Trích ly chất màu từ hạt dành dành(gardenia jasminoides ellis) bằng phương pháp trích ly hai pha nước

Mục tiêutrích ly hoạt chất màu vàng crocin từ hạt dành dành với định hướng tách crocin và geniposide bằng phương pháp trích ly dung môi hai pha nước, với các nội dung cụ thể: - Xây dựng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KỸ THUẬT

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP NGÀNH CÔNG NGHỆ HÓA HỌC

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KỸ THUẬT TP HỒ CHÍ MINH

Sinh viên thực hiện: Đường Tiểu Phụng

Mã số sinh viên: 17128049 Giáo viên hướng dẫn: TS Võ Thị Ngà

Tp Hồ Chí Minh, tháng 1 năm 2022

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KỸ THUẬT TP HỒ CHÍ MINH

- -KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Sinh viên thực hiện: Đường Tiểu Phụng

Mã số sinh viên: 17128049 Giáo viên hướng dẫn: TS Võ Thị Ngà

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KỸ THUẬT TP HCMKHOA CÔNG NGHỆ HÓA HỌC VÀ THỰC PHẨM

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ HÓA HỌC

-oOo -NHIỆM VỤ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Ngành: Công nghệ Kỹ thuật Hóa học

Chuyên ngành: Công nghệ Kỹ thuật Hóa Hữu cơ

phương pháp trích ly hai pha nước

2 Nhiệm vụ:

- Tìm hiểu tổng quan về crocin, các phương pháp trích ly chất màu, cơ sở để lựa chọnphương pháp trích ly hai pha nước cho quá trình trích ly chất màu crocin từ hạt dành dành

- Xây dựng phương pháp xác định các thành phần dịch trích

- Xây dựng điều kiện trích ly chất màu crocin từ hạt dành dành bằng phương pháp ATPE:

 Khảo sát chọn tỷ lệ của muối citrate và hỗn hợp muối phosphate;

 Khảo sát điều kiện ảnh hưởng quá trình trích ly

- Đánh giá hiệu quả trích ly

3 Ngày giao khóa luận: 23/02/2021

6 Nội dung hướng dẫn: Toàn bộ khóa luận

Nội dung và yêu cầu khóa luận tốt nghiệp đã được thông qua bởi

Trưởng bộ môn Công nghệ Hóa Học.

Thành phố Hồ Chí Minh, ngày 8 tháng 01 năm 2022

TRƯỜNG ĐH SƯ PHẠM KỸ THUẬT TP.HCM

KHOA CN HÓA HỌC & THỰC PHẨM

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ HÓA HỌC

-CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

-PHIẾU ĐÁNH GIÁ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

NGÀNH CÔNG NGHỆ KỸ THUẬT HÓA HỌC

KHÓA 2017

(NGƯỜI HƯỚNG DẪN)

1 THÔNG TIN CHUNG

Họ và tên người hướng dẫn: VÕ THỊ NGÀ

Đơn vị công tác: Khoa CNHH&TP, trường ĐH SPKT TPHCM

Học hàm, học vị: Tiến sĩ

Chuyên ngành: Hoá hữu cơ

Họ và tên sinh viên: ĐƯỜNG TIỂU PHỤNG

MSSV: 17128049

Chuyên ngành: Hoá hữu cơ

Tên đề tài: Trích ly chất màu từ hạt dành dành (Gardenia jasminoides Ellis) bằng phương pháp trích ly

dung môi hai pha nước

2 NHẬN XÉT VỀ KHÓA LUẬN

2.1 Hình thức

Số tài liệu tham khảo: 54 Phần mềm tính toán: Excel, Matlab

Bố cục: rõ ràng, hợp lý

Hành văn: tương đối mạch lạc, đôi chỗ còn viết câu dài

Sử dụng thuật ngữ chuyên môn: phù hợp

2.2 Mục tiêu và nội dung

Mục tiêu đề ra có định hướng rõ ràng và mang tính thực tế cao Mục tiêutrích ly hoạt chất màu vàng crocin từ hạt dành dành với định hướng tách crocin và geniposide bằng phương pháp trích ly dung môi hai pha nước, với các nội dung cụ thể:

- Xây dựng phương pháp xác định các thành phần dịch trích

- Xây dựng điều kiện trích ly chất màu crocin từ hạt dành dành bằng phương phápATPE:

 Khảo sát chọn tỷ lệ của muối citrate và hỗn hợp muối phosphate;

 Xây dựng đường cong hai pha;

 Khảo sát chọn thành phần hệ APTS;

 Khảo sát điều kiện ảnh hưởng quá trình trích ly.

- Đánh giá hiệu quả trích ly

2.3 Kết quả đạt được

Kết quả đạt được đáp ứng phần lớn mục tiêu đề ra Kết quả khảo sát đã chọn lựa được hỗn hợp muối gồm sodium citrate: (K 2 HPO 4 :KH 2 PO 4 , 18:7, w/w) tỷ lệ 80:20 dùng trong hệ ATPS Xác định được thành phần hệ hai pha nước ATPS tối ưu Xác định được điều kiện trích ly về tỷ lệ mẫu nghiên cứu :

dung môi, nhiệt độ trích ly, hàm lượng muối trung tính bổ sung Do hạn chế điều kiện nghiên cứu nên việc định hướng tách geniposide chưa được áp dụng xuyên suốt quá trình khảo sát.

2.4 Ưu điểm của khóa luận

Khoá luận tốt nghiệp với khối lượng công việc nhiều

2.5 Những thiếu sót của khóa luận

Điểm hạn chế của khoá luận là chưa tối ưu hoá được điều kiện trích ly nhằm chuyển

geniposide xuống pha dưới được nhiều nhất

Cần hoàn thiện một số lỗi biên tập báo cáo

3 NHẬN XÉT TINH THẦN VÀ THÁI ĐỘ LÀM VIỆC CỦA SINH VIÊN

 Kỹ năng làm việc trong phòng thí nghiệm tỷ mỉ và kiên trì

 Tác phong làm việc nghiêm túc, tận tuỵ và chủ động trong công việc

Không được bảo vệ

5 ĐÁNH GIÁ CỦA NGƯỜI HƯỚNG DẪN

Hình thức trình bày (đẹp, rõ ràng, tài liệu tham khảo

đầy đủ/đa dạng…)

20

16

Phương pháp nghiên cứu phù hợp, đảm bảo độ tin cậy,

17

Nội dung thực hiện, kết quả của đề tài đảm bảo tính

Kết luận phù hợp với mục tiêu, nội dung nghiên cứu 10 8

ổn

Tp Hồ Chí Minh, ngày 5 tháng 1 năm 2022

Giảng viên hướng dẫn

TS Võ Thị Ngà

TRƯỜNG ĐH SƯ PHẠM KỸ THUẬT

TP.HCM

KHOA CN HÓA HỌC & THỰC PHẨM

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ HÓA HỌC

1 THÔNG TIN CHUNG

Họ và tên người phản biện: Nguyễn Vinh Tiến

Đơn vị công tác: khoa CNHH&TP, ĐH SPKT TPHCM

Học hàm, học vị: Tiến sĩ

Chuyên ngành: Hóa học

Họ và tên sinh viên: Đường Tiểu Phụng

MSSV: 17128049

Chuyên ngành: Công nghệ Kỹ thuật Hóa hữu cơ

Tên đề tài:TRÍCH LY CHẤT MÀU TỪ HẠT DÀNH DÀNH (Gardenia jasminoides Ellis) BẰNG

PHƯƠNG PHÁP TRÍCH LY HAI PHA NƯỚC

Sử dụng thuật ngữ chuyên môn: có sử dụng, phù hợp

2.2 Mục tiêu và nội dung

- Mục tiêu trích ly hoạt chất màu vàng crocin từ hạt dành dành (Gardenia jasminoidesEllis) với định hướng tách crocin và geniposide bằng phương pháp trích ly hai phanước gồm nước, ethanol, hỗn hợp muối phosphate, natri citrate

- Nội dung:

+ Khảo sát dung môi loại chất béo khỏi bột hạt dành dành

+ Khảo sát tỉ lệ hỗn hợp muối citrate/phosphate và xây dựng giản đồ pha của hệ 2 pha nước

+ khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ dịch trích dành dành/hệ hai pha nước, nhiệt độ và nồng độ NaCl đến khả năng thu hồi crocin.

2.3 Kết quả đạt được

2.4 Ưu điểm của khóa luận

- khối lượng công việc hoàn thành khá lớn.

- SV biết sử dụng Matlab để giải hệ phương trình.

- có cố gắng bàn luận về những kết quả thu được, đối chiếu với các nghiên cứu khác và rút kinh nghiệm về những thiếu sót trong thực nghiệm.

2.5 Những thiếu sót của khóa luận

- Trong file luận văn hiện tại bị thiếu phiếu giao nhiệm vụ khóa luận cùng xác nhận của giáo viên hướng dẫn và Trưởng Bộ môn Công nghệ Hóa học.

- Phần tóm tắt luận văn quá sơ sài, không thể hiện được các nội dung chính của luận văn Ở đây chỉ là tóm tắt kết quả chứ không phải tóm tắt luận văn.

- Thiếu tổng quan về quả dành dành và các thành phần khác có trong hạt dành dành ngoài crocin và geniposide, vì các chất này có thể ảnh hưởng đến kết quả đo nồng độ bằng UV-vis.

- Thiếu trình bày quy trình thực nghiệm xác định nồng độ crocin ở pha trên và pha dưới (pha loãng bao nhiêu lần, bằng dung môi gì), quy trình định lượng geniposide bằng HPLC, cách khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ, cách thay đổi nồng độ NaCl mà không làm thay đổi hàm lượng nước trong hệ.

- Ở trang 26, các tài liệu [39] và [53] được trích dẫn ở những câu không phù hợp, khiến người đọc hiểu lầm là các giá trị nhiệt độ và giá trị nồng độ NaCl được tham khảo từ 2 tài liệu trên, nhưng thực tế thì không phải.

- Một số câu viết khó hiểu hoặc sai nghĩa:

+ “crocin với độ tinh khiết trên 99,6% có hoạt tính chống oxy hóa ở nồng độ lên đến 40 ppm” (trang

2) Chắc chắn crocin trên 40 ppm vẫn chống oxy hóa rất tốt chứ không phải chỉ “lên đến” 40 ppm.

+ “nếu có cùng anion thì xét tới cation nhằm tăng hiệu ứng tách muối lên khi kích thước cation giảm”

(trang 6) Câu này cần viết lại, thêm dấu phẩy phù hợp để rõ nghĩa.

+ “lựa chọn một điểm trong vùng tách pha với thành phần hỗn hợp là 2,5% EtOH, 2,9% hỗn hợp của

ba muối, 4,5% H 2O và 0,1% nguyên liệu thô, w/w Lượng mẫu được điều chỉnh là 0,5 g (trang 21).” Ở

đây % khối lượng các chất đã bị tính sai!

+ Trục C PA được chia thành ba phần bằng nhau dựa vào quy tắc cánh tay đòn.” (trang 36) Việc chia

thành 3 phần bằng nhau ở đây đâu có liên quan gì đến quy tắc cánh tay đòn.

+ “Theo nguyên tắc về cân bằng hoà tan, thì khi đạt đến một ngưỡng nhất định thì dung dịch trở nên bão hoà và không thể hoà tan thêm nữa Lượng crocin do dư ra (không thể hoà tan vào pha trên) sẽ nằm ở bề mặt phân chia pha hoặc đi xuống pha dưới Nếu tiếp tục tăng thêm lượng crocin (bằng cách tăng tỷ lệ mẫu nghiên cứu:dung môi) thì sẽ làm cân bằng chuyển dịch theo chiều ngược lại, nghĩa là

crocin sẽ đi xuống pha dưới” Nguyên lý dịch chuyển cân bằng không hề nói như vậy Khi tăng hàm

lượng mẫu thì crocin đồng thời phân bố vào 2 pha chứ không phải phân bố tối đa vào pha trên rồi sau

đó bị đẩy xuống pha dưới.

- Dùng sai thuật ngữ: giá trị nồng độ tối đa ức chế half maximal inhibitory concentration (IC50 ) (trang

3); ngâm ethanol 99.5% (trong sơ đồ 2.4 trang 20 Chất lỏng trộn với chất lỏng thì không gọi là

“ngâm”); hiệu suất thu hồi crocin/geniposide so với mẫu vật liệu (mg/g) (chữ “hiệu suất thu hồi”

thường dùng với ý nghĩa bao nhiêu % hoạt chất trong bột ban đầu được thu lại sau quá trình trích ly, chỗ này dường như dư chữ “hồi”)

- mục 2.2.4.4 Xây dựng và xác định độ dài đường nối hai điểm-TLL cần có một hình giản đồ minh họa

cùng với các đường và điểm được nói tới trong đoạn văn để giúp người đọc dễ hiểu quy trình hơn.

- Trong hình 3.4, nên đặt tên các ống nghiệm bằng chính tỉ lệ citrate-phosphate để người đọc không phải tìm xuống phần phụ lục.

- Hình 3.5 thể hiện 3 đại lượng trong cùng một biểu đồ cột, trong đó trục y bên trái vừa thể hiện hệ số phân bố, vừa thể hiện %hiệu suất thu hồi crocin ở pha trên với đơn vị khác nhau Cách lựa chọn biểu

đồ cột có vẻ chưa hợp lý cho việc thể hiện đồng thời 3 loại số liệu này.

- Trong phần thực nghiệm và kết quả, tác giả nói về việc hồi quy đường giản đồ pha bằng 3 phương trình 2.4, 2.5 và 2.6, nhưng trong bảng kết quả 3.2 lại chỉ có các thông số của 2 phương trình 2.5 và 2.6 Hãy chỉnh lại cho khớp phần phương pháp và kết quả.

- Thuật ngữ “mẫu nghiên cứu” được xuất hiện khi nói về quá trình trích ly nhưng lại không được nói

rõ là gì, khiến người đọc khó hiểu đó là mẫu bột hay mẫu dịch trích sau khi định mức lên 100 mL.

- Kết luận về việc tăng nhiệt độ từ 27 đến 50 o C làm giảm hiệu suất thu hồi crocin không thuyết phục

và gượng ép, vì kết quả cho thấy các giá trị hiệu suất thu hồi dường như không khác biệt ở các nhiệt

độ khảo sát Phần biện luận về việc nước đi từ pha trên xuống pha dưới khi tăng nhiệt độ có thiếu thuyết phục Dựa trên việc hệ số phân bố giảm, có thể dự đoán là ethanol chứ không phải nước đi từ pha trên xuống pha dưới.

- Nhìn vào kết quả trong bảng 3.8, khó lòng khẳng định là NaCl có ảnh hưởng đáng kể đến các thông

số trong bảng vì các giá trị rât gần nhau Độ lệch chuẩn tương đối của các kết quả chỉ khoảng 0.2% là quá nhỏ đối với sai số có thể gây ra do thao tác khi thực nghiệm lặp lại Có vẻ tác giả đã lấy kết quả đo lặp 3 lần độ hấp thụ của cùng 1 mẫu, chứ không phải đo độ hấp thụ của 3 mẫu lặp.

0.03-3 CÂU HỎI PHẢN BIỆN

1 Tại sao natri citrate thay thế cho một phần hỗn hợp muối phosphate? Tại sao tăng tỉ lệ citrate/phosphate thì hệ số phân bố giảm? Trong Hình 3.4, ống nghiệm TN3 cho thấy pha dưới có màu vàng, nhưng tại sao hệ số phân bố lại cao nhất?

Dung dịch chứa K 2 HPO 4 /KH 2 PO 4 =18/7 có pH =7, nhưng khi thêm muối natri citrate thì pH sẽ thay đổi thế nào? Sự thay đổi này có gây ra phản ứng gì đối với crocin nếu sự trích ly thực hiện ở nhiệt độ cao hay thời gian dài hay không?

2 Khi khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ, tác giả đã kiểm soát nhiệt độ 27℃; 35℃; 50℃ như thế nào, đặc biệt là 27 o C? Tại sao chọn 3 nhiệt độ này?

3 Hệ số phân bố là gì và có phụ thuộc vào nồng độ chất tan trong hệ dung môi hay không? Tại sao hệ

số này lại thay đổi gần 10 lần khi hàm lượng dịch trích cao tăng từ 0,5% đến 4% (bảng 3.6)?

4 Khi thêm 0,5 g “mẫu nghiên cứu” vào 9,9 g hệ (phụ lục 3.3) thì tỉ lệ thành phần nước, muối, ethanol có thay đổi gì hay không và có ảnh hưởng thế nào đến các kết quả V r , Y t và K?

5 Điểm tới hạn Cp là gì và được xác định bằng cách nào trên giản đồ pha?

6 Trình bày ví dụ về quy tắc cánh tay đòn trên giản đồ thu được của nghiên cứu này.

7 Hãy trình bày thành phần các chất có trong hệ trích ly chứa 4% mẫu nghiên cứu.

8 Các số liệu để tính kiểm định LSD được dựa trên kết quả đo UV-vis của 1 lần trích ly hay 3 lần trích ly lặp lại?

9 Trên sắc kí đồ HPLC, peak unknown là gì? đâu là các peak của crocin và geniposide?

Note: thời gian lưu của geniposide trong Luận văn của Trương Thị Khánh Vân là 6.1-6.2 phút.

10 Tại sao việc loại bỏ chất béo (không phân cực) lại giúp việc trích ly crocin và geniposide (phân cực) dễ dàng hơn? Màu vàng của dung môi loại béo có phải của crocin không?

4 ĐỀ NGHỊ VÀ ĐÁNH GIÁ CỦA PHẢN BIỆN

Được bảo vệ X Bổ sung thêm để được bảo vệ

Không được bảo vệ

5 ĐÁNH GIÁ CỦA NGƯỜI PHẢN BIỆN

STT Nội dung đánh giá Điểm tối đa Điểm đánh giá

1 Chất lượng bài viết 30 26

Hình thức trình bày (đẹp, rõ ràng, tài liệu tham khảo

2 Nội dung khóa luận 70 56

Phương pháp nghiên cứu phù hợp, đảm bảo độ tin

Tp Hồ Chí Minh, ngày 27 tháng 11 năm 2021

Giảng viên phản biện

TÓM TẮT KHÓA LUẬN

Đề tài: “Trích ly chất màu từ hạt dành dành (Gardenia jasminoides Ellis) bằng

phương pháp trích ly hai pha nước”.

Mục tiêu thực hiện đề tài nhằm trích ly hoạt chất màu vàng crocin từ hạt dành dành

(Gardenia jasminoides Ellis) với định hướng tách crocin và geniposide bằng phương

pháp trích ly hai pha nước Việc định lượng chất màu vàng crocin được thực hiện bằngquang phổ UV-Vis và định lượng geniposide bằng kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao(HPLC)

Hạt dành dành (Gardenia jasminoides) là một nguyên liệu tiềm năng để thu hồi chấtmàu crocin với giá thành rẻ hơn nhụy hoa nghệ tây rất nhiều Bên cạnh crocin,geniposide là một chất chiếm hàm lượng cao có trong hạt dành dành Với phương pháptrích ly thông thường thì hiệu suất trích ly crocin và geniposide chưa cao và độ tinhsạch thấp Phương pháp hai pha nước mang lại hiệu suất trích ly cao, với độ tinh sạch

và an toàn cao Hạt dành dành được xử lý sơ bộ thu được bột dành dành Nhằm trích ly

và tinh sạch hiệu quả crocin và geniposide nên tiến hành loại béo bột dành dành (50 g)bằng ether dầu hỏa, sau đó tiến hành đun hồi lưu với hỗn hợp ethanol-nước 40% thuđược mẫu nghiên cứu (100 mL) Tiến hành khảo sát để chọn lựa tỷ lệ hỗn hợp muốicủa hệ ATPS bằng cách sử dụng phương pháp UV-Vis để phân tích hàm lượng crocin

ở từng pha và phương pháp HPLC để phân tích hàm lượng geniposide ở pha dưới, kếtquả thu được tỷ lệ hỗn hợp muối gồm trisodium citrate: (K2HPO4:KH2PO4, 18:7, w/w)

tỷ lệ 80:20 Sau đó, tiến hành thực nghiệm để xác định giản đồ pha bằng phương phápchuẩn độ đục và sử dụng phần mềm matlab để xây dựng đường cong hai điểm tại từngđiểm đục Sau đó, tiến hành khảo sát các điều kiện riêng lẻ với hệ hai pha nướcethanol-muối, kết quả thu được với thành phần hệ hai pha nước ATPS và điều kiệntrích ly tối ưu là: 26,361% muối, 19,546% ethanol, 0,5% nguyên liệu (w/w) ở nhiệt độtrích ly là 27℃ Thành phần hệ ATPS tối ưu mang lại hiệu quả trích ly tốt nhất, hiệusuất thu hồi crocin ở pha trên cao nhất là 98,065% ứng với hàm lượng là 89,400 mg.L-

1tương đương với 11,767 ± 0,014 mg crocin/g bột nguyên liệu

LỜI CẢM ƠN

Khóa luận tốt nghiệp là bước ngoặc lớn trong cuộc đời của mỗi sinh viên Trong suốt quátrình làm khóa luận, ngoài sự cố gắng của bản thân, tôi đã nhận được sự quan tâm, hỗ trợcủa bạn bè xung quanh, sự giúp đỡ tận tình của các thầy cô và gia đình

Về phía nhà trường, tôi xin chân thành cảm ơn đến quý thầy cô Khoa Công nghệ Hóa học

và Thực phẩm-Trường Đại học Sư phạm Kỹ thuật TP HCM, đã truyền đạt những kiếnthức quý báu, đó chính là nền tảng giúp tôi thực hiện nghiên cứu đề tài, cũng như sự hỗtrợ nhiệt tình của quý thầy cô trong lúc tôi thực hiện khóa luận tại phòng thí nghiệm.Đặc biệt, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến cô TS Võ Thị Ngà, giảng viên Bộ môn Côngnghệ Hóa học- người đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và hỗ trợ tôi giải quyết những khókhăn trong suốt quá trình nghiên cứu đề tài và hoàn thiện luận văn này

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến cô Nguyễn Thị Mỹ Lệ, chuyên viên phòng thí nghiệm Bộmôn Công nghệ Hóa học, đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi được vào các phòng thínghiệm của Khoa và hỗ trợ tôi trong việc sử dụng thiết bị, dụng cụ tại các phòng thínghiệm

Cuối cùng tôi xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè, những người luôn bên cạnh và ủng

hộ về mặt tinh thần trong suốt thời gian thực hiện khóa luận Trong quá trình thực hiện đềtài khó tránh khỏi những sai sót, tôi rất mong nhận được những ý kiến, đóng góp của quýthầy cô để giúp đề tài của chúng tôi được hoàn thiện hơn

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan luận văn này là công trình nghiên cứu do chính tôi thực hiện cùngvới sự hướng dẫn cô TS Võ Thị Ngà Các thông tin tham khảo trong luận văn nàyđược thu thập và trích dẫn nguồn gốc rõ ràng từ những nguồn đáng tin cậy, được công

bố rộng rãi Các kết quả báo cáo trong luận văn được thực hiện một cách nghiêm túc,trung thực và không trùng lặp với các nghiên cứu khác

TP Hồ Chí Minh, ngày 17 tháng 1 năm 2022

Sinh viên thực hiện

Đường Tiểu Phụng

MỤC LỤC

TÓM TẮT KHÓA LUẬN i

LỜI CẢM ƠN ii

LỜI CAM ĐOAN iii

MỤC LỤC iv

DANH MỤC BẢNG vi

DANH MỤC SƠ ĐỒ vii

DANH MỤC HÌNH viii

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT x

MỞ ĐẦU xi

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1

1.1 Tổng quan về crocin 1

1.1.1 Đặc điểm và nguồn gốc của crocin 1

1.1.2 Hoạt tính sinh học của crocin 5

1.1.3 Các phương pháp trích ly crocin 5

1.1.4 Các phương pháp xác định hàm lượng crocin 5

1.2 Tổng quan về phương pháp trích ly hai pha nước (ATPE) 6

1.2.1 Giới thiệu phương pháp trích ly hai pha nước 6

1.2.2 Hệ hai pha nước (ATPS) 6

1.2.3 Giản đồ pha 7

1.2.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tách pha 8

1.2.5 Ứng dụng ATPE trích ly crocin 10

1.3 Định hướng nghiên cứu 11

1.3.1 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước 11

1.3.2 Định hướng nghiên cứu 12

CHƯƠNG 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ THỰC NGHIỆM 15

2.1 Quy trình nghiên cứu 15

2.2 Thực nghiệm 16

2.2.1 Nguyên liệu và thiết bị 16

2.2.2 Chuẩn bị mẫu nghiên cứu 17

2.2.3 Xây dựng phương pháp xác định thành phần dịch trích 20

2.2.4 Xây dựng điều kiện trích ly ATPE 22

2.2.5 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình trích ly ATPE 29

2.2.6 Phương pháp tính toán và đánh giá hiệu quả của quá trình trích ly 30

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 32

3.1 Chuẩn bị mẫu nghiên cứu 32

3.1.1 Xác định độ ẩm của bột nguyên liệu 32

3.1.2 Mẫu nghiên cứu 32

3.2 Kết quả xây dựng điều kiện trích ly ATPE 34

3.2.1 Kết quả khảo sát tỷ lệ hỗn hợp ba muối 34

3.2.2 Kết quả xây dựng giản đồ pha 37

3.2.3 Kết quả khảo sát lựa chọn đường tie line 39

3.2.4 Kết quả khảo sát điểm thành phần tối ưu 43

3.3 Kết quả khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình trích ly ATPE 45

3.3.1 Khảo sát tỷ lệ mẫu nghiên cứu:dung môi 45

3.3.2 Khảo sát nhiệt độ 47

3.3.3 Khảo sát nồng độ muối NaCl 48

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 52

Kết luận 52

Kiến nghị 53

DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO 54

PHỤ LỤC 61

DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.1 Kết quả khảo sát các thông số tỷ lệ thể tích Vr, hệ số phân bố K, hiệu suất thuhồi crocin pha trên Yt và hiệu suất thu geniposide so với bột nguyên liệu Ygeniposidekhithay đổi tỷ lệ muối 35Bảng 3.2 Các thông số của phương trình hồi quy 38Bảng 3.3 Thông số các thành phần từng pha, độ dài và hệ số góc của các đường nốiđiểm D, E và A 41Bảng 3.4 Sự thay đổi tỷ lệ thể tích pha Vr, hệ số phân bố K và hiệu suất thu hồicrocin(*)trên các điểm đại diện trên đường nối điểm D, E, A 42Bảng 3.5 Sự thay đổi tỷ lệ thể tích pha Vr, hệ số phân bố K, hiệu suất thu hồi crocin(*)

tại các điểm X, Y, A, Z, T 44Bảng 3.6 Sự thay đổi tỷ lệ thể tích Vr, hệ số phân bố K và hiệu suất thu hồi crocin(*)

theo tỷ lệ mẫu nghiên cứu:dung môi 45Bảng 3.7 Sự thay đổi tỷ lệ thể tích, hệ số phân bố K và hiệu suất thu hồi crocin(*) theonhiệt độ trích ly 47Bảng 3.8 Sự thay đổi tỷ lệ thể tích Vr, hệ số phân bố K, hiệu suất thu hồi crocin(*) theo

sự bổ sung NaCl 49

DANH MỤC SƠ ĐỒ

Sơ đồ 2.1 Sơ đồ quy trình nghiên cứu 15

Sơ đồ 2.2 Quy trình xử lý nguyên liệu 18

Sơ đồ 2.3 Quy trình chuẩn bị mẫu nghiên cứu 20

Sơ đồ 2.4 Quy trình trích ly crocin/geniposide 1

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Hoa và quả dành dành 1

Hình 1.2 Cấu trúc của crocetin 1

Hình 1.3 Công thức tổng quát của crocin 2

Hình 1.4 Cấu trúc của nhóm iridoid và iridoid glycoside trong hạt dành dành 3

Hình 1.5 Cấu trúc của terpenoid trong hạt dành dành 3

Hình 1.6 Cấu trúc của một số acid phenolic trong hạt dành dành 4

Hình 1.7 Cấu trúc của các hợp chất dễ bay hơi trong tinh dầu dành dành 4

Hình 1.8 Mô hình giản đồ pha [22] 7

Hình 2.1 Quả dành dành khô 17

Hình 2.2 Giản đồ pha và các đường TL qua D, E, A 27

Hình 3.1 Dịch trích loại béo 33

Hình 3.2 TLC so sánh dịch trích loại béo gồm1: chloroform; 2: n-hexane; 3: ether dầu hỏa được quan sát ở: a: đèn UV bước sóng 254 nm; b: khi phun thuốc thử acid-vanilinTLC được giải ly với hệ ethyl acetate:isopropanol:nước (60:30:10) 33

Hình 3.3 TLC của mẫu nghiên cứu (a-c) và geniposide (d) được quan sát ở:a: sáng ban ngày; b: đèn UV bước sóng 254 nm; c và d: khi phun thuốc thử acid-vanilin TLC được giải ly với hệ ethyl acetate:isopropanol:nước (60:30:10) 34

Hình 3.4 Thí nghiệm tách pha tại các tỷ lệ hỗn hợp 3 muối 35

Hình 3.5 Biểu đồ sự thay đổi hệ số phân bố K và hiệu suất thu geniposide so với bột nguyên liệu Ygeniposideở các tỷ lệ muối phosphate 36

Hình 3.6 Giản đồ pha thực nghiệm 38

Hình 3.7 Giản đồ pha chuẩn xây dựng bằng phần mềm MatLab 39

Hình 3.8 Giản đồ pha thể hiện điểm Cpvà A 40

Hình 3.9 Giản đồ pha và các đường TL qua D, E, A 41

Hình 3.10 Biểu đồ sự ảnh hưởng của TLL lên hệ số phân bố K và hiệu suất thu hồi crocin ở pha trên Yt 42

Hình 3.11 Giản đồ pha thể hiện các điểm X, Y, A, Z, T 43

Hình 3.12 Biểu đồ sự thay đổi tỷ lệ thể tích Vr, hệ số phân bố K, hiệu suất thu hồicrocin ở pha trên Ytvà hiệu suất thu crocin so với bột nguyên liệu (Ycrocin) tại các điểm

X, Y, A, Z, T 44Hình 3.13 Ảnh hưởng của tỷ lệ mẫu nghiên cứu:dung môi lên hệ số phân bố K vàhiệusuất thu hồi crocin ở pha trên Yt 46Hình 3.14 Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hệ số phân bố K, hiệu suất thu hồi crocin ở phatrên Ytvà hiệu suất thu hồi crocin so với bột nguyên liệu Ycrocin 48Hình 3.15 Ảnh hưởng của việc bổ sung NaCl lên hệ số phân bố K, hiệu suất thu hồicrocin ở pha trên Yt, hiệu suất thu crocin so với bột nguyên liệu Ycrocin 49

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

ATPE Aqueous two-phase extraction Trích ly hai pha nướcATPS Aqueous two-phase system Hệ hai pha nướcHPLC High-performance liquidchromatography Sắc ký lỏng hiệu năng caoLSD Least significant difference Sai biệt nhỏ nhất có ý nghĩa

MW Molecular weight Khối lượng phân tửSTL Slope of tie line Độ dốc của đường nối

TLC Thin layer chromatography Sắc ký lớp mỏngTLL Tie line length Độ dài đường nốiv/v Volume/volume Thể tích/thể tíchw/w Weight/weight Khối lượng/khối lượng

Hóa chất

-K2HPO4 Dipotassium hydrogen phosphate

-KH2PO4 Potassium dihydrogen phosphate

-Na3C6H5O7 Trisodium citrate

-MỞ ĐẦU

Trong những năm gần đây, nhu cầu về nguồn chất màu tự nhiên ngày càng tăng cao,

do nhận thức được lợi ích tích cực từ các hợp chất tự nhiên mang lại cho sức khỏe Vìvậy, đòi hỏi phải tìm kiếm các nguồn chất màu thực phẩm tự nhiên và phát triển tiềmnăng sử dụng của chúng Trong đó, crocin là chất màu đang được quan tâm Crocin là

một thành phần có màu vàng đặc trưng có trong nhụy nghệ tây (Crocus sativus) và hạt dành dành (Gardenia jasminoides Ellis) Nhụy hoa nghệ tây được biết là một loại gia

vị đắt tiền nhất trên thế giới và là một loại cây có tính “khan hiếm” được mệnh danh là

“vàng đỏ” phương Đông nên tính kinh tế cho việc điều chế chất màu từ nguồn nguyênliệu này sẽ không thể hiệu quả như hạt dành dành Cây dành dành là một loài cây phổbiến ở Việt Nam với sản lượng thu hoạch quả nhiều, giá thành thấp nên chọn cây dànhdành là đối tượng nghiên cứu để trích ly crocin Bên cạnh crocin, geniposide là thànhphần chính trong nhóm hợp chất glycoside iridoid, cũng là một thành phần chiếm hàmlượng khá cao trong hạt dành dành Geniposide đã được chứng minh có nhiều tác dụngtrong y học như bảo vệ mật, gan, và hệ thần kinh; kháng viêm, kháng oxy hoá; vàchống đái tháo đường, chống ung thư,… Tuy nhiên, một số nghiên cứu về độc họccũng đã chỉ ra rằng việc sử dụng quá liều geniposide có thể dẫn đến gây độc gan Vớicác phương pháp truyền thống thì việc tách chiết chất màu crocin và geniposide chưađược hiệu quả, tốn nhiều chi phí, thời gian dài không mang lại tính kinh tế Trong khóaluận này, tôi chọn phương pháp trích ly hai pha nước để trích ly chất màu crocin vàgeniposide, đây là phương pháp tiềm năng có nhiều ưu điểm hơn so với các phươngpháp truyền thống như tính chọn lọc cao, chi phí thấp, các dung môi được sử dụngthân thiện với môi trường, có khả năng thu hồi được các chất đã sử dụng để hình thành

hệ Với hy vọng có thể phát huy tối đa lợi ích và nâng cao giá trị của các chất có tronghạt dành dành cùng với việc nghiên cứu và phát triển thêm về hướng trích ly bằng

phương pháp trích ly hai pha nước nên tôi quyết định nghiên cứu đề tài “Trích ly chất

màu từ hạt dành dành (Gardenia jasminoides Ellis) bằng phương pháp trích ly

hai pha nước”.

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan về crocin

1.1.1 Đặc điểm và nguồn gốc của crocin

Crocin là một trong số ít carotenoid tan trong nước, màu đỏ đậm ở dạng khô, cho màu

sắc từ màu vàng đến màu cam trong dịch chiết từ hoa nghệ tây, Crocus sativus (C.

sativus) [1] Crocin được tìm thấy trong hạt dành dành, Gardenia jasminoides Ellis (G jasminoides), thuộc chi Gardenia, họ Rubiaceae [2] Một số bộ phận của cây dành

dành được thể hiện trong Hình 1.1

Hình 1.1 Hoa và quả dành dànhCrocin là các ester glycosyl hoặc gentiobiosyl của polyene dicarboxylic acid (8,8-diapocarotene-8,8-dioic acid hay còn gọi là crocetin) [3]

Phân tử crocin bao gồm chuỗi 16 carbon, có 7 liên kết đôi liên hợp, 4 nhóm methyl vàmột nhóm ester ở mỗi đầu Trong đó gốc R1, R2 có thể là các gốc gentiobiosyl (Gen)hoặc glucosyl (Glu) Cấu trúc của crocetin và các dẫn xuất crocin được trình bày lầnlượt trong Hình 1.2 và Hình 1.3 [4]

Hình 1.2 Cấu trúc của crocetin

Gentiobiosyl (Gen) Glucosyl (Glu)

Hình 1.3 Công thức tổng quát của crocinCrocin-1: R1=R2=Gen Crocin-3: R1=Gen; R2=H

Crocin-2: R1=Gen; R2=Glu Crocin-4: R1=Glu; R2=H

Cis crocin-1: R1=R2=Gen

Crocin là thành phần chính tạo màu vàng cho hạt dành dành Bên cạnh nhóm hợp chấtcrocin, một số thành phần hóa học của hạt dành dành đã được phân lập gồm các hợpchất thuộc nhóm iridoid, iridoid glycoside, triterpenoid, acid hữu cơ, dẫn xuất phenol

Hình 1.4 Cấu trúc của nhóm iridoid và iridoid glycoside trong hạt dành dành.Terpenoid trong dành dành bao gồm secoiridoid và monoterpenoid Một số terpenoid,đặc biệt là một số lượng nhỏ nguyên tử carbon, tồn tại trong dầu dễ bay hơi Các

terpenoid tiêu biểu là 6’-O-trans-Sinapoyljasminoside C (4), Rehmapicrogenin (5) [5].

Hình 1.5 Cấu trúc của terpenoid trong hạt dành dành

Một số acid phenolic trong dành dành được xác định là hydroxy-3-methyl) glutaroylquinic acid (6), 3,5-di-O-caffeoylquinic aicd (7) và chlorogenic acid (8) Một lignin glucoside mới, (+)-(7S,8R,8′R)- lyoniresinol 9-O-β - D-(600-O-trans-sinapoyl) glucopyranoside (9) đã được tìm thấy trong dành dành [5].

3

Hình 1.6 Cấu trúc của một số acid phenolic trong hạt dành dành.

Các hợp chất dễ bay hơi chính trong tinh dầu của dành dành là acid béo, ketone,aldehyde, ester, alcohol và các dẫn xuất thơm Do nhiệt độ và thời gian gia nhiệt khácnhau nên tinh dầu từ dành dành sẽ chứa hàm lượng và tỷ lệ các hợp chất dễ bay hơikhác nhau Ngoài ra các thành phần kém bền như các hợp chất thuộc nhóm iridoid cóthể bị biến đổi một phần tạo thành các thành phần dễ bay hơi trong quá trình xử lý ởnhiệt độ cao [5] Các hợp chất bay hơi chiếm tỷ lệ cao nhất trong dành dành là myristicacid (10) chiếm 15,3%, pentadecane (11) 15,14%, palmitic acid (12) 13,7% [6]

Hình 1.7 Cấu trúc của các hợp chất dễ bay hơi trong tinh dầu dành dành

12

1.1.2 Hoạt tính sinh học của crocin

Crocetin (Hình 1.2) có nhiều tác dụng dược lý khác nhau như chống viêm, hạn chế xơvữa động mạch, chống ung thư, bảo vệ thần kinh, tác dụng hạ huyết áp, chống đôngmáu, ức chế tổn thương võng mạc,… [5]

Crocin (Hình 1.3) là ester digentiobiosyl của crocetin, có hoạt tính sinh học cao, nhiềutác dụng y học như điều trị viêm, vàng da, nhức đầu, phù, sốt, viêm gan, tăng huyết áp[7], chống tăng mỡ trong máu và bảo vệ gan bị tổn thương [8], chống co giật-bảo vệthần kinh [9], chống trầm cảm [10], kháng u [11], bảo vệ dạ dày [12] Crocin có đặctính chống ung thư, được ưu tiên lựa chọn để bổ sung vào những thực phẩm hòa tantrong nước [13]

Ngoài ra, crocin với độ tinh khiết trên 99,6% có hoạt tính chống oxy hóa ở nồng độ từ

40 ppm Thử nghiệm thiocyanate cho thấy ở nồng độ 40 ppm, sự ức chế quá trình oxyhóa bằng crocin là 80% khi so sánh với mẫu trắng Ở mức 20 ppm, hoạt động chốngoxy hóa của crocin tương đương với hoạt động của butylated hydroxyanisole (BHA)[14] Qua kết quả thực nghiệm của Nguyễn Thị Thúy Diễm và cộng sự, dịch tríchcrocin bằng hệ ATPS ethanol-potassium phosphate với giá trị nồng độ ức chế 50% đốitượng thử half maximal inhibitory concentration (IC50) đối với hoạt tính ức chế 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) là 28,86 μg/mL

1.1.3 Các phương pháp trích ly crocin

Crocin là một chất màu đang được quan tâm, nên hiện nay có nhiều phương pháp trích

ly crocin từ dành dành đã được nghiên cứu như phương pháp trích ly truyền thống vớicác loại dung môi khác nhau như methanol, ethanol, 1-propanol hoặc 2-propanol [16],phương pháp trích ly với sự hỗ trợ vi sóng [5], phương pháp trích ly nhờ sự hỗ trợ củasóng siêu âm [1], phương pháp trích ly lỏng siêu tới hạn [17] Bên cạnh đó, phươngpháp chiết pha rắn đánh dấu phân tử polymer cho phép chiết xuất chọn lọc crocin với

độ thu hồi cao (84%) từ một hỗn hợp phức tạp [18]

1.1.4 Các phương pháp xác định hàm lượng crocin

Phương pháp quang phổ UV-Vis là phương pháp phân tích định lượng dựa vào hiệuứng hấp thu xảy ra khi phân tử vật chất tương tác với bức xạ điện từ Các hợp chất

khác nhau trong hạt dành dành có đặc tính hấp thu UV-Vis khác nhau Trong đó, điềukiện phát hiện để xác định geniposidic acid và geniposide là ở bước sóng 240 nm vàđối với crocin-1 và crocin-2 là 440 nm [19].

Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là một kỹ thuật để tách, định tính,định lượng và xác định các thành phần không bay hơi trong hỗn hợp Năm 2016,Hong-Ping Zhang và cộng sự đã phân tích crocin-1 và geniposide bằng HPLC với cộtsắc ký silica gel pha đảo C18 (4,6 mm × 250 mm, 5 μm) và đầu dò mảng diode SPD-M20A với bước sóng lần lượt là 440 nm và 238nm cho crocin-1 và geniposide [20]

1.2 Tổng quan về phương pháp trích ly hai pha nước (ATPE)

1.2.1 Giới thiệu phương pháp trích ly hai pha nước

Vào những năm 1950, Albertson đã phát hiện ra rằng dung dịch nước của polyethyleneglycol (PEG) và muối phosphate trong một phạm vi nồng độ nhất định có khả năngphân tách thành hai pha, một pha giàu polymer và một pha giàu muối [21]

Từ đó, kỹ thuật trích ly hai pha nước (aqueous two-phase extraction-ATPE) đã trởthành một công cụ mạnh mẽ để phân tách một loạt các vật liệu sinh học bao gồm tếbào thực vật và động vật, vi sinh vật, nấm và bào tử của chúng, virus, lục lạp, ty thể,túi màng, protein và nucleic acid [22] Một trong những ưu điểm chính của kỹ thuậtnày là môi trường tương thích sinh học, cân bằng pha rất nhanh, chi phí thấp, các dungmôi được sử dụng để tạo thành pha thường thân thiện với môi trường, có khả năng thuhồi các chất đã sử dụng để hình thành hệ [23]

Tuy ATPE là một phương pháp trích ly đầy ưu điểm nhưng bên cạnh đó vẫn tồn tạinhững hạn chế như sự chưa hiểu biết rõ ràng về cơ chế tách pha liên quan đến hệAPTS Với việc ngày càng có nhiều nghiên cứu và có thêm sự hỗ trợ của các phươngpháp khác sẽ giúp cho phương pháp ATPE ngày càng phát triển hoàn thiện hơn, sẽ hứahẹn là một bước đột phá trong việc thu nhận các sản phẩm có giá trị sinh học cao [24]

1.2.2 Hệ hai pha nước (ATPS)

Phương pháp ATPE dần được phát triển với các hệ hai pha nước (aqueous two-phasesystem-ATPS) khác nhau Hiện nay, hệ ATPS có thể được phân thành năm nhóm:polymer-polymer, polymer-muối, alcohol-muối, các micellar và các chất lỏng ion

Trong đó, hệ ATPS polymer-polymer và polymer-muối có lợi thế hơn các hệ dung môihữu cơ thông thường cho sự phân tách các hoạt chất sinh học [25].

1.2.3 Giản đồ pha

Giản đồ pha giống như “dấu vân tay” của hệ ATPS trong một điều kiện xác định Giản

đồ pha cung cấp thông tin về các thành phần cần thiết để tạo thành một hệ hai pha ởtrạng thái cân bằng gồm nồng độ các thành phần pha trên và pha dưới và tỷ lệ thể tíchpha Giản đồ pha được mô tả trong Hình 1.4

Hình 1.8 Mô hình giản đồ pha [22]

Đường cong hai điểm (binodal curve) TCpB biểu diễn trạng thái cân bằng của hệATPS và phân chia thành hai vùng Vùng phía dưới đường cong là vùng mà tỷ lệ nồng

độ các thành phần tạo hệ ATPS là một pha duy nhất, vùng phía trên đường cong làvùng có tỷ lệ nồng độ các thành phần tạo hệ ATPS tách thành hai pha riêng biệt có thểquan sát rõ Điểm đỉnh T (top point) là điểm đầu tiên hệ xuất hiện hiện tượng đục vàđiểm đáy B (bottom point) là điểm mà tại đó hệ không xảy ra hiện tượng đục nữa.Điểm tới hạn Cp (critical point) là điểm mà thể tích của cả hai pha bằng nhau đượcxem như điểm phân vùng Các điểm nằm trên đường nối TB (thường gọi là đường nối(tie line-TL) là hệ đạt trạng thái cân bằng) của đường cong hai điểm Di chuyển dọctheo tọa độ đường nối TB biểu thị các hệ ATPS A1, A2 và A3 có thành phần pha banđầu và tỷ lệ thể tích khác nhau nhưng có cùng các thành phần cân bằng pha trong phatrên và trong pha dưới Đặc biệt, trên đường cong hai điểm có một điểm quan trọng làđiểm tới hạn Cp (critical point), ngay trên Cp thành phần và thể tích của cả hai phabằng nhau và tại Cp độ dài đường nối TL là bằng 0 [26].

1.2.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tách pha

Hệ ATPS polymer-polymer và polymer-muối thường dùng để thúc đẩy tách pha phụthuộc vào kích thước phân tử của các chất hòa tan Khi tăng trọng lượng (MW) củapolymer cần giảm nồng độ polymer để tạo thành pha, tăng sự chênh lệch giữa MW củacác polymer dẫn đến sự thay đổi của đường cong giản đồ pha Trong hệ polymer–muối,

sự tách pha theo chiều hướng pha giàu polymer giảm khi tăng nồng độ polymer [27]

Các loại muối ảnh hưởng đến quá trình tách pha tuân theo thứ tự được nghiên cứu bởiHofmeister Khi xem xét một loại muối, anion đóng vai trò quan trọng hơn cation Cácanion như PO43-, C6H5O73-, HPO42-, H2PO4-, SO42-, C2H3O2-có hiệu quả trong việc táchpha với hệ alcohol-muối Việc giải thích sự tách pha của hệ nước-muối-alcohol dựavào hiệu ứng salting-out (tách muối) mạnh hay yếu Tuy nhiên nếu có cùng anion thìxét tới cation, khi kích thước cation giảm thì hiệu ứng tách muối tăng lên [27, 28, 29].Trong số các cation của kim loại kiềm, K+ và Rb+ có hiệu quả nhất trong khi Li+ làkém hiệu quả nhất [31]

- Tương tác điện hóa và pH

Phân bố điện tích là một thông số rất quan trọng trong hệ ATPS, xét về độ hòa tanprotein và phân tử sinh học chủ yếu liên quan đến tương tác điện tích bề mặt với cácion trong dung dịch [32]

pH của ATPS có thể làm thay đổi điện tích và tính chất bề mặt của chất tan làm ảnhhưởng đến sự tách các phân tử sinh học Ví dụ, khi áp dụng phương pháp ATPE đểtách protein, điện tích của protein phụ thuộc pH lớn hơn pI (âm), nhỏ hơn pI (dương),hay bằng pI (không) [26] Các phân tử sinh học tích điện âm hơn khi trong hệ pH caohơn, điều này làm tăng hệ số phân bố và các phân tử sinh học cần tách sẽ hiện diện chủyếu ở pha trên [33] Giá trị pH từ 6,7-7,3 phù hợp với hệ ATPS PEG-phosphate, pHtrong khoảng 4,3-5,0 sẽ phù hợp với hệ ATPS PEG-sulfate và pH bằng 8,0 sẽ tươngứng với hệ PEG-citrate [34]

Tính kỵ nước đóng vai trò quan trọng trong việc tách pha, đặc biệt với protein Haihiệu ứng chính có liên quan đến các tương tác kỵ nước là hiệu ứng kỵ nước của pha vàhiệu ứng tách muối [27] Trong hệ polymer-muối, tính kỵ nước có thể điều khiển bằngcách thay đổi TLL, MW của polymer và bằng cách thêm muối (ví dụ như NaCl) Việcthêm muối vào hệ ATPS có ảnh hưởng đáng kể đến sự tách pha [35] Các muối chứaion với độ kỵ nước khác nhau, các ion kỵ nước sẽ bị ép đến pha với mức độ kỵ nướccao hơn và ngược lại Hiệu ứng tách muối làm di chuyển các phân tử sinh học từ phagiàu muối sang pha giàu polymer [26] NaCl được xem là phụ gia sử dụng rộng rãinhất trong hệ ATPS vì NaCl tương đối trung tính với protein [36] Nồng độ NaCl thấp(nhỏ hơn 1 M) không ảnh hưởng ATPS, tuy nhiên nồng độ muối cao (lớn hơn 1 M)làm thay đổi giản đồ pha [37]

Phân vùng ái lực trong các hệ ATPS chiết chất lỏng-lỏng cũng có thể đạt được bằngcách thêm các phối tử tự do (phân tử sinh học hoặc hóa học) vào hệ ATPS để tạo ra sựdịch chuyển phân vùng của các phân tử mong muốn mà không cần thay đổi thành phần

để tạo pha Hệ ATPS ái lực giúp nồng độ phối tử cao trên mỗi thể tích dung dịch

polymer giúp chuyển hóa nồng độ cao của các phân tử sinh học bị ràng buộc trong cácgiai đoạn của hệ ATPS (tăng cường quá trình tách pha) và nhanh chóng đạt được trạngthái cân bằng [38].

Nhiệt độ ảnh hưởng rất lớn đến thành phần hai pha trong hệ ATPS, dẫn đến sự thayđổi giản đồ pha Những thay đổi về nhiệt độ cũng ảnh hưởng sự tách pha thông quayếu tố độ nhớt và tỷ trọng Do đó, các nhà nghiên cứu luôn kiến nghị nên kiểm soátchặt chẽ nhiệt độ trong các thí nghiệm liên quan đến hệ ATPS Nhìn chung, đối với hệATPS polymer–polymer có nồng độ polymer thấp thì sự tách pha đạt được ở nhiệt độthấp, tuy nhiên hiệu ứng ngược lại trong hệ polymer-muối [39]

1.2.5 Ứng dụng ATPE trích ly crocin

Theo nghiên cứu của Montalvo-Hernández và cộng sự (2012), hệ ATPS phosphate mang lại hiệu suất thu hồi crocin từ nhụy hoa nghệ tây cao nhất [40] Tuynhiên, phải thực hiện một quá trình siêu lọc để tách phân tử crocin (hợp chất có trọnglượng phân tử thấp) khỏi thành phần phân tử cao-PEG Quá trình này có thể có một sốnhược điểm kỹ thuật vì PEG có thể tích tụ trên bề mặt tạo thành lớp gel làm giảmthông lượng đáng kể ở áp suất hoạt động [41] Để cải thiện vấn đề này, nghiên cứu củaMontalvo-Hernández và cộng sự cho thấy các hệ ATPS alcohol-muối cung cấp một sốlợi thế so với hệ ATPS polymer-muối như chi phí các thành phần thấp, tách phân tửmong muốn khỏi các thành phần của hệ ATPS và thu hồi ethanol để tái sử dụng mộtcách dễ dàng bằng cách bay hơi để thu hồi alcohol [40]

PEG-Alcohol sử dụng trong hệ ATPS có nhiều loại Nghiên cứu của Hong, I K và cộng sự(2015) đã thực hiện trên lần lượt bốn loại alcohol: methanol, ethanol, 1-propanol và 2-propanol Kết quả cho thấy methanol tạo dịch trích có màu gần với màu crocin nhất,sau đó là ethanol, 1-propanol, và 2-propanol Nhưng do methanol có tính độc, nênkhông dùng trong sản xuất phụ gia thực phẩm [16]

1.3 Định hướng nghiên cứu

1.3.1 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước

Năm 2000, tác giả Phạm Thành Quân và cộng sự (Đại học Bách khoa TP.HCM) đã

nghiên cứu đặc tính chống oxy hóa của crocin từ G jasminoides, nghiên cứu về phản

ứng của crocin với linoleic acid và crocin với oxy Crocin tinh khiết với nồng độ lớnhơn 99,6% có hoạt tính chống oxy hóa ở nồng độ lên đến 40 ppm Ở nồng độ 20 ppm,hoạt tính chống oxy hóa tương đương với BHA [14]

Năm 2014, tác giả Nguyễn Thị Hồng Nhung (Đại học Bách khoa TP.HCM) thực hiệnkhóa luận thạc sĩ về quá trình trích ly hợp chất crocin và geniposide trong quả dành

dành G jasminoides Ellis bằng phương pháp vi sóng Kết quả của nghiên cứu cho thấy

phương pháp trích ly này có ưu điểm là thời gian trích ly ngắn; hai yếu tố ảnh hưởngđến hàm lượng crocin và geniposide là nồng độ dung môi trích ly (EtOH/H2O) và tỷ lệdung môi trên nguyên liệu [42]

Năm 2016, trên Tạp chí Khoa học Nông nghiệp Việt Nam có bài nghiên cứu củaNguyễn Thị Thanh Thủy và Nguyễn Thị Hiển về “Chiết tách và khảo sát độ bền củachất màu crocin từ quả dành dành” Kết quả cho thấy khi chiết tách bằng dung môiethanol-nước thì thu được crocin với hàm lượng là 14,63 mg/g nguyên liệu khô vàchứng minh crocin bền với nhiệt độ dưới 100℃ trong thời gian 140 phút Bên cạnh đó,crocin khá bền trong môi trường acid yếu, trung tính và kiềm [43]

Năm 2020, trong một bài khóa luận tốt nghiệp đại học trường Đại học Sư phạm Kỹthuật Tp.HCM của Nguyễn Thị Thúy Diễm và cộng sự thực hiện “Trích ly crocin từ

hạt dành dành (G jasminoides) bằng phương pháp trích ly hai pha nước và ứng dụng

tạo màu cho mì khô” Bài khóa luận đã đưa ra các điều kiện tối ưu của quá trình trích

ly cho hệ ATPS: 38,22% (w/w) potassium phosphate (K2HPO4/KH2PO4 = 18/7),15,80% (w/w) ethanol, TLL 75,19 % (w/w), 2% (w/w) nguyên liệu và 0,5% (w/w)NaCl 0,3 M ở nhiệt độ 27℃ trong 30 phút và có hàm lượng crocin là 4,8803 ± 0,20mg/g nguyên liệu khô [15]

Bên cạnh các nghiên cứu trong nước, ở nước ngoài việc tách crocin từ dành dành bằngnhiều phương pháp khác nhau đã được ứng dụng và ngày càng hoàn thiện

Năm 2007, Chen, Y và cộng sự đã công bố nghiên cứu có đề cập đến vấn đề tách cácloại crocin từ nguyên liệu dành dành bằng ethanol-nước (40%,v/v) Nghiên cứu nàydùng ethyl acetate phân đoạn các nhóm hợp chất, phần tan trong nước được pha loãng,cho qua nhựa macroporous HPD100 và rửa giải bằng dung dịch ethanol-nước với cácnồng độ khác nhau Phân đoạn ethanol-nước (60%) tiếp tục được tách bằng sắc ký cột,rửa giải bằng hệ dung môi giải ly ethyl acetate trong hỗn hợp methanol:nước (16:13)với các tỷ lệ khác nhau sau đó được tinh sạch bằng cột pha đảo của máy HPLC để táchđược crocin-3, crocin-2 và crocin-1 [44].

Năm 2012, Montalvo-Hernández và cộng sự đã nghiên cứu thu hồi crocin từ nhụy hoa

nghệ tây, C Sativus bằng phương pháp trích ly hai pha nước Sau khi thử nghiệm với

các hệ ATPS khác nhau, tác giả đã đưa ra kết luận hệ ATPS ethanol-potassiumphosphate đã được lựa chọn dựa trên năng suất thu hồi crocin cao nhất và chi phí thấptrong các loại hệ ATPS khảo sát [40]

Năm 2016, Hong-Ping Zhang và cộng sự chỉ ra rằng khả năng trích ly crocin vàgeniposide bằng phương pháp trích ly hai pha nước với hệ isopropanol-citrate qua 3lần trích: lần một ở nhiệt độ phòng mà không cần điều chỉnh pH, lần hai và lần ba ở

pH 3,2 Sau khi trích lần thứ ba, đã tách geniposide ở pha dưới với hiệu suất thu hồi là89,02%, và pha trên cùng về cơ bản chỉ có màu vàng của hạt dành dành với hiệu suấtthu hồi là 85,93% [20]

1.3.2 Định hướng nghiên cứu

Cây dành dành là một loài cây phổ biến ở Việt Nam, với hai thành phần nổi bật làcrocin và geniposide hiện đang được quan tâm nghiên cứu Trong đó, crocin là chấtmàu được dùng chủ yếu trong thực phẩm và geniposide là chất chứa nhiều hoạt tínhsinh học nhưng cần sử dụng với liều lượng giới hạn, nên cần tìm một phương pháp cóthể thu nhận được chất màu crocin và loại được geniposide Dựa trên các đặc tính hóa

lý đặc biệt của crocin như khối lượng phân tử thấp, độ ổn định và chiết xuất hiệu quảtrong môi trường hữu cơ, phù hợp cho việc áp dụng phương pháp trích ly hai pha nước.Một so sánh kinh tế sơ bộ, người ta ước tính rằng các hệ ATPS polymer-muối (PEG1000-potassium phosphate) đắt hơn khoảng 2,5 lần so với các hệ ATPS alcohol-muối

(ethanol-potassium phosphate) trên cơ sở thu hồi nhóm hợp chất crocin [40] Vì vậy,chúng tôi đề xuất chọn hệ ATPS alcohol-muối để trích ly crocin và geniposide.

Năm 2012, Montalvo-Hernández và cộng sự đã nghiên cứu thu hồi crocin từ nhụy hoa

nghệ tây, C.sativus bằng hệ ATPS ethanol-potassium phosphate cho năng suất thu hồi

crocin cao nhất Bên cạnh đó, với hệ ATPS isopropanol-citrate trong nghiên cứuHong-Ping Zhang và cộng sự cho thấy có thể trích ly thêm một thành phần quan trọng

là geniposide bằng cách thêm muối citrate vào hệ ATPS [20] Trong một nghiên cứukhác, chỉ ra rằng khả năng tạo pha của các alcohol lần lượt là 1-propanol > 2-propanol > ethanol [45] Mặc dù khả năng tách pha của 2-propanol cao hơn ethanolnhưng tính ổn định các sản phẩm sinh học trong ethanol cao hơn so với 2-propanol[46], nên ethanol được chọn cho hệ ATPS Do đó, tôi chọn hệ ATPS alcohol-muối làethanol và hỗn hợp 3 muối gồm muối citrate, hỗn hợp muối phosphate (KH2PO4 và

K2HPO4) Việc ứng dụng hệ ATPS này giúp mang lại nhiều giá trị cho ngành côngnghệ thực phẩm là thu được chất màu (crocin) và tách hoạt chất sinh học (geniposide)

Từ đó, đề ra mục tiêu trích ly chất màu vàng từ hạt dành dành với định hướng táchcrocin và geniposide bằng phương pháp trích ly hai pha nước

Để đạt được mục tiêu này, các nội dung công việc được đề xuất:

- Tìm hiểu tổng quan về crocin, các phương pháp trích ly chất màu, cơ sở để lựa chọnphương pháp trích ly hai pha nước cho quá trình trích ly chất màu crocin từ hạt dànhdành

- Xây dựng phương pháp xác định thành phần dịch trích

- Xây dựng điều kiện trích ly chất màu crocin từ hạt dành dành bằng phương phápATPE:

 Khảo sát chọn tỷ lệ của muối citrate và hỗn hợp muối phosphate;

 Xây dựng điều kiện trích ly ATPE: xác định giản đồ pha, khảo sát và xác định

độ dài đường nối tối ưu, khảo sát và xác định điểm thành phần tối ưu

 Khảo sát điều kiện ảnh hưởng: tỷ lệ mẫu nghiên cứu:dung môi, nhiệt độ, nồng

độ NaCl

- Đánh giá hiệu quả trích ly

CHƯƠNG 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ THỰC NGHIỆM

2.1 Quy trình nghiên cứu

Quy trình nghiên cứu được thực hiện theo Sơ đồ 2.1

Sơ đồ 2.1 Sơ đồ quy trình nghiên cứu

2.2 Thực nghiệm

2.2.1 Nguyên liệu và thiết bị

2.2.1.1 Thiết bị

Các thiết bị được sử dụng trong nghiên cứu được liệt kê dưới đây:

- Máy quang phổ UV-VIS hai chùm tia (Hitachi UH5300, Nhật Bản)

- Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC (Jasco–Nhật Bản)

- Hệ thống đun hồi lưu (Stuart, SRC5)

- Máy cô quay chân không (Yamato Scientific, Nhật Bản)

- Máy khuấy từ gia nhiệt (Phoenix, Đức)

- Cân phân tích 4 số (Precisa, Thụy Sỹ)

- Máy ly tâm (Hermle Z 326, Đức)

- Phễu chiết 250 mL (Duran, Đức)

- Tủ lạnh (Hitachi, Nhật Bản)

- Tủ sấy (Memmet, Đức)

- Các dụng cụ thủy tinh khác

2.2.1.2 Hóa chất

- Ethanol (C2H5OH) 99,5% (Chemsol, Việt Nam)

- Ethyl acetate (CH3COOC2H5) 99,9% (Top solvent, Indonesia)

- Ether dầu hỏa (bp 60 - 90) 99,5% (Chemsol, Việt Nam)

- Trisodium citrate dihydrate (Na3C6H5O7.2H2O) 99,0% (Xilong Chemical, TrungQuốc)

- Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) 99,5% (Xilong Chemical, Trung Quốc)

- Dipotassium hydrogen phosphate trihydrate (K2HPO4.3H2O) 99,0% (XilongChemical, Trung Quốc)

- Sắc ký lớp mỏng-TLC silica gel 60 F254 (Merck, Đức)

- Nước cất

- Vanillin 100% (Rhodia operations, Pháp)

- Sulfuric acid (H2SO4) 95-98% (Xilong Chemical, Trung Quốc)

2.2.1.3 Nguyên liệu

Quả dành dành khô có nguồn gốc ở tỉnh Ninh Thuận, Việt Nam được mua ở công tyTNHH Tấn Phát HCM, địa chỉ 22/21 đường 21, phường 8, quận Gò Vấp, TPHCM.Hình dạng quả dành dành khô được thể hiện trong Hình 2.1

Hình 2.1 Quả dành dành khô

2.2.2 Chuẩn bị mẫu nghiên cứu

2.2.2.1 Xử lý nguyên liệu

Nguyên liệu được xử lý theo Sơ đồ 2.2

Thuyết minh quy trình:

Quả dành dành khô được đập dập loại bỏ vỏ và tạp chất, tách lấy phần hạt Hạt dànhdành được xay mịn thành bột để tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình trích ly Để đồngnhất kích thước, bột khô được rây qua sàng rây có kích thước đường kính 200 mm,

chiều cao 50 mm, kích thước lỗ 0,125 mm Nhằm tránh bột bị ẩm nên bảo quản bộttrong túi kín, đặt nơi khô ráo, thoáng mát và tiến hành nghiên cứu.

Sơ đồ 2.2 Quy trình xử lý nguyên liệu

2.2.2.2 Xác định độ ẩm của nguyên liệu

Nguyên tắc: Xác định độ ẩm bằng phương pháp sấy khô Dựa vào trọng lượng nguyênliệu trước và sau khi sấy để tính toán phần trăm độ ẩm của mẫu [47]

Cách thực hiện: Đĩa chứa mẫu được đem sấy ở 105℃ tới khối lượng không đổi, đểnguội, sau đó xác định khối lượng chính xác đến 0,0001 g Cân khoảng 2 g mẫu, xácđịnh khối lượng mẫu và đĩa chính xác đến 0,0001 g Sấy ở 105℃ đến khi khối lượngkhông đổi Cân khối lượng mẫu và đĩa sau khi sấy Độ ẩm của nguyên liệu được xácđịnh theo công thức 2.1

G: trọng lượng của đĩa (g);

G1: trọng lượng của đĩa và mẫu trước khi sấy (g);

G2: trọng lượng của đĩa và mẫu sau khi sấy (g)

2.2.2.3 Quy trình điều chế mẫu nghiên cứu

- Khảo sát dung môi loại béo

Crocin và geniposide là thành phần phân cực trong hạt dành dành, việc loại béo bộtnguyên liệu là cần thiết để dễ dàng trích ly và tinh sạch các hoạt chất mục tiêu này

Mẫu nguyên liệu được khảo sát loại béo với ba loại dung môi ether dầu hỏa, n-hexane

và chloroform

Cách thực hiện: Bột dành dành (1 g) được ngâm với 5 mL từng dung môi loại béo

khảo sát (ether dầu hỏa, n-hexane và chloroform) trong các cốc thủy tinh, khuấy trộn

đều trong vòng 30 phút Kiểm tra thành phần dịch trích từng mẫu với sắc ký lớp mỏngcùng hệ dung môi giải ly ethyl acetate:isopropanol:nước (60:30:10) (Phương pháp tiếnhành sắc ký lớp mỏng được trình bày chi tiết ở phần 2.2.3.1)

Phân tích kết quả TLC của các mẫu dịch trích chất béo bằng các dung môi ether dầu

hỏa, n-hexane và chloroform để xác định dung môi loại béo phù hợp.

- Quy trình điều chế mẫu nghiên cứu

Quy trình điều chế mẫu nghiên cứu được thể hiện theo Sơ đồ 2.3

Thuyết minh quy trình

Bột dành dành (50 g) được ngâm với 100 mL dung môi loại béo đã được xác địnhtrong cốc thủy tinh kết hợp khuấy từ trong 3 giờ Sau đó lọc qua hệ thống chân không,loại bỏ phần dịch trích và thu phần bã, tiếp tục thêm hỗn hợp dung môi loại béo mớivào, thực hiện tương tự như vậy 3 lần

Phần bã cho vào bình cầu chứa 400 mL hỗn hợp 40% ethanol-nước, đem đun hồi lưutrong 1,5 giờ ở nhiệt độ sôi của dung môi Sau đó, dịch trích được gạn để riêng vàthêm hỗn hợp dung môi mới, thực hiện tương tự 3 lần Sau đó được lọc bằng hệ thống