Tuy nhiên, lĩnh vực này vẫn còn biểu hiện nhiều hạn chế: nguồn tế bào gốc còn hạn chế, các nghiên cứu áp dụng tế bào gốc biệt hóa thành các dòng tế bào áp dụng điều trị còn chưa đạt hiệu
T Ổ NG QUAN
Đặc điể m c ấ u trúc màng ố i
Màng ối được hình thành từ lá phôi ngoài, có nguồn gốc từ khối nội bào Ở loài người, vào ngày thứ 8 sau thụ tinh, một khoang nhỏ xuất hiện ở cực phôi và dần lớn lên, tạo thành khoang ối Các tế bào phủ trần khoang này sẽ hình thành nên màng ối.
Hình 1.1 Sơ đồ rau thai và màng ối
1 Cuống rốn, 2: Đĩa đệm, 3: Màng ối, 4: Vùng ranh giới giữa rau thai và màng bào thai, 5: Màng đệm
Ngu ồ n: theo Kurt Benirschke và CS [21]
Khoang ối là một không gian nhỏ ở mặt lưng phôi, phát triển thành một khoang lớn chứa toàn bộ phôi vào cuối tháng thứ nhất Trong khoang ối, phôi được bao bọc trong nước ối, trong khi màng ối được cấu tạo từ hai lớp mô khác nhau: lớp biểu mô từ ngoại bì và lớp trung mô từ lá thành trung bì ngoài phôi Khi phôi lớn lên, khoang ối mở rộng, nước ối được sản xuất nhiều hơn, và màng ối giãn ra gần sát màng đệm Cuối cùng, phần lá thành trung bì ngoài phôi kết hợp với màng đệm, khiến khoang ngoài phôi ngày càng hẹp lại và cuối cùng biến mất.
Theo tác giả Đỗ Kính, khi phôi nang bắt đầu làm tổ trong nội mạc tử cung, nó được cấu thành từ hai dòng tế bào: đại phôi bào và tiểu phôi bào Đại phôi bào sẽ phát triển thành phôi chính thức và các bộ phận phụ như biểu mô màng ối, biểu mô túi noãn hoàng và niệu nang.
Màng ối bao gồm ba lớp chính: lớp biểu mô đơn, màng đáy dày và lớp vô mạch Nó không chứa thần kinh, mạch máu hay bạch huyết, nằm gần khoang ối và các tế bào lá nuôi, có thể dễ dàng tách ra khỏi màng đệm bên dưới Màng ối được cung cấp dinh dưỡng và oxy từ dịch ối xung quanh và mạch máu của thai.
Phân tích về mặt mô học, màng ối gồm hai lớp biểu mô đơn và trung mô
Lớp biểu mô đơn là một lớp tế bào hình trụ, với một phần tự do và một phần tiếp xúc với màng đáy Dưới màng đáy là lớp trung mô màng ối, bao gồm các mô liên kết được hình thành từ các tế bào giống nguyên bào sợi.
Hình 1.2 Sơ đồ cấu trúc màng ối
Ngu ồ n theo Parry và CS [23]
Màng ối ở vùng rìa cách cuống rốn khoảng 10 cm được bao phủ bởi lớp biểu mô vuông đơn, chứa ít tế bào gốc nhưng rất hiệu quả cho việc sản xuất tấm màng ối đông khô trong điều trị Màng ối từ khu vực này có độ đàn hồi cao.
1.1.3 Chức năng của màng ối
Màng ối đóng vai trò quan trọng trong sự phát triển của thai nhi và quá trình chuyển dạ, với prostaglandin là yếu tố cốt yếu trong việc khởi đầu và duy trì co thắt tử cung Biểu mô màng ối không chỉ cung cấp prostaglandin, đặc biệt là prostaglandin E2, mà còn sản xuất các enzym sinh tổng hợp prostaglandin như phospholipase, prostaglandin synthase và cyclooxygenase Các enzym này được điều hòa bởi human chorionic gonadotropin (hCG), và thụ cảm thể của chúng cũng có mặt trong màng biểu mô màng ối Trong suốt thai kỳ, biểu mô màng ối hoạt động với mức độ chuyển hóa cao và có chức năng điều hòa pH của dịch ối, giữ cho pH ở mức ổn định khoảng 7,1.
Laminin là thành phần chính của màng đáy tế bào gốc màng ối, đóng vai trò quan trọng trong quá trình biệt hóa tế bào, duy trì hình dạng và hoạt động của tế bào, cũng như cấu trúc mô Nó thúc đẩy sự tồn tại của các mô thông qua các thụ cảm thể như integrin và dystroglycan Việc xác định đặc điểm các chuỗi dưới đơn vị của laminin ở màng ối người là rất cần thiết Laminin có nhiều đồng dạng khác nhau với các chuỗi α-, β-, và γ-, mỗi chuỗi lại có nhiều dạng chuỗi dưới đơn vị: α1–5, β1–3, γ1–3 Laminin được sản xuất và bài tiết từ biểu mô trên màng đáy, do đó, biểu hiện gen của các chuỗi dưới đơn vị laminin trong các tế bào biểu mô màng ối (HAE) được phát hiện thông qua phản ứng RT-PCR.
T ế bào g ố c màng ố i
1.2.1 Một số khái niệm tế bào gốc
Tế bào gốc (TBG) là các tế bào chưa có chức năng chuyên biệt, có khả năng phát triển thành nhiều loại tế bào khác nhau và có khả năng tự thay mới Chúng là các tế bào chưa biệt hóa hoặc đang ở những giai đoạn khác nhau trong quá trình biệt hóa, bao gồm tế bào vạn tiềm năng, tế bào đa tiềm năng, tế bào ít tiềm năng và tế bào đơn tiềm năng, cho phép chúng có thể phát triển theo nhiều hướng khác nhau.
Hình 1.3 Một số tế bào gốc Nguồn: Phan Kim Ngọc và CS[26]
+ T ế bào g ố c phôi (embryonic stem cells - ESCs) và t ế bào m ầ m phôi (embryonic germ cells)
Tế bào gốc phôi là các tế bào gốc vạn năng được lấy từphôi giai đoạn sớm
Trong giai đoạn từ 4 đến 7 ngày tuổi, phôi phát triển thành hình cầu và được gọi là phôi túi (blastocyst) Blastocyst chứa khoảng 30 tế bào vạn năng tập trung ở một cực, được gọi là khối tế bào bên trong (inner cell mass) Việc sử dụng enzyme đặc biệt để phân tách các tế bào trong khối này sẽ thu được các tế bào gốc phôi.
Tế bào mầm phôi là các tế bào nguyên thủy có tính vạn năng, đóng vai trò quan trọng trong việc hình thành giao tử (trứng và tinh trùng) ở người trưởng thành Những tế bào này được phân lập từ phôi 5-9 tuần tuổi hoặc từ thai nhi So với tế bào gốc phôi, tế bào mầm phôi khó duy trì lâu dài trong nuôi cấy nhân tạo do chúng ở giai đoạn biệt hóa cao hơn.
+ T ế bào g ố c thai (foetal stem cells)
Tế bào gốc thai là các tế bào vạn năng hoặc đa năng được tách ra từ tổ chức thai sau nạo phá thai Chúng thường được coi là tế bào gốc trưởng thành ở giai đoạn biệt hóa thấp Nghiên cứu và ứng dụng các tế bào này gặp phải nhiều vấn đề về đạo đức, do đó thường chỉ được sử dụng để tìm hiểu quá trình phát triển phôi thai.
+ T ế bào g ốc nhũ nhi (infant stem cell)
Tế bào gốc nhũ nhi được lấy từ trẻ sơ sinh hoặc các phần phụ của thai như dây rốn, nhau thai, màng ối và dịch ối, thường có tính đa tiềm năng hoặc vạn tiềm năng Phương pháp thu thập tế bào có thể ảnh hưởng đến đối tượng cho tế bào Việc chọc dịch ối hoặc chọc tĩnh mạch dây rốn trước sinh để lấy tế bào gốc có thể gây ra các rủi ro như nhiễm trùng, chảy máu, sẩy thai hoặc đẻ non Ngược lại, việc lấy máu dây rốn từ dây rốn hoặc nhau thai sau khi sinh không ảnh hưởng đến sức khỏe của em bé, vì tế bào này có thành phần giống hệt máu tĩnh mạch của trẻ sơ sinh và là sản phẩm bỏ đi sau khi sinh.
+ T ế bào g ố c trưở ng thành (adult stem cells / somatic stem cells)
Tế bào gốc thân, hay còn gọi là tế bào gốc trưởng thành, là các tế bào chưa biệt hóa, tồn tại với số lượng ít trong các mô của người trưởng thành như máu ngoại vi, mô não, mô da và mô cơ Ngoài ra, tế bào gốc cũng có thể được tìm thấy ở trẻ em và thai nhi, và có thể được tách chiết từ máu cuống rốn Vai trò chính của các tế bào gốc trưởng thành trong cơ thể là duy trì và sửa chữa các tổ chức nơi chúng được phát hiện.
Các tế bào gốc trưởng thành thường được coi là đa năng, có khả năng phát triển thành các nhóm tế bào liên quan trong cùng một tổ chức Chẳng hạn, tế bào gốc tạo máu có thể hình thành tất cả các loại tế bào máu như hồng cầu, bạch cầu và tiểu cầu Gần đây, các nghiên cứu cho thấy một số tế bào gốc trưởng thành có thể có tính vạn năng hoặc ít nhất là khả năng biệt hóa thành nhiều loại tế bào khác nhau, thể hiện tính mềm dẻo (plasticity).
Tế bào giống tế bào gốc phôi (embryonic-like stem cell) hay tế bào gốc vạn tiềm năng cảm ứng (induced pluripotent stem cell - iPS) được tạo ra bằng cách cảm ứng các tế bào đã biệt hoá của cơ thể trở lại trạng thái giống như tế bào gốc phôi, còn được gọi là tế bào gốc nhân tạo Kỹ thuật này chủ yếu được thực hiện trong phòng thí nghiệm, và người cho tế bào để cảm ứng, chẳng hạn như tế bào da, chỉ bị ảnh hưởng rất ít, thường chỉ cần sinh thiết để lấy một miếng da nhỏ.
Tế bào gốc ung thư, được phân lập từ các khối u, được xem là nguồn gốc của khối u Trong chiến lược trị liệu miễn dịch chống ung thư, tế bào này đang được nghiên cứu để phát triển vaccine nhằm điều trị ung thư "tận gốc" Vaccine được chế tạo từ tế bào gốc ung thư của chính bệnh nhân hoặc từ khối u cùng loại của bệnh nhân khác, nhằm kích thích hệ thống miễn dịch của bệnh nhân chống lại các thành phần của khối u.
1.2.2 Các đặc điểm màng ối liên quan công nghệ tế bào gốc
1.2.2.1 Tính v ạ n ti ềm năng (pluripotent)
Trong nghiên cứu về biệt hóa tế bào gốc, câu hỏi liệu các tế bào gốc màng ối có thuộc tính vạn tiềm năng hay không đang được quan tâm Khối nội bào của túi phôi phát triển thành cả ngoại phôi bì và nội phôi bì, trong đó ngoại bì phôi hình thành thai nhi và nội bì phôi tạo ra túi noãn hoàng Lớp biểu mô màng ối xuất hiện vào ngày thứ 8 sau khi thụ tinh, trong khi các tế bào trung mô được hình thành từ lá trung mô ngoài phôi Ngoại bì phôi có khả năng tạo ra tất cả các lớp mầm của phôi, và lớp biểu mô màng ối được hình thành trước phôi vị Đặc biệt, các tế bào ung thư phôi vạn tiềm năng chỉ xuất hiện trước khi có phôi vị, cho thấy tầm quan trọng của giai đoạn này trong quá trình biệt hóa tế bào Do đó, tính mềm dẻo của các tế bào trong tiền phôi vị có thể cũng tồn tại ở các tế bào lớp biểu mô màng ối.
Nhiều báo cáo đã chỉ ra rằng cả lớp tế bào biểu mô và trung mô của màng ối đều thể hiện một số marker tế bào gốc như OCT-4, nanog, GATA-4, HNF-3β và nestin Đặc biệt, OCT-4 là marker đặc trưng cho tế bào gốc phôi và tế bào mầm, cho thấy sự liên quan của các tế bào này trong nghiên cứu tế bào gốc.
Bốn dấu hiệu (maker) được sử dụng để xác định phôi và các tạng nội bì phôi, trong đó HNF-3β là dấu hiệu đặc trưng cho nội bì phôi, còn nestin là một loại protein trung gian biểu hiện đặc trưng cho các tế bào gốc thần kinh Những vấn đề này cho thấy rằng cả tế bào của các lớp biểu mô và trung mô màng ối đều có đặc tính vạn tiềm năng.
1.2.2.2 Tính ch ố ng viêm và sinh mi ễ n d ị ch th ấ p
Màng ối và tế bào gốc từ màng ối được coi là mô và tế bào lý tưởng cho ghép tự thân nhờ vào tính kháng viêm và khả năng sinh miễn dịch thấp Nhiều nghiên cứu đã cung cấp bằng chứng xác thực cho quan điểm này.
Nghiên cứu của Hao và cộng sự cho thấy rằng tế bào biểu mô và trung mô màng ối có khả năng kháng viêm nhờ vào việc biểu hiện các protein như thụ thể đối kháng interleukin-1 (IL-1), yếu tố ức chế mô TIMPs-1,-2,-3,-4 và IL-10 Khối chất nền màng ối ức chế quá trình tổng hợp polysaccharide của IL-1α và IL-1β ở tế bào rìa biểu mô giác mạc khi ghép Ngoài ra, lớp nền màng ối còn ức chế tổng hợp DNA và sự biệt hóa của nguyên bào sợi cơ thông qua việc ức chế tín hiệu TGF-β Những hoạt động này không chỉ giải thích khả năng chống sẹo hóa của màng ối trong cấy ghép mà còn lý giải sự liền vết thương của thai nhi mà không để lại sẹo.
Các tế bào biểu mô màng ối biểu hiện mRNA của các yếu tố như TNF-α, Fas ligand, TRAIL, TGF-β và MIF Dịch chiết từ các tế bào này có khả năng ức chế hoạt hóa bạch cầu đa nhân trung tính và đại thực bào, làm giảm sản xuất MIP-2, giảm sự sinh sản của tế bào T và B, và tăng quá trình apoptosis của chúng Ngoài ra, dịch chiết cũng ngăn chặn quá trình tân tạo mạch và chuyển đổi MHC class II ở các tế bào APCs trong vùng giác mạc bị bỏng Màng ối người còn có thuộc tính kháng khuẩn, giúp giảm số lượng vi khuẩn và thúc đẩy quá trình liền vết thương.
M ộ t s ố nghiên c ứ u t ế bào g ố c
1.3.1 Tế bào gốc và bệnh đái tháo đường
Hiện nay, có nhiều phương pháp điều trị tiểu đường như tiêm insulin và uống thuốc hạ đường huyết Những phương pháp này có thể giúp giảm hoặc trì hoãn sự khởi phát và phát triển của bệnh tiểu đường cùng các biến chứng liên quan Tuy nhiên, chúng không giải quyết được nguyên nhân gốc rễ gây suy chức năng của tế bào beta tuyến tụy.
Tế bào β của tụy bị tổn thương là nguyên nhân chính gây ra đái tháo đường type I và góp phần vào sự phát triển của đái tháo đường type II Do đó, việc thay thế tế bào β đóng vai trò quan trọng trong điều trị bệnh đái tháo đường.
1.3.1.1 Nguyên t ắc điề u tr ị đái tháo đườ ng b ằ ng t ế bào g ố c
Phương pháp điều trị tế bào gốc cho bệnh tiểu đường nhằm bảo vệ các tế bào còn lại và bổ sung đầy đủ các tế bào beta Điều này giúp bệnh nhân có thể giảm hoặc ngưng sử dụng insulin và thuốc hạ đường huyết trong một số trường hợp, đồng thời giảm thiểu các biến chứng tiểu đường mạn tính.
Liệu pháp điều trị bệnh tiểu đường cần thay thế và bổ sung các tế bào tiết insulin mới cho bệnh nhân Để đạt được mục tiêu này, có thể áp dụng hai chiến lược chính.
Cấy ghép tế bào gốc là phương pháp thu nhận tế bào gốc có khả năng biệt hoá thành các tế bào tiết insulin để ghép vào bệnh nhân Chiến lược này thường sử dụng tế bào gốc trưởng thành nhằm giảm nguy cơ gây ung thư Khi được đưa vào cơ thể trong điều kiện thích hợp, các tế bào gốc này sẽ biệt hoá thành tế bào cần thiết, trong đó phải có khả năng chuyển thành tế bào tiết insulin.
Ghép tế bào tiết insulin được biệt hoá từ tế bào gốc là một chiến lược quan trọng trong điều trị bệnh tiểu đường Các tế bào gốc được thu nhận từ mô, sau đó được nuôi cấy và biệt hoá thành tế bào tiết insulin in vivo Cuối cùng, những tế bào này sẽ được cấy ghép vào cơ thể người nhận để cải thiện khả năng sản xuất insulin.
Để đạt được mục tiêu điều trị, chúng ta có thể sử dụng ba loại nguồn tế bào gốc khác nhau: 1) tế bào đã biệt hóa, 2) tế bào gốc đa tiềm năng trưởng thành, và 3) tế bào gốc đa năng, bao gồm tế bào gốc phôi và tế bào gốc đa năng cảm ứng.
1.3.1.2 Các nhân t ố ảnh hưởng đế n s ự phát tri ể n c ủ a t ụ y in vivo
Khi nghiên cứu tái tạo tế bào beta, các nhà khoa học nhận thấy rằng khối tế bào beta bình thường có khả năng điều chỉnh để thích ứng với sự thay đổi của môi trường và sinh lý Tế bào beta có thể nhân lên suốt đời, mặc dù với tỷ lệ thấp Quá trình nhân lên này có thể bị ảnh hưởng bởi thai kỳ hoặc các tác nhân kích thích đái tháo đường chuyển hóa như glucose và acid béo tự do, cho thấy rằng sự phát triển của tế bào beta có thể được tác động bằng các phương thức nhân tạo.
Các yếu tố tăng trưởng như activin A và yếu tố tăng trưởng tế bào gan đã được áp dụng để kích thích tái tạo tế bào beta Bên cạnh đó, sự kết hợp của các yếu tố tăng trưởng biểu bì (EGF) và gastrin, cũng như các yếu tố như keratinocyte, betacellulin (BTC), và GLP-1 (glucagon-like peptide-1) hoặc homolog exendin-4, cũng đã được sử dụng để thúc đẩy quá trình này Hơn nữa, các protein tái tạo như protein Reg và INGAP (islet neogenesis gene associated protein) có khả năng kích thích sự gia tăng tế bào beta và đang được xem xét như liệu pháp tiềm năng cho bệnh tiểu đường.
Sự hiểu biết về quá trình biệt hóa thành đảo tuỵ và tuyến tuỵ cung cấp thông tin quan trọng về bệnh tiểu đường Nghiên cứu trên chuột có khiếm khuyết gen pdx-1 cho thấy gen này đóng vai trò thiết yếu trong sự phát triển tuyến tuỵ, khác với vai trò của nó trong giai đoạn muộn khi biệt hóa tế bào phôi thành tế bào bêta Một gen quan trọng khác là Ngn3 (neurogenein-3), được biểu hiện trong tế bào cơ chất, có vai trò trong cơ chế biệt hóa đảo tuỵ Sự biểu hiện tạm thời của Ngn3 được kích thích bởi sự ức chế tín hiệu notch và sự kích thích từ các phân tử thuộc họ TGF-β.
Zhou và CS đã chứng minh rằng sự kết hợp của ba yếu tố phiên mã, Pdx-
Ngn3 và MafA (gen homolog fibrosarcoma musculoaponeurotic A) đã chứng minh khả năng cải thiện đáng kể trong việc kiểm soát tình trạng tăng đường huyết Các yếu tố phiên mã này được áp dụng trong quá trình tái lập chương trình của các tế bào nang chùm trong tụy ngoại tiết thành tế bào beta thông qua adenovirus trung gian Những tế bào beta mới được tạo ra có hình dạng, kích thước và siêu cấu trúc tương tự như tế bào beta tự nhiên.
Tiêm toàn thân Pdx-1 tái tổ hợp cho thấy sự biểu hiện của insulin và các gen liên quan đến chức năng tuyến tụy không chỉ ở tuyến tụy mà còn ở gan Nhiều phương pháp đã được thử nghiệm để biến đổi tế bào gan thành tế bào sản xuất insulin Ghép gen Pdx-1 hoặc gen NeuroD và betacellulin (BTC) vào gan dẫn đến sự biểu hiện các gen insulin và đảo tụy khác trong gan, cải thiện tình trạng tăng đường huyết ở chuột bị tiểu đường Sử dụng các gen Pdx-1/VP16 hoặc Ngn-3 cùng với gen BTC cũng dẫn đến sản xuất insulin ở gan.
1.3.1.3 Ngu ồ n t ế bào g ố c s ử d ụng cho điề u tr ị
Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra khả năng biệt hóa in vitro các tế bào gốc và tiền tế bào thành tế bào sản xuất insulin Tế bào gốc phôi (ES) có khả năng tạo ra số lượng không giới hạn các tế bào này, và lý thuyết cho thấy chúng có thể được nhân lên vô hạn trước khi biệt hóa thành tế bào beta chức năng Để đạt được sự biệt hóa định hướng, có nhiều phương pháp như sử dụng nhân tố môi trường, nhân tố phát triển hòa tan, nguyên liệu chất nền và tương tác tế bào - tế bào Một báo cáo gần đây đã chỉ ra rằng sự biệt hóa từng bước của tế bào ES theo mô hình phát triển tuyến tụy nội tiết có thể tạo ra tế bào beta chức năng Tuy nhiên, năng suất hiện tại vẫn còn thấp và chức năng tiết insulin của các tế bào beta này chưa đạt được như tụy đảo chính thức Do đó, việc tìm kiếm quy trình biệt hóa hiệu quả hơn cho tế bào ES thành tế bào beta chức năng trưởng thành vẫn cần được nghiên cứu thêm.
Tế bào gốc người trưởng thành là nguồn tế bào quan trọng cho liệu pháp tế bào trong các mô hình bệnh tật, không gặp phải các vấn đề đạo đức như tế bào gốc phôi (ES) và cung cấp nguồn tế bào không giới hạn Nhiều nghiên cứu cho thấy tế bào sản xuất insulin có thể được tạo ra từ tế bào gốc trưởng thành hoặc tiền tế bào có trong tủy xương, mô mỡ, gan, ruột, lá lách, tuyến nước bọt, mô tế bào thần kinh và máu cuống rốn.
Tế bào gốc trưởng thành và tiền tế bào của mô gan là nguồn cung cấp tiềm năng cho việc sản xuất tế bào insulin, do gan và tụy có nguồn gốc chung từ các tế bào có tiềm năng kép trong nội bì phôi Các tế bào dương tính với Ngn-3 được phân lập từ tuyến tụy của chuột trưởng thành hoặc từ các tế bào nhân bản vô tính trong quần thể tế bào của đảo tụy hoặc ống tụy cũng có khả năng biệt hóa thành các tế bào beta chức năng.
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨ U
Đối tượ ng nghiên c ứ u
Màng ối của các sản phụ mổđẻ trên 18 tuổi, thai đủ tháng > 37 tuần
Sốlượng mẫu nghiên cứu: 30 màng ối
Hình 2.1 Bánh rau và màng ối thu nhận được từ sản phụ
Chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu 30 mẫu nhuộm HE, 10 mẫu soi kính hiển vi điện tử quét (SEM), 5 mẫu kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM)
Chúng tôi đã tiến hành nuôi cấy, bảo quản và phân lập 10 mẫu tế bào gốc từ màng ối Mục tiêu là biệt hóa các tế bào gốc này thành tế bào giống tế bào beta tụy nội tiết Quá trình này bao gồm việc thu gom và phân lập tế bào gốc từ màng ối để phục vụ cho nghiên cứu.
Phương pháp nghiên cứ u
Nghiên cứu mô tả cắt ngang với phương pháp lấy mẫu thuận tiện theo thời gian, nhằm phân tích các đặc điểm cấu trúc vi thể và siêu vi thể của màng ối thu được từ thai phụ đến viện sinh mổ.
Nghiên cứu thực nghiệm này tập trung vào việc phân lập và nuôi cấy tế bào gốc từ màng ối người, đồng thời đánh giá khả năng biệt hóa của chúng thành tế bào beta tụy nội tiết.
Bánh rau được thu nhận từ Bệnh viện 103 - Học viện Quân y từ các sản phụ mổ đẻ, thai đủ tháng và nước ối bình thường Mẫu được lấy ngay sau khi sản phụ sinh em bé và được bảo quản trong bình chứa PBS có bổ sung kháng sinh Sau đó, mẫu được chuyển về phòng thí nghiệm để xử lý ngay hoặc bảo quản ở 4 độ C không quá 4 giờ.
Bánh rau được đưa vào buồng thao tác và đặt trên khay inox để bóc tách lớp màng ối, cần tránh làm rách nát trong quá trình này Sau đó, lớp màng ối được rửa sạch nhiều lần (4-6 lần) bằng dung dịch đệm PBS đã được hấp khử trùng nhằm loại bỏ máu đông, cho đến khi tạo thành một màng mỏng trong suốt Toàn bộ quy trình thao tác phải đảm bảo vô trùng.
Sử dụng bình bảo quản chứa PBS có bổ sung kháng sinh
Mẫu màng ối được thu nhận, bảo quản và chuyển đến phòng thí nghiệm
Hình 2.2 Chuẩn bị và thu nhận mẫu màng ối
Hình 2.3 Bóc tách màng ối và rửa bằng PBS
Màng ối thu được có độ trong suốt cao, không bị rách nát và đảm bảo vô khuẩn trong quá trình vận chuyển từ bệnh viện về trung tâm nghiên cứu (Hình 2.4).
Hình 2.4 Màng ối thu nhận được phục vụ cho nghiên cứu
2.2.3 Xác định các đặc điểm hình thái vi thể của màng ối bằng tiêu bản nhuộm HE
- Cắt mẫu có kích thước 1 x 1 cm từ màng ối
- Mẫu được cốđịnh trong Glutaraldehyde 2,5%
- Khử nước bằng cồn, khử cồn bằng Xylen
- Đúc trong parafin bằng tay theo khuôn có sẵn
- Cắt bằng máy cắt lạnh độdày 5 μm
Hematein, một sản phẩm được tạo ra từ quá trình oxy hóa hematoxylin, kết hợp với chất gắn màu Al³⁺ có điện tích dương mạnh, giúp nó gắn kết với các axit nucleic, đặc biệt là axit nucleic trong nhân tế bào.
- Eosin Y: thuộc nhóm chất nhuộm mang tính axít nên có khả năng liên kết (nhuộm) với các ba-dơ hay các protein trong bào tương
1 Nhuộm nhân bằng hematoxylin với thời gian từ 5 đến 15 phút (tuỳ vào độ dày lát cắt tiêu bản)
2 Rửa tiêu bản dưới vòi nước chảy cho đến khi tiêu bản màu xanh (từ hồng sang xanh), thời gian rửa khoảng 10 phút dưới vòi nước chảy
3 Kiểm tra tiêu bản, nếu thấy nhân nhuộm đậm thì tiến hành biệt hóa nhân bằng cồn – axit (khảng 3-5giây) Cần lắc tiêu bản, sau đó rửa bằng nước cất
Kiểm tra mức độ biệt hóa; nếu chưa đạt yêu cầu, nhúng mẫu vào dung dịch cồn-axit Nếu màu sắc vẫn nhạt, sau khi rửa bằng nước cất, có thể nhuộm lại bằng Hematoxylin trong khoảng 10-15 phút trước khi thực hiện quá trình biệt hóa lần nữa.
4 Nhúng tiêu bản vào dung dịch lithi carbonat bão hòa cho đến khi tiêu bản có màu xanh, rửa dưới vòi nước chảy 10 phút;
5 Nhuộm bào tương bằng cách nhúng tiêu bản trong dung dịch Eosin 1% với thời gian từ2 đến 4 phút, rửa tiêu bản trong nước cất từ 3 đến 4 phút;
6 Kiểm tra tiêu bản trên kính hiển vi;
Nhúng tiêu bản trong cồn ethanol 90 0 trong khoảng 10 - 15 giây;
Nhúng tiêu bản trong cồn ethanol 100 0 lần 1 trong khoảng 10 - 15 giây;
Nhúng tiêu bản trong cồn ethanol 100 0 lần 2 trong khoảng 10 - 15 giây; Nhúng tiêu bản trong cồn ethanol 100 0 lần 3 trong khoảng 10 - 15 giây;
Nhúng nhanh tiêu bản trong xylen lần 1, khoảng 5 giây;
Nhúng nhanh tiêu bản trong xylen lần 2, khoảng 5 giây;
Nhúng nhanh tiêu bản trong xylen lần 3, khoảng 5 giây;
Kết quả: Nhân bắt màu xanh - đen, bào tương và các bó sợi collagen bắt màu đỏtươi.
Soi trên kính hiển vi Nikon (Nhật Bản), chụp ảnh bằng phần mềm ACT-
1, đo đếm bằng phần mềm tự động Image Pro Plus
2.2.4 Nghiên cứu đặc điểm hình thái siêu vi thể của màng ối bằng kính hiển vi điện tử quét (SEM)
1 Cố định mẫu trong glutaraldehyd 2,5% trong 12 giờ (để qua đêm), ở 40C;
2 Rửa mẫu bằng đệm cacodylat, 2 lần x 10 phút/lần;
3 Cốđịnh bổ sung bằng axit osmic 1% trong 4-6 giờ), ở 40 o C;
4 Rửa lại mẫu bằng đệm cacodylat 0,3M, 2 lần x 10 phút/lần
5 Khử nước các mẫu theo qui trình:
- Cồn ethanol 500, 2 lần x 15 phút/lần;
- Cồn ethanol 700, 2 lần x 15 phút/lần;
- Cồn ethanol 800, 2 lần x 15 phút/lần;
- Cồn ethanol 900, 2 lần x 15 phút/lần;
- Cồn ethanol 950, 2 lần x 15 phút/lần;
- Cồn ethanol 1000, 2 lần x 15 phút/lần
Phương pháp làm khô tại điểm tới hạn là cách tối ưu nhất để bảo tồn bề mặt mẫu, được thực hiện bằng máy làm khô tại điểm tới hạn với các bước chính cụ thể.
- Ngâm các mẫu trong isoamyl acetate;
- Thay thế isoamyl acetate bằng CO2 lỏng;
- Làm bay hơi CO 2 lỏng ở điểm tới hạn
Gắn mẫu trên đế mang mẫu của kính hiển vi điện tử quét bằng băng dính cacbon, hướng bề mặt quan sát lên trên
Máy JFC-1200 và JFC 420T của JEOL - Nhật Bản cho phép mạ phủ mẫu bằng vàng trong thời gian 45 - 60 giây Ngoài ra, có thể mạ phủ mẫu bằng các bon trước khi mạ đồng trên máy JFC 420T.
Mẫu sau khi mạ phủđã sẵn sàng đểsoi trên kính HVĐT quét.
2.2.5 Nghiên cứu đặc điểm hình thái siêu vi thể của màng ối bằng kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM)
Pha mẫu mô thành các mảnh nhỏcó kích thước 1mm x1mm x 1mm
Cốđịnh mẫu trong glutaraldehyde 2,5 % trong 2 giờ;
Rửa mẫu bằng đệm cacodylat 0,3M 2 lần x 10 phút/lần;
Cốđịnh mẫu bằng axit osmic 1% trong đệm cocadylat trong 2 giờ;
Rửa lại mẫu bằng đệm cacodylat 0,3M 2 lần x 10 phút/lần;
Khử nước các mẫu bằng cồn ethanol và sau đó khử cồn ethanol bằng propylen oxide Tiến hành đúc mẫu bằng chất đúc epoxy, sau đó đặt trong tủ ấm ở 35 độ C trong 24 giờ, tiếp theo là 45 độ C trong 24 giờ và cuối cùng là 60 độ C trong 24 giờ.
Cắt tiêu bản siêu mỏng và nhuộm:
Sử dụng lưới đồng loại 200 mắt lưới
Làm sạch lưới là quá trình quan trọng, trong đó lưới được rửa bằng siêu âm trong ethanol và acetone Sau khi rửa, lưới được để ổn định ở đáy cốc nhỏ, sau đó chất lỏng được rót đi Cuối cùng, cốc được lật úp trên giấy lọc và sấy ở nhiệt độ 60 độ C cho đến khi hoàn toàn khô.
Tạo màng đỡ của lưới bằng màng formvar
Cắt tiêu bản siêu mỏng
Gọt tinh là quá trình quan trọng sau khi xác định các vùng block mẫu đúc cần chú ý Cần kiểm tra độ dày của các lát cắt, và nếu cần thiết, có thể tiếp tục gọt thêm block mẫu để loại bỏ những phần không phù hợp.
Quy trình cắt lát siêu mỏng trên máy ultramicrotom cần tuân thủ hướng dẫn của nhà sản xuất Sau khi gọt tinh block, kẹp nó vào giá đỡ và gắn lên thanh đỡ block mẫu Cần thực hiện các điều chỉnh như mức nước, góc lưỡi dao, vị trí mép lưỡi dao và sự tiếp xúc với block mẫu Đặt độ dày cắt ban đầu từ 80 đến 90 nm, sau đó tiến hành cắt những lát đầu tiên và vớt chúng trong khuôn nước Cuối cùng, điều chỉnh độ dày lát cắt giảm dần cho đến khi đạt khoảng 50 nm.
Vớt các lát cắt lên lưới
Nhuộm tiêu bản siêu mỏng và quan sát trên TEM:
1 Đặt giấy lọc vào đáy của đĩa petri và làm ướt bằng một lượng nước cất nhỏ
2 Đặt giấy paraphin lên trên miếng giấy lọc ướt
3 Nhỏ các giọt thuốc nhuộm uranyl acetat lên trên bề mặt giấy paraphin
4 Đặt các lưới đỡ mẫu nổi riêng rẽ trên các giọt thuốc nhuộm sao cho mặt có dính lát cắt hướng xuống dưới và đậy nắp đĩa petri lại, che sáng; để
Hóa ch ấ t và thi ế t b ị máy móc nghiên c ứ u
2.3.1 Môi trường sinh phẩm và hóa chất
Các hóa chất phục vụ nghiên cứu bao gồm:
Glutaraldehyde 2,5%, Cồn 90, Xylen, Parafin, Hematoxylin, Eosin, dung dịch đệm Cacodylat, Acid osmic 1%, Propylen Oxide, chất đúc Epoxy, dung dịch Uranyl acetat, Chì citrat
The article discusses various essential laboratory reagents and solutions, including 0.25% Trypsin-EDTA, 1X PBS (Phosphate Buffered Saline), DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium), and FBS (Fetal Bovine Serum from ATCC, USA) It also highlights the use of antibiotics such as penicillin-streptomycin (from Sigma, USA), along with DMSO (Dimethyl Sulfoxide), ethanol, D-PBS, primers (from Invitrogen, USA), Percoll (from Sigma, USA), glycerol (from Merck), nicotinamide, β-mercaptoethanol, and sodium pyruvate.
The article discusses various reagents and antibodies used in research, including Hoechst 33342 from Invitrogen, monoclonal antibodies for octamer-binding transcription factor (Oct-4), Sox 2, SSEA4, vimentin, and CK18 from Santa Cruz It also mentions fluorescent secondary antibodies such as goat anti-mouse IgG, goat anti-rabbit IgG, and donkey anti-mouse IgG, all sourced from Invitrogen Additionally, the article references RNA extraction kits, cDNA synthesis kits from Quiagen, as well as Taq Polymerase and dNTPs.
2.3.2 Các thiết bị máy móc
- Tủ cấy an toàn sinh học (BioAir, Mỹ)
- Đĩa plastic nuôi cấy 24, 6 giếng, đĩa plastic 10 cm nuôi cấy (Corning)
- Máy ly tâm văng ngang ROTANDA 460R, (Hettich, Đức)
- Máy ly tâm lạnh (Hettich, Đức)
- Tủ cấy ( Hepa-Nuaire, Mỹ),
- Kính hiển vi Nikon (Nhật Bản) kết hợp chụp ảnh bằng phần mềm ACT-
1, đo đếm bằng phần mềm tụđộng Image Pro Plus
- Kính hiển vi điện tử quét (SEM) JSM – 5410LV (JEOL- Nhật Bản)
- Kính hiển vi điện tử truyền qua JEM 1400 kèm bộ chụp ảnh Xray và phần mềm chụp ảnh 3D - kết nối máy tính (JEOL - Nhật Bản)
- Máy bốc bay cồn JFD 100 (JEOL - Nhật Bản)
- Máy mạ phủ mẫu JFC-1200, (JEOL - Nhật Bản)
- Kính hiển vi đảo ngược (Leica,Đức)
- Kính hiển vi huỳnh quang (Carl Zeiss, Đức)
- Máy điện di (BioRad, Mỹ)
- Bể ổn nhiệt (Sellab, Mỹ)
- Hệ thống lọc nước siêu sạch, Ultral clear basic (Đức)
- Cân điện tử Sartorius CP224S (Đức)
- Nồi hấp CL-40LDP (ALP-Nhật Bản)
- Tủ lạnh âm (-20) và 4oC Sanyo (Nhật Bản)
- Bình nitơ lỏng XL 45, IC 50 (Mỹ)
- Lưới đồng loại 200 mắt lưới
Hình 2.6 Kính hiển vi điện tử quét JSM – 5410LV (JEOL- Nhật Bản)
Hình 2.7 Kính hiển vi điện tử truyền qua JEM 1400
(Ảnh chụp kèm bộ chụp ảnh Xray và phần mềm chụp ảnh 3D - kết nối máy tính (JEOL - Nhật Bản)
Kính hiển vi soi ngược Tủ ấm Buồng hotte
Máy ly tâm Pipette Bình nitơ lỏng
Hình 2.8 Một số dụng cụ máy móc phục vụ nghiên cứu
Th ời gian và địa điể m nghiên c ứ u
Nghiên cứu được tiến hành trong thời gian 2010-2015, tại các địa điểm sau:
− Trung tâm nghiên cứu Y Dược học Quân sự - Học viện Quân Y
− Khoa Hóa Sinh - Bệnh viện 103
− Viện 69 - BộTư lệnh Bảo vệ Lăng Chủ tịch Hồ Chí Minh
Phương pháp xử lý s ố li ệ u
Dữ liệu thu thập được đã được xử lý và phân tích bằng phần mềm thống kê y học SPSS 16.1 Trong quá trình phân tích, các chỉ số được sử dụng bao gồm tỷ lệ phần trăm, giá trị trung bình, độ lệch chuẩn và giá trị p.
Đạo đức trong nghiên cứu
Đề tài này nhằm tạo ra nguồn tế bào gốc phục vụ nghiên cứu y sinh học Nhóm nghiên cứu cam kết không sử dụng sản phẩm cho bất kỳ mục đích nào khác Việc phân lập tế bào gốc từ màng ối không gây tranh cãi về đạo đức, do đó sản phẩm của đề tài có giá trị sử dụng theo cam kết.
Cung cấp thông tin cho các sản phụđồng ý hiến màng ối:
• Nội dung, các bước tiến hành nghiên cứu
Quy trình nghiên cứu được thực hiện tại khoa Sản Bệnh viện 103, Học viện Quân Y, trong đó các sản phụ hiến màng ối có chỉ định mổ đẻ Màng ối thu được sau khi mổ đẻ sẽ được sử dụng cho mục đích nghiên cứu.
• Đảm bảo bí mật riêng tư của các cá nhân sản phụ hiến màng ối
Thực hiện theo quy định về đạo đức y học, đề tài nghiên cứu khoa học cấp Nhà nước mang tên “Hợp tác nghiên cứu quy trình sản xuất một số chế phẩm sinh học từ tế bào gốc màng ối” do Học viện Quân y chủ trì.