Luận án Tiến sĩ Thực trạng, một số yếu tố liên quan, thành phần loài nấm Malassezia spp gây bệnh lang ben ở học sinh 11 15 tuổi và hiệu quả can thiệp tại Hải Phòng

ra ngân hàng dữ liệu giúp các nhà khoa học trong nước và trên thế giới hiểu sâu hơn về thành phần loài, dịch tễ học và bệnh sinh của các bệnh gây ra bởi nấm Malassezia spp.. Hải Phòng là

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

VI ỆN SỐT RÉT - KÝ SINH TRÙNG - CÔN TRÙNG TRUNG ƢƠNG

-

VÕ TH Ị THANH HIỀN

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

VI ỆN SỐT RÉT - KÝ SINH TRÙNG - CÔN TRÙNG TRUNG ƢƠNG

-

VÕ TH Ị THANH HIỀN

L ỜI CAM ĐOAN

Tôi là Võ Thị Thanh Hiền, nghiên cứu sinh khóa 8, chuyên ngành Ký sinh trùng y học, Viện Sốt rét - Ký sinh trùng - Côn trùng Trung Ương, xin cam đoan:

1 Đây là luận án do tôi trực tiếp thực hiện dưới sự hướng dẫn của PGS.TS Nguyễn Duy Bắc và PGS.TS Nguyễn Thị Liên Hương

2 Công trình nghiên cứu này không trùng lặp với bất kỳ công trình nghiên cứu nào khác đã được công bố tại Việt Nam

3 Các số liệu và thông tin trong nghiên cứu là hoàn toàn chính xác, trung thực và khách quan, đã được các địa điểm nghiên cứu chấp thuận và xác

nhận

Hà N ội, ngày tháng năm 2018

Nghiên c ứu sinh

Võ Th ị Thanh Hiền

L ỜI CẢM ƠN

Trong suốt quá trình học tập và hoàn thành luận án, tôi đã nhận được sự hướng dẫn quý báu của thầy cô, anh chị em và bạn bè đồng nghiệp Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tôi xin bày tỏ lời cảm ơn tới:

Đảng ủy, Ban giám hiệu Trường Đại học Y Dược Hải Phòng đã tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp đỡ tôi trong quá trình học tập

Viện Sốt rét - Ký sinh trùng - Côn trùng Trung Ương và phòng Khoa

học đào tạo đã tạo mọi điều kiện thuận lợi, giúp đỡ tôi trong quá trình học tập

PGS.TS Nguyễn Duy Bắc và PGS.TS Nguyễn Thị Liên Hương,

những người Thầy đã tận tình hướng dẫn, tạo mọi điều kiện thuận lợi, động viên tôi trong quá trình học tập, triển khai nghiên cứu và hoàn thành luận án

TS Đỗ Ngọc Ánh luôn tận tụy, chu đáo, chia sẻ những kiến thức, kinh nghiệm trong chuyên môn, nghiên cứu khoa học, trực tiếp giúp đỡ tôi trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận án

PGS.TS Đinh Thị Thanh Mai và toàn thể cán bộ của Bộ môn Ký sinh trùng - Trường Đại học Y Dược Hải Phòng đã luôn động viên, giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập, triển khai nghiên cứu

và hoàn thành luận án

PGS.TS Nguyễn Khắc Lực và toàn thể cán bộ của Bộ môn Ký sinh trùng Học viện Quân y đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình học

tập và triển khai nghiên cứu tại Bộ môn

TS Nguyễn Quang Chính - Giám đốc trung tâm truyền thông giáo dục

sức khỏe Hải Phòng đã giúp đỡ tôi trong quá trình xây dựng kế hoạch và nội dung truyền thông giáo dục sức khỏe cho học sinh về bệnh lang ben

Sinh viên lớp kỹ thuật xét nghiệm K6 - Trường Đại học Y Dược Hải Phòng đã nhiệt tình giúp đỡ trong quá trình thu thập số liệu

Ban giám hiệu, giáo viên chủ nhiệm các lớp, cán bộ y tế học đường, phụ huynh học sinh và học sinh Trường THCS Đoàn Xá, trường THCS Lạc Viên,

trường THCS Vĩnh Niệm, trường THCS Quang Hưng đã cho phép, giúp đỡ và

tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình triển khai thu thập số liệu

Các thầy cô trong hội đồng chấm chuyên đề cũng như Hội đồng chấm

luận án đã cho tôi những đóng góp quý báu để tôi hoàn chỉnh luận án cũng như trong quá trình nghiên cứu khoa học sau này

Bố mẹ, anh chị em, chồng con và bạn bè đồng nghiệp đã hết lòng ủng

hộ, động viên tôi trong suốt quá trình học tập và là động lực giúp tôi vượt qua

những khó khăn để hoàn thành luận án

Hà N ội, ngày tháng năm 2018

Nghiên c ứu sinh

Võ Th ị Thanh Hiền

DANH M ỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Ahr : Aryl hydrocarbon receptor

(Thụ thể hydrocarbon tập trung ở lớp tế bào biểu bì) CI95% : Confidence Interval (Khoảng tin cậy95%)

DNA : Deoxyribonucleic acid

HIV/AIDS : Human Immunodeficiency Virus infection /Acquired

Immunodeficiency Syndrome (Nhiễm virút gây suy giảm miễn dịch ở người) ICZ : Indolo carbazole

(Hoạt chất do Malassezia sản xuất)

IgE : Immunoglobulin E

KAP Knowledge - Attitude - Practice

(Kiến thức - thái độ - thực hành) KHV : Kính hiển vi

MfTam1 : M furfur Tryptophan Aminotransferase 1

(enzyme do M furfur s ản xuất)

Mglip2 : M globosa lipase 2

(enzyme thủy phân lipid do M globosa sản xuất)

NC : Nghiên cứu

NRS : Non restriction site (không phân cắt)

OR : Odds ratio (Tỷ suất chênh)

PCR : Polymerase Chain Reaction

(Phản ứng chuỗi trùng hợp) Nested - PCR : Nested - Polymerase Chain Reaction

(Phản ứng chuỗi polymerase lồng ghép)

PCR - RFLP : Polymerase Chain Reaction - Restriction Fragment

Length Polymorphism (PCR đa hình độ dài đoạn cắt giới hạn) SDA : Sabouraud Dextrose Agar

M ỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Khái niệm nấm Malassezia spp và bệnh lang ben 3

1.2 Lịch sử nghiên cứu nấm Malassezia spp 3

1.3 Nấm Malassezia spp 5

1.3.1 Vị trí của nấm Malassezia spp trong hệ thống phân loại 5

1.3.2 Đặc điểm hình thể của nấm Malassezia spp 5

1.3.3 Đặc điểm sinh thái học của nấm Malassezia spp 6

1.3.4 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của nấm Malassezia spp 7

1.3.5 Các hoạt động enzyme 8

1.3.6 Phân bố của các loài Malassezia spp 9

1.3.7 Các bệnh lý liên quan đến nấm Malassezia spp 10

1.4 Các phương pháp xác định thành phần loài nấm Malassezia spp 15

1.4.1 Kỹ thuật xét nghiệm nấm trực tiếp 15

1.4.2 Kỹ thuật nuôi cấy nấm 16

1.4.3 Kỹ thuật sinh học phân tử 20

1.5 Bệnh lang ben 21

1.5.1 Tình hình bệnh lang ben 21

1.5.2 Thành phần loài nấm Malassezia spp gây bệnh lang ben 24

1.5.3 Một số yếu tố nguy cơ 26

1.5.4 Chẩn đoán bệnh lang ben 29

1.5.5 Điều trị bệnh lang ben 30

1.5.6 Phòng bệnh 35

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 37

2.1 Đối tượng, địa điểm và thời gian nghiên cứu 37

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 37

2.1.2 Địa điểm nghiên cứu 37

2.1.3 Thời gian nghiên cứu 38

2.2 Phương pháp nghiên cứu 39

2.2.1 Thiết kế nghiên cứu 39

2.2.2 Cỡ mẫu và cách chọn mẫu 39

2.2.3 Sơ đồ thiết kế nghiên cứu 43

2.3 Nội dung nghiên cứu 44

2.3.1 Nghiên cứu thực trạng nhiễm và một số yếu tố liên quan nhiễm nấm lang ben ở học sinh tại Hải Phòng 44

2.3.2 Nghiên cứu xác định thành phần loài nấm lang ben ở học sinh tại Hải Phòng 44

2.3.3 Nghiên cứu can thiệp tại cộng đồng 44

2.4 Vật liệu nghiên cứu 44

2.4.1 Vật liệu cho xét nghiệm nấm trực tiếp và nuôi cấy 44

2.4.2 Vật liệu cho nghiên cứu xác định thành phần loài nấm 44

2.4.3 Vật liệu cho nghiên cứu can thiệp điều trị 45

2.4.4 Vật liệu cho nghiên cứu can thiệp truyền thông giáo dục sức khỏe 46

2.5 Phương pháp thu thập số liệu và kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu 46 2.5.1 Khám lâm sàng 46

2.5.2 Kỹ thuật xét nghiệm nấm trực tiếp 46

2.5.3 Kỹ thuật nuôi cấy 47

2.5.4 Kỹ thuật thực hiện phản ứng PCR - RFLP 48

2.5.5 Giải trình tự gen 54

2.5.6 Kỹ thuật phỏng vấn cộng đồng 55

2.5.7 Can thiệp tại cộng đồng 55

2.6 Các biến số và chỉ số nghiên cứu 57

2.6.1 Đặc điểm chung 57

2.6.2 Đặc điểm bệnh lang ben 57 2.6.3 Kiến thức - thái độ - thực hành của học sinh về bệnh lang ben 58

2.6.4 Các chỉ tiêu đánh giá 59

2.7 Các biện pháp khống chế sai số 59

2.8 Phương pháp xử lý số liệu 60

2.9 Đạo đức trong nghiên cứu 60

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 62

3.1 Thực trạng và một số yếu tố liên quan đến bệnh lang ben ở học sinh lứa tuổi 11 - 15 tại Hải Phòng năm 2016 62

3.1.1 Một số thông tin về đối tượng nghiên cứu 62

3.1.2 Thực trạng bệnh lang ben ở học sinh lứa tuổi 11 - 15 63

3.1.3 Kiến thức - thái độ - thực hành của học sinh về bệnh lang ben 67 3.1.4 Một số yếu tố liên quan đến bệnh lang ben ở học sinh 11 - 15 tuổi 70

3.2 Thành phần loài nấm Malassezia spp gây lang ben 75

3.2.1 Kết quả định danh các loài nấm bằng kỹ thuật PCR - RFLP 75

3.2.2 Kết quả giải trình tự gen định danh các loài nấm lang ben 83

3.3 Hiệu quả của các biện pháp can thiệp 85

3.3.1 Hiệu quả điều trị 85

3.3.2 Hiệu quả của các biện pháp truyền thông giáo dục sức khỏe 91

CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 95

4.1 Thực trạng và một số yếu tố liên quan đến bệnh lang ben ở học sinh lứa tuổi 11 - 15 tại Hải Phòng năm 2016 95

4.1.1 Thực trạng bệnh lang ben ở học sinh lứa tuổi 11 - 15 95

4.1.2 Một số yếu tố liên quan đến bệnh lang ben 105

4.2 Thành phần loài nấm Malassezia spp gây lang ben 108

4.2.1 Thành phần loài nấm Malassezia spp gây lang ben định danh bằng PCR - RFLP 109

4.2.2 Thành phần loài nấm Malassezia spp định danh bằng phương pháp giải trình tự 116

4.3 Hiệu quả của các biện pháp can thiệp 117

4.3.1 Hiệu quả điều trị 117

4.3.2 Hiệu quả của các biện pháp truyền thông giáo dục sức khỏe 125

KẾT LUẬN 128

KIẾN NGHỊ 130 TÍNH MỚI, TÍNH KHOA HỌC VÀ TÍNH THỰC TIỄN CỦA LUẬN ÁN DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH M ỤC BẢNG

Bảng 1.1 Sự phân bố của các loài Malassezia spp trên người và động vật 9

Bảng 1.2 Các bệnh ở người liên quan đến nấm men Malassezia spp và các loài thường gặp nhất 15

Bảng 1.3 Đặc tính sinh lý và sinh hóa của các loài Malassezia spp 19

Bảng 1.4 Một số cây thuốc dùng điều trị bệnh lang ben theo kinh nghiệm dân gian 32

Bảng 2.1 Đặc điểm khuẩn lạc nấm Malassezia spp trên môi trường CHROMagarTMMalassezia 48

Bảng 2.2 Kích thước sản phẩm khuếch đại và các đoạn giới hạn sau khi phân cắt bằng enzyme giới hạn 54

Bảng 3.1 Phân bố đối tượng nghiên cứu theo giới 62

Bảng 3.2 Tỷ lệ bệnh lang ben ở học sinh lứa tuổi 11 - 15 theo địa dư 64

Bảng 3.3 Tỷ lệ bệnh lang ben ở học sinh lứa tuổi 11 - 15 theo giới tính 64

Bảng 3.4 Tỷ lệ bệnh lang ben theo tiền sử mắc bệnh 64

Bảng 3.5 Triệu chứng cơ năng của bệnh lang ben 65

Bảng 3.6 Đặc điểm lâm sàng của bệnh lang ben 66

Bảng 3.7 Thời gian mắc bệnh lang ben 66

Bảng 3.8 Kiến thức của học sinh về bệnh lang ben 67

Bảng 3.9 Kiến thức của học sinh về điều trị và phòng bệnh lang ben 68

Bảng 3.10 Thái độ của học sinh về bệnh lang ben 69

Bảng 3.11 Thực hành của học sinh phòng chống bệnh lang ben 69

Bảng 3.12 Mối liên quan giữa bệnh lang ben với cơ địa của học sinh 70

Bảng 3.13 Mối liên quan giữa bệnh lang ben với kiến thức về bệnh học bệnh lang ben của học sinh 71

Bảng 3.14 Mối liên quan giữa bệnh lang ben với kiến thức về điều trị và phòng bệnh lang ben của học sinh 72

Bảng 3.15 Mối liên quan giữa bệnh lang ben với thái độ của học sinh 72

Bảng 3.16 Mối liên quan giữa bệnh lang ben với yếu tố tắm ngay sau khi đi

học về 73

Bảng 3.17 Mối liên quan giữa bệnh lang ben với yếu tố dùng xà phòng, sữa tắm khi tắm 73

Bảng 3.18 Mối liên quan giữa bệnh lang ben với yếu tố giặt quần áo hàng ngày 74

Bảng 3.19 Mối liên quan giữa bệnh lang ben với yếu tố mặc chung quần áo74 Bảng 3.20 Kích thước sản phẩm PCR và sản phẩm cắt giới hạn bằng enzyme giới hạn 80

Bảng 3.21 Đơn nhiễm và đa nhiễm các loài nấm định danh bằng PCR - RFLP 81

Bảng 3.22 Thành phần loài nấm Malassezia spp định danh bằng PCR - RFLP theo vị trí tổn thương 82

Bảng 3.23 Thành phần loài nấm Malassezia spp định danh bằng PCR - RFLP theo giới tính 82

Bảng 3.24 Thành phần loài nấm Malassezia spp định danh bằng PCR - RFLP theo địa dư 83

Bảng 3.25 Kết quả giải trình tự gen 83

Bảng 3.26 Thông tin về học sinh tham gia điều trị 85

Bảng 3.27 Kết quả nuôi cấy nấm trước và sau điều trị theo địa dư 85

Bảng 3.28 Kết quả nuôi cấy nấm trước và sau điều trị theo giới tính 86

Bảng 3.29 So sánh tổn thương thay đổi màu sắc trên da trước và sau điều trị theo địa dư 87

Bảng 3.30 So sánh tổn thương thay đổi màu sắc trên da trước và sau điều trị theo giới tính 88

Bảng 3.31 Kết quả điều trị sau 1 tháng theo địa dư 88

Bảng 3.32 Kết quả điều trị sau 1 tháng theo giới tính 89

Bảng 3.33 Kết quả điều trị sau 1 tháng theo thời gian mắc bệnh 89

Bảng 3.34 Tỷ lệ tái phát sau điều trị theo địa dư 90

Bảng 3.35 Tỷ lệ tái phát sau điều trị theo giới 90

Bảng 3.36 Thông tin về các nội dung truyền thông giáo dục sức khỏe áp dụng

tại các địa điểm nghiên cứu 91

Bảng 3.37 Kiến thức của học sinh về bệnh lang ben trước và sau can thiệp 92

Bảng 3.38 Thái độ của học sinh về bệnh lang ben trước và sau can thiệp 93

Bảng 3.39 Thực hành của học sinh về bệnh lang ben 93 trước và sau can thiệp 93

DANH M ỤC HÌNH

Hình 1.1 Cơ chế gây bệnh viêm da tiết bã 10

Hình 1.2 Hình ảnh tổn thương viêm da tiết bã 11

Hình 1.3 Hình ảnh tổn thương viêm nang lông 12

Hình 1.4 Hình ảnh tế bào nấm lang ben soi trên KHV vật kính 40x 16

Hình 1.5 Hình ảnh khuẩn lạc nấm M pachydermatis trên môi trường CHROMagarTMMalassezia 17

Hình 1.6 Hình ảnh tế bào nấm Malassezia pachydermatis 17

Hình 1.7 Hình ảnh khuẩn lạc nấm M furfur trên môi trường CHROMagarTMMalassezia 17

Hình 1.8 Hình ảnh tế bào nấm Malassezia furfur 17

Hình 1.9 Hình ảnh khuẩn lạc nấm M japonica trên môi trường CHROMagarTMMalassezia 17

Hình 1.10 Hình ảnh tế bào nấm Malassezia japonica 17

Hình 1.11 Quy trình thử nghiệm với Tween và Cremophor EL 18

Hình 1.12 Hình ảnh tổn thương lang ben 29

Hình 1.13 Cơ chế tác động của ketoconazole 33

Hình 2.1 Bản đồ địa điểm nghiên cứu 38

Hình 2.2 Sơ đồ thiết kế nghiên cứu 43

Hình 2.3 Thuốc etoral (ketoconazole) 46

Hình 2.4 Sơ đồ cặp mồi ITS3 và ITS4, NL1 và NL4 55

Hình 3.1 Phân bố đối tượng nghiên cứu theo địa dư 62

Hình 3.2 Kết quả xét nghiệm nấm trực tiếp 63

Hình 3.3 Tỷ lệ bệnh lang ben của học sinh 63

Hình 3.4 Phân bố vị trí tổn thương lang ben 65

Hình 3.5 Kết quả nuôi cấy nấm 75

Hình 3.6 Kết quả điện di sản phẩm PCR với mồi ITS3 và ITS4 của một số mẫu nấm lang ben 76

Hình 3.7 Kết quả điện di sản phẩm PCR cắt giới hạn bằng enzyme giới hạn

AluI của một số mẫu nấm lang ben 76 Hình 3.8 Kết quả điện di sản phẩm PCR cắt giới hạn bằng enzyme giới hạn

BanI của một số mẫu nấm lang ben 77 Hình 3.9 Kết quả điện di sản phẩm PCR cắt giới hạn bằng enzyme giới hạn

MspAI của một số mẫu nấm lang ben 78 Hình 3.10 Kết quả điện di sản phẩm PCR (mồi ITS3, ITS4) và các mảnh cắt

giới hạn bằng enzyme AluI, BanI, MspAI của nấm M furfur 78

Hình 3.11 Kết quả điện di sản phẩm PCR (mồi ITS3, ITS4) và các mảnh cắt

giới hạn bằng enzyme AluI, BanI, MspAI của nấm M japonica 79

Hình 3.12 Kết quả định danh bằng PCR - RFLP 80 Hình 3.13 Thành phần loài nấm Malassezia sppđịnh danh bằng PCR - RFLP 81 Hình 3.14 Cây phả hệ xác định mối quan hệ về loài giữa các chủng

Malassezia spp 84

ĐẶT VẤN ĐỀ

Malassezia spp là nấm men ưa lipid, sống hoại sinh ở bề mặt da người

và động vật máu nóng Hiện nay, có tất cả 14 loài Malassezia spp, trong đó có

3 loài gây lang ben thường gặp nhất là M furfur (ở các nước có khí hậu nhiệt đới), M globosa (ở các nước có khí hậu ôn đới) và M sympodialis [64] Ngoài ra, Malassezia spp còn là tác nhân thứ phát làm nặng nề hơn tình trạng

của một số bệnh da khác: viêm da tiết bã, viêm nang lông, viêm da cơ địa,

bệnh vẩy nến, … [31] cũng như có thể là một nguyên nhân gây nhiễm trùng toàn thân [8], [61] ở trẻ sơ sinh, người được nuôi dưỡng bằng nhũ tương lipid, đặt catheter tĩnh mạch trung tâm và những bệnh nhân suy giảm miễn dịch

Malassezia spp thường gây bệnh lang ben là một bệnh phổ biến ở người Bệnh phân bố ở mọi nơi trên thế giới, nhất là ở các nước nhiệt đới có khí hậu nóng ẩm với tỷ lệ nhiễm là 30% - 50%, ở vùng ôn đới là 14%, vùng hàn đới là 1,1% [4], [64] Tại Việt Nam, bệnh khá phổ biến nhưng do không

có ảnh hưởng lớn đến sức khỏe nên ít được thống kê, báo cáo [3]

Mọi lứa tuổi đều có thể mắc bệnh lang ben nhưng gặp nhiều hơn ở lứa

tuổi dậy thì từ 11 - 15 tuổi [64] Theo nghiên cứu của Jena tại Ấn Độ trên đối tượng dưới 15 tuổi có tỷ lệ bệnh lang ben là 31% [60] Nguyên nhân chủ yếu

là do hoạt động mạnh mẽ của tuyến bã nhờn đã tạo ra môi trường thuận lợi cho nấm lang ben phát triển Cơ địa ra mồ hôi nhiều, ngủ chung, mặc chung

quần áo, tiền sử mắc bệnh lang ben trước đó cũng như của người thân trong gia đình được coi là yếu tố thuận lợi Các tổn thương thay đổi sắc tố trên da được cho là vệ sinh kém đã làm ảnh hưởng không nhỏ đến tâm lý của học sinh

Các loài nấm Malassezia spp được xác định dựa vào các kỹ thuật chẩn

đoán định danh nấm truyền thống quá phức tạp và mất nhiều thời gian, không cho phép phân biệt được tất cả các loài nấm Malassezia spp Vì vậy, các

nghiên cứu hiện nay sử dụng nhiều kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại đã tạo

ra ngân hàng dữ liệu giúp các nhà khoa học trong nước và trên thế giới hiểu sâu hơn về thành phần loài, dịch tễ học và bệnh sinh của các bệnh gây ra bởi

nấm Malassezia spp

Điều trị bệnh lang ben không khó song tỷ lệ tái phát cao [85] Phác đồ điều trị có thể bôi, uống thuốc kháng nấm hoặc phối hợp Thuốc bôi thường được áp dụng cho tổn thương có diện tích nhỏ Thuốc uống kháng nấm được

tiến hành theo phác đồ thường quy có thể tốn kém và ảnh hưởng không nhỏ đến chức năng gan thận, nhất là người suy giảm miễn dịch và có tiền sử suy gan thận [54] Hiện nay kháng sinh kháng nấm nhóm azole như ketoconazole, fluconazole, itraconazole là những lựa chọn đầu tay

Hải Phòng là thành phố công nghiệp nằm ở miền Bắc Việt Nam với đặc điểm khí hậu thuận lợi cho các bệnh nấm phát triển nhưng đến nay chưa có

một nghiên cứu nào về bệnh lang ben và các yếu tố liên quan tại cộng đồng

trên đối tượng 11 - 15 tuổi cũng như thành phần loài nấm Malassezia spp gây

lang ben Do vậy, để góp phần đánh giá đúng vai trò y học của nấm

Malassezia spp, áp dụng các phương pháp chẩn đoán và điều trị cũng như phòng chống bệnh lang ben có hiệu quả tại Hải Phòng nói riêng và Việt Nam nói chung, chúng tôi đã triển khai nghiên cứu: “Thực trạng, một số yếu tố lien quan, thành phần loài nấm Malassezia spp gây bệnh lang ben ở học

sinh 11 - 15 tu ổi và hiệu quả can thiệp tại Hải Phòng (2016 - 2017)”với

mục tiêu:

1 Mô t ả thực trạng và một số yếu tố liên quan đến bệnh lang ben ở học sinh 11 - 15 tu ổi tại Hải Phòng năm 2016

2 Xác định thành phần loài nấm Malassezia spp gây bệnh lang ben

3 Đánh giá hiệu quả can thiệp điều trị đặc hiệu và truyền thông giáo dục

s ức khỏe phòng chống bệnh lang ben năm 2016 - 2017

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Khái niệm nấm Malassezia spp và bệnh lang ben

Malassezia spp là nấm men ưa lipid, sống hoại sinh ở bề mặt da người

và động vật máu nóng, là tác nhân của một số bệnh ngoài da cũng như các

bệnh nhiễm trùng hệ thống [31], [61] Những nấm men này hiện nay được coi

là các mầm bệnh cơ hội Quan sát bằng kính hiển vi điện tử cho thấy loại nấm men này có một tế bào đa lớp dày với chồi hình thành liên tục từ một cực duy

nhất trên tế bào cha mẹ, vì thế cho phép nhận dạng dễ dàng các loại nấm men này trong da Các loài nấm Malassezia spp đều cần có chuỗi axit béo dài trong môi trường nuôi cấy trừ M pachydermatis nên các môi trường nuôi cấy thông

thường được sử dụng để xác định nấm men không thể áp dụng cho nấm này Vì

vậy, trong một khoảng thời gian dài, khởi đầu từ năm 1846 chúng đã được phát

hiện trên các tổn thương ở da nhưng đến năm 1927 chúng mới được phân lập trên môi trường nuôi cấy có bổ sung chất béo

Lang ben (pityriasis versicolor) là một bệnh mạn tính của lớp sừng do

nấm men Malassezia spp gây nên Bệnh biểu hiện bằng những đám thay đổi

màu sắc trên da có hình tròn hoặc hình bầu dục, bong vảy mỏng, mịn, các tổn thương có thể đứng rải rác hoặc liên kết với nhau thành đám, tập trung chủ

yếu ở vùng da giàu tuyến bã nhờn như lưng, ngực, … và kèm theo ngứa [3], [4]

1.2 Lịch sử nghiên cứu nấm Malassezia spp

Lang ben là một thuật ngữ được sử dụng bởi Willan vào cuối thế kỷ XVIII và đầu thế kỷ XIX Năm 1846, Eichstedt đã mô tả một giống nấm men

Malaasezia được xác định là nguyên nhân gây bệnh lang ben ở người Ông quan sát thấy sự hiện diện của nấm men và nấm sợi trong bệnh phẩm từ bệnh nhân, nhưng loài nấm này đã không được nêu tên cho đến khi Robin xác định

là Microspporon furfur vào năm 1853 Năm 1874, Malassez lần đầu tiên mô tả

cả hai “bào tử” hình cầu và hình bầu dục có chồi trên vảy da của những bệnh nhân viêm da tăng tiết bã nhờn, ông đã đặt tên “Vi khuẩn hình chai của Unna”

để mô tả những tế bào hình bầu dục nhỏ trong vảy da

Từ những năm 40 - 50 của thế kỷ 19, các tác giả đã ghi nhận vai trò gây

bệnh của nấm với tên gọi Pityrospporum và tác giả nhận thấy sự hiện diện của

nấm trên một số bệnh như: lang ben, viêm da dầu, viêm nang lông, viêm da

cơ địa Trong năm 1925, Weidman phân lập được nấm men từ da của một con

tê giác có hình thái giống P ovale nhưng lại không phụ thuộc vào chất béo để tăng trưởng và đặt tên là P pachydermatis Trong nhiều năm sau đó, một số

tác giả tiến hành phân lập nhiều loại nấm men từ động vật và đều kết luận là

P pachydermatis Loài này không tồn tại trên bề mặt da của con người nhưng được tìm thấy ở nhiều vật nuôi

Năm 1927, Panja công nhận sự tương đồng giữa Malassezia và

Pityrospporum , đặt tên chúng M furfur và M ovalis, và loài thứ ba, M

tropica là nguyên nhân của lang ben vùng nhiệt đới Tuy nhiên, khái niệm này

đã không được chấp nhận bởi các nhà nghiên cứu tại thời điểm đó vì người ta cho rằng Malassezia là nấm sợi còn Pityrospporum là nấm men.

Trong tác phẩm "Nấm men, một nghiên cứu phân loại", xuất bản đầu

tiên năm 1952 đã liệt kê hai loài nấm: P ovale và P pachydermatis P

orbiculare đã được thêm vào chi Pityrospporum trong lần xuất bản thứ hai

năm 1970 Trong 3 loài này có hai loài nấm men ưa lipid gây bệnh ở người là

P oval và P orbiculaire và một loài không ưa lipid gây bệnh cho động vật là

P pachydermatis Trong tác phẩm này, tác giả đã thừa nhận sự giống nhau

giữa Pityrospporum và Malassezia Vào năm 1986, tại Ủy ban Quốc tế về

phân loại nấm, một cái tên chung duy nhất được đề xuất cho các loại nấm này

là Malassezia Mặc dù quyết định này đã được công nhận bởi các nhà phân

loại, "Pityrospporum" tiếp tục được sử dụng, đặc biệt là trong chuyên ngành

da liễu

Năm 1995 - 1996, nhiều thành tựu khoa học công nghệ phát triển nhanh chóng, ứng dụng thành công việc giải mã trình tự bộ gen và đã tìm ra 7 loài

Malassezia [38] Đến năm 2004, các nhà khoa học Nhật Bản tiếp tục tìm ra thêm 6 loài mới nữa trong đó có 3 loài có nguồn gốc từ động vật và 3 loài có nguồn gốc từ người Từ đó, các nhà khoa học thống nhất tên gọi cho nấm này

là Malassezia Cho đến hiện nay các nhà khoa học đã phân lập được tất cả là

14 loài Malassezia [31], [34],[ 35], [38] Các loài này đóng vai trò rất quan

trọng trong căn nguyên sinh bệnh của lang ben

Loài : M furfur, M pachydermatis, M sympodialis, M globosa, M

obtusa, M restricta, M slooffiae, M dermatis, M japonica, M nana, M yamatoensis, M caprae, M equine, M cuniculi

1.3.2 Đặc điểm hình thể của nấm Malassezia spp

Quan sát dưới kính hiển vi quang học, các tế bào nấm men có hình tròn

hoặc hình bầu dục hay hình trụ, kích thước 3 - 8 µm [91] Các tế bào nấm men sinh sản bằng cách nảy chồi, các tế bào con khi tách khỏi tế bào mẹ sẽ để lại

một vết sẹo, từ vết sẹo này các tế bào con khác lại nhô lên [27] Dạng sinh sản

đa chồi không xảy ra, nhưng các tế bào con sau khi được sinh ra lại không tách hoàn toàn khỏi tế bào mẹ nên khi quan sát dưới kính hiển vi thấy dính nhau thành chùm

Mô tả về các đặc điểm khuẩn lạc của Malassezia spp trên môi trường

nuôi cấy rất hạn chế cho đến khi môi trường nuôi cấy cung cấp đầy đủ lipid cho sự phát triển của nấm men này Trên các môi trường nuôi cấy khác nhau

sẽ cho hình thể khuẩn lạc khác nhau Trên môi trường CHROMagarTM

Malassezia khuẩn lạc có màu từ hồng đến tím và có thể dùng để định loài

Quan sát dưới kính hiển vi điện tử, vách tế bào của Malassezia spp có

một cấu trúc độc nhất [79] Nó dày hơn vách của các tế bào nấm men khác, khoảng 0,12 mm, gồm nhiều lớp mỏng và màng plasma [79], [115] Chính các lớp mỏng này đóng một vai trò quan trọng trong sự kết dính của nấm vào

da người và ống thông Vách tế bào của Malassezia spp có một tỷ lệ lipid cao

là 15% [118] giúp cho tế bào Malassezia có sức đề kháng với các ảnh hưởng

từ bên ngoài Chính cấu trúc này Malassezia đã ngăn chặn cơ thể sản xuất

cytokin [27]

1.3.3 Đặc điểm sinh thái học của nấm Malassezia spp

Nhiều nghiên cứu đã được tiến hành nhằm khảo sát thực trạng nhiễm

nấm trên da người bằng phương pháp xét nghiệm trực tiếp và nuôi cấy [27]

Và các tác giả đã chỉ ra rằng nấm Malassezia spp rất phổ biến trong cộng

đồng, đạt tỷ lệ nhiễm cao nhất ở sau tuổi dậy thì và lứa tuổi trưởng thành sớm

Do phụ thuộc vào chất béo để tồn tại nên vùng da giàu tuyến bã nhờn là vị trí thích hợp nhất cho sự tồn tại của nấm men Malassezia spp [91], [99]

Malassezia spp xâm chiếm vùng da mặt, da đầu và thân trên, mức độ phân bố trên chi là tương đối thấp hơn [31] Hoạt tính tuyến bã xuất hiện ở trẻ nhỏ, bắt đầu tăng lên từ giữa đến cuối thời thơ ấu để đáp ứng sự bài tiết androgen, tiếp

tục tăng lên đến 16 - 19 tuổi, và sau đó không có thay đổi đáng kể cho đến

tuổi già [86] Vì vậy, sự phát triển của Malassezia spp phụ thuộc vào sự hoạt

động của tuyến bã theo tuổi

Trên các cá thể khỏe mạnh, Malassezia spp gặp ở mọi lứa tuổi và ở cả

hai giới [31] Đây là một thành phần của hệ sinh vật bình thường trong hơn

90% người trưởng thành sống ở các vùng nhiệt đới Do đó, lang ben phổ biến

ở vùng nhiệt đới hơn vùng ôn đới [60]

1.3.4 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của nấm Malassezia spp

Ngoại trừ M pachydermatis, tất cả các loài Malassezia spp đòi hỏi một

nguồn lipid bên ngoài để tăng trưởng [8], các lipid này được cho là một yếu tố

bảo vệ Malassezia spp và giảm sự đáp ứng miễn dịch viêm [67] Sự phụ thuộc

vào lipid được biết đến dựa trên một khiếm khuyết trong sự tổng hợp của acid myristic, nó là tiền thân của acid béo chuỗi dài Vì vậy sự tăng trưởng trong môi trường nuôi cấy chỉ xảy ra khi có các axit béo chuỗi dài từ C12 đến C24 [75]

Ngoại trừ sự chuyển hóa lipid, ít được biết về điều kiện tăng trưởng và

hoạt động trao đổi chất của loài Malassezia spp Khả năng lên men đường

không tìm thấy ở bất kỳ loài Malassezia spp nào

Điều kiện quan trọng cho sự thành công của việc nuôi cấy, phân lập

nấm Malassezia spp tiếp tục được tìm thấy Đó là việc các môi trường nuôi

cấy được duy trì trong điều kiện độ ẩm và nhiệt độ thích hợp Vì vậy, các mẫu

bệnh phẩm lấy từ da, da đầu, móng tay, tóc, máu, ống thông, hoặc bất kỳ nguồn nào khác của con người hoặc động vật, sẽ được đưa càng sớm càng tốt vào một hoặc nhiều dụng cụ để tránh mất nước của nấm men [31] Trong quá trình vận chuyển, độ ẩm phải được duy trì càng cao càng tốt bằng cách sử

dụng túi hoặc hộp nhựa [31]

Nhiệt độ tăng trưởng tối ưu là khoảng 32 - 34o

C và cần nuôi cấy ít nhất trong 2 tuần [31] Nấm men Malassezia spp không tồn tại ở nhiệt độ dưới

28oC, vì vậy, các mẫu bệnh phẩm thu thập được không được giữ trong tủ lạnh trước khi nuôi cấy [31] Nhiệt độ nuôi cấy chưa bao giờ vượt quá 35o

với một vài loài trong một thời gian dài [31] Tất cả các loài có thể được lưu

trữ ở nhiệt độ - 80o

C trong glycerol 50% [33]

1.3.5 Các hoạt động enzyme

Sự cần thiết cho các loài Malassezia spp để hấp thu các axit béo từ các

nguồn bên ngoài được phản ánh trong sự hiện diện của 8 loại lipase và 3 loại phospholipases [31], [51], [91] Lipase thủy phân triglycerides ở tuyến bã

nhờn của người thành glycerin và các acid béo tự do là nguyên nhân gây ra

phản ứng viêm cũng như đóng vai trò là các chất dinh dưỡng cho nấm [31]

Trong môi trường chứa dầu ôliu, nấm men Malassezia spp (có thể là M

furfur) sản xuất axit dicarboxylic C9 - C11 [83] Đặc biệt axit azelaic, một axit dicarboxylic C9 (HOOC- (CH2) 7-COOH), ức chế cạnh tranh tyrosinase,

một enzyme có liên quan đến sản xuất melanin [33] đồng thời làm giảm việc

sản xuất oxy hoạt tính của bạch cầu trung tính

M fufur s ản xuất enzyme tryptophanaminotransferase (MfTam1) hoạt

động ở pH từ 6,0 đến 10,0, pH = 8,0 điều kiện thuận lợi nhất [89] Điều này cũng giải thích lý do một trong những điều kiện thuận lợi của lang ben là da

kiềm Các nghiên cứu về M globosa đã phát hiện hệ enzyme thủy phân lipid

rất phong phú gồm 13lipase có vai trò quan trọng trong tính chất gây bệnh của

nấm này trong đó Mglip 2 đặc trưng hoạt động ở pH = 6,0 có khả năng

chuyển hóa hầu hết các chất béo có trong tuyến bã nhờn (trừ triglycerid) [114], [123] Như vậy, mỗi loài Malassezia sản xuất một hệ enzyme hoạt

động ở mỗi dải pH đặc trưng khác nhau

Malassezia spp tổng hợp một số chất có hoạt tính sinh học như indole

và hoạt động thông qua các thụ thể hydrocarbon (Ahr) tập trung ở lớp tế bào

biểu bì Ngoài ra, Malassezia spp còn sản xuất một số hợp chất tham gia đáp

ứng miễn dịch và hấp thụ tia cực tím như indirubin, indolo carbazone (ICZ)

do đó có giả thuyết cho rằng Malassezia spp có khả năng gây ung thư da [74],

[82] Năm 2013, Magiatis P và CS đã chứng minh Ahr có vai trò là tác nhân

quan trọng trong cơ chế gây bệnh của nấm Malassezia bởi khả năng làm thay

đổi cấu trúc nội môi và gây ra các biểu hiện bệnh lý trên da [74]

Sự phát triển của các kỹ thuật phân tử cho phép xác định rõ các loài

Malassezia spp Cho đến nay, các tác giả đã nghiên cứu và phân lập được 14 loài nấm Malassezia spp trong đó có M pachydermatis là loài duy nhất không

ưa lipid và thường gây bệnh trên động vật Việc hiểu biết sâu về các loài nấm

và cơ chế gây bệnh sẽ thúc đẩy việc nghiên cứu các phương pháp điều trị có

hiệu quả hơn

1.3.6 Phân bố của các loài Malassezia spp

Bảng 1.1 Sự phân bố của các loài Malassezia spp trên người và động vật

1 M pachydermatis Chó, mèo, động vật ăn thịt, chim [35]

2 M furfur Người/bò, voi, lợn, khỉ, đà điểu, bồ nông, chó,

mèo [35], [69], [112], [127]

3 M yamatoensis Người [35]

4 M sympodialis Người/ngựa, lợn, cừu [35]

5 M caprae Dê, ngựa [35]

1.3.7 Các b ệnh lý liên quan đến nấm Malassezia spp

Malassezia spp gây bệnh cho người và động vật đã nhận được sự quan tâm đáng kể trong những năm gần đây của các bác sĩ da liễu, các bác sỹ lâm

sàng, bác sĩ thú y và các nhà nghiên cứu bệnh học [30] Nấm Malassezia spp

là tác nhân chủ yếu gây lang ben, tuy nhiên vi nấm này còn được cho là gây ra

hoặc làm trầm trọng thêm một số bệnh lý khác nhau trên da người: viêm da

tiết bã, viêm nang lông, viêm da cơ địa, vảy nến, [8], [30], [70] Ngoài ra,

nấm này còn gây nhiễm trùng hệ thống nhưng hiếm gặp hơn [8], [31] Vì vậy,

một số nghiên cứu đã được tiến hành với mục đích làm sáng tỏ các bệnh gây

ra bởi các loài Malassezia spp cụ thể

Trong phần này tập trung trình bày các bệnh lý liên quan đến nấm men

Malassezia spp, còn bệnh lang ben sẽ được trình bày riêng ở phần sau (xem

phần 1.4)

1.3.7.1 Viêm da ti ết bã

Hình 1.1 Cơ chế gây bệnh viêm da tiết bã [32]

Mối liên hệ giữa nấm và viêm da tiết bã lần đầu tiên được đề xuất bởi Malassez vào năm 1874 Viêm da tiết bã là một bệnh da mà tổn thương đặc trưng là các dát đỏ, ngứa và vảy da bóng mỡ thường được tìm thấy ở vùng cơ

thể có nhiều tuyến bã nhờn như da đầu, trong các nếp gấp mũi má, lông mày, phía sau tai và trên ngực, trước xương ức, vùng liên bả vai và da đầu [116]

Bệnh thường gặp ở nam nhiều hơn nữ [31]

Các nghiên cứu về nấm Malassezia spp ở bệnh nhân viêm da tiết bã đều

cho thấy vai trò đặc biệt của nấm men trong cơ chế bệnh sinh của bệnh Tajima và CS cho thấy rằng vùng da bị tổn thương của bệnh nhân viêm da tiết

bã có Malassezia spp và cao gấp 3 lần vùng da lành [116] Trong nghiên cứu

ở Hy Lạp về bệnh nhân viêm da tiết bã, M globosa là loài phổ biến đã được

phân lập riêng lẻ hoặc kết hợp với M sympodialis hoặc M restricta hoặc cả

M sympodialis và M restricta [46]

Hình 1.2 Hình ảnh tổn thương viêm da tiết bã [31]

Điều trị bằng dầu gội chống nấm, các loại kem hoặc thuốc kháng nấm đường uống như itraconazole hoặc ketoconazole thường là thành công Điều

đó cho thấy rằng Malassezia spp có liên quan mật thiết đến sự phát triển của

viêm da tiết bã [51]

1.3.7.2 Viêm nang lông

Viêm nang lông có biểu hiện là các mụn mủ phân bố ở vùng ngực và lưng, bao quanh các mụn mủ là tổn thương viêm đỏ [28] Bệnh có thể gặp ở các thai phụ, bệnh bạch cầu, bệnh Hodgkin và ở những bệnh nhân suy giảm

miễn dịch [27]

Sự tắc nghẽn nang lông là nguyên nhân chính gây nên viêm nang lông,

Malassezia spp là một tác nhân xuất hiện thứ phát Vì vậy, các tác giả đã tìm

thấy một lượng lớn nấm men trong nang lông và xung quanh tổn thương viêm [31], [93] Bằng phương pháp nuôi cấy, các tác giả đã thu hồi được hai loài gây bệnh là M globosa và M sympodialis, nhưng khi sử dụng các phương

pháp khác các nhà nghiên cứu thu được M restricta, M globosa và M

sympodialis [25]

Chẩn đoán viêm nang lông do nấm Malassezia spp được xác nhận gián

tiếp bằng cách đáp ứngvới thuốc điều trị kháng nấm phù hợp [93] Điều trị tại

chỗ có hiệu quả trong một số trường hợp, nhưng hầu hết cần uống ketoconazole, itraconazole hoặc fluconazole

Hình 1.3 Hình ảnh tổn thương viêm nang lông [70]

1.3.7.3 Viêm da cơ địa

Viêm da cơ địa là một bệnh da mạn tính rất hay gặp, là sự kết hợp giữa

một cơ địa dị ứng với những tác nhân kích thích gây viêm Trong đó căn nguyên vi sinh vật thường được nhắc đến trong nhiều nghiên cứu là tụ cầu vàng, ít nghiên cứu đề cập đến vai trò của nấm khiến tình trạng bệnh thêm

trầm trọng

Một nghiên cứu được thực hiện tại Thuỵ Điển [105] đã phát hiện M

furfur, M globosa, M sympodialis, và M slooffiae ở các mẫu của bệnh nhân viêm da cơ địa Việc xác định Malassezia bằng phương pháp phân tử có thể

được coi là tốt hơn phương pháp truyền thống, Tajima và CS [116] cho thấy

M globosa và M restricta là những loài chủ yếu trong viêm da cơ địa Kháng

thể đặc hiệu IgE chống lại kháng nguyên Malassezia spp đã được phát hiện

với nồng độ cao ở những bệnh nhân bị viêm da cơ địa [72]

Ngoài ra, các triệu chứng của bệnh nhân viêm da cơ địa có thể được cải thiện bởi các thuốc chống nấm như ketoconazole và itraconazole [39] Scheynius cũng thấy rằng điều trị với ketoconazole làm giảm mức độ IgE huyết thanh và IgE đặc hiệu của M sympodialis [108]

1.3.7.4 B ệnh vẩy nến

Bệnh vảy nến là một bệnh viêm da mạn tính có liên quan đến các yếu tố

di truyền học, miễn dịch và môi trường [3], [49] Các vi sinh vật được coi là tác nhân làm trầm trọng thêm bệnh vảy nến [31], [49]

Tỷ lệ phát hiện của M furfur, M japonica, và M globosa trên da của

bệnh nhân vảy nến lần lượt là 70,6%, 11,8%, và 8,8% Không có sự khác biệt nào giữa tỷ lệ phân lập Malassezia spp trong số các bệnh nhân vảy nến và các

cá nhân khỏe mạnh [103]

Vai trò của Malassezia spp trong bệnh vẩy nến vẫn chưa được xác định,

những bằng chứng thuyết phục về tầm quan trọng của chúng trong quá trình sinh bệnh vẫn còn thiếu đòi hỏi cần tiếp tục nghiên cứu Tuy nhiên, một báo cáo đã cho thấy tình trạng bệnh vẩy nến được cải thiện khi bệnh nhân dùng thuốc kháng nấm do đó đã gợi ý rằng nấm Malassezia spp hay một loại nấm

khác có vai trò gây bệnh [102]

1.3.7.5 Nhi ễm trùng hệ thống

Malassezia spp được mô tả như một nguyên nhân hiếm gặp gây nhiễm trùng hệ thống ở trẻ sơ sinh, trẻ sơ sinh suy dinh dưỡng nặng, trẻ em và người

lớn suy giảm miễn dịch, người được nuôi dưỡng bằng nhũ tương lipid, sử

dụng kháng sinh phổ rộng và kéo dài [31], [100] Với sự gia tăng các bệnh suy giảm miễn dịch như HIV/AIDS và các thủ thuật đòi hỏi phải ức chế hệ

thống miễn dịch, chẳng hạn như cấy ghép nội tạng, các ca nhiễm M furfur

đang tăng lên [33].Trường hợp đầu tiên được báo cáo năm 1981 cho thấy mối liên hệ với việc sử dụng thức ăn lipid tiêm tĩnh mạch ở trẻ sơ sinh [97] Một đường truyền khác được tìm thấy từ nhân viên bệnh viện hoặc bệnh nhân khác

hoặc người thân của họ đã được đưa ra [113] Cho đến năm 1987, chỉ có một vài báo cáo về bệnh nấm Malassezia spp máu ở trẻ sơ sinh và người lớn xuất

hiện [36], [88], [98] Tuy nhiên, trong hai thập niên tiếp theo đã có rất nhiều báo cáo về sự bùng phát của Malassezia spp trong các đơn vị chăm sóc tích

cực, đặc biệt ở trẻ sơ sinh và trẻ sơ sinh dùng lipid tiêm tĩnh mạch [121]

Nguyên nhân thông thường là M pachydermatis và M furfur

Malassezia spp phân lập được từ da của 3% trẻ sơ sinh khoẻ mạnh, nhưng từ 30% - 64% trẻ sơ sinh non tháng nhập viện trong tuần thứ hai của cuộc đời [121] Năm 2000, khi nghiên cứu nhiễm nấm máu ở một đơn vị chăm sóc tích

cực tại Mỹ, Tirodker [119] đã phát hiện 4 trường hợp nhiễm M furfur khi

nuôi cấy nhưng chỉ có 1 trường hợp được xác định bằng kỹ thuật PCR Tại

một bệnh viện ở miền nam Italia [58], 8 trong số 12 bệnh nhi non tháng nhiễm

nấm máu được chẩn đoán là do M furfur Các tác giả này cũng phân lập được

M furfur từ da của bệnh nhân, phụ huynh và nhân viên y tế

Như vậy, Malassezia spp có liên quan đến việc đặt catheter, việc sử

dụng nhũ tương lipid đường tĩnh mạch, sử dụng kháng sinh lâu dài [31], non tháng và thời gian nằm viện [75] Mặc dù cơ chế gây bệnh không rõ ràng nhưng việc sử dụng nhũ tương lipid đường tĩnh mạch có thể mang lại lợi thế

tăng trưởng cho Malassezia spp [37], [75], [121] Nấm Malassezia spp ngày

càng được công nhận, tỷ lệ nhiễm có thể cao nhưng khó xác định do bản chất

ưa lipid của nó không được hỗ trợ trong hầu hết các môi trường nuôi cấy Hơn

nữa, thời gian nuôi cấy Malassezia spp cản trở việc chẩn đoán nhanh, vì thế

các phương pháp phân tử là một cách chẩn đoán thay thế [45], [119]

Nhiễm nấm Malassezia spp hệ thống thường gây tử vong nếu không

được điều trị và bệnh nhân đáp ứng tốt nếu được điều trị kịp thời với thuốc kháng nấm toàn thân Tuy nhiên, đây là một mầm bệnh bất thường nên việc

chẩn đoán thường chậm [31] Giải quyết tình trạng nhiễm nấm máu này là

loại bỏ catheter tĩnh mạch trung tâm và ngưng dinh dưỡng ngoài ruột bằng nhũ tương lipid, cộng với điều trị kháng nấm toàn thân [81] Các thuốc kháng

nấm nhóm azole là các hợp chất cho thấy hoạt tính kháng nấm cao nhất chống

lại M furfur [47]

Bảng 1.2 Các bệnh ở người liên quan đến nấm men Malassezia spp

và các loài thường gặp nhất

STT B ệnh liên quan đến

Malassezia spp Loài Malassezia spp thường gặp

1 Lang ben M globosa, M furfur, M sympodialis

2 Viêm da tiết bã M restricta, M globosa, M sympodialis

3 Viêm nang lông M globosa, M restricta

4 Viêm da cơ địa M sympodialis, M globosa, M furfur

5 Vẩy nến M globosa, M restricta

6 Nhiễm trùng hệ thống M furfur, M pachydermatis

1.4 Các phương pháp xác định thành phần loài nấm Malassezia spp

1.4.1 K ỹ thuật xét nghiệm nấm trực tiếp

Sử dụng kính hiển vi quang học trong việc tìm nấm đã được sử dụng từ

thế kỷ XIX Đây là phương pháp đơn giản, dễ làm và cho kết quả nhanh giúp các bác sỹ lâm sàng chẩn đoán và điều trị được bệnh nấm Tuy nhiên, kết quả xét nghiệm còn phụ thuộc rất nhiều vào kinh nghiệm của các cán bộ y tế

Có hai bước quan trọng nhất của kỹ thuật xét nghiệm nấm trực tiếp là

bộc lộ được tế bào nấm và nhận định được hình thái của nấm dưới kính hiển

vi Hóa chất thường dùng phải có tính kiềm mạnh để thấm tốt vào lớp sừng giúp làm mềm và làm trong tổ chức biểu mô, bộc lộ hình thái nấm Dung dịch

có tính kiềm mạnh thường được sử dụng là KOH 10%, KOH 20%, NaOH 10% NaOH được áp dụng tại một số phòng xét nghiệm do có tính thấm sâu vào lớp biểu bì, có tác dụng tốt đối với bệnh phẩm móng và tóc KOH có tính

kiềm tuy không mạnh bằng NaOH nhưng an toàn, giá thành rẻ, có thể mua

sẵn trên thị trường hoặc tự pha chế dễ dàng KOH được áp dụng rộng rãi và

có hiệu quả với bệnh phẩm vảy da của bệnh nhân lang ben nhưng ái tính kém

với tế bào nấm men nên dễ bỏ qua khi soi trên kính hiển vi

Hiện nay các tác giả cải tiến kỹ thuật xét nghiệm nấm trực tiếp với KOH bằng cách dùng một chất màu có ái tính với tế bào nấm men Kỹ thuật

này được áp dụng bởi ưu điểm cho kết quả nhanh, nhận định rõ hình thái nấm, tránh bỏ sót Chất màu có thể sử dụng: mực Parker, xanh methylen Các chất màu này tạo nền màu xanh tương phản dễ quan sát hình thái nấm, không bắt màu vách tế bào sừng và không gây mỏi mắt khi quan sát lâu

Hình thái nấm điển hình trên kính hiển vi quang học là những sợi nấm thô ngắn như miến vụn, các tế bào nấm men hình tròn đứng tập trung thành

loài Malassezia spp gây bệnh Bệnh phẩm là vảy da của bệnh nhân lang ben

Môi trường định loài nấm là những môi trường thích hợp để nấm phát triển và bộc lộ các đặc tính về khuẩn lạc, hình thể và hóa học của nấm qua đó giúp định loài nấm được dễ dàng Mặc dù không cho được kết quả nhanh và chính xác như các phương pháp sinh học phân tử nhưng nuôi cấy nấm vẫn được sử dụng nhiều do khả năng hơn trong việc triển khai ở các phòng xét nghiệm

Nuôi cấy là không cần thiết để chẩn đoán thông thường, nhưng nó là điều cần thiết nếu muốn xác định các loài hiện diện trong các tổn thương Có nhiều môi trường thường được sử dụng để nuôi cấy Malassezia spp: môi

trường thạch đường Sabouraud, môi trường Sabouraud có phủ dầu oliu, môi trường thạch Dixon, môi trường Leeming - Notman và môi trường CHROMagarTMMalassezia Hiện nay, các tác giả khuyến nghị sử dụng môi

trường CHROMagarTM

Malassezia Nhiệt độ ủ cũng là một yếu tố quan trọng,

có hai loài là M globosa và M restricta không phát triển ở nhiệt độ trên

36oC Do đó, môi trường nên được ủ ở nhiệt độ 30oC đến 35o

Tuy nhiên, để phân biệt hình thái khuẩn lạc giữa các loài Malassezia

spp là tương đối khó khăn do hình ảnh đại thể của một số loài rất giống nhau

Vì vậy, sau khi nuôi cấy trên môi trường, các tác giả phải dựa vào sự phát triển ở các điều kiện nhiệt độ khác nhau và một số tính chất sinh hóa của từng loài mới có thể định danh chính xác được: khả năng đồng đồng hóa Tween 20

có acid lauric, Tween 40 có acid palmitic, Tween 60 có acid stearic, Tween 80

có acid oleic

Hình 1.11 Quy trình th ử nghiệm với Tween và Cremophor EL [31]

Kaneko và CS dựa trên sự phát triển của Malassezia spp trên môi

trường ChromagarTM

Malassezia, đồng thời sử dụng các phản ứng Catalase, cremophor esculin, sản xuất chất kết tủa đã xác định được 9 loài Malassezia

spp [62] Như vậy, để định danh được các loài nấm Malassezia spp thường

mất rất nhiều thời gian và công sức

Bảng 1.3 Đặc tính sinh lý và sinh hóa của các loài Malassezia spp [31], [34], [62]

STT Loài SDA 32 0 C 37 0 C 40 0 C Sợi

1.4.3 K ỹ thuật sinh học phân tử

Đối với nấm lang ben, kỹ thuật sinh học phân tử thường không được áp

dụng để chẩn đoán nhiễm mà thường dùng để xác định loài và đặc điểm phân

tử của nấm Các kỹ thuật khác nhau có thể được sử dụng để xác định loài nấm

Malassezia spp là PCR thường, RAPD (Randomly Amplified Polymorphic DNA), PCR - RFLP, Multiplex - PCR, Nested - PCR, giải trình tự Hiện nay, các kỹ thuật sinh học phân tử được xem là phương pháp nhanh và chính xác

hơn để xác định các loài Malassezia spp

1.4.3.1 K ỹ thuật sử dụng enzyme giới hạn PCR - RFLP

PCR - RFLP (Polymerase Chain Reaction - Restriction Fragment Length Polymorphisms) là một kỹ thuật trong sinh học phân tử nhằm nhân

một hoặc một vài đoạn DNA lên nhiều bản sao Kỹ thuật này với 2 lần phân tích, lần 1 khuếch đại gen đích của vi nấm, lần 2 cắt giới hạn đoạn gen khuếch đại được bằng enzyme cắt giới hạn Dựa trên kích thước sản phẩm PCR, số lượng và kích thước các mảnh cắt giới hạn mà các loài nấm được xác định và phân biệt với nhau Rezvan Talaee và CS (2014) áp dụng kỹ thuật PCR -

RFLP để xác định thành phần loài nấm Malassezia spp phân lập ở tỉnh

Kashan (Iran) [117] Để thực hiện việc xác định loài nấm Malassezia spp

bằng kỹ thuật PCR - RFLP, tác giả sử dụng cặp mồi 5’-

TAACAAGGATTCCCCTAGTA - 3’ và 5´- ATTACGCCAGCATCCTAAG

- 3´để khếch đại 1 phần đoạn gen đích 26rDNA có kích thước khoảng 580bp

của nấm Malassezia spp Sản phẩm PCR thu được sẽ được cắt giới hạn bởi enzyme CfoI Các loài n ấm Malassezia spp được phân biệt với nhau và xác

định loài dựa trên kích thước và số lượng mảnh cắt sản phẩm PCR

1.4.3.2 K ỹ thuật Nested - PCR

Kỹ thuật này còn được gọi là PCR lồng hay PCR tổ [125] Với 2 lần phân tích PCR, sản phẩm của PCR lần thứ 1 là cơ chất để thực hiện phản ứng PCR vòng 2 Nhờ 2 lần thực hiện PCR với 2 cặp mồi khác nhau nên tính đặc

hiệu trong nhận biết và xác định loài rất cao Tuy nhiên, kỹ thuật này dễ bị

nhiễm nên dễ dẫn tới dương tính giả Hao Zhang và CS (2013) [126] đã áp

dụng kỹ thuật Nested - PCR để xác định 10 loài nấm Malassezia spp Trong

nghiên cứu này, tác giả đã thiết kế 1 cặp mồi chung để khuếch đại gen đích

của giống nấm Malassezia spp 10 cặp mồi đặc hiệu để nhận biết 10 loài nấm

được thiết kế trên cơ sở đoạn gen đích thu được với cặp mồi chung Phương

pháp này có độ đặc hiệu trong nhận biết loài nấm Malassezia spp rất cao

nhưng mất khá nhiều thời gian để xác định được 1 mẫu nấm là loài nào

1.4.3.3 K ỹ thuật giải trình tự

Giải trình tự gen giúp xác định được trình tự các nucleotide của đoạn gen quan tâm Dựa trên sự khác biệt về nucleotide trong chuỗi DNA và sự tương đồng về nucleotide với ngân hàng gen mà nấm được xác định loài và phân biệt với nhau Kỹ thuật này còn giúp xác định được các đặc điểm phân

tử của nấm Tuy nhiên, do chi phí cao mà kỹ thuật này thường được sử dụng

để khẳng định lại giá trị của các kỹ thuật như PCR thường, PCR - RFLP, nested - PCR,

1.5 B ệnh lang ben

1.5.1 Tình hình bệnh lang ben

1.5.1.1 Tình hình b ệnh lang ben trên Thế giới

Lang ben là một trong những bệnh nấm da phổ biến nhất trên thế giới

do Malassezia spp gây ra nhưng thường gặp nhất ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới với tỷ lệ nhiễm là 30% - 50%, ở vùng ôn đới là 14% [4], [64] Tại khu vực hàn đới, một số nghiên cứu nhỏ ước chừng tỷ lệ mắc bệnh dưới 1% dân số Tuy nhiên tỷ lệ bệnh khác nhau ở mỗi quốc gia, khu vực

Tại châu Á, nghiên cứu của Elham Zeinali ở viện Pasteur, Iran năm

2012 - 2013 cho thấy tỷ lệ bệnh lang ben là 9,5% [125] Theo số liệu nghiên

cứu của Deepak Kumar Jena và CS , tỷ lệ bệnh lang ben ở trẻ em dưới 15 tuổi

tại Ấn Độ là 31% [60]

Năm 2003, một nghiên cứu gồm 1024 thủy thủ Ý trẻ tuổi, đã xác định

tỷ lệ hiện nhiễm lang ben là 2,1% [59]

Các nghiên cứu tại châu Mỹ cũng có tỷ lệ khác nhau Theo báo cáo của Mellen LA, tỷ lệ bệnh lang ben ở Mỹ rất thấp 0,8% [78] Daiane Heidrich tiến hành nghiên cứu tại Brazil từ năm 1996 đến năm 2011 là vùng có khí hậu ôn đới [56], tỷ lệ bệnh lang ben là 5,8% Một nghiên cứu khác được tiến hành trong một cộng đồng ngư dân ở Venezuela từ tháng 08/2001 đến tháng 05/2002 [23] có tỷ lệ phổ biến chung của bệnh lang ben đã được tìm thấy là 15,52%

Châu Phi là một châu lục có khí hậu nóng và điều kiện kinh tế thấp nhất

thế giới nhưng ở Malawi, tỷ lệ bệnh lang ben trong quần thể thấp khoảng 8% [87] Khác với Malawi, tỷ lệ bệnh lang ben ở Libya do Ellabib và CS nghiên

cứu năm 2002 là 27,8% [43]

Các nghiên cứu đều ghi nhận bệnh có thể gặp quanh năm, mùa hè nhiều hơn mùa đông Bệnh thường gặp vào những tháng cuối hè đầu thu Theo Elham Zeinali và CS ở Iran, bệnh thường gặp vào khoảng tháng 7, tháng 8 và tháng 9 [125] He SM cũng cho kết quả tương tự khi nghiên cứu tại Trung

Quốc [55]

Bệnh có thể gặp ở mọi lứa tuổi với tỷ lệ mắc cao nhất ở trẻ lớn và người lớn trẻ tuổi Bệnh này phổ biến ở bệnh nhân có da màu do cơ hội phát

hiện cao hơn sau khi nấm làm thay đổi sắc tố da [31] Theo Elham Zeinali và

CS ở Iran, bệnh hay gặp nhất ở lứa tuổi 20 - 29 chiếm 32,3%, ít gặp ở trẻ nhỏ, nhóm 0 - 9 tuổi chỉ chiếm 2,9% [125] Trong một nghiên cứu gần đây của hơn

800 trẻ em ở Tanzania, 26% có biểu hiện bệnh lang ben [44] Lang ben cũng

có thể xảy ra ở trẻ dưới 1 tuổi [60]

Phân bố bệnh ở nam và nữ có xu hướng cân bằng nhau Tại Mỹ, theo Mellen LA, 50% bệnh nhân được chẩn đoán mắc bệnh lang ben là nam [78] Asja Prohic nghiên cứu tại Ấn Độ cho kết quả tỷ lệ bệnh lang ben ở nam/nữ là 1/1 [90] Một số nghiên cứu lại có tỷ lệ ở nam cao hơn nữ như nghiên cứu của Ingordo năm 2003 tại Italia trên đối tượng thủy thủ nên 100% bệnh nhân là nam giới [59], nghiên cứu của He SM tại Trung Quốc thông báo tỷ lệ nam/nữ

là 2,2/1 [55], là 2,8/1 trong nghiên cứu của Archana BR và CS [26] Santana

JO nghiên cứu tại Brazil, tỷ lệ nam/nữ là 1/2 [106]

1.5.1.2 Tình hình b ệnh lang ben ở Việt Nam

Cho đến nay, ở nước ta có rất ít tác giả quan tâm đến bệnh lang ben một cách toàn diện Các nghiên cứu về bệnh chủ yếu đề cập đến thực trạng nhiễm

tại bệnh viện, hiệu quả của một số phác đồ điều trị bằng thuốc kháng nấm đường uống, nghiên cứu khả năng kháng nấm lang ben của một số cây thuốc

y học dân tộc, nghiên cứu về vấn đề miễn dịch trong bệnh lang ben Tỷ lệ mắc

bệnh lang ben khác nhau tùy từng khu vực và đối tượng nghiên cứu

Các nghiên cứu tiến hành tại bệnh viện Da liễu Trung Ương đều có tỷ

lệ bệnh lang ben thấp Theo nghiên cứu của Triệu Tân Phong [18] từ tháng 7/2008 đến tháng 8/2009, tỷ lệ bệnh lang ben của người dân đến khám tại đây

là 1,1% so với tổng số bệnh da liễu trong đó số bệnh nhân dưới 16 tuổi có tỷ

lệ nhiễm thấp nhất chiếm 3,1% Kết quả nghiên cứu của Phạm Thị Lan [12] từ 01/01/2009 đến 31/12/2011, tỷ lệ bệnh lang ben của người dân đến khám tại đây là 1,04%, có xu hướng tăng dần và đạt đỉnh vào tháng 9 trong đó số bệnh nhân dưới 15 tuổi có tỷ lệ nhiễm thấp

Tại cộng đồng, kết quả nghiên cứu của Nguyễn Duy Hưng [11] năm

2009 tại tỉnh Kiên Giang cho biết tỷ lệ bệnh lang ben trong cộng đồng người dân tại tỉnh này rất thấp 0,6% Lê Trần Anh nghiên cứu năm 2000 đã công bố

tỷ lệ bệnh lang ben trong 2 đơn vị bộ đội là 1,6% [1] Năm 2002, Nguyễn Quý Thái nghiên cứu trên đối tượng có nguy cơ cao là công nhân mỏ than Làng

Cẩm - Thái Nguyên [19], tỷ lệ bệnh lang ben 5,28% nhưng đến năm 2004 [20] tại 4 mỏ than ở Thái Nguyên, tỷ lệ nhiễm nấm lang ben từ 6,5% đến 7,4% tùy thuộc theo mùa Theo nghiên cứu của Nguyễn Đinh Nga năm 2005

tại Trường Đại học Y Dược thành phố Hồ Chí Minh, tỷ lệ bệnh lang ben của

lứa tuổi 17 - 19 là 20,87% [16]

Tỷ lệ bệnh tăng cao vào các tháng mùa thu Theo Phạm Thị Lan, bệnh lang ben có tỷ lệ mắc không cao nhưng có xu hướng tăng dần từ mùa xuân

đến mùa thu, đạt đỉnh vào tháng 9 [12] Tại Viện Da liễu Trung Ương, Triệu Tân Phong cũng cho kết quả tương tự với tỷ lệ bệnh nhân đến khám cao nhất vào tháng 8 (16,8%) [18] và Nguyễn Văn Hoàn cũng thông báo tỷ lệ bệnh cao

nhất vào các tháng mùa thu (42,2%) [10]

Phân bố bệnh có xu hướng cân bằng nhau ở nam và nữ [18]

1.5.2 Thành ph ần loài nấm Malassezia spp gây bệnh lang ben

Hiện nay, 14 loài Malassezia spp đã xác định được trong đó có 3 loài gây lang ben thường gặp là M furfur (gây bệnh ở khu vực nhiệt đới), M

globosa (gây b ệnh ở khu vực ôn đới) và M sympodialis Tùy theo phương

pháp lấy mẫu, đối tượng nghiên cứu, khu vực địa lý khí hậu mà thành phần loài nấm Malassezia spp gây lang ben khác nhau Thậm chí ở cùng một khu

vực địa lý khí hậu nhưng các nghiên cứu khác nhau, sử dụng các kỹ thuật xác định loài khác nhau cũng cho thành phần loài khác nhau

Một số nghiên cứu cho rằng M globosa là loài chiếm ưu thế trong bệnh

lang ben Các nghiên cứu này được tiến hành ở châu Âu và một số nước châu

Á có khí hậu ôn đới

Một nghiên cứu ở Hy Lạp (Đông Nam Âu) [46], bệnh nhân có thể đơn nhiễm M globosa hoặc kết hợp với các loài Malassezia spp khác ở 12,7%

Gaitanis và cộng sự [45] chỉ phát hiện được M globosa từ tổn thương lang

ben

M globosa và M restricta đã được phát hiện ở hầu hết các bệnh nhân lang ben bằng phương pháp nested - PCR với các mồi đặc hiệu cho từng loài trong một nghiên cứu của Nhật Bản [80] Theo nghiên cứu của Zhen Xie [122] năm 2014 tại Trung Quốc là một nước có khí hậu ôn đới gió mùa, bằng

kỹ thuật realtime - PCR đã xác định được 10 loài Malassezia spp khác nhau trong đó cao nhất là M globosa (95,8%), M restricta (91,7%), M

sympodialis (50,0%) M ột số nghiên cứu khác tại Ấn Độ lại cho thấy M

globosa là loài ưu thế: Sidbartha Dutta [42] M globosa chiếm tỷ lệ 54,4%,

tiếp theo là M furfur chiếm tỷ lệ 29,6%; Kaur M [65] năm 2013 M globosa