Đánh giá khả năng sinh trưởng, phát triển và kháng thuốc diệt cỏ (nhóm phosphinothricin )của một số dòng đậu tương chuyển gen

Khóa luận tốt nghiệp rất hay và bổ ích !

Phần 1

MỞ ĐẦU1.1 Tính cấp thiết của đề tài

Cỏ dại là một trong những nguyên nhân chính làm giảm năng suất của câytrồng do cạnh tranh trực tiếp dinh dưỡng, ánh sáng và là nơi cư trú của nhiều đốitượng sâu bệnh hại Mặt khác, sự cạnh tranh của cỏ dại gây ra các stress sinh họcđối với cây trồng, làm giảm khả năng sinh trưởng của cây Trong trồng trọt, để hạnchế cỏ dại có thể sử dụng (i) biện pháp diệt trừ thủ công hay canh tác tuy nhiên biệnpháp này mất nhiều công sức mà hiệu quả không cao; (ii) phun thuốc trừ cỏ hóahọc, phương pháp này được cho là hiệu quả hơn và được lựa chọn là công cụ chínhdiệt trừ cỏ dại Tuy nhiên thuốc diệt cỏ sẽ gây hại cho cây trồng, thậm trí làm chếtcây nếu phun quá nồng độ và không đúng thời điểm Để khắc phục điều này, cácnhà khoa học trên thế giới đã nghiên cứu chuyển gen kháng thuốc diệt cỏ vào câytrồng Tính đến năm 2010, diện tích cây trồng biến đổi gen kháng thuốc diệt cỏchiếm khoảng 61% (70 triệu ha) tổng diện tích cây trồng biến đổi gen hiện nay (148triệu ha) (Clive James, 2011) Chuyển gen kháng thuốc diệt cỏ vào cây trồng đãmang lại lợi ích lớn cho sản xuất nhờ tăng năng suất, giảm chi phí đầu tư công làmđất, trừ cỏ, giảm ô nhiễm môi trường do sử dụng thuốc hóa học,… Đậu tương làcây trồng chính cung cấp protein cho con người và được trồng rộng khắp ở nhiềuquốc gia trên thế giới Diện tích trồng đậu tương vào khoảng 102,4 triệu ha(FAOSTAT, 2011); trong đó đậu tương chuyển gen chiếm 81% diện tích (CliveJames, 2011), là cây trồng chuyển gen có diện tích lớn nhất hiện nay (bông 64%,ngô 39%) Ở Việt Nam, đậu tương có diện tích khoảng 197,8 nghìn ha, năng suấtchỉ đạt 15 tạ/ha (Tổng cục thống kê, 2011) Cỏ dại là một trong những trở ngại làmcho diện tích trồng đậu tương không được mở rộng và ảnh hưởng đến năng suất câytrồng Năng suất và sản lượng đậu tương trong nước không đáp ứng đủ nhu cầutrong nước Do vậy, hàng năm Việt Nam phải nhập khẩu một lượng lớn hạt đậutương để phục vụ nhu cầu trong nước (năm 2010, Việt Nam nhập khẩu hơn 227nghìn tấn hạt đậu tương) (Tổng cục thống kê, 2011) Cùng với cây ngô và cây bông,đậu tương là cây trồng được ưu tiên phát triển bằng kỹ thuật chuyển gen Nhiều nhàkhoa học đã tiến hành nghiên cứu, tạo giống đậu tương bằng phương pháp chuyểngen và đã thu được kết quả nhất định (Nguyễn Tiến Dũng và cs, 2010), (Trần ThịCúc Hòa, 2007 và 2008)

Năm 2010, Khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm, trường Đạihọc Nông Lâm Thái Nguyên đã chuyển gen thành công tạo ra các dòng đậu tươngkháng thuốc diệt cỏ từ các giống đậu tương của Việt Nam Trong phạm vi đề tài,

chúng tôi tiến hành: “Đánh giá khả năng sinh trưởng, phát triển và kháng thuốc diệt cỏ (nhóm phosphinothricin )của một số dòng đậu tương chuyển gen”.

1.2 Mục đích, yêu cầu và ý nghĩa của đề tài

1.2.1 Mục đích

Đánh giá khả năng sinh trưởng, phát triển và kháng thuốc diệt cỏ nhómphosphinothricin của một số dòng đậu tương chuyển gen

1.2.2 Yêu cầu

- Đánh giá khả năng kháng thuốc diệt cỏ của các dòng đậu tương chuyển gen

- Sử dụng phương pháp PCR xác định sự có mặt của gen bar với các cặp

mồi đặc hiệu

- Đánh giá khả năng sinh trưởng, phát triển của các dòng đậu tươngchuyển gen

1.2.3 Ý nghĩa của đề tài

1.2.3.1 Ý nghĩa trong học tập, nghiên cứu

Giúp sinh viên củng cố và hệ thống lại các kiến thức đã học, đồng thời manglại cho bản thân những kinh nghiệm và tác phong làm việc khoa học phục vụ chocông tác sau này

Biết được phương pháp nghiên cứu một vấn đề khoa học, xử lý và phân tích

số liệu, cách trình bày một bài báo khoa học

Ngoài ra đề tài hoàn thành có thể dùng làm tài liệu tham khảo cho các nghiêncứu tiếp theo

1.2.3.2 Ý nghĩa thực tiễn

Những kết quả đạt được sẽ góp phần đưa cây đậu tương chuyển gen ra khảosát trên diện rộng hơn, từ đó là cơ sở cho việc ứng dụng cây đậu tương chuyển genkháng thuốc diệt cỏ vào thực tiễn sản xuất sau này

Phần 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU2.1 Giới thiệu chung về đậu tương

2.1.1 Nguồn gốc và phân loại

2.1.1.1 Nguồn gốc của đậu tương

Cây đậu tương là một trong những loài cây trồng được biết đến từ rất sớm.Các bằng chứng về lịch sử, địa lý và khảo cổ học chỉ ra rằng đậu tương có nguồngốc từ Trung Quốc Cây đậu tương được thuần hóa và trồng làm cây thực phẩm ởTrung Quốc vào khoảng thế kỷ XVII trước công nguyên Cây đậu tương đượctruyền bá sang Nhật vào khoảng thế kỷ thứ XVIII, du nhập vào nhiều nước Châu Ákhác như: Indonesia, Philippin, Thái Lan, Ấn Độ, Việt Nam,… vài thế kỷ sau đó.Cây đậu tương được trồng ở Châu Âu vào thế kỷ thứ XVII và ở Hoa Kỳ vào thế kỷXVIII (Chu Hoàng Mậu và cs, 2011)

2.1.1.2 Phân loại đậu tương

Đậu tương thuộc chi Glycine, họ đậu Leguminosae, họ phụ cánh bướm Papilionoideae và bộ phaseoleae Đậu tương có tên khoa học là Glycine Max (L)

Merr

Do xuất phát từ những yêu cầu, căn cứ và tiêu chí phân loại khác nhau nêncũng có nhiều cách phân loại khác nhau Nhưng đến nay, hệ thống phân loại căn cứvào đặc điểm về hình thái, phân bố địa lý và số lượng nhiễm sắc thể được nhiềungười sử dụng

Hệ thống phân loại căn cứ vào đặc điểm hình thái, sự phân bố địa lý và

số lượng nhiễm sắc thể do Hymowit và Newell (1984) xây dựng Theo hệ thống

này ngoài chi Glycine còn có thêm chi phụ Soja Chi Glycine được chia ra thành 7 loài hoang dại lâu năm, và chi phụ Soja được chia ra làm 2 loài: loài đậu tương trồng Glycine (L) Merr và loài hoang dại hàng năm G.Soja Sieb và Zucc (Trần Văn Điền, 2007).

Hiện nay, đậu tương trồng ở Việt Nam có 2 nguồn gốc, đó là các giống địaphương và các giống nhập nội (Chu Hoàng Mậu và cs, 2011)

2.1.2 Đặc điểm thực vật học của cây đậu tương

Đậu tương là loại cây trồng cạn thu hạt, gồm các bộ phận chính: rễ, thân,cành, lá, hoa, quả và hạt

Rễ đậu tương là loại rễ cọc, gồm rễ cái và các rễ phụ, trên rễ có nhiều nốt sần

chứa vi khuẩn Rhizobium japonicum, có khả năng cố định đạm của không khí tạo

thành đạm dễ tiêu (Chu Hoàng Mậu và cs, 2011)

Đậu tương là cây hai lá mầm, thân thảo Thân cây có nhiều lông nhỏ, khi cònnon thân có màu xanh hoặc tím, khi về già chuyển màu nâu nhạt Màu sắc thân câycho ta biết màu của hoa sau này, nếu thân có màu xanh hoa sẽ màu trắng, nếu thân

có màu tím thì hoa sẽ có màu tím đỏ, chiều cao của thân từ 0,3-1m tùy theo giống.Thân cây đậu tương hình tròn, mang nhiều đốt, thường đứng, có khi bò hay nửa bò.Mỗi thân cây có khoảng 8-14 đốt, các cành mọc ra từ các đốt trên thân, đốt đầu tiêncủa thân chính mang 2 lá mầm, đốt thứ hai mang hai lá đơn đối nhau, từ đốt thứ 3trở lên, mỗi đốt mang một lá kép (Chu Hoàng Mậu và cs, 2011)

Mỗi lá kép có 3 lá chét Phiến lá có nhiều hình dạng khác nhau: trứng, tròn,dài, lưỡi mác… Hình dạng của lá thay đổi theo giống, những giống có lá dài và nhỏchịu hạn tốt nhưng cho năng suất thấp, những giống lá to thường cho năng suất caohơn nhưng cũng chịu hạn kém hơn (Chu Hoàng Mậu và cs, 2011)

Đậu tương là cây tự thụ phấn Hoa đậu tương được phát sinh từ nách lá, đầucành hoặc đầu thân Hoa mọc thành chùm, mỗi chùm thường có từ 3-5 hoa Hoalưỡng tính nên đậu tương là cây tự thụ phấn, tỷ lệ giao phấn rất thấp chỉ chiếm 0,5-1%, hoa có màu tím hay trắng Thời kỳ cây ra hoa sớm hay muộn, thời gian dài hayngắn tùy thuộc vào giống và thời vụ gieo, bởi nó chịu ảnh hưởng phối hợp của ánhsáng và nhiệt độ (Chu Hoàng Mậu và cs, 2011)

Quả đậu tương là loại quả ráp, ngoài vỏ quả thường có lông bao phủ, màusắc vỏ quả khi chín có màu vàng hay xám đen Quả đậu tương thẳng hoặc hơi cong,dài từ 2-7cm Mỗi quả thường có 2- 3 hạt Hạt đậu tương có hình dạng tròn bầu dục,tròn dài, tròn dẹt, vỏ hạt thường nhẵn và có màu vàng nhạt, vàng đậm, xanh, nâu,đen…đa số là hạt màu vàng Những giống có hạt màu vàng có giá trị thương phẩmcao Khối lượng 1000 hạt dao động trung bình từ 100-200g Hình dạng và màu sắccủa rốn hạt đặc trưng cho mỗi giống (Chu Hoàng Mậu và cs, 2011)

Bộ rễ đậu tương gồm rễ chính và rễ phụ Trên rễ có rất nhiều nốt sần, đó là

kết quả của sự cộng sinh giữa vi khuẩn Rhizobium japonicum với rễ Nốt sần có thể

dài 1cm, đường kính 5-6mm, khi mới hình thành nó có màu trắng sữa, khi phát triển

tốt nhất nốt sần có màu hồng Nốt sần tập trung nhiều ở tầng đất có độ sâu từ 20cm, có vai trò quan trọng trong việc cố định đạm nitơ không khí, với lượng đạmcung cấp cho cây khoảng 30-60kg/ha (Chu Hoàng Mậu và cs, 2011).

0-Dựa vào thời gian sinh trưởng, đậu tương được chia thành các loại: chín rấtsớm: thu hoạch sau 80-90 ngày; chín sớm: thu hoạch sau 90-100 ngày; chín trungbình: thu hoạch sau 100- 110 ngày; chín muộn trung bình: thu hoạch sau 110-120ngày; chín muộn: thu hoạch sau 130-140 ngày; chín rất muộn: thu hoạch sau 140-

150 ngày(Chu Hoàng Mậu và cs, 2011)

2.1.3 Đặc điểm sinh trưởng, phát triển của cây đậu tương

Sinh trưởng là quá trình tạo mới các yếu tố cấu trúc, kết quả là sự tăng lên về

số lượng, kích thước của tế bào các cơ quan trong cây, phát triển là sự biến đổi vềchất các tế bào, các cơ quan dẫn đến sự thay đổi về cấu trúc, chức năng

Đối với cây đậu tương thì sinh trưởng và phát triển là quá trình biến đổi từhạt, là sự tăng lên không ngừng về chiều cao cây, số lá, quá trình lớn lên của quả vàhạt cho đến khi đạt kích thước tối đa và chín

Quá trình sinh trưởng và phát triển của cây đậu tương tạm phân ra làm 2 giaiđoạn chính:

- Giai đoạn sinh trưởng sinh dưỡng

- Giai đoạn sinh trưởng sinh thực (Trần Văn Điền, 2007)

2.1.3.1 Giai đoạn sinh trưởng sinh dưỡng

độ và oxy

+ Nước: Hạt đậu tương hút nhiều nước hơn so với các cây trồng khác Hạtphải hút một lượng nước trên 50% trọng lượng hạt thì mới nảy mầm, trong khi đócác cây trồng khác như lúa chỉ hút 26%; ngô 44% v.v

+ Nhiệt độ: Nhiệt độ từ 15-300C là thích hợp nhất cho quá trình nảy mầm củahạt đậu tương Trong khoảng nhiệt độ này, chỉ sau gieo 3-7 ngày là hạt đã nảy mầm

+ Hàm lượng O2: Có liên quan tới độ ẩm đất, nếu ẩm độ đất trên 90% thìkhông đủ O2 để hạt nảy mầm Khi có đủ nước, oxy, nhiệt độ thì hạt sẽ hút nước

trương lên, các men proteinaza, amyloaza vv chứa trong hạt bắt đầu hoạt độngchuyển các chất dữ trữ ở dạng phức tạp sang đơn giản về nuôi phôi và hình thành bộphận mới (Trần Văn Điền, 2007).

* Thời kỳ phân cành và sinh trưởng thân lá

Thời kỳ này được tính từ khi cây có 1-2 lá kép và căn bản kết thúc lúc bắtđầu nở hoa Tốc độ sinh trưởng thân lá trong thời gian đầu của thời kỳ này tươngđối chậm chỉ tới khi bắt đầu xuất hiện lớp rễ thứ 2 và sắp ra nụ hoa mới bắt đầu tăngnhanh Đây là thời kỳ mầm hoa bắt đầu phân hóa Thời kỳ này rất quan trọng, chỉtrên cơ sở thân lá sinh trưởng tốt, cành phát triển nhiều, sinh trưởng nhanh thì mầmhoa mới phân hóa được nhiều Nhưng nếu thân lá sinh trưởng quá mạnh lại ức chếmầm hoa phân hóa chậm lại Thời kỳ này nốt sần bắt đầu được hình thành Sau mọcđược khoảng 15 ngày cây có lá kép đầu tiên thì nốt sần được hình thành và khảnăng cố định N dần dần được tăng lên Điều kiện ngoại cảnh thích hợp cho thời kỳnày là nhiệt độ: 22-250C, ẩm độ đất: 70-80% và yêu cầu ánh sáng đầy đủ để câysinh trưởng và phát triển khỏe Có thể nói đây là thời kỳ mấu chốt để cây đậu tươngthân to, đốt ngắn, rễ ăn sâu và mầm hoa nhiều (Trần Văn Điền, 2007)

2.1.3.2 Giai đoạn sinh trưởng sinh thực

Sau giai đoạn sinh trưởng sinh dưỡng, cây chuyển sang giai đoạn sinh thực.Trong giai đoạn này, những nụ ở nách lá chính phát triển thành những chùm hoa

Đối với giống có tập tính sinh trưởng vô hạn, cây vẫn tiếp tục sinh trưởngsinh dưỡng hầu như trong suốt vụ trồng Số quả thường thưa và phân bố đều ở tất cảcác cành, về phía ngọn thân quả thường ít hơn Đôi khi trên ngọn thân có chùm hoangọn, nhưng thực tế nó là chùm hoa nách tập trung ở trên ngọn thân Đối với giống

có tập tính sinh trưởng hữu hạn, cây ngừng sinh trưởng khi ra hoa Loại này có cảchùm hoa ngọn và nách, quả phân bố đều dọc theo thân và phía trên ngọn Giaiđoạn này cây rất nhạy cảm với thiếu nước Phần lớn biến động về năng suất là dobiến động về lượng nước cho cây trong thời kỳ ra hoa đậu quả Sự thiếu nước dẫnđến rụng hoa, quả và giảm kích thước hạt Nhu cầu nước của cây cao nhất vào giaiđoạn cây ra hoa đến khi quả vào chắc Giai đoạn quả bắt đầu chín nhu cầu nước lạigiảm đi Điều kiện thích hợp cho sự nở hoa ở nhiệt độ 25-280C, ẩm độ không khí75-80%, ẩm độ đất 70-80% Nhiệt độ tối ưu cho đậu tương chín là 250C ban ngày

và 150C ban đêm (Trần Văn Điền, 2007)

2.1.4 Đặc tính chống chịu của cây đậu tương

2.1.4.1 Tính chịu lạnh

Nhiệt độ dưới 15 C có ảnh hưởng xấu đến nảy mầm của hạt và sự hútnước Nhiệt độ dưới 13-150C, giảm ra hoa, đậu quả và ảnh hưởng tới quang hợp

và bộ máy quang hợp Nhưng cơ chế của ảnh hưởng này như thế nào? Tổnthương do lạnh thường do hại màng tế bào, do màng tế bào không có khả nănggiữ cấu trúc của nó ở nhiệt độ thấp Các mô, chẳng hạn như hạt phấn đang lớn dễnhạy cảm với nhiệt độ thấp hơn các mô khác và dẫn đến sự bất dục ở cây đậutương (Trần Văn Điền, 2007)

2.1.4.2 Tính chịu hạn

Tính chịu hạn của cây có thể phân loại ra như sau:

- Tránh hạn: Là cơ chế một số thời kỳ sinh trưởng phát triển nhạy cảm của

cây đậu tương tránh và thoát các ảnh hưởng trực tiếp của khô hạn

- Chịu hạn hoặc do giảm sự mất nước, hoặc cây chịu được sự mất nước.

Tránh hạn đối với những vùng có khô hạn dài ngày thì rất khó thực hiện Tachỉ có thể chọn thời vụ mà khô hạn xảy ra ít nhất để hạn chế ảnh hưởng của nó tớisinh trưởng và năng suất cây Hướng chọn giống có tính giảm sự mất nước cho thấy

có nhiều triển vọng Nên chọn những cây có bộ rễ sâu phân nhánh nhiều, do đó cóthể hút nước từ tầng đất sâu và rộng

Sự mất nước qua khí khổng phụ thuộc chủ yếu vào độ mở của khí khổng vàsau đó là hướng lá và các yếu tố khác Khi hạn xảy ra, lỗ khí khổng lá đóng ngaylại, dẫn đến giảm sự bốc hơi nước và quang hợp, nhưng sự giảm bốc hơi nước mạnhhơn Giữa các giống có sự khác nhau về lớp phấn và lông trên lá Lớp phấn trên lá

có tác dụng giảm sự bốc hơi (Trần Văn Điền, 2007)

2.1.4.3 Tính chịu đựng và khả năng phục hồi

Cho dù đặc tính giảm sự mất nước của cây tốt đến đâu chăng nữa, cây vẫn bịtổn thương hoặc chết do khô hạn kéo dài Có rất ít thông tin về khả năng phục hồicủa cây đậu tương sau khi bị mất nước nặng Cây bị lạnh trong thời gian ra hoa, thìhầu hết những hoa ra trong thời kỳ đó bị rụng và sau đó vài tuần cây có thể ra hoa

và đậu quả nếu thời tiết ấm Thiếu nước trong giai đoạn ra hoa sẽ làm giảm thờigian ra hoa Thiếu nước trong giai đoạn làm quả sẽ ảnh hưởng tới năng suất nhiềuhơn so với thiếu nước trong giai đoạn ra hoa Qua các nghiên cứu người ta có thể dựđoán được giai đoạn nào cây bị ảnh hưởng nhiều do bất lợi (khô hạn, lạnh…) Tuynhiên, bởi vì người ta khó có thể dự đoán khi nào bất lợi xảy ra, cho nên người nông

dân khó có thể ứng dụng được những kết quả nghiên cứu đó nếu như điều kiện tướikhông có Tốt nhất nên chọn giống có thời gian ra hoa dài và có khả năng phục hồitốt sau khi bị hạn hoặc bị lạnh (Trần Văn Điền, 2007).

2.1.5 Giá trị của cây đậu tương

Đậu tương là cây trồng ngắn ngày có giá trị kinh tế cao, sản phẩm của nóđược dùng làm thực phẩm cho con người, thức ăn cho gia súc, nguyên liệu cho côngnghiệp, làm hàng cho xuất khẩu và là loại cây cải tạo đất trồng rất tốt Đậu tươngđược xem là cây quan trọng nhất trong các cây họ đậu vì giá trị rất toàn diện về mặtdinh dưỡng, kinh tế và cải tạo đất (Chu Hoàng Mậu và cs, 2011)

Giá trị về mặt thực phẩm

Hạt đậu tương có thành phần dinh dưỡng cao, hàm lượng protein trung bìnhkhoảng từ 35,5-40% Trong khi đó hàm lượng protein trong gạo chỉ 6,2-12%; ngô:9,8-13%; thịt bò: 21%, thịt gà: 20%; cá 17-20% và trứng: 13-14,8%, lipit từ 15-20%, hyđrat cacbon từ 15-16% và nhiều loại sinh tố và muối khoáng quan trọng cho

sự sống Hạt đậu tương là loại thực phẩm duy nhất mà giá trị của nó được đánh giáđồng thời cả protit và lipit Protein của đậu tương có phẩm chất tốt nhất trong số cácprotein có nguồn gốc thực vật Hàm lượng protein trong hạt đậu tương cao hơn cảhàm lượng protein có trong cá, thịt và cao gấp 2 lần so với các loại đậu đỗ khác(Ngô Thế Dân và cs, 1999)

Hàm lượng axit amin có chứa lưu huỳnh như methionin và cystein của đậutương cao gần bằng hàm lượng các chất này có trong trứng gà Hàm lượng cazein,đặc biệt lysin cao gần gấp rưỡi lần chất này có trong trứng Vì thế mà khi nói về giátrị của protein trong hạt đậu tương là nói đến hàm lượng protein cao và sự cân đốicủa các loại axit amin cần thiết Protein của đậu tương dễ tiêu hóa hơn thịt và không

có các thành phần tạo colesteron Ngày nay người ta mới biết thêm hạt đậu tương cóchứa lexithin, có tác dụng làm cho cơ thể trẻ lâu, tăng thêm trí nhớ, tái tạo các mô,làm cứng xương và tăng sức đề kháng của cơ thể (Ngô Thế Dân và cs, 1999)

Hạt đậu tương có chứa hàm lượng dầu béo cao hơn các loại đậu đỗ khác nênđược coi là cây cung cấp dầu thực vật quan trọng Lipit của đậu tương chứa một tỷ

lệ cao các axit béo chưa no (khoảng 60-70%) có hệ số đồng hóa cao, mùi vị thơmnhư axit linoleic chiếm 52-65%, oleic từ 25-36%, linolenolic khoảng 2-3% (NgôThế Dân và cs, 1999)

Trong hạt đậu tương có khá nhiều loại vitamin, đặc biệt là hàm lượngvitamin B1 và B2 ngoài ra còn có các loại vitamin PP, A, E, K, D, C… Đặc biệttrong hạt đậu tương đang nảy mầm hàm lượng vitamin tăng lên nhiều, đặc biệt làvitamin C Phân tích thành phần sinh hóa cho thấy trong hạt đậu tương đang nảymầm, ngoài hàm lượng vitamin C cao, còn có các thành phần khác như: vitamin

PP, và nhiều chất khoáng khác như Ca, P, Fe… Chính vì thành phần dinh dưỡngcao như vậy nên đậu tương có khả năng cung cấp năng lượng khá cao khoảng

4700 cal/kg

Hiện nay, từ hạt đậu tương người ta đã chế biến ra được trên 600 sản phẩmkhác nhau, trong đó có hơn 300 loại làm thực phẩm được chế biến bằng cả phươngpháp cổ truyền, thủ công và hiện đại dưới dạng tươi, khô và lên men… Như làmgiá, đậu phụ, tương, xì dầu… đến các sản phẩm cao cấp khác như cà phê đậu tương,bánh kẹo và thịt nhân tạo… Đậu tương còn là vị thuốc để chữa bệnh, đặc biệt là đậutương hạt đen, có tác dụng tốt cho tim, gan, thận, dạ dày và ruột Đậu tương là thức

ăn tốt cho những người bị bệnh đái đường, thấp khớp, thần kinh suy nhược và suydinh dưỡng (Trần Văn Điền, 2007)

Giá trị về mặt công nghiệp

Đậu tương là nguyên liệu của nhiều ngành công nghiệp khác nhau như: chếbiến cao su nhân tạo, sơn, mực in, xà phòng, chất dẻo, tơ nhân tạo, chất đốt lỏng,dầu bôi trơn trong ngành hàng không, nhưng chủ yếu đậu tương đậu tương đượcdùng để ép dầu Hiện nay trên thế giới đậu tương là cây đứng đầu về cung cấpnguyên liệu cho ép dầu, dầu đậu tương chiếm 50% tổng lượng dầu thực vật Đặcđiểm của dầu đậu tương: khô chậm, chỉ số iốt cao: 120-127; ngưng tụ ở nhiệt độ: -

15 đến -180C Từ dầu này người ta chế ra hàng trăm sản phẩm công nghiệp khácnhư: làm nến, xà phòng, ni lông… (Trần Văn Điền, 2007)

Giá trị về mặt nông nghiệp

- Làm thức ăn cho gia súc: Đậu tương là nguồn thức ăn tốt cho gia súc, 1 kg

hạt đậu tương đương với 1,38 đơn vị thức ăn chăn nuôi Toàn cây đậu tương (thân,

lá, quả, hạt) có hàm lượng đạm khá cao cho nên các sản phẩm phụ như thân lá tươi

có thể làm thức ăn cho gia súc tốt, hoặc nghiền khô làm thức ăn tổng hợp của giasúc Sản phẩm phụ công nghiệp như khô dầu có thành phần dinh dưỡng khá cao: N:6,2%, P2O5: 0,7%, K2O: 2,4%, vì thế làm thức ăn cho gia súc rất tốt (Ngô Thế Dân

và cộng sự, 1999)

- Cải tạo đất: Đậu tương là cây luân canh cải tạo đất tốt 1 ha trồng đậu

tương nếu sinh trưởng phát triển tốt để lại trong đất từ 30-60 kg N Trong hệ thốngluân canh, nếu bố trí cây đậu tương vào cơ cấu cây trồng hợp lý sẽ có tác dụng tốtđối với cây trồng sau, góp phần tăng năng suất cả hệ thống cây trồng mà giảm chiphí cho việc bón N Thân lá đậu tương dùng bón ruộng thay phân hữu cơ rất tốt bởihàm lượng N trong thân chiếm 0,05%, trong lá: 0,19% (Trần Văn Điền, 2007)

2.1.6 Đặc điểm của một số giống đậu tương sử dụng trong thí nghiệm

2.1.6.1 Giống VX93

* Nguồn gốc

Giống đậu tương VX93 do trung tâm nghiên cứu và thực nghiệm Đậu Viện Cây lương thực và cây thực phẩm chọn lọc từ mẫu giống K-7002 Năm 1989giống VX93 được Hội đồng khoa học Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn côngnhận là giống quốc gia

Đỗ-* Đặc điểm chính

Có thời gian sinh trưởng 90- 100 ngày Cây cao khoảng 50-55cm Cónhiều quả, hạt to, màu hạt vàng Hạt khá to, trọng lượng hạt trong điều kiện bìnhthường khoảng 138-140 g/1000 hạt nhưng nếu được thâm canh sẽ lên 160-180 g.Rốn hạt màu nâu Giống VX93 chịu được rét nên thích hợp với vụ thu đông và

vụ đông Năng suất trung bình có thể đạt 13-14 tạ/ha Nhưng nếu được thâmcanh có thể đến 15-25 tạ/ha Khả năng chống chịu sâu bệnh thuộc loại trung bình(Phạm Văn Thiều, 1996)

2.1.6.2 Giống ĐVN9

* Nguồn gốc

Giống đậu tương ĐVN9 do nhóm các nhà khoa học của Viện Nghiên cứuNgô lai tạo và chọn lọc từ tổ hợp lai ĐT-12 x VN20-5 Giống được công nhận chosản xuất thử năm 2007 và hiện đang được nhân ra diện rộng

* Đặc điểm chính

ĐVN9 là giống đậu tương chín sớm: vụ xuân 88-90 ngày, vụ hè 75-77ngày, vụ đông 78-80 ngày; dạng cây đứng, lá hình trứng nhọn, hoa tím, vỏ quảchín màu vàng rơm, hạt vàng, rốn hạt nâu nhạt Chiều cao cây trung bình 27,3-56,5cm; phân cành mạnh (1,7-3,1 cành cấp 1/cây); cỡ hạt trung bình (148,5 -171,8g/1000 hạt); sai quả (22,9 - 49,5 quả/cây) Năng suất trung bình ở vụ xuânđạt 17 tạ/ha, vụ hè 21 tạ/ha

2.2 Tình hình sản xuất đậu tương trên thế giới và Việt Nam

2.2.1 Tình hình sản xuất đậu tương trên thế giới

Đậu tương là cây trồng lấy hạt, cây có dầu quan trọng bậc nhất trên thế giới,đứng hàng thứ 4 sau cây lúa mì, lúa nước và ngô Do khả năng thích ứng rộng nên

nó đã được trồng ở khắp năm châu lục, nhưng tập trung nhiều nhất ở Châu Mỹ trên70%, tiếp đến là Châu Á hơn 20% và một số nước khác trên thế giới (Trần VănĐiền, 2007)

Bảng 2.1 Tình hình sản xuất đậu tương trên thế giới những năm gần đây

Năm Diện tích (triệu ha) Sản lượng (triệu tấn) Năng suất (tạ/ha)

(Nguồn: FAOSTAT Database, 2011)

Bảng 2.2 Tình hình sản xuất đậu tương của một số nước đứng đầu trên thế

giới trong những năm gần đây

Nước

Diện tích (triệu ha)

Năng suất (tạ/ha)

Sản lượng (triệu tấn)

Diện tích (triệu ha)

Năng suất (tạ/

ha)

Sản lượng (triệu tấn)

Theo dự báo của Bộ nông nghiệp Mỹ, tổng sản lượng đậu tương thế giới liên

vụ năm 2010 và 2011 sẽ đạt 253,69 triệu tấn, điều chỉnh tăng 2,41 triệu tấn (tăng0,96%) so với dự báo hồi tháng 7/2010, song vẫn giảm 6,20 triệu tấn (giảm 2,39%)

so với sản lượng 259,90 triệu tấn của năm 2009 Trong đó, sản lượng của các nước

dự báo đạt: Mỹ 93,44 triệu tấn; Brazil 65,00 triệu tấn; Argentina 50,00 triệu tấn;Trung Quốc 14,60 triệu tấn; Ấn Độ 8,80 triệu tấn; Paragoay 6,50 triệu tấn; Canada3,90 triệu tấn và các nước khác 11,45 triệu tấn.

2.2.2 Tình hình sản xuất đậu tương ở Việt Nam

Việt Nam có lịch sử trồng đậu tương lâu đời, một số tài liệu cho rằng cây đậutương được đưa vào trồng ở nước ta từ thời vua Hùng, và xác định rằng nhân dân tatrồng đậu tương trước đậu xanh (Trần Văn Điền, 2007)

Hiện nay cây đậu tương ở Việt Nam chiếm một vị trí rất quan trọng trongnền kinh tế nông nghiệp, đặc biệt ở những vùng nông thôn nghèo, nền kinh tế chưaphát triển Ngoài ra, cây đậu tương còn là nguồn cung cấp thức ăn cho chăn nuôi,cung cấp nguyên liệu cho chế biến và xuất khẩu Có thể nói cây đậu tương ở Việtnam đang phát triển không ngừng và ngày càng có vị trí quan trọng trong nền kinh

tế quốc dân

Cây đậu tương thích ứng với nhiều vùng sinh thái nông nghiệp khác nhau,

là cây có hiệu quả kinh tế cao trên đất bạc màu và khô hạn Góp phần tích cực vàochuyển dịch cơ cấu cây trồng trong nông nghiệp, tạo thêm công ăn việc làm vàkhai thác sử dụng được tiềm năng đất đai sẵn có, góp phần tăng thêm thu nhập chongười dân Trong vòng 10 năm trở lại đây, cây đậu tương đã phát triển khá nhanh

cả về diện tích, năng suất và sản lượng, nhưng hiện nay trong sản xuất đậu tương ởnước ta chưa được đầu tư cao, năng suất còn thấp so với các nước trên thế giới(Hà Tấn Thụ, 2006)

Theo số liệu thống kê chính thức của chính phủ, đậu tương được trồng ở 28tỉnh trên khắp cả nước, trong đó 70% ở miền Bắc và 30% ở miền Nam Khoảng65% đậu tương nước ta được trồng ở vùng cao, những nơi đất không cần màu mỡ

và 35% được trồng ở những vùng đất thấp ở khu vực đồng bằng sông Hồng Đậutương được trồng ở nhiều địa phương trên khắp cả nước vào từng thời điểm khácnhau nên có cả vụ xuân, vụ hè và vụ đông

Sản lượng đậu tương nước ta năm 2010 đạt 297.000 tấn, tăng 39% so vớinăm 2009 Nguyên nhân chính là do sự mở rộng đáng kể về diện tích cây trồng

(khoảng 35%) Tuy nhiên, sản lượng trên vẫn thấp hơn so với mục tiêu đề ra chonăm 2010 là 325.000 tấn của Bộ NN&PTNT do chi phí sản xuất tăng và năng suấtđậu tương của cả nước chưa cao.

Bảng 2.3 Tình hình sản xuất đậu tương ở Việt Nam những năm gần đây

(Nghìn ha)

Sản lượng (Nghìn tấn)

Năng suất (tạ/ha)

2009 diện tích có giảm đi (146,2 nghìn ha) xong năng suất vẫn giữ mức ổn định cao(14,61 tạ/ha) Năng suất biến động từ 13,89 tạ/ha (năm 2006), lên 15,01 tạ/ha (năm2010) và sản lượng từ 258,1 nghìn tấn (năm 2006) lên 296,9 nghìn tấn (năm 2010-tăng 15,03%).Tuy vậy, với năng suất 15,01 tạ/ha (năm 2010), Việt Nam vẫn là nước

có năng suất thấp so với năng suất bình quân của thế giới là 23,78 tạ/ha (năm 2010)

2.3 Tình hình cây đậu tương biến đổi gen trên thế giới và Việt Nam

2.3.1 Tình hình cây đậu tương biến đổi gen trên thế giới

Cũng như các cây trồng biến đổi gen khác cây đậu tương biến gen khác câyđậu tương biến đổi gen mang các tính trạng tốt như kháng hạn, kháng sâu, khángthuốc diệt cỏ, tăng năng suất… đang ngày một phát triển nhiều trên thế giới Lầnđầu tiên diện tích trồng đậu tương biến gen chiếm tới trên 81% trong tổng diện tích102,4 triệu ha trồng đậu tương trên toàn thế giới Tính trạng kháng thuốc diệt cỏcũng là tính trạng phổ biến nhất ở đậu tương hiện nay, chiếm tới 62% Cây đậutương biến đổi gen đa tính trạng cũng ngày càng được áp dụng rộng rãi, chiếm 26%tổng diện tích trồng cây biến đổi gen toàn thế giới, được trồng ở 12 nước, trong đó

có 9 nước đang phát triển (Clive James, 2011)

2.3.2 Tình hình cây đậu tương biến đổi gen tại Việt Nam

Tại Việt Nam, chuyển gen vào cây đậu tương mới được đưa vào chươngtrình công nghệ sinh học mấy năm gần đây Một số tác giả đã có báo cáo về quy

trình tái sinh cây đậu tương như Nguyễn Thúy Điệp và cộng sự (2005) báo cáo kếtquả nghiên cứu ban đầu về khả năng tái sinh của một số giống đậu tương hiện có tạiViệt Nam Tác giả thử nghiệm khả năng tái sinh của các giống đậu tương qua haiphương pháp nuôi cấy: (1) tạo mô sẹo và (2) từ protocorm xuất hiện qua nuôi cấyđỉnh sinh trưởng Tỷ lệ tạo mô sẹo cao nhất được ghi nhận ở môi trường MS-B5 có

bổ sung 19 mg/l 2,4D, tuy nhiên tất cả các mô sẹo đều bị chết sau 7 tuần nuôi cấytrên môi trường tái sinh cây Với phương pháp tạo protocorm từ đỉnh sinh trưởng,tác giả thu được cây tái sinh từ một giống duy nhất dùng trong thí nghiệm làPSBsy4s với môi trường MS-B5 có bổ sung 1,5 mg BAP /l

Tác giả Trần Thị Cúc Hòa và cộng sự (2007) đã tiến hành biến nạp gen chỉ

thị bar/gus vào 91 giống đậu tương để tìm ra 5 giống có tiềm năng để sử dụng cho

chuyển nạp gen Năm 2008, tác giả tiếp tục nghiên cứu hiệu quả biến nạp gen vào

giống đậu tương PC19 với hệ thống vector nhị thể pZY 102 /pTF 102 mang gen bar

và gen GusA Qua phân tích Southern Blot các cây T0 cho thấy hiệu quả chuyển nạpgen đạt 1-3% Đây là một trong những bước đầu thuận lợi cho các nghiên cứuchuyển gen hữu dụng vào cây đậu tương ở Việt Nam

Nguyễn Tiến Dũng và cs (2010) đã tiến hành nghiên cứu khả năng tiếp nhận

gen của 20 giống đậu tương Việt Nam thông qua gen chỉ thị Gus Kết quả đã xác

định được hai giống đậu tương có tiềm năng sử dụng cho biến nạp gen

2.4 Tác hại của cỏ dại đối với cây trồng hiện nay

2.4.1 Đặc tính và tác hại của cỏ dại

2.4.1.1 Đặc tính của cỏ dại

Cỏ dại là loại thực vật có khả năng thích ứng với điều kiện ngoại cảnh, cótính chống chịu cao với điều kiện khắc nghiệt của khí hậu và thổ nhưỡng, thườngmọc tự nhiên trên đồng ruộng, vườn tược, ven đường, bãi đất hoang…

Cỏ dại có khả năng sinh sản, nhân giống và duy trì giống cao Đối với câytrồng thường chỉ có một hình thức sinh sản vô tính hoặc hữu tính Ví dụ, ngô và lúa

lá hai cây lương thực quan trọng của nước ta, chỉ có hình thức sinh sản hữu tính.Một số cây lại sinh sản vô tính như khoai lang, khoai tây Ở cỏ dại, khả năng sinhsản rất lớn và số hình thức sinh sản khá đa dạng (Chu Thị Thơm và cs, 2006)

Ví dụ: Cỏ gà là loài cỏ lưu niên họ hòa thảo, mọc ở khắp các vùng, có tới 3hình thức sinh sản: bằng hạt, bằng thân bò và bằng thân ngầm Cỏ gấu và cỏ tranh

có 2 hình thức sinh sản: bằng thân ngầm và bằng hạt

Cỏ dại gồm nhiều loài khác nhau, hạt của cỏ dại nhỏ, nhẹ hơn cây trồng Với

số lượng nhiều hạt trên một cây đảm bảo cho cỏ dại có hệ số nhân giống cao Trên

một đơn vị diện tích đất canh tác, người ta có thể bới lên hàng tạ thân, rễ cỏ lâu nămvới hàng triệu mầm ngủ của nhiều loại cỏ khác nhau (Chu Thị Thơm và cs, 2006).

Hạt cỏ dại sau khi chín dễ rời khỏi cây và rụng xuống Hiện tượng này kèmtheo sự chín không đều làm cỏ dại kéo dài thời gian phóng thích hạt Hạt cỏ dại nhỏ

và nhẹ nên dễ trôi nổi hoặc lơ lửng trong không trung, trong nước…

Quả và hạt của các loài cỏ dại thường có nhiều bộ phận phụ như lông, râu,móc, cánh…giúp chúng phân tán bằng nhiều con đường Những loại hạt cỏ có lông

dễ bay theo gió, dễ trôi nổi trên mặt nước, có thể di chuyển xa từ ruộng này sangruộng khác hoặc từ vùng nọ đến vùng kia…

Cỏ dại còn có khả năng giữ sức sống của mầm qua bộ máy tiêu hóa của cácloài động vật và cả ở trong phân bón do động vật thải ra Hạt cỏ có mức độ chínkhác nhau, mọc lai rai, hơn nữa lại mọc mầm ở nhiều thời điểm khác nhau, nên trênđồng ruộng , khu trồng cây, rau màu… lúc nào cũng có cỏ dại mọc, gây khó khăncho việc phòng trừ và chăm bón cây trồng (Chu Thị Thơm và cs, 2006)

So với cây trồng, cỏ dại còn có khả năng chống chịu các điều kiện ngoạicảnh bất lợi cao hơn Đặc tính này có được là kết quả của sự thích nghi với môitrường xung quanh và sự chọn lọc tự nhiên lâu đời Ở dạng hạt, khi gặp nhiệt độ caotrong khoảng thời gian dài vài ba ngày, một số loại cỏ dại chẳng những không bịchết mà dôi khi còn là điều kiện để nảy mầm cao hơn Cỏ dại sinh sản chủ yếu theohình thức vô tính với các mầm ngủ nằm sâu dưới đất, nên vào mùa đông, gặp thờitiết lạnh, chúng sống tiềm sinh trong lòng đất, gặp điều kiện thích hợp mới pháttriển nhanh (Chu Thị Thơm và cs, 2006)

Ngoài ra cỏ dại còn có khả năng chịu được đất chặt, xấu, nghèo chất dinhdưỡng, khả năng chịu hạn, chịu ngập úng cao hơn cây trồng Ví dụ như cỏ tranh, cỏlông may… là những loại cỏ có bộ rễ ăn sâu và rộng nên chịu hạn tốt, có thể mọcđược ở trên sườn đồi, bờ đê- là những nơi lượng nước trong đất ít Hơn nữa, một sốloại cỏ, do có mùi hôi, vị đắng hoặc cay hay có lá nhám, có gai… nên chúng còn cókhả năng xua đuổi nhiều động vật ăn cỏ Vì thế, việc trừ cỏ dại thường tốn kém, khókhăn (Chu Thị Thơm và cs, 2006)

2.4.1.2 Tác hại của cỏ dại với cây trồng

Nhìn chung, cỏ dại ảnh hưởng xấu đến quá trình sinh trưởng, năng suất vàphẩm chất của cây trồng, gây tốn kém trong chi phí sản xuất…

- Cỏ dại tranh chấp ánh sáng, nước và các chất dinh dưỡng

Đối với cây trồng, nhất là cây trồng ngắn ngày thì yếu tố ánh sáng quyết địnhrất lớn (tới 90-95%) năng suất của cây Sự tranh chấp ánh sáng giữa cây trồng và cỏdại làm cho năng suất cây trồng giảm sút hoặc sinh trưởng chậm, sản phẩm đem lạichất lượng kém Một số loài cỏ dại như tơ hồng, tầm gửi thường sống ký sinh trêncây ăn quả: cam, bưởi, nhãn, khế… chẳng những chúng hút nước, muối khoáng mà

cả chất hữu cơ nữa (Chu Thị Thơm và cs, 2006)

- Cỏ dại tiết ra những chất độc hại cho cây trồng và là ký chủ của nhiều loạisâu bệnh

Trong quá trình sinh trưởng và phát triển, bộ rễ của cỏ dại có thể tiết ranhững chất độc hại cho cây trồng Hơn nữa, cỏ dại còn là ký chủ của nhiều loại sâubệnh hại cây trồng Một số nghiên cứu cho biết: Các cây cỏ dại cùng họ, bộ hay cónhững đặc tính giống cây trồng thường làm ký chủ cho những nguồn sâu bệnh hạicây trồng tương ứng (Chu Thị Thơm và cs, 2006)

- Cỏ dại làm giảm năng suất và phẩm chất cây trồng

Cây trồng bị cỏ dại lấn áp, tranh cướp ánh sáng, nước, chất dinh dưỡngthường sinh trưởng kém và cho năng suất thấp Tùy theo từng điều kiện cụ thể mà

cỏ dại có thể làm cho năng suất cây trồng giảm nhiều hay ít Ruộng nhiều cỏ, phẩmchất cây trồng giảm Mặt khác, do phải tốn thêm công sức và các phương tiện làmđất, xới xáo đất, làm cỏ để trừ cỏ dại nên chi phí trong sản xuất nông nghiệp tất yếutăng lên, dẫn tới việc tăng giá thành sản phẩm (Chu Thị Thơm và cs, 2006)

- Cỏ dại gây hại cho gia súc và ảnh hưởng đến sức khỏe của con người

Những cây cỏ dại có chứa chất độc, nếu để lẫn vào thức ăn gia súc sẽ làmảnh hưởng đến sức khỏe gia súc, đồng thời người sử dụng sản phẩm của loại độngvật này cũng bị ảnh hưởng (Chu Thị Thơm và cs, 2006)

2.4.2 Những thiệt hại do cỏ dại gây ra đối với cây trồng hiện nay

Nghiên cứu của tổ chức môi trường Land Care của New Zealand cho thấy cỏdại gây ra thiệt hại 95 tỷ đô la Mỹ mỗi năm do làm giảm sản lượng lương thực thựcphẩm trên toàn cầu so với 85 tỷ bởi bệnh cây, 46 tỷ bởi côn trùng và 2,4 tỷ bởi cácđộng vật có xương sống (không kể con người) phá hoại

Thiệt hại về năng suất do cỏ dại và chi phí cho phòng trừ cỏ dại là mất mátlớn nhất trong sản xuất đậu tương Thiệt hại do cỏ dại trên toàn nước Mỹ vàokhoảng 1,9 tỷ đôla Mỹ, thêm vào đó chi phí để phòng trừ là 1,1 tỷ đôla nữa như vậytoàn chi phí do cỏ dại ở Mỹ hàng năm mất khoảng 3 tỷ đôla Một chi phí cao hơn cảchi phí để phòng trừ sâu bệnh (Ngô Thế Dân và cộng sự, 1999)

2.4.3 Biện pháp phòng trừ cỏ dại bằng thuốc hóa học

Đến nay, đã có nhiều công trình nghiên cứu cho biết, trừ cỏ cho cây trồng nóichung và cho lúa, ngô, khoai, sắn, đậu đỗ… nói riêng bằng các biện pháp trồng trọt,đặc biệt là các biện pháp làm đất (cày, bừa, cuốc xới…) tuy có khả năng diệt cỏ dạitốt, song lại có nhược điểm là dễ làm cho đất đai bị xói mòn, rửa trôi trong mùamưa Tình hình này càng nghiêm trọng hơn đối với các vùng núi cao, vùng đồi dốctrồng cây ăn quả, hoa màu, cây lấy gỗ v.v… Dùng thuốc hóa học trừ cỏ sẽ góp phầnchống xói mòn, rửa trôi đất, bảo vệ cây trồng không bị cỏ dại lấn át Hơn nữa, dùngthuốc hóa học cho cây trồng có thể rút ngắn công làm cỏ Điều này đặc biệt có ýnghĩa đối với những nước có nền công nghiệp phát triển cần huy động nhiều lựclượng lao động nông nghiệp phục vụ cho các ngành kinh tế quốc dân khác (Chu ThịThơm và cs, 2006)

Ở nước ta, hiện nay việc dùng thuốc hóa học trừ cỏ đã trở nên phổ biến,không chỉ đối với ruộng trồng lúa, hoa màu mà cả đối với đất trồng cây công nghiệpngắn ngày, cây ăn quả… Việc dùng thuốc hóa học trừ cỏ đã thực sự giảm số cônglao động làm cỏ để chuyển sang một số khâu thâm canh khác Như vậy, dùng thuốchóa học trừ cỏ cũng góp phần quan trọng trong việc tăng năng suất cây trồng vàhiệu quả lao động trong nông nghiệp

Tuy nhiên, nếu ứng dụng biện pháp hóa học trừ cỏ một cách máy móc, tùytiện, thiếu hiểu biết, thiếu cơ sở khoa học sẽ đưa lại những hậu quả tai hại, ngaytrước mắt cũng như lâu dài Dùng sai thuốc, không đúng kỹ thuật, liều lượng, thờigian, quy định v.v… chẳng những không diệt trừ được cỏ dại mà còn hại cây trồng,ảnh hưởng không tốt đến đai canh tác, môi trường và sức khỏe con người… (ChuThị Thơm và cs, 2006)

Với sự ra đời của nhiều thế hệ thuốc trừ cỏ từ tiền nảy mầm đến thuốc trừ cỏhậu nảy mầm đã tạo bước đột phá làm giảm chi phí sản xuất và cho phép nông dâncanh tác với diện tích lớn Thuốc cỏ chọn lọc có loại tiền nảy mầm phun trước hayngay khi xuống giống nhằm diệt các hạt cỏ dại nhưng không diệt hạt giống câytrồng Ngược lại thuốc cỏ hậu nảy mầm diệt cỏ dại đã lớn nhưng không diệt câytrồng Các loại thuốc trừ cỏ hiện nay có nhược điểm khi sử dụng phải tuân thủ theohướng dẫn của nhà sản xuất để tránh gây thiệt hại đến cây trồng, nó chỉ hiệu quả đốivới một số loại cỏ nhất định, có loại chỉ diệt cỏ lá rộng không diệt cỏ lá hẹp vàngược lại Ngay đối với họ hòa bản, các loại thuốc trừ cỏ loại này phải chừa cây lúa

ra Việc sử dụng thuốc cỏ chọn lọc gặp trở ngại hiệu quả không cao, phun nhiều lần,kết hợp nhiều loại thuốc trừ cỏ khác nhau và đôi khi ảnh hưởng tới cây trồng (ChuThị Thơm và cs, 2006).

Với lý do đó trên thế giới đã phát triển loại giống cây trồng kháng thuốc trừ

cỏ, cho phép sử dụng thuốc trừ cỏ phổ rộng để diệt các loại cỏ có mặt trên đồngruộng, chỉ chừa lại cây trồng nhờ mang gen kháng thuốc

2.5 Một số nghiên cứu về đặc tính kháng thuốc trừ cỏ cho cây trồng hiện nay

2.5.1 Cơ chế hoạt động của gen kháng thuốc diệt cỏ

Cơ chế hoạt động của gen kháng thuốc diệt cỏ như sau:

- Ngăn cản không cho cây hấp thu thuốc trừ cỏ

- Vô hiệu hóa các enzyme kích hoạt của thuốc trừ cỏ

- Ức chế tác động của thuốc trừ cỏ đối với các protein mục tiêu trong cây trồng

- Kích thích protein mục tiêu kháng lại thuốc trừ cỏ của cây trồng (NguyễnPhước Tuyên, 2011)

2.5.2 Một số nghiên cứu về đặc tính kháng thuốc trừ cỏ cho cây trồng hiện nay

Tính chống chịu đối với thuốc trừ cỏ được đưa vào những cây không có tínhkháng thuốc cỏ phổ rộng trong tự nhiên Tính chống chịu này rất dễ chuyển vị dođơn gen điều khiển tính trạng kháng bằng cơ chế sinh hóa đối với một loại thuốc cỏ

mà chúng ta hiểu rất rõ về cơ chế tác động Cây trồng được chuyển gen kháng thuốctrừ cỏ được ứng dụng nhiều nhất (Nguyễn Phước Tuyên, 2011)

1) Kháng nhóm thuốc trừ cỏ Glyphosate và Glufosinate

Thuốc trừ cỏ nhóm này thuộc nhóm thuốc cỏ phổ rộng có ưu điểm khi sử dụngđược các chất hữu cơ trong đất giữ chặt nên không bị rửa trôi xuống tầng nước ngầm

và không ảnh hưởng đến vụ sau, nó cũng ít độc đến động vật so với các loại thuốc trừ

cỏ khác Nó trừ cỏ bằng cách vô hiệu hóa enzymes EPSPS và tổng hợp diệp lục tốtrong lục lạp EPSPS là loại enzymes giúp cây tổng hợp các amino acid vòng nhưtyrosine, phenylalanine và tryptophan EPSPS có trong tất cả các thực vật, nấm, vikhuẩn nhưng không có trong người và động vật Cỏ dại bị chết vì thiếu các aminoacid thiết yếu Glyphosate là loại thuốc trừ cỏ phổ rộng có tên thương mại là Ground

Up của Công ty Monsanto Nhằm tăng doanh số bán Ground Up, Monsanto đã đưavào một loại enzymes chức năng có tên là Roundup Ready®, gen này sản xuất raenzymes EPSPS đột biến, nó vẫn có khả năng tổng hợp các amino acid vòng nhưng

kháng lại thuốc trừ cỏ Ground Up Gen này được vi khuẩn Agrobacterium dòng

CP4 chuyển vào cây trồng để tạo ra giống kháng thuốc trừ cỏ Ground Up, vẫn sống

sót sau khi xịt thuốc trừ cỏ Ground Up Trên 90% giống đậu nành tại Mỹ hiện nayđều được chuyển gen kháng Ground Up Đến năm 2008, có 80 triệu ha kháng thuốctrừ cỏ mà chủ yếu kháng thuốc trừ cỏ Ground Up (Nguyễn Phước Tuyên, 2011).

2) Kháng thuốc trừ cỏ nhóm Phosphinothricin

Nhóm thuốc trừ cỏ này tên thương mại là Bialaphos và Basta, trong đó cóchất L-PPT ngăn cản men glutamine syntherase tổng hợp glutamine, dẫn đến tíchlũy ammonia quá nhiều gây ngộ độc cho cây L-PPT có cấu trúc hóa học tươngđồng với glutamate, nên nó có tác dụng ngăn cản enzymes glutamine synthetase.Gen kháng PPT vô hiệu hóa men chất L-PPT, giúp cây trồng vẫn sống sau khi xịtthuốc cỏ Phosphinothricin, gen này được chuyển qua rau, nho và bắp trên thươngmại Đối với lúa, IRRI đã thành công trong việc chuyển gen PPT để tạo giống lúa

kháng thuốc trừ cỏ Tại Việt Nam, đã sử dụng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens

LBA 4404 chuyển gen PPT sang giống Nàng Thơm Chợ Đào, Một Bụi kháng thuốctrừ cỏ Basta TM (Nguyễn Phước Tuyên, 2011)

3) Kháng thuốc trừ cỏ nhóm imidazolinone

Có tên thương mại hiện đang lưu hành ở Việt Nam là imazapic, imazapyr vàimazethapyr Nhóm này chuyên trừ lúa cỏ, ngoài ra còn trừ cỏ lồng vực, cỏ đuôiphụng, các loài cỏ lác Nhóm thuốc trừ cỏ này ức chế sự hoạt động của menacetohydroxyacid synthase (AHAS) tham gia vào quá trình sinh tổng hợp các aminoacid như : valine, leucine, isoleucine Do đó khi phun thuốc lên thực vật, quá trìnhtạo protein bị xáo trộn dẫn đến sự hình thành không bình thường DNA cũng như sựphát triển của tế bào nên cỏ không phát triển

Qua chọn lọc từ 1 tỷ hạt lúa trong hơn 10 năm, đã phát hiện 1 cây lúa cógen tạo ra AHAS enzyme kháng với imidazolinone Giống này được lai tạo vớicác giống lúa cao sản để tạo ra giống lúa kháng thuốc trừ cỏ nhóm imidalizoneđược đặt tên là CL 121 và CL 141 Một chương trình hợp tác giữa Viện lúaĐBSCL, tập đoàn BASF và Đại học Louisiana (Hoa Kỳ) đã được tiến hành từ năm

2003 và tiếp tục cho đến ngày nay Mục đích của chương trình này là nghiên cứulai tạo các giống lúa india có gen kháng thuốc diệt cỏ thuộc nhóm imidazolinone

để sử dụng các loại thuốc diệt cỏ thuộc nhóm này diệt lúa cỏ và cỏ dại trên ruộnglúa tại Việt Nam Giống lúa kháng thuốc diệt cỏ imidazolinone được gọi là lúaCLEARFIELD đã được tạo ra bởi các nhà di truyền giống thuộc Đại họcLouisiana (Hoa Kỳ) Phương pháp sử dụng để tạo giống lúa này là qua con đườngđột biến kết hợp với lai truyền thống Công nghệ sinh học qua hình thức chuyển

gen đã không được sử dụng trong quá trình chọn tạo do đó lúa CLEARFIELDkhông phải là cây trồng chuyển gen (GMO) Chương trình đã đưa ra giống CF6 laigiữa CL161 và IR64 có thời gian 95 ngày Về mặt năng suất, giống lúa CF6 chonăng suất không thua kém các giống lúa đang canh tác phổ biến ở Đồng bằngSông Cửu Long, nhưng có ưu điểm về cứng cây, trổ gọn và chất lượng gạo tốt Vềmặt sâu bệnh, do được lai tạo từ giống IR64 nên nhiễm nhẹ rầy nâu và đạo ôn.Nhưng lợi thế của giống CF6 là chống chịu tốt với thuốc trừ cỏ thuộc nhómimidazolinone gồm: imazapic, imazapyr và imazethapyr diệt rất tốt đối với lúa cỏ,

cỏ lồng vực, cỏ đuôi phụng và các giống lúa khác Lúa cỏ là dịch hại đang pháttriển rất mạnh ở các nước trồng lúa Châu Á nói chung và các tỉnh Đồng bằng SôngCửu Long nói riêng, nó phát triển chung với lúa trồng và gần như không có biệnpháp phòng trừ hữu hiệu Giống lúa CF6 kết hợp với thuốc trừ cỏ nhómimidazolinone là giải pháp diệt cỏ hữu hiệu (Nguyễn Phước Tuyên, 2011)

2.6 Một số đặc điểm và tác dụng của gen bar

Gen bar - gen kháng thuốc diệt cỏ được phân lập từ hệ DNA của S.hygroscopicus (Charles J.Thompson et al, 1987), gen được nhân dòng thứ cấp trong E.coli W3110iq sử dụng vectơ pUC19 Trong W3110iq, quá trình phiên mã

bởi promoter Lac bị kìm hãm mạnh nhưng có thể cảm ứng vớiisopropylthiogalactoside Gen tạo ra bằng cách nhân dòng thứ cấp vùng BamHI

được phân lập ban đầu từ Streptomycete, pBG4, từ vị trí BamHI của pUC19 tạo

pBG195 và pBG196 W3110iq có hoạt tính kháng bialaphos yếu khi nó chứapBG196; tuy nhiên, tăng mức độ kháng chất không thể cảm ứng bằngisopropylthiogalactoside Với W3110iq/pBG195, hàm lượng kháng chất có thể cảmứng từ 0,005 đến hơn 0,05 mg/l

Gen bar (bialaphos resistance) mã hóa phosphinothricin acetyl transferase (PAT) khử độc phosphinothricin làm cho glutamine synthase (GS) không bị ức chế

Phosphinothricin là thành phần mang hoạt tính của các thuốc trừ cỏ nhómglufosinate có tên thương mại là Basta, Liberty, Ignite, v.v Phosphinothricin cócấu trúc tương tự glutamine, cấu trúc này cũng giống cấu trúc của bialaphos (PPT),

một kháng sinh của Streptomyces Tác động của phosphinothricin là ức chế

glutamine synthase (GS), một enzyme chủ chốt trong chu trình khử độc ammonihình thành trong quá trình trao đổi chất nitơ trong thực vật Tính kháng glufosinatesđược thực hiện thông qua gen mã PAT có nguồn gốc từ các loài xạ khuẩn như

Streptomyces hygroscopicus hay S.viridochromogens (Lê Trần Bình, 2008) Khi

chuyển loại gen này vào cây giúp hoạt động trao đổi chất của cây diễn ra bìnhthường không bị tác động bởi nhóm thuốc diệt cỏ trên.

Phần 3 VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU3.1 Vật liệu, hóa chất, thiết bị thí nghiệm

- Giống đậu tương: VX93, ĐVN9, Kwangkong (KW) và các dòng đậu tươngchuyển gen được tạo ra từ phòng thí nghiệm Khoa Công nghệ Sinh học và Côngnghệ Thực phẩm, trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên

- Hóa Chất thí nghiệm: Hoạt chất diệt cỏ DL- Phosphinothricin (PPT) củahãng Duchefa, thuốc trừ cỏ Basta thương phẩm (hãng Bayer), PCR master mix,

Taq DNA polymerase của hãng Fermatas, mồi đặc hiệu gen bar do hãng

Địa điểm và thời gian nghiên cứu

Các thí nghiệm được tiến hành từ tháng 10/2011 đến tháng 6/2012 tại trườngĐại học Nông Lâm Thái Nguyên

3.3 Nội dung và phương pháp nghiên cứu

3.3.1 Nội dung nghiên cứu

Nội dung 1: Đánh giá khả năng kháng thuốc diệt cỏ của các dòng đậu tương

chuyển gen

Nội dung 2: Sử dụng phương pháp PCR xác định sự có mặt của gen bar với

các cặp mồi đặc hiệu

Nội dung 3: Đánh giá khả năng sinh trưởng, phát triển của các dòng đậu

tương chuyển gen

3.3.2 Phương pháp nghiên cứu

3.3.2.1 Đánh giá khả năng kháng thuốc diệt cỏ của các dòng đậu tương chuyển gen

Cây chuyển gen kháng thuốc diệt cỏ được tạo ra dựa trên phương pháp

chuyển gen gián tiếp thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens của Margine

M.Paz và cs 2006 Cây con được đưa ra trồng trong chậu, chăm sóc trong điều kiện

nhà lưới tại trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên và đánh giá khả năng khángthuốc diệt cỏ theo phương pháp của Margine M.Paz và cs 2006 Khi cây có từ 3 láthật trở lên tiến hành thử khả năng kháng thuốc diệt cỏ bằng cách dùng bông tẩmdung dịch thuốc PPT quét ngang lá với các nồng độ 0,3; 0,5; 0,7; 1,0 và 1,3mg/ml.Theo dõi khả năng kháng của cây sau 3-5 ngày thử thuốc Thí nghiệm sử dụnggiống ĐVN9 và VX93 không chuyển gen làm đối chứng.

Thí nghiệm 1: Đánh giá khả năng kháng thuốc diệt cỏ của các dòng đậu

tương chuyển gen thế hệ T0

Mỗi công thức được nhắc lại 3 lần, mỗi lần 1 lá Thí nghiệm được tiến hànhtrong điều kiện nhà lưới

Thí nghiệm 2: Đánh giá khả năng kháng thuốc diệt cỏ của các dòng đậu

tương chuyển gen thế hệ T1

Thu hạt của cây T0, trồng riêng rẽ, mỗi cây được ký hiệu thành một dòngriêng biệt Nồng độ PPT thích hợp cho chọn lọc cây chuyển gen xác định ở thínghiệm 1 được lựa chọn để đánh giá khả năng kháng thuốc diệt cỏ của các dòng đậutương chuyển gen thế hệ T1 bằng cách phun trực tiếp lên lá (giai đoạn chắc xanh)

Thí nghiệm 3: Đánh giá khả năng kháng thuốc diệt cỏ của các dòng đậu

tương chuyển gen thế hệ T2

Thu hạt của cây T1, trồng riêng rẽ, mỗi cây được ký hiệu thành một dòngriêng biệt, đánh giá tương tự thế hệ T1 Thí nghiệm tiến hành ở 2 giai đoạn: giaiđoạn cây con (3-4 lá thật) và giai đoạn chắc xanh

3.3.2.2 Phân tích PCR xác định sự có mặt của gen bar với các cặp mồi đặc hiệu

Từ kết quả nghiên cứu ghi nhận ở thí nghiệm trên chúng tôi tiến hành phân

tích PCR nhằm kiểm tra sự hiện diện của gen bar với các mồi đặc hiệu Vì gen

chuyển là gen đã được biết vì vậy chỉ cần sử dụng cặp mồi đặc hiệu cho gen đó vàtách chiết DNA từ mẫu thực vật cần xác định làm khuôn là có thể tiến hành PCR.Nếu sản phẩm PCR có kích thước đúng như dự kiến thì mẫu phân tích có biểu hiện

là dương tính Tuy nhiên, PCR dương tính không đồng nghĩa với chuyển gen thànhcông vì có nhiều cách để giải thích sự có mặt của DNA trong mẫu phân tích: (i) Vi

khuẩn Agrobacterium mang gen chuyển còn tồn tại trong khối mô hay trong các

gian bào của mẫu phân tích Tuy nhiên, nếu là mẫu phân tích của thực vật đã qua

nhân giống hữu tính, tức là qua thế hệ T1, T2 v.v… dưới dạng hạt thì hoàn toàn loạitrừ khả năng này; (ii) Gen chuyển tồn tại tự do trong tế bào chất, có thể biến mấtqua sinh sản hữu tính; (iii) Gen chuyển không hoạt động, tức là không được biểuhiện thành protein có chức năng sinh học Vì thế kết quả phân tích bằng PCR là cơ

sở để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo

Phân tích PCR: Cây chuyển gen kháng thuốc diệt cỏ sau 5 ngày tiến hành

thu mẫu lá để tách chiết DNA và phân tích PCR với cặp mồi đặc hiệu gen bar; tách

chiết DNA tổng số từ mẫu lá theo phương pháp CTAB của Saghai Maroof (1984)

Phương pháp tách chiết DNA tổng số từ lá đậu tương

DNA tách chiết và tinh sạch bằng phương pháp CTAB của Saghai Maroof(1984) có cải tiến cho phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm

Hóa chất được sử dụng để tách chiết DNA như sau:

Tách chiết DNA từ lá đậu tương

- Bước 1: Nghiền 0,3- 0,5 gam lá đậu tương trong nitơ lỏng thành bột mịn.

- Bước 2: Chuyển bột lá vào ống ly tâm 1,5 ml Thêm 0,8 ml đệm CTAB đã

ủ ở 65oC trong 10 phút

- Bước 3: Ủ các ống ly tâm ở 65 C trong 90 phút, lắc nhẹ nhàng nhưng dứtkhoát 20 phút một lần để việc tách có hiệu quả.

- Bước 4: Ly tâm 12.000 vòng/phút, hút lớp dịch nổi sang ống mới rồi bổ

sung 0,7 ml dung dịch 24:1, lắc nhẹ nhàng trong 10 phút rồi tiến hành ly tâm trong

10 phút ở tốc độ 10.000 vòng/phút ở nhiệt độ phòng (lặp lại bước này 2 lần)

- Bước 5: Hút lớp dịch nổi sang ống mới rồi bổ sung (25:24:1) tỷ lệ (1:1)

lắc nhẹ nhàng trong 20 phút Rồi tiến hành ly tâm ở tốc độ 10.000 vòng/phút trong

10 phút

- Bước 6: Hút lớp dịch nổi sang ống mới bổ sung Isopropanol vào tỷ lệ 1:1

với mẫu, bổ sung thêm 3-5 µl NaCl 5M Lắc nhẹ trong 10 phút Để trong tủ -200Cqua đêm

- Bước 7: Ly tâm 14.000 vòng/phút trong 15 phút thu kết tủa.

- Bước 8: Rửa với Ethanol 70% sau đó ly tâm 12.000 vòng/phút trong 20

Phân tích PCR các cây đậu tương chuyển gen

Nguyên tắc của PCR dựa vào sự phối hợp khả năng lai đặc hiệu của DNA vàkhả năng tổng hợp DNA in vitro của DNA polymerase để nhân bản in vitro cácđoạn DNA (gen) khác nhau lên hàng triệu lần so với ban đầu Do DNA polymerasehoạt động theo nguyên tắc cần phức hợp khuôn mồi, trong môi trường thích hợp cócác dNTP thì sẽ kéo dài thành sợi bổ sung với khuôn Vì vậy, để nhân bản đượcđoạn DNA đích, người ta cần phải biết được trình tự nucleotide ở cả hai đầu đoạnDNA cần nhân bản để từ đó thiết lập cặp mồi đặc hiệu Mồi dùng trong phản ứngPCR thường có chiều dài từ 10 đến 40 nucleotide, tùy thuộc vào mức độ khuếch đạiđặc hiệu đối với trình tự đích và tùy thuộc vào mục đích của các nhà nghiên cứu.Sau khi tiến hành chạy PCR với các mẫu phân tích, sự sai khác của DNA được kiểmtra dựa vào phương pháp điện di

Chúng tôi sử dụng cặp mồi đặc hiệu cho việc xác định sự có mặt của gen

kháng thuốc trừ cỏ (gen bar), sản phẩm khuếch đại được phát hiện và kết quả

dương tính sẽ cho một vạch có kích thước 408bp Trình tự cặp mồi được thể hiệntrong bảng 3.1.

Bảng 3.1 Trình tự các cặp mồi được sử dụng trong nghiên cứu

Mồi xuôi (Bar - F) TCC GTA CCG AGC CGC AGG AA 408bp

Mồi ngược (Bar - R) CCG GCA GGC TGA AGT CCA GC 408bp

- Taq DNA polymerase 1µl

* Phản ứng được diễn ra trên máy PCR với chu trình chạy như sau:

Bảng 3.2 Chu trình chạy phản ứng PCR Các bước khuếch đại Nhiệt độ ( 0 C) Thời gian Số chu kỳ

Biến tính

Bắt cặp

Kéo dài

955572

* Chuẩn bị bản gel

- Chuẩn bị khay điện di, lau khô, cài lược, chỉnh cho cân bằng.

- Chuẩn bị gel agarose 0,8%, đưa vào lò vi sóng khoảng 2 phút cho agarose

tan hoàn toàn trong dung dịch TAE 1X Để hỗn hợp giảm nhiệt độ xuống còn

50-600C, bổ sung ethidium bromide rồi đổ vào khay điện di

- Sau khoảng 45- 60 phút gel đông lại, rút lược khỏi bản gel Đặt khay vào

bản điện di, bổ sung thêm dung dịch TAE 1X cho ngập mặt gel

* Tra mẫu DNA

- Lấy 2µl đệm tra mẫu, thêm vào 8µl DNA sản phẩm, trộn đều rồi tra vào

các giếng Tra thêm DNA marker 1kb vào giếng đầu tiên để xác định độ dài của cácbăng DNA