Nghiên cứu tình hình nhiễm streptococcus nhóm b âm đạo trực tràng và sự đề kháng kháng sinh của vi khuẩn ở phụ nữ mang thai 35 37 tuần tại bệnh viện quốc tế phương châu năm 2021 2022

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC CẦN THƠ NGUYỄN VĂN CHỨC NGHIÊN CỨU TÌNH HÌNH NHIỄM STREPTOCOCCUS NHÓM B ÂM ĐẠO-TRỰC TRÀNG VÀ SỰ ĐỀ KHÁNG KHÁNG SINH CỦA VI KHUẨN Ở PHỤ NỮ MANG THAI 35-37 TUẦN

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC CẦN THƠ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC CẦN THƠ

NGUYỄN VĂN CHỨC

NGHIÊN CỨU

TÌNH HÌNH NHIỄM STREPTOCOCCUS NHÓM B

ÂM ĐẠO-TRỰC TRÀNG VÀ SỰ ĐỀ KHÁNG KHÁNG SINH CỦA VI KHUẨN Ở PHỤ NỮ MANG THAI 35-37 TUẦN TẠI BỆNH VIỆN QUỐC TẾ PHƯƠNG CHÂU

NĂM 2021-2022

Chuyên ngành: Kỹ thuật xét nghiệm y học

Mã số: 8720601

LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT XÉT NGHIỆM Y HỌC

Người hướng dẫn khoa học: TS.BS Nguyễn Thị Hải Yến

Cần Thơ – 2022

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các kết quả nghiên cứu được trình bày trong luận văn là trung thực, khách quan và chưa từng được công bố ở bất kỳ nơi nào

Tác giả luận văn

Nguyễn Văn Chức

LỜI CẢM ƠN

Trong cuộc sống chúng ta không có sự thành công nào mà không có sự

hỗ trợ và giúp đỡ dù đó là việc lớn hay việc nhỏ, dù giúp ít hay giúp nhiều, gián tiếp hay trực tiếp của người khác Trong quá trình học tập và bắt đầu thực hiện luận văn cho đến nay, tôi đã nhận được rất nhiều sự quan tâm, giúp đỡ của quý Thầy Cô, cơ quan, gia đình và bạn bè

Với lòng biết ơn chân thành nhất, tôi xin gửi đến quý Thầy, Cô Trường Đại học Y Dược Cần Thơ đã truyền đạt vốn kiến thức quý báu cho tôi trong suốt thời gian học tập tại trường Đặc biệt là gửi lòng biết ơn sâu sắc đến Cô Nguyễn Thị Hải Yến, luôn tận tâm hướng dẫn, theo dõi và hỗ trợ tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn

Xin cảm ơn quý Lãnh đạo Bệnh viện Quốc tế Phương Châu đã giúp đỡ

và tạo mọi điều kiện cho tôi trong quá trình thực hiện luận văn

Xin cảm ơn quý Lãnh đạo Trung tâm Kiểm soát bệnh tật tỉnh Hậu Giang

đã tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập

Xin cảm ơn gia đình và bạn bè đã dành tình cảm, động viên tôi trong suốt thời gian học tập

Tác giả luận văn

Nguyễn Văn Chức

MỤC LỤC

Trang Lời cam đoan

Lời cảm ơn

Danh mục các chữ viết tắt

Danh mục các bảng

Danh mục các sơ đồ, hình

MỞ ĐẦU……….……….…….…………1

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU…… ……….….…………3

1.1 Tổng quan về Streptococcus nhóm B……….……….3

1.2 Các phương pháp xét nghiệm chẩn đoán nhiễm Streptococcus nhóm B…6 1.3 Sự đề kháng kháng sinh của Streptococcus nhóm B………….………….10

1.4 Các nghiên cứu trong và ngoài nước……….………17

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU………20

2.1 Đối tượng nghiên cứu………20

2.2 Phương pháp nghiên cứu……… 20

2.3 Đạo đức trong nghiên cứu……….33

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU……….35

3.1 Đặc điểm của mẫu nghiên cứu……… 35

3.2 Tỉ lệ nhiễm Streptococcus nhóm B ở phụ nữ mang thai 35-37 tuần…… 41

3.3 Tỉ lệ đề kháng kháng sinh của Streptococcus nhóm B……… 48

Chương 4 BÀN LUẬN……… 53

4.1 Đặc điểm của mẫu nghiên cứu……… 53

4.2 Tỉ lệ nhiễm Streptococcus nhóm B ở phụ nữ mang thai 35-37 tuần…… 57

4.3 Tỉ lệ đề kháng kháng sinh Streptococcus nhóm B phân lập được………64

KẾT LUẬN……….70

KIẾN NGHỊ……….71

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC 1: PHIẾU THU THẬP THÔNG TIN

PHỤ LỤC 2: DANH SÁCH THAI PHỤ THAM GIA NGHIÊN CỨU

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Chữ

viết tắt Thuật ngữ tiếng Anh Thuật ngữ tiếng Việt

BHI Brain Heart Infusion broth Canh thang não - tim

CAMP

test Christie - Atkins – Munch - Peterse test Thử nghiệm CAMP

CDC Centers for Disease control and

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang

Bảng 2.1: Tiêu chuẩn xác định đề kháng kháng sinh………32

Bảng 3.1: Tỉ lệ nhiễm Streptococcus nhóm B theo độ tuổi……… 42

Bảng 3.2: Tỉ lệ nhiễm Streptococcus nhóm B theo nơi cư trú……… 42

Bảng 3.3: Tỉ lệ nhiễm Streptococcus nhóm B theo dân tộc……… 43

Bảng 3.4: Tỉ lệ nhiễm Streptococcus nhóm B theo nghề nghiệp……….43

Bảng 3.5: Tỉ lệ nhiễm Streptococcus nhóm B theo trình độ học vấn…………44

Bảng 3.6: Tỉ lệ nhiễm Streptococcus nhóm B theo tuổi thai………44

Bảng 3.7: Tỉ lệ nhiễm Streptococcus nhóm B theo số lần sinh con………….45

Bảng 3.8: Tỉ lệ nhiễm Streptococcus nhóm B theo tiền sử nạo hút thai………45

Bảng 3.9: Tỉ lệ nhiễm Streptococcus nhóm B theo kỹ năng thực hành………46

Bảng 3.10: Tỉ lệ nhiễm Streptococcus nhóm B theo kiến thức hiểu biết…….46

Bảng 3.11: Tỉ lệ nhiễm Streptococcus nhóm B theo thói quen vệ sinh………47

Bảng 3.12: Tỉ lệ nhiễm Streptococcus nhóm B theo tiền sử nhiễm………… 47

Bảng 3.13: Tỉ lệ nhiễm Streptococcus nhóm B theo biểu hiện viêm…………48

Bảng 3.14: Tỉ lệ đề kháng kháng sinh cùng lúc nhiều loại kháng sinh……… 49

Bảng 3.15: Tỉ lệ đề kháng kháng sinh theo nơi cư trú……….………49

Bảng 3.16: Tỉ lệ đề kháng kháng sinh theo tiền sử nhiễm….…… …………50

Bảng 3.17: Mối liên quan tỉ lệ đề kháng nhiều loại kháng sinh với nơi cư trú……….………51

Bảng 3.18: Mối liên quan tỉ lệ đề kháng nhiều loại kháng sinh với tiền sử nhiễm……….……… 51

DANH MỤC BIỂU ĐỒ

Trang

Biểu đồ 3.1: Đặc điểm về nhóm tuổi của phụ nữ mang thai………35

Biểu đồ 3.2: Đặc điểm về dân tộc của phụ nữ mang thai……….35

Biểu đồ 3.3: Đặc điểm về nơi cư trú của phụ nữ mang thai……… 36

Biểu đồ 3.4: Đặc điểm về nghề nghiệp của phụ nữ mang thai.……… 36

Biểu đồ 3.5: Đặc điểm về trình độ học vấn của phụ nữ mang thai.………37

Biểu đồ 3.6: Đặc điểm về tuổi thai của phụ nữ mang thai……….37

Biểu đồ 3.7: Đặc điểm về số lần sinh con của phụ nữ mang thai.……… 38

Biểu đồ 3.8: Đặc điểm về tiền sử nạo hút thai của phụ nữ mang thai.…………38

Biểu đồ 3.9: Đặc điểm về kỹ năng thực hành của phụ nữ mang thai ……….39

Biểu đồ 3.10: Đặc điểm về kiến thức hiểu biết của phụ nữ mang thai.……… 39

Biểu đồ 3.11: Đặc điểm về các thói quen vệ sinh của phụ nữ mang thai………40

Biểu đồ 3.12: Đặc điểm về tiền sử nhiễm Streptococcus nhóm B của phụ nữ mang thai……….40

Biểu đồ 3.13: Đặc điểm về biểu hiện triệu chứng viêm của phụ nữ mang thai……….……… 41

Biểu đồ 3.14: Tỉ lệ nhiễm Streptococcus nhóm B chung……….41

Biểu đồ 3.15: Tỉ lệ đề kháng kháng sinh chung………48

DANH MỤC SƠ ĐỒ, HÌNH VẼ

Trang

Sơ đồ 1: Sơ đồ nghiên cứu……….……… 34

Hình 1.1: Máy VITEK2 thực hiện định danh và kháng sinh đồ tự động…… 14

Hình 1.2: Kỹ thực thực hiện kháng sinh đồ phương pháp đĩa giấy………… 15

Hình 1.3: Thực hiện đo vòng vô khuẩn kháng sinh đồ phương pháp đĩa giấy 16

Hình 1.4: Kháng sinh đồ phương pháp ETEST……….……….……… 17

Hình 2.1: Kết quả nuôi cấy mẫu 13……… ………25

Hình 2.2: Kết quả thử nghiệm CAMP mẫu 31 ……….….… ……… 28

Hình 2.3: Kết quả kháng sinh đồ mẫu 31………… ………31

MỞ ĐẦU

Ở người có rất nhiều loại vi khuẩn thường trú trên cơ thể, trong số đó

không thể không kể đến Streptocoocus nhóm B Streptocoocus nhóm B thường

cư trú tại đường tiêu hóa và đường sinh dục của phụ nữ, phần lớn không biểu hiện triệu chứng bên ngoài và không ảnh hưởng đến sức khỏe Một số trường hợp, vi khuẩn có thể gây viêm đường tiết niệu hoặc viêm tử cung [22] Tuy

nhiên ảnh hưởng lớn nhất của Streptococcus nhóm B ở phụ nữ mang thai là vào

thời kỳ cuối của thai kỳ có thể lây truyền vi khuẩn sang cho con [6]

Sự lây truyền từ mẹ sang con có thể xảy ra vào thời điểm chuyển dạ hoặc

vỡ ối Có tới 30-40% các trường hợp nhiễm trùng chu sinh do vi khuẩn là do

Streptococcus nhóm B [15] Đối với thai phụ Streptococcus nhóm B có thể gây

ra tình trạng nhiễm khuẩn tiết niệu, vỡ ối sớm, viêm niêm mạc tử cung sau sinh Đối với trẻ sơ sinh có thể gây ra nhiễm khuẩn sơ sinh, nhiễm khuẩn huyết Mặc

dù được chăm sóc trong điều kiện tốt nhất nhưng dẫn có khoảng 10% trẻ sơ

sinh được chẩn đoán nhiễm Streptococcus nhóm B khởi phát nhiễm khuẩn sớm [13] Theo Lancefield, Streptococcus nhóm B là nguyên nhân gây ra hầu hết

các bệnh nhiễm khuẩn huyết và viêm màng não ở trẻ sơ sinh, là nguyên nhân gây sốt gần thời gian sinh nở ở phụ nữ mang thai và gây vỡ ối sớm, đẻ non [16]

Năm 1996, Trung tâm kiểm soát và phòng ngừa bệnh tật Hoa Kỳ (Centers for Disease control and Prevention - CDC) khuyến cáo về chiến lược

điều trị dự phòng Streptococcus nhóm B dựa vào các yếu tố nguy cơ của các

thai phụ [28] Từ năm 2002, những trường hợp điều trị dự phòng được dựa vào tầm soát nuôi cấy, thường thực hiện ở tuổi thai 35-37 tuần [27]

Ở Việt Nam, hàng năm tỉ lệ tử vong sơ sinh do nhiều nguyên nhân, trong

đó có nhiễm khuẩn sơ sinh do Streptococcus nhóm B [4] Đã có một số nghiên cứu về nhiễm Streptococcus nhóm B ở phụ nữ mang thai và hầu hết các nghiên

cứu tập trung xác định tỉ lệ mắc bệnh là chính, chưa đi sâu vào phân tích yếu tố

liên quan và sự đề kháng kháng sinh của vi khuẩn trong giai đoạn hiện nay Nghiên cứu tại Bệnh viện Sản Nhi Nghệ An 2018-2019, cho thấy tỉ lệ nhiễm chung là 36,3% [5] Một nghiên cứu tại Bệnh viện Đa khoa Khu vực Nam Bình Thuận 2015-2016, tỉ lệ nhiễm chung là 17,8 % [16] Để thực hiện khuyến cáo của WHO và CDC Hoa Kỳ, chiến lược xét nghiệm tầm soát, xác định tỉ lệ đề kháng kháng sinh và áp dụng tỉ lệ đề kháng kháng sinh, lựa chọn kháng sinh

giúp công tác điều trị dự phòng nhiễm Streptococcus nhóm B ở phụ nữ mang

thai là cần thiết [2] Vì vậy chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu tình hình

nhiễm Streptoccocus nhóm B âm đạo-trực tràng và sự đề kháng kháng sinh

của vi khuẩn ở phụ nữ mang thai 35-37 tuần tại Bệnh viện Quốc tế Phương Châu năm 2021-2022” nhằm 2 mục tiêu:

1 Xác định tỉ lệ nhiễm Streptococcus nhóm B âm đạo-trực tràng và một

số yếu tố liên quan ở phụ nữ mang thai 35-37 tuần tại Bệnh viện Quốc tế Phương Châu năm 2021-2022

2 Xác định tỉ lệ đề kháng kháng sinh của Streptococcus nhóm B phân

lập được

Chương 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tổng quan về Streptococcus nhóm B

1.1.1 Đặc điểm vi sinh vật học

Group B Streptococcus là vi khuẩn hiếu khí kỵ khí tùy nghi có hình

cầu hay bầu dục, đường kính trung bình 1μm (thường 0,5-1x1-2μm), bắt màu gram dương và không di động, trên tiêu bản nhuộn gram vi khuẩn xếp thành

đôi hoặc chuỗi [22] Cấu trúc bộ gen Streptococcus nhóm B gồm 2.211.485 đôi base và mã hóa cho 2.118 protein Streptococcus nhóm B có 10 serotypes khác nhau (Ia, Ib, II, III, IV, V, VI, VII, VIII, IX) [40] Serotypes gây bệnh trên người

được xác định là type Ia, Ib, II, III, V Serotype gây bệnh ở trẻ sơ sinh, phụ nữ mang thai và người lớn không mang thai thường gặp là type Ia, III và V, trong

đó type III là type gây bệnh chính ở trẻ sơ sinh, chiếm tỉ lệ 79% [7]

Streptococcus nhóm B có men hemolysin làm tan hoàn toàn hồng cầu gây tiêu

huyết β trên môi trường thạch máu Streptococcus nhóm B được phân biệt với các nhóm Streptococcus còn lại dựa vào các tính chất như hình thái khuẩn lạc

xuất hiện sớm 18-24 giờ sau nuôi cấy, hiện tượng tiêu huyết và các phản ứng sinh hóa [23]

Tính chất nuôi cấy: Streptococcus nhóm B là vi khuẩn hiếu khí kỵ khí

tùy nghi, thích hợp ở nhiệt độ 370C với khí trường có 5-10% CO2 Khuẩn lạc

xuất hiện sau 24-48 giờ nuôi cấy Môi trường cấy phân lập Streptococcus nhóm

B gồm môi trường thạch máu, môi trường thạch máu chọn lọc Môi trường thạch máu chọn lọc có chứa các loại kháng sinh (gentamycin và axit nalidixic,

hoặc colistin và axit nalidixic) giúp loại trừ những loại vi khuẩn không phải là

Streptococcus nhóm B, thích hợp cho việc phân lập Streptococcus nhóm B từ

bệnh phẩm lấy từ âm đạo, trực tràng Khuẩn lạc trên môi trường thạch máu trong suốt như những giọt sương xung quanh có vòng tiêu huyết β [22]

Streptococcus nhóm B không có enzym catalase, là enzym xúc tác làm

phân hủy hydrogen peroxide Đặc điểm này được ứng dụng để phân biệt nhóm

Streptococcus và Staphylococcus Ngoài ra Streptococcus nhóm B có lớp vỏ

polysaccharide và các protein bề mặt giúp vi khuẩn bám chặt vào lớp biểu mô

bề mặt của ký chủ, tránh bị tiêu diệt bởi miễn dịch của ký chủ [36]

trong 15 phút [22] Nhiệt độ tối ưu cho vi khuẩn phát triển là 37oC Trong không khí vi khuẩn sống được 1 tháng, trong sữa ở -20oC có thể sống 4 tuần và trong thịt cá đông lạnh ở -70oC có thể sống 9 tháng [12]

1.1.2 Các yếu tố liên quan nhiễm Streptococcus nhóm B

1.1.2.1 Nơi cư trú

Tỷ lệ nhiễm Streptococcus nhóm B của các thai phụ ở các nước đang

phát triển là 17,8% và của Châu Á-Thái Bình Dương là 19% [33] Theo 2 nghiên cứu của tác giả Đỗ Khoa Nam [12], Nguyễn Thị Vĩnh Thành tại Bệnh

viện Từ Dũ cho rằng có mối liên hệ giữa tỉ lệ nhiễm Streptococcus nhóm B và nơi sinh sống, cụ thể là nhóm thai phụ ở nội thành có tỉ lệ nhiễm Streptococcus

nhóm B cao hơn so với nhóm thai phụ ở ngoại thành Tuy nhiên, theo Mavenyengwa và CS tiến hành nghiên cứu tại Zimbabwe vào năm 2010 cho

thấy những thai phụ ở nông thôn có tỉ lệ nhiễm Streptococcus nhóm B cao hơn

so với những thai phụ sống ở thành thị [44]

1.1.2.2 Tiền sử nạo hút thai

Theo tác giả Lucia Matsiane Lekala nghiên cứu tại Nam Phi cho thấy tỉ

lệ nhiễm Streptococcus nhóm B ở những người chưa có tiền sử nạo thai, sẩy

thai hoặc thai chết lưu cao hơn so với nhóm đã có tiền sử can thiệp vào đường sinh dục [42] Trong nghiên cứu của Trần Quang Hiệp tại Bệnh viện Bạch Mai cũng cho thấy có sự khác biệt giữa những thai phụ chưa có tiền sử nạo hút thai lần nào với những thai phụ đã từng nạo hút thai [6] Tuy nhiên, nghiên cứu

Jichang Chen tại Trung Quốc lại cho thấy không có sự khác biệt về nhiễm

Streptococcus nhóm B với tiền sử nạo hút thai [37]

1.1.2.3 Kỹ năng thực hành vệ sinh đường sinh dục

Kỹ năng thực hành vệ sinh đường sinh dục: cách thức vệ sinh (rửa từ sau

ra trước hay từ trước ra sau) sẽ ảnh hưởng tới sự lây nhiễm của Streptococcus

nhóm B từ đường tiết niệu hay đường tiêu hóa tới đường sinh dục của phụ

nữ Trong nghiên cứu của Hillier S.L, những thai phụ vệ sinh đường sinh dục

không đúng cách có tỉ lệ nhiễm Streptococcus nhóm B cao gấp 2,1 lần những

thai phụ vệ sinh đường sinh dục đúng cách [34] Tuy nhiên, theo nghiên cứu của Đỗ Khoa Nam không có sự khác biệt giữa kỹ năng thực hành vệ sinh âm

hộ âm đạo với nhiễm Streptococcus nhóm B ở các thai phụ [12]

1.1.2.4 Kiến thức hiểu biết về Streptococcus nhóm B

Hiểu biết về nhiễm Streptococcus nhóm B khi mang thai là một vấn đề

quan trọng để phòng ngừa nhiễm khuẩn sơ sinh, các yếu tố dễ dẫn đến nhiễm

Streptococcus nhóm B cũng như các phương pháp điều trị dự phòng đến nhiễm Streptococcus nhóm B cho sơ sinh từ những thai phụ bị nhiễm

Nghiên cứu của Jichang Chen ở Trung Quốc, tỉ lệ nhiễm Streptococcus

nhóm B cao ở những thai phụ có trình độ đại học, sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê [37] Nghiên cứu của tác giả Javanmanesh F năm 2013 tại Iran trên

1028 thai phụ tác giả kết luận không có mối liên quan giữa trình độ học vấn và

nhiễm Streptococcus nhóm B [35]

Nghiên cứu của tác giả Trần Quang Hiệp tại Bệnh viện Bạch Mai, Hà Nội lại có liên quan khi những thai phụ có trình độ nhận thức cao hơn thì tỉ lệ

nhiễm Streptococcus nhóm B thấp hơn [6]

1.1.2.5 Các thói quen vệ sinh

Nghiên cứu của Đỗ Khoa Nam tại Bệnh viện Từ Dũ về liên quan giữa

một số thói quen vệ sinh hàng ngày với tình trạng nhiễm Streptococcus B, tác

giả thấy: các thói quen kiêng tắm rửa, thụt rửa âm đạo, sử dụng dung dịch vệ

sinh không liên quan đến nhiễm Streptococcus nhóm B ở thai phụ [12] Nghiên

cứu của Trần Quang Hiệp tại Bệnh viện Bạch Mai cũng chưa tìm thấy liên quan giữa thói quen vệ sinh như thụt rửa âm đạo, sử dụng dung dịch vệ sinh với

nhiễm Streptococcus nhóm B [6] Nghiên cứu của Medugu tại Nigieria những thai phụ có thụt rửa âm đạo có tỷ lệ nhiễm Streptococcus nhóm B cao gấp 3,5

lần nhóm thai phụ không thụt rửa [45]

1.1.2.6 Nhiễm Streptococcus nhóm B ở lần mang thai trước

Theo khuyến cáo của CDC Hoa Kỳ, những thai phụ sinh con bị nhiễm

khuẩn do Streptococcus nhóm B ở lần mang thai trước thì sẽ được tiêm kháng

sinh dự phòng mà không cần tham gia sàng lọc ở lần mang thai này Tuy nhiên,

Streptococcus nhóm B tồn tại trong cơ thể chỉ mang tính chất nhất thời [28]

1.2 Các phương pháp xét nghiệm chẩn đoán Streptococcus nhóm B

Ưu điểm: xét nghiệm cho kết quả nhanh, chi phí tương đối thấp

Nhược điểm: độ nhạy không cao, trong trường hợp có ít Streptococcus

nhóm B cho kết quả âm tính giả Vì thế khuyến cáo không nên dùng làm xét nghiệm tầm soát [2]

1.2.2 Xét nghiệm kháng thể

Mẫu bệnh phẩm là huyết thanh hoặc huyết tương

Nguyên lý: kháng thể kháng Streptococcus nhóm B có trong máu của

bệnh nhân sẽ kết hợp với kháng nguyên tái tổ hợp được gắng trên que thử, kháng nguyên này sẽ kết hợp với kháng thể tạo ra ngưng kết và được phát hiện bởi dung dịch tạo màu

Ưu điểm: xét nghiệm cho kết quả nhanh, chi phí cho thấp

Nhươc điểm: không xác định được tình trạng nhiễm hiện tại vì người đã

nhiễm Streptococcus nhóm B trước đó trong cơ thể đã sinh ra kháng thể kháng lại Streptococcus nhóm B Khuyến cáo không nên dùng xét nghiệm kháng thể chẩn đoán nhiễm Streptococcus nhóm B mà chỉ dùng điều tra dịch tễ học [1]

1.2.3 Xét nghiệm PCR (Polymerase Chain Reaction)

Bệnh phẩm là dịch âm đạo, trực tràng

Nguyên lý: dùng enzyme trùng hợp polymerase để nhanh chóng tạo ra một lượng lớn các bản sao từ một đoạn AND (ARN) chọn lọc Xét nghiệm có

độ nhạy và độ đặc hiệu cao, kết quả nhanh và chính xác

Ưu điểm: phương pháp xét nghiệm PCR có độ nhạy 97%, độ đặc hiệu 100%, cho kết quả nhanh trong vòng 30 phút [10],[41]

Nhược điểm: chi phí cao, trang thiết bị đắc tiền nên ít được áp dụng rộng rải Tuy nhiên xét nghiệm PCR là xét nghiệm cho kết quả nhanh và chính xác

có thể dùng để tầm soát nhiễm Streptococcus nhóm B khi phụ nữ mang thai

chuyển dạ trong giai đoạn hiện nay [7],[46]

1.2.4 Nuôi cấy định danh

Theo những khuyến cáo của Trung tâm Kiểm soát và phòng ngừa bệnh tật Hoa Kỳ, Hội Sản phụ khoa Hoa Kỳ, Tổ chức Y tế Thế giới, nuôi cấy bệnh

phẩm là phương pháp tốt nhất để tầm soát Streptococcus nhóm B ở những thai

phụ có tuổi thai 35-37 tuần [27]

1.2.4.1 Cấy phân lập

Bệnh phẩm là dịch âm đạo, trực tràng

Môi trường nuôi cấy: thạch máu cừu

Nguyên lý: làm cạn dần mầm cấy, tách vi khuẩn thành những khúm riêng biệt trên môi trường nuôi cấy

Thực hiện: cấy vạch 3 chiều, hơ đỏ vòng cấy trên ngọn lửa đèn cồn, chờ vòng cấy nguội tiến hành lấy mầm cấy bằng cách nhúng vòng cấy vào bệnh phẩm Cấy đường cấy thứ nhất đặt vòng cấy có vi khuẩn trên mặt thạch máu cừu kéo zic - zac khoảng 1/3 đường kính hộp thạch Đốt đỏ vòng cấy, để nguội, xoay hộp thạch 90°, cấy đường cấy thứ hai bằng cách đặt vòng cấy vào đường cấy thứ nhất kéo zic-zac đến 1/3 đường kính hộp thạch dừng lại Đốt đỏ vòng cấy, để nguội, xoay hộp thạch 90° cấy đường cấy thứ ba đốt vòng cấy vào đường cấy thứ hai nhẹ nhàng kéo zic-zac 1/3 còn lại của hộp thạch Cấy xong, đặt ngược hộp thạch đáy lên trên, nắp ở dưới, cho vào tủ ủ ấm 37°C với khí trường có 5-10% CO2 Khuẩn lạc xuất hiện sau 24-48 giờ nuôi cấy [23]

Kết quả: xuất hiện những khúm khuẩn lạc riêng lẻ, tách rời nhau

1.2.4.2 Nhuộm Gram khuẩn lạc

Bệnh phẩm: là chủng khuẩn lạc sau khi nuôi cấy phân lập

Nguyên lý: dựa trên sự khác nhau về cấu trúc của vách tế bào nên trong quá trình nhuộm gram, vi khuẩn gram dương sẽ giữ được phức hợp tím gentians-iod không bị tẩy màu bởi alcohol, trong vách tế bào vi khuẩn gram âm không giữ được phức hợp màu tím của thuốc nhuộn [24]

Vì thế, kết quả sau khi nhuộm vi khuẩn gram dương vẫn giữ được màu tím của gentians, còn vi khuẩn gram âm bắt màu hồng của fucshin

Thực hiện dàn tiêu bản và cố định tiêu bản: dùng que cấy vô trùng lấy một ít vi khuẩn từ ống môi trường BHI chứa bệnh phẩm âm đạo trực tràng hoà vào 1 giọt nước muối sinh lý ở giữa phiến kính, để khô trong phòng thí nghiệm

Cố định tiêu bản bằng cách hơ nhanh trên ngọn lửa đèn cồn 2-3 lần để gắn chặt vi khuẩn vào phiến kính Việc cố định nhằm 3 mục đích giết chết vi khuẩn, gắn chặt vi khuẩn vào phiến kính, làm phết nhuộm bắt màu tốt hơn vì các tế bào chết bắt màu tốt hơn các tế bào sống [24]

1.2.4.3 Thử nghiệm sinh vật hóa học định danh

- Thử nghiệm Catalase

+ Bệnh phẩm là những khúm vi khuẩn thuần nhất đã được nuôi cấy

+ Nguyên lý: vi khuẩn sinh enzym catalase để thủy phân H2O2 thành H2O

và O2, tạo ra bọt khí Xét nghiệm này được dùng để phân tích đặc điểm ban đầu của hầu hết các vi khuẩn [1]

+ Dung dịch H2O2 3%

+ Thực hiện: khởi động tủ an toàn sinh học ít nhất 15 phút trước khi thực hiện Sắp xếp các dụng cụ cần thiết vào tủ an toàn sinh học, chọn một khuẩn lạc tách biệt rõ, đã được 18-24 giờ, chuyển sang lam kính sạch Nhỏ 1 giọt thuốc thử H2O2 lên lam kính và quan sát trên nền tối ngay lập tức hiện tượng sủi bọt Bỏ lam kính vào thùng chứa vật sắc nhọn

+ Kết quả thử nghiệm: dương tính có hiện tượng sủi bọt Âm tính không

có hiện tượng sủi bọt [1]

- Thử nghiệm định danh CAMP

+ Bệnh phẩm Bệnh phẩm là những khúm vi khuẩn thuần nhất đã được nuôi cấy phân lập.

+ Nguyên lý: Streptococcus nhóm B tạo ra một loại protein chịu nhiệt,

ngoài tế bào, có thể khuếch tán và tác động hiệp đồng với yếu tố tan máu (tiêu

huyết) beta (beta-lysin) do Staphylococcus aureus sản xuất ra để tạo thành một vùng ly giải trong môi trường chứa hồng cầu cừu hoặc bò, Streptococcus nhóm

B có hiện tượng tiêu huyết hiệp đồng với Staphylococcus aureus [22]

Cách tiến hành lấy Staphylococcus aureus có sinh β-hemolysin cấy một

đường giữa hộp thạch máu cừu, sau đó chọn những khuẩn lạc nghi ngờ là

Streptococcus nhóm B cấy những đường vuông góc với đường cấy của Staphylococcus aureus, cách đường cấy của Staphylococcus aureus 1-2mm,

đem ủ ở 37oC với thời gian 24 giờ trong bình nến

Kết quả: nếu thấy tại đầu vạch cấy tiếp cận vạch Staphylococcus aureus

có một vùng tiêu huyết hình mũi tên hướng về đường cấy Staphylococcus

aureus là thử nghiệm CAMP dương tính Âm tính không xuất hiện vùng tiêu

huyết hình mũi tên hướng về đường cấy Staphylococcus aureus [50]

1.3 Sự đề kháng kháng sinh của Streptococcus nhóm B

1.3.1 Các kháng sinh được sử dụng để điều trị nhiễm Streptococcus nhóm

B trên phụ nữ mang thai

Thực hiện khuyến cáo của Trung tâm Kiểm soát và phòng ngừa bệnh tật

Hoa Kỳ, các kháng sinh dùng để điều trị nhiễm Streptococcus nhóm B cho phụ

nữ mang thai được lựa chọn như sau: Ampicillin, Cefazolin, Clindamycin, Erythromycin, Penicillin, Vancomycin [27]

Các kháng sinh Penicillin, Ampicillin, Cefazolin thuộc nhóm lactam Nhóm beta-lactam là một họ kháng sinh rất lớn, các kháng sinh có cấu trúc hóa học chứa vòng beta-lactam Khi vòng này liên kết với một cấu trúc vòng khác sẽ hình thành các phân nhóm khác: nhóm Penicillin, Cephalosporin

beta-Clindamycin là một loại thuốc kháng sinh thuộc họ Lincosamide có tác dụng chống lại vi khuẩn trong cơ thể

Erythromycin thuộc nhóm Macrolid, có phổ kháng khuẩn hẹp, chủ yếu tập trung vào một số chủng vi khuẩn gram dương và một số vi khuẩn không điển hình

Vancomycin thuộc nhóm kháng sinh peptid, tác dụng diệt khuẩn bằng cách ức chế quá trình sinh tổng hợp vỏ tế bào vi khuẩn tạo ra phức chất với nhánh đuôi peptidyl-D-Ala-D-Ala của các tiền chất peptidoglycan, ở giai đoạn sớm hơn so với các kháng sinh nhóm beta-lactam Ngoài ra còn tác động đến tính thấm màng tế bào và quá trình tổng hợp DNA của vi khuẩn [36]

- Cơ chế tác động của kháng sinh

+ Ngăn cản sự tổng hợp thành tế bào vi khuẩn, tác động ở giai đoạn sinh sản của vi khuẩn như nhóm beta-lactamin, Vancomycin

+ Làm biến đổi màng nguyên sinh chất của vi khuẩn, dưới tác dụng của kháng sinh màng nguyên sinh chất bị biến đổi làm thoát các chất có trọng lượng phân tử thấp ở bên trong ra ngoài tế bào

+ Cản trở tổng hợp protein và acid nucleic trong tế bào

+ Làm đảo lộn cấu trúc của ribosom và làm sai sót trong việc đọc mã, dẫn đến tế bào tổng hợp ra một protein dị thường, ngừng một chức năng chuyển hoá hoặc cấu trúc cần thiết cho sự sống của tế bào

+ Ức chế sự hình thành các cầu nối peptid [13]

1.3.2 Cơ chế đề kháng kháng sinh của vi khuẩn

- Ức chế bằng enzym: vi khuẩn sản xuất ra các enzym gây phân hủy hoặc bất hoạt kháng sinh Các beta-lactamase là các men do vi khuẩn sinh ra và được lây truyền theo nhiễm sắc thể hoặc plasmid Các men này đề kháng với các kháng sinh rất hiệu quả, chúng bất hoạt các thuốc nhóm beta-lactamine bằng cách phá hủy các cầu nối amide của vòng beta-lactam [13]

- Giảm tính thấm của tế bào vi khuẩn: vi khuẩn là các sinh vật đơn bào, màng tế bào chất phân cách tế bào chất với môi trường bên ngoài có tác dụng như một hàng rào che chở, các chất dinh dưỡng và kháng sinh đi vào bên trong

tế bào phải đi ngang lớp vỏ này để thấm vào bên trong vi khuẩn theo khuếch tán thụ động qua các lỗ nhỏ Sự giảm tính thấm của tế bào sẽ làm giảm lượng kháng sinh đi vào bên trong tế bào đến đích tác dụng của kháng sinh [5]

- Biến đổi vị trí gắn kết: hiện tượng này do nguồn gốc nhiễm sắc thể hoặc plasmide, theo cơ chế làm giảm ái lực của kháng sinh tại vị trí tác động

+ Biến đổi các protein liên kết với Penicillin: làm giảm ái lực của các protein tham gia vào việc cấu tạo nên peptidoglycan với các thuốc beta-lactam

+ Biến đổi vị trí gắn kết ở ribosom: biến đổi bên trong tế bào vi khuẩn ở tiểu đơn vị ribosom đích có thể làm giảm hoạt tính của kháng sinh Sự biến đổi này làm cho kháng sinh không đủ để ức chế tổng hợp protein của vi khuẩn

+ Biến đổi các men DNA-gyrase và men topoisomerase là men cần thiết cho hoạt tính của các kháng sinh nhóm quinolone, sự đột biến nhất thời của một acid amin gây ra đề kháng Biến đổi các tiền chất đích ở thành tế bào vi khuẩn

+ Biến đổi các enzyme đích: sự biến đổi của các men dihydropteroate synthetase kháng lại sự gắn kết với các sulfamide và của men dihydropteroate reductase làm mất nhạy cảm với trimetoprime đồng thời gây ra kháng thuốc

- Bơm đẩy: chủ động đẩy kháng sinh ra khỏi tế bào vi khuẩn, góp phần lớn cho tính đề kháng nội sinh của vi khuẩn chống lại nhiều thuốc kháng sinh, các bơm này cần năng lượng việc tiếp xúc với kháng sinh tạo điều kiện thuận lợi cho việc tăng số lượng bơm do đột biến chất mang làm tăng mạnh tính đề kháng của vi khuẩn với kháng sinh [6]

1.3.3 Tình hình đề kháng kháng sinh của Streptococcus nhóm B

Nghiên cứu của tác giả Nguyễn Thị Quí Thi cho thấy kháng sinh nhạy

cao với Streptococcus nhóm B là Piperacilline 94,5%, Cefazolin 87,3%,

Vancomycin 83,6% [21] Trong nghiên cứu của Trần Quang Hiệp tại Bệnh viện

Bạch Mai Hà Nội, tỉ lệ Streptococcus nhóm B nhạy với Penicillin là 55%, kháng

thuốc 42%, trung gian 7%; với Ampicillin lần lượt là 21% - 72% - 7% Có một

tỷ lệ kháng thuốc tương đối cao với 2 loại kháng sinh Penicillin và Ampicillin

ở nghiên cứu [6]

Nghiên cứu của Phùng Thị Lý năm 2020, kết quả 100% Streptococcus

nhóm B nhạy cảm với các kháng sinh nhóm β-Lactam và Vancomycin, kháng Clindamycin chiếm 81,4% [11] Kết quả nghiên cứu của Nguyễn Thị Châu Anh

năm 2020 tại Huế, Streptococcus nhóm B đề kháng với kháng sinh

Erythromycin chiếm tỉ lệ cao 75% và Tetracycline là 66,7% [3]

Có thể làm định danh và kháng sinh đồ đồng thời cùng lúc, giao diện trực quan,

dễ sử dụng và an toàn Định danh vi sinh vật và làm kháng sinh đồ bằng cách theo dõi liên tục sự phát triển của vi sinh vật trong các giếng của thẻ Dùng

phương pháp đo màu để nhận biết các tính chất sinh vật hoá học của vi sinh vật thông qua sự thay đổi màu của các giếng môi trường có sẵn trong thẻ Phương pháp làm kháng sinh đồ: dùng phương pháp đo MIC ( nồng độ ức chế tối thiểu),

đo độ đục để theo dõi sự phát triển của vi sinh vật trong các giếng của thẻ [31]

Hai phương pháp được thực hiện theo nguyên lý sự suy giảm cường độ sáng: hệ thống quang học sử dụng ánh sáng nhìn thấy để theo dõi trực tiếp sự phát triển của vi sinh vật thông qua việc đo cường độ ánh sáng bị chặn lại khi ánh sáng đi qua giếng Hệ thống sử dụng các bước sóng 660nm, 568nm, 428nm cho hiệu suất cao với thời gian ngắn, phạm vi rộng với độ chính xác cao Cho

kết quả kháng sinh đồ của vi khuẩn đảm bảo độ chính xác cao bởi giá trị nồng

độ ức chế tối thiểu riêng biệt cho 18-20 loại kháng sinh khác nhau Giá trị nồng

độ ức chế tối thiểu được cập nhật và khuyến cáo bởi phần mềm quản lý dữ liệu theo hệ thống và được xử lý bởi phần mềm chuyên dụng, cho kết quả theo các mức độ kháng, nhạy, trung gian và thời gian cho kết quả kháng sinh đồ trong khoảng 18 giờ [1]

Hình 1.1: Máy VITEK 2 thực hiện định danh và kháng sinh đồ tự động

(Nguồn: catalog [1])

1.3.4.2 Phương pháp kháng sinh đồ đĩa giấy

+ Nguyên lý: khoanh giấy có đường kính và độ dày nhất định, vô trùng,

đã tẩm sẵn kháng sinh với nồng độ nhất định được đặt lên đĩa môi trường đã nuôi cấy vi khuẩn Sau khi ủ ấm ở nhiệt độ và khí trường thích hợp, vi khuẩn chỉ mọc được ở nơi có nồng độ kháng sinh thấp hoặc không có Tùy theo khả năng ức chế sự phát triển của vi khuẩn mà tạo ra vùng ức chế xung quanh khoanh giấy kháng sinh, dựa vào đường kính vùng ức chế ta xác định được mức

độ nhạy cảm của vi khuẩn được thử với kháng sinh [1]

+ Trang thiết bị, sinh phẩm: tủ ấm, máy trộn, lắc, đĩa thạch Hinton, khoanh giấy kháng sinh Ampicillin 10µg, Cefazolin 30µg, Clindamycin 2µg, Erythromycin 15µg, Penicillin 10UI, Vancomycin 30µg, độ đục chuẩn McFarland 0,5 Nước muối 0,9% vô trùng, tăm bông (que gòn) vô trùng, đèn cồn, que cấy, panh, ống nghiệm

Mueller-+ Các bước tiến hành

Chuẩn bị môi trường: môi trường sử dụng làm thử nghiệm kháng sinh đồ cho các vi khuẩn hiếu khí dễ nuôi cấy là môi trường thạch đĩa Mueller-Hinton

có độ dày 40,5mm

Chuẩn bị huyền dịch trực tiếp từ khuẩn lạc: dùng que cấy lấy vi khuẩn

từ 3-5 khuẩn lạc Streptoccus nhóm B vào ống nước muối sinh lý, lắc đều trên

máy lắc để có huyền dịch đồng nhất So sánh độ đục của huyền dịch vi khuẩn với độ đục của ống McFarland 0,5 [2] Huyền dịch vi khuẩn sau khi pha, sử dụng ngay trong vòng 15 phút

Dàn đều vi khuẩn trên mặt thạch dùng tăm bông vô trùng nhúng vào ống huyền dịch vi khuẩn đã pha ở trên, ép nhẹ và xoay tròn tăm bông trên thành bên của ống huyền dịch vi khuẩn để loại bớt phần huyền dịch vi khuẩn đã thấm vào đầu tăm bông Sau đó, ria đều que tăm bông trên toàn bộ mặt đĩa thạch Mueller-Hinton, xoay đều đĩa thạch theo góc 60º rồi ria đều que tăm bông, tiếp tục xoay đĩa một góc 60º và ria que tăm bông để sao cho vi khuẩn được dàn đều lên trên toàn bộ bề mặt đĩa thạch Đóng nắp đĩa thạch và để đĩa thạch sau ria cấy vài phút ở nhiệt độ phòng cho mặt thạch se lại Đặt các khoanh giấy kháng sinh lên mặt thạch Các khoanh giấy sau khi đặt cần được ấn xuống vừa phải để đảm bảo chúng được tiếp xúc hoàn toàn với mặt thạch Đặt tối đa chỉ nên đặt 6 khoanh giấy trên đĩa thạch đường kính 9-10cm

Hình 1.2: Kỹ thuật thực hiện kháng sinh đồ phương pháp đĩa giấy

World Health Organization 2003) [1]

Trong vòng 15 phút sau khi đặt khoanh giấy kháng sinh, các đĩa thạch phải được lật úp để trong tủ ấm 37ºC trong vòng 16-18 giờ trong điều kiện khí trường bình thường [1]

Đọc và nhận định kết quả: sau khi nuôi cấy qua đêm (16-18 giờ), kiểm tra đĩa thạch và chỉ đọc kết quả khi vi khuẩn thử nghiệm mọc đồng đều trên mặt thạch, các khuẩn lạc mọc dày sát cạnh nhau nhưng không chồng lên nhau thành thảm dày hoặc không quá thưa có các khe giữa các khuẩn lạc

Vùng ức chế tạo ra có hình tròn đều Dùng thước kẻ có chia vạch đến

mm hoặc thước kẹp đặt lên mặt đáy của đĩa thạch, không mở nắp đĩa thạch, đo đường kính vùng ức chế hoàn tính theo mm

Đường kính vùng ức chế tính ra mm được so sánh với các giá trị điểm gãy trong tài liệu CLSI năm 2019 [31]

Hình 1.3: Thực hiện đo vòng vô khuẩn kháng sinh đồ phương pháp đĩa giấy

(Nguồn Textbook of diagnostic microbiology Connie R Mahon, Donald C

1.3.4.3 Phương pháp kháng sinh đồ ETEST

Bệnh phẩm: chủng vi khuẩn đã được nuôi cấy phân lập từ mẫu bệnh phẩm âm đạo, trực tràng

Nguyên lý: dải plastic có kích thước 5x57mm có 15 nồng độ kháng sinh được giảm dần theo bậc 2 gắn cố định trên bề mặt của dải plastic với tên kháng sinh cho từng vị trí tương ứng Trãi đều vi khuẩn lên mặt thạch môi trường đặt

dải plastic, nồng độ kháng sinh nhanh chóng khuếch tán trong thạch Sau khi nuôi cấy qua đêm, xuất hiện vùng ức chế hình elip đối xứng qua dải plastic Giá trị MIC được xác định trực tiếp tại điểm cắt của hình elip với dải Etest [1]

Môi trường: thạch đĩa Mueller-Hinton Hóa chất: nước muối sinh lý vô trùng, dải Etest, chủng vi khuẩn thuần Dụng cụ: panh kẹp, kéo, đèn cồn, que cấy, que tăm bông vô trùng Thiết bị: máy lắc, tủ ấm, máy đo độ đục hoặc ống McFaland 0,5 Chuẩn bị huyền dịch vi khuẩn Thực hiện dùng tăm bông vô trùng nhúng vào ống huyền dịch vi khuẩn, ria đều que tăm bông trên toàn bộ mặt đĩa thạch Mueller-Hinton, dàn đều vi khuẩn Đóng nắp đĩa thạch để vài phút ở nhiệt độ phòng cho mặt thạch se lại hoàn toàn Đặt dải Etest lên mặt thạch, mặt có ghi dải nồng độ hướng lên trên và phải đảm bảo toàn bộ bề mặt của dải Etest được tiếp xúc hoàn toàn với mặt thạch Ủ ấm đĩa ở 352C trong vòng 16-20 giờ ở điều kiện khí trường 5-10% CO2 [1]

Hình 1.4: Kết quả thử nghiệm bằng Etest (MIC ở hình sau 1,5 μg/mL) [1]

Đọc kết quả 16-24 giờ sau ủ ấm và khi thấy rõ vi khuẩn mọc, đọc giá trị MIC ở điểm cắt của hình elip với dải Etest theo hướng dẫn của CLSI 2019 [31]

1.4 Các nghiên cứu trong và ngoài nước

1.4.1 Nghiên cứu ngoài nước

Tại Trung Quốc, nghiên cứu của Jichang Chen trên 3439 thai phụ cho

thấy tỉ lệ nhiễm Streptococcus nhóm B ở thai phụ là 6,1%, ở sơ sinh là 0,7%,

lây truyền từ mẹ sang con là 7,6%; tỉ lệ nhiễm khuẩn do Streptococcus nhóm B

khởi phát sớm là 0,58/1.000 ca sinh sống [37] Nghiên cứu của Seal Ac năm

2015 ước tính có 319000 trẻ bị nhiễm khuẩn do Streptococcus nhóm B, khoảng

205000 trẻ mắc bệnh khởi phát sớm và 114000 trẻ mắc bệnh khởi phát muộn

Có 90000 trẻ tử vong dưới 3 tháng tuổi, 7000 bị bệnh não sơ sinh Khoảng 3,5

triệu ca sinh non có thể là do Streptococcus nhóm B [51]

Nghiên cứu của tác giả Lucy L Furfaro và các cộng sự thực hiện tại Tây Australian năm 2019 nghiên cứu khảo sát trên một nhóm 814 phụ nữ mang thai

trong giai đoạn 2015-2017, tỉ lệ nhiễm Streptococcus nhóm B là 24% [43] Nghiên cứu năm 2019 của tác giả Cilicia S tại Brazil tỉ lệ nhiễm Streptococcus

nhóm B ở phụ nữ mang thai dao động từ 4,2 đến 28,4% trong 10 năm qua và tỉ

lệ đề kháng kháng sinh cao nhất với kháng sinh Tetracyclin [29]

1.4.2 Nghiên cứu trong nước

Nghiên cứu của tác giả Hồ Ngọc Sơn và Vũ Thị Nhung năm 2015-2016

thực hiện tại Bệnh viện Đa khoa Khu vực Nam Bình Thuận, tỉ lệ Streptococcus

nhóm B âm đạo-trực tràng ở phụ nữ mang thai 35-37 tuần là 17,8% [16] Tác giả Trần Bích Ngọc năm 2022 nghiên cứu tại Thành phố Hồ Chí Minh, tỉ lệ nhiễm và đặc điểm nhạy cảm kháng sinh của Liên cầu khuẩn nhóm B ở phụ nữ

mang thai 35-37 tuần có kết quả như sau tỉ lệ nhiễm Streptococcus nhóm B ở

phụ nữ mang thai 35-37 tuần là 15,38% [14] Nghiên cứu của Phùng Thị Lý năm 2020, nghiên cứu tỉ lệ mang Liên cầu khuẩn nhóm B ở 35-37 tuần thai kỳ

và hiệu quả của kháng sinh dự phòng lây nhiễm trước sinh, kết quả cho thấy tỉ

lệ nhiễm Streptococcus nhóm B là 17,5% [11] Nghiên cứu của Trần Quang Hanh, nghiên cứu thực trạng nhiễm Streptococcus nhóm B ở phụ nữ mang thai

và hiệu quả điều trị bằng kháng sinh trong chuyển dạ phòng lây truyền sang con tại Bệnh viện Sản Nhi Nghệ An năm 2018-2019, tỉ lệ nhiễm chung qua thăm khám lâm sàng là 36,3%, tỉ lệ có triệu chứng lâm sàng như ra khí hư,

ngứa, đau rát là 39,7% Chiếm tỷ lệ trong nghiên cứu là những thai phụ không

có triệu chứng lâm sàng khi khai thác (60,3%) [5] Tác giả Lương Phong Nhã,

nghiên cứu tình hình thai phụ nhiễm Streptococcus nhóm B âm đạo-trực tràng,

các yếu tố liên quan và kết quả điều trị dự phòng lây truyền từ mẹ sang con tại Bệnh viện Phụ Sản Cần Thơ năm 2020, kết quả cho thấy tỉ lệ nhiễm 17,6% [13]

Trong nghiên cứu của Nguyễn Thị Lan và Bùi Thị Phương Nga năm

2020 tại Bệnh viện Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh, nghiên trên 235 thai phụ tuổi thai từ 35-37 tuần đến khám thai tại Bệnh viện Đại học Y Dược,

kết quả tỉ lệ nhiễm Streptococcus nhóm B ở mẫu cấy âm đạo trực tràng là

17,4%, mẫu âm đạo 14% và mẫu cấy trực tràng 4,7%, thai phụ có viêm âm đạo 28,6% và không viêm âm đạo là 17,1% [9]

Nhìn chung các nghiên cứu chủ yếu tập trung vào xác định tỉ lệ mắc, các yếu tố liên quan và khả năng đề kháng kháng sinh của vi khuẩn các biện pháp phòng ngừa chưa được nghiên cứu sâu

Chương 2

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Phụ nữ mang thai đến khám tại Phòng Khám sản-phụ khoa Bệnh viện Quốc tế Phương Châu năm 2021-2022

2.1.2 Tiêu chuẩn chọn mẫu

- Tuổi thai 35-37 tuần

- Không đặt thuốc âm đạo và không sử dụng kháng sinh trong vòng 48 giờ trước khi lấy mẫu

- Đồng ý tham gia nghiên cứu

2.1.3 Tiêu chuẩn loại trừ

- Phụ nữ mang thai không giao tiếp được

- Phụ nữ mang thai không biết chữ

2.1.4 Địa điểm và thời gian nghiên cứu

Bệnh viện Quốc tế Phương Châu, từ tháng 12/2021 đến tháng 8/2022

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Thiết kế nghiên cứu

Nghiên cứu mô tả cắt ngang

2.2.2 Cỡ mẫu

Cỡ mẫu được tính theo công thức

Chọn Z1-α/2 = 1,96

d: sai số cho phép, chọn d= 0,04 (sai số 4%)

p là tỉ lệ nhiễm Streptococcus nhóm B Chọn p= 0,178 (Theo nghiên cứu của tác giả Hồ Ngọc Sơn và Vũ Thị Nhung năm 2017, tỉ lệ Streptococcus nhóm

B âm đạo-trực tràng ở phụ nữ mang thai 35-37 tuần là 17,8%) [16]

n= 351 [25]

Cỡ mẫu thu thập là 400 mẫu

2.2.3 Phương pháp chọn mẫu

Chọn mẫu thuận tiện

2.2.4 Nội dung nghiên cứu

2.2.4.1 Đặc điểm chung của phụ nữ mang thai tham gia nghiên cứu

- Tuổi: được tính bằng cách lấy năm tại thời điểm lấy mẫu trừ đi năm sinh của phụ nữ mang thai, được chia thành 5 nhóm

- Nghề nghiệp: là nghề nghiệp hiện tại đang làm để tạo ra thu nhập, được chia thành 5 nhóm

+ Cán bộ viên chức

- Kiến thức hiểu biết về Streptococcus nhóm B: là việc tìm hiểu, nghe nói về tác hại của nhiễm streptococcus ở phụ nữ mang thai, chia thành 2 nhóm

+ Hiểu biết

+ Không hiểu biết

- Các thói quen vệ sinh của phụ nữ mang thai: là các thói quen vệ sinh hằng ngày, được chia thành 2 nhóm

+ Thụt rửa âm đạo

+ Không biết nhiễm

- Biểu hiện triệu chứng viêm của phụ nữ mang thai trong lần mang thai này, được chia thành 4 nhóm

- Tỉ lệ nhiễm Streptococcus nhóm B ở phụ nữ mang thai 35-37 tuần

- Tỉ lệ nhiễm Streptococcus nhóm B theo đặc điểm của phụ nữ mang thai

tham gia nghiên cứu

2.2.4.3 Tỉ lệ đề kháng kháng sinh của Streptococcus nhóm B

- Tỉ lệ đề kháng kháng sinh của Streptococcus nhóm B đối với các loại

kháng sinh: Ampicillin, Cefazolin, Clindamycin, Erythromycin, Penicillin Vancomycin (dựa vào tiêu chuẩn CLSI 2019)

- Tỉ lệ đề kháng kháng sinh của Streptococcus nhóm B với đặc điểm của

phụ nữ mang thai tham gia nghiên cứu

2.2.5 Phương pháp thu thập và đánh giá số liệu

2.2.5.1 Phương tiện nghiên cứu

- Phiếu thu thập thông tin (phụ lục 1)

- Trang thiết bị: tủ an toàn sinh học, tủ ủ vi khuẩn, tủ sấy, máy autoclave,

tủ mát, kính hiển vi, máy vortex Bộ môn Vi sinh Trường Đại học Y Dược Cần Thơ

- Dụng cụ: vòng cấy, kim cấy, đèn cồn, giá đựng ống nghiệm, ống nghiệm, que tăm bông vô trùng

- Môi trường BHI, thạch máu cừu, Mueller-Hinton được cung cấp bởi công ty Nam Khoa

- Bộ thuốc nhuộm gram

- Dung dịch H2O2 3%

- Đĩa kháng sinh các loại Ampicillin 10µg, Cefazolin 30µg, Clindamycin 2µg, Erythromycin 15µg, Penicillin 10UI, Vancomycin 30µg

2.2.5.2 Người thu thập dữ liệu

Thu thập thông tin là những thành viên tham gia nghiên cứu trực tiếp tư vấn, thu thập thông tin phụ nữ mang thai tham gia nghiên cứu theo phụ lục 1,

có kiến thức chuyên môn Lấy mẫu âm đạo trực tràng là các bác sĩ thăm khám công tác tại Bệnh viện Quốc tế Phương Châu

2.2.5.3 Các kỹ thuật thực hiện

- Kỹ thuật lấy mẫu bệnh phẩm âm đạo phụ nữ mang thai

+ Bước 1: xác định tuổi thai của phụ nữ mang thai 35-37 tuần đến khám

Giải thích, đồng ý tham gia nghiên cứu, tiến hành thu thập thông tin theo phiếu thu thập (phụ lục 1) và ghi thông tin họ và tên năm sinh trên que lấy mẫu chuyên dụng

+ Bước 2: tiến hành lấy mẫu bệnh phẩm đối với mẫu âm đao phụ nữ mang thai nằm trên bàn phụ khoa khám trong tư thế phụ khoa, bộc lộ âm đạo

+ Bước 3: dùng một que tăm bông phết bệnh phẩm ở 1/3 dưới âm đạo qua lỗ âm đạo 2 cm, xoay tăm bông 2 vòng quanh trục [1] Đối với mẫu trực tràng phụ nữ mang thai nằm trên bàn phụ khoa, bộc lộ hậu môn, dùng que tâm bông đưa vào hậu môn qua cơ vòng hậu môn xoay nhẹ tâm bông 2 vòng quanh trục Sau khi lấy bệnh phẩm xong cho que tăm bông vào ống môi trường chuyên chở BHI, ủ bình nến, vận chuyển bệnh phẩm về Bộ môn Vi sinh Trường Đại học Y Dược Cần Thơ thực hiện nuôi cấy và làm kháng sinh đồ

- Kỹ thuật nuôi cấy bệnh phẩm và định danh

+ Nuôi cấy phân lập bệnh phẩm

Nguyên lý: nuôi cấy phân lập bệnh phẩm với kỹ thuật cấy 3 chiều, làm cạn dần mầm cấy, tách vi khuẩn thành những khúm riêng biệt

Thực hiện: cấy phân lập bệnh phẩm vào môi trường thạch máu, ủ trong

bình nến ở 37oC, khuẩn lạc xuất hiện 18-48h sau nuôi cấy và tính chất tan máu

sau 18-24 giờ Tiêu chuẩn chẩn đoán: hình thái khuẩn lạc và tính chất tan máu

trên môi trường thạch máu là khuẩn lạc có Streptococcus nhóm B, kích thước

0,5-1mm, trong suốt như giọt sương, có vòng tiêu huyết β quanh khuẩn lạc [22]

Kết quả: những khúm vi khuẩn tách rời nhau, trong suốt như giọt sương,

có vòng tiêu huyết β quanh khuẩn lạc

Hình 2.1: Kết quả nuôi cấy phân lập mẫu 13

+ Nhuộm Gram

Nguyên lý: dựa trên sự khác nhau về cấu trúc của vách tế bào nên trong

quá trình nhuộm gram, vi khuẩn gram dương sẽ giữ được phức hợp tím gentians-iod không bị tẩy màu bởi alcohol, trong khi vi khuẩn gram âm không giữ được phức hợp này [24] Kết quả sau khi nhuộm là vi khuẩn gram dương vẫn giữ được màu tím của gentians, còn vi khuẩn gram âm bắt màu hồng của fucshin

Dụng cụ, thiết bị: kính hiển vi, que cấy đầu tròn, đèn cồn, diêm, phiến kính, chậu rửa, bình xịt nước cất và các dụng cụ cần thiết

Vật liệu, hoá chất bao gồm mẫu vi khuẩn vừa nuôi cấy phân lập được Dung dịch tím gentians

Cố định tiêu bản bằng cách hơ nhanh trên ngọn lửa đèn cồn 2-3 lần để gắn chặt

vi khuẩn vào phiến kính Việc cố định nhằm 3 mục đích là giết chết vi khuẩn, gắn chặt vi khuẩn vào phiến kính và làm vết bôi bắt màu tốt hơn vì các tế bào chết bắt màu tốt hơn các tế bào sống [23]

Nhuộm tiếp bằng dung dịch Fucshin trong 1 phút, rửa nước, để khô

Kết quả: vi khuẩn có dạng hình cầu hay bầu dục bắt màu gram dương,

xếp thành đôi hoặc chuỗi

+ Thử nghiệm sinh vật hóa học định danh vi khuẩn

Thử nghiệm Catalase

Nguyên lý: vi khuẩn sinh enzym catalase để thủy phân H2O2 thành H2O

và O2, tạo ra bọt khí Xét nghiệm này được dùng để phân tích đặc điểm ban đầu của hầu hết các vi khuẩn

Sinh phẩm hóa chất: H2O2 3%

Thực hiện: khởi động tủ an toàn sinh học ít nhất 15 phút trước khi thực hiện Sắp xếp các dụng cụ cần thiết vào tủ an toàn sinh học, chọn một khuẩn lạc tách biệt rõ, đã được 18-24 giờ, chuyển sang lam kính sạch Nhỏ 1 giọt thuốc thử H2O2 lên lam kính và quan sát trên nền tối ngay lập tức hiện tượng sủi bọt Bỏ lam kính vào thùng chứa vật sắc nhọn

Kết quả thử nghiệm

Thử nghiệm dương tính: có hiện tượng sủi bọt

Thử nghiệm âm tính: không có hiện tượng sủi bọt [1]

Thử nghiệm CAMP (phương pháp chuẩn)

Nguyên lý: Streptococcus nhóm B tạo ra một loại protein chịu nhiệt,

ngoài tế bào, có thể khuếch tán và tác động hiệp đồng với yếu tố tan máu (tiêu

huyết) beta (beta-lysin) do Staphylococcus aureus sản xuất ra để tạo thành một

vùng ly giải trong môi trường chứa hồng cầu cừu hoặc bò Protein này tên là yếu tố CAMP Thử nghiệm CAMP chuẩn dựa vào sự tương tác giữa hai yếu tố này trong quá trình nhân lên của vi khuẩn để tạo nên một vùng trong suốt hình ngọn lửa hay đầu mũi tên tại vùng gặp nhau của hai vi khuẩn này khi chúng

được đặt vuông góc với nhau Thử nghiệm CAMP được sử dụng để định danh

Streptococcus nhóm B [1],[50]

Sinh phẩm hóa chất

Chủng S aureus ATCC 25923

+ Thực hiện: phương pháp chuẩn cấy S aureus ATCC 25923 theo một

đường thẳng ở giữa đĩa thạch

Ria chủng vi khuẩn chưa biết theo một đường thẳng vuông góc với đường

cấy S aureus nhưng không chạm vào đường đó

Ria chủng làm chứng dương song song và cách đường ria chủng cần xác định khoảng 2,54cm

Đề tên mỗi đường ria vào mặt sau của đĩa

Ủ đĩa qua đêm ở 37C trong tủ ấm có CO2

+ Diễn giải và ghi chép kết quả

Thử nghiệm dương tính: có khoảng tiêu huyết hình đầu mũi tên ở chỗ

giao giữa đường ria của S aureus và chủng cần xác định sinh yếu tố CAMP

[1],[50]

Thử nghiệm âm tính: không có khoảng tiêu huyết hình đầu mũi tên ở chỗ

giao giữa đường ria của S aureus

Hình 2.2: Kết quả thử nghiệm CAMP mẫu 31

Tiêu chuẩn chẩn đoán xác định Streptococcus nhóm B: để chẩn đoán Streptococcus nhóm B phải thỏa các tiêu chuẩn sau

Tiêu huyết β trên môi trường thạch máu

Nhuộm gram: cầu khuẩn gram (+)

+ Mẫu vi khuẩn Streptococcus nhóm B đã được nuôi cấy phân lập

+ Môi trường làm kháng sinh đồ: là thạch Mueller-Hinton

+ Các loại đĩa kháng sinh làm kháng sinh đồ

Phương pháp kháng sinh đồ đĩa giấy

+ Nguyên lý: khoanh giấy có đường kính và độ dày nhất định, vô trùng,

đã tẩm sẵn kháng sinh với nồng độ nhất định được đặt lên đĩa môi trường đã nuôi cấy vi khuẩn Sau khi ủ ấm ở nhiệt độ và khí trường thích hợp, vi khuẩn chỉ mọc được ở nơi có nồng độ kháng sinh thấp hoặc không có

Tùy theo khả năng ức chế sự phát triển của vi khuẩn mà tạo ra vùng ức chế xung quanh khoanh giấy kháng sinh, dựa vào đường kính vùng ức chế ta xác định được mức độ nhạy cảm của vi khuẩn được thử với kháng sinh [3]

+ Trang thiết bị, sinh phẩm: tủ ấm, máy trộn, lắc, đĩa thạch Hinton

Mueller-Khoanh giấy kháng sinh Ampicillin 10µg, Cefazolin 30µg, Clindamycin 2µg, Erythromycin 15µg, Penicillin 10UI, Vancomycin 30µg, độ đục chuẩn McFarland 0,5

Nước muối 0,9% vô trùng, tăm bông (que gòn) vô trùng, đèn cồn, que cấy, panh, ống nghiệm

+ Các bước tiến hành

Chuẩn bị môi trường: môi trường sử dụng làm thử nghiệm kháng sinh đồ cho các vi khuẩn hiếu khí dễ nuôi cấy là môi trường thạch đĩa Mueller-Hinton

có độ dày 40,5mm Chuẩn bị huyền dịch vi khuẩn, chủng vi khuẩn cần

Streptoccus nhóm B phải thuần và đang ở giai đoạn phát triển mạnh (nuôi cấy

sau 18-24 giờ)

Chuẩn bị huyền dịch trực tiếp từ khuẩn lạc: dùng que cấy lấy vi khuẩn

từ 3-5 khuẩn lạc Streptoccus nhóm B vào ống nước muối sinh lý, lắc đều trên

máy lắc để có huyền dịch đồng nhất So sánh độ đục của huyền dịch vi khuẩn với độ đục của ống McFarland 0,5 [3] Huyền dịch vi khuẩn sau khi pha, sử dụng ngay trong vòng 15 phút

Dàn đều vi khuẩn trên mặt thạch dùng tăm bông vô trùng nhúng vào ống huyền dịch vi khuẩn đã pha ở trên, ép nhẹ và xoay tròn tăm bông trên thành bên của ống huyền dịch vi khuẩn để loại bớt phần huyền dịch vi khuẩn đã thấm vào đầu tăm bông Sau đó, ria đều que tăm bông trên toàn bộ mặt đĩa thạch Mueller-Hinton, xoay đều đĩa thạch theo góc 60º rồi ria đều que tăm bông, tiếp tục xoay đĩa một góc 60º và ria que tăm bông để sao cho vi khuẩn được dàn đều lên trên toàn bộ bề mặt đĩa thạch Cuối cùng, ria tăm bông vòng quanh bờ mép của mặt thạch Đóng nắp đĩa thạch và để đĩa thạch sau ria cấy vài phút ở nhiệt độ phòng cho mặt thạch se lại

Đặt khoanh giấy kháng sinh Ampicillin 10µg, Cefazolin 30µg, Clindamycin 2µg, Erythromycin 15µg, Penicillin 10UI, Vancomycin 30µg có thể dùng panh kẹp hoặc đầu kim vô trùng để đặt các khoanh giấy kháng sinh lên mặt thạch Các khoanh giấy sau khi đặt cần được ấn xuống vừa phải để đảm bảo chúng được tiếp xúc hoàn toàn với mặt thạch