SỬ DỤNG Ở BƯỚC NÀO CỦA QUÁ TRÌNH

TINH SẠCH?

32