(Luận Văn Thạc Sĩ) Nghiên Cứu Sự Thay Đổi Theo Tháng Của Hàm Lượng, Chất Lượng Carrageenan Và Hoạt Tính Lectin Từ Rong Đỏ Betaphycus Gelatinus.pdf

Untitled BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ Lê Trọng Nghĩa NGHIÊN CỨU SỰ THAY ĐỔI THEO THÁNG CỦA HÀM LƯỢNG, CHẤT LƯỢNG CARRAGEENAN VÀ HO[.]

VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGH Ệ VIỆT NAM

H ỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

-

Lê Trọng Nghĩa

NGHIÊN C ỨU SỰ THAY ĐỔI THEO THÁNG CỦA HÀM LƯỢNG, CHẤT LƯỢNG CARRAGEENAN VÀ HOẠT TÍNH LECTIN TỪ RONG ĐỎ BETAPHYCUS GELATINUS

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Hà N ội – 2021

H ỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

-

Lê Trọng Nghĩa

NGHIÊN C ỨU SỰ THAY ĐỔI THEO THÁNG CỦA HÀM LƯỢNG, CHẤT LƯỢNG CARRAGEENAN VÀ HOẠT TÍNH LECTIN TỪ RONG ĐỎ BETAPHYCUS GELATINUS

Chuyên ngành: Sinh h ọc thực nghiệm

L ỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của bản thân tôi dưới

sự hướng dẫn của TS Lê Đình Hùng và tham khảo thêm các tài liệu đã

được công bố trước đó có nguồn gốc rõ ràng Các số liệu nêu trong luận văn

là kết quả làm việc của tôi trong suốt quá trình thực nghiệm tại Viện Nghiên

cứu và Ứng dụng công nghệ Nha Trang, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Nha Trang, ngày tháng năm 2021

Tác giả

Lê Tr ọng Nghĩa

L ỜI CẢM ƠN

Đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất đến thầy giáo TS Lê Đình Hùng – Trưởng phòng Công nghệ Sinh học biển, Viện Nghiên cứu và Ứng dụng công nghệ Nha Trang đã dành trọn tâm huyết, tận tình hướng dẫn,

chỉ dạy tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu tại Viện và hoàn thành

luận văn này

Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Học viện Khoa học và Công nghệ, ban lãnh đạo và các Phòng ban thuộc Viện Nghiên cứu và Ứng dụng công nghệ Nha Trang đã tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất để tôi hoàn thành khóa học Thạc sĩ Sinh học thực nghiệm khóa 2019 - 2021

Tôi xin cảm ơn các thầy, cô giáo giảng dạy và các anh, chị cùng lớp cao học BIO19 đã tận tình giảng dạy và giúp đỡ tôi bổ sung, nâng cao thêm

kiến thức trong suốt khóa học

Tôi xin cảm ơn các anh chị Phòng Vật liệu Hữu cơ từ Tài nguyên biển, Phòng Công nghệ Sinh học biển thuộc Viện Nghiên cứu và Ứng dụng công nghệ Nha Trang đã tạo điều kiện và giúp đỡ những thiếu sót về kiến thức chuyên ngành trong quá trình làm thực nghiệm

Tôi chân thành cảm ơn Phòng Vật liệu Hữu cơ từ Tài nguyên biển đã cho phép tôi sử dụng đề tài cơ sở của phòng và đề tài Ninh Thuận để hỗ trợ thực hiện luận văn này

Cuối cùng tôi xin dành lời cảm ơn gia đình và bạn bè của tôi, đã luôn bên cạnh ủng hộ và động viên, hỗ trợ về mọi mặt để tôi cố gắng vươn lên,

tiếp tục con đường học tập của mình

Nha Trang, ngày tháng năm 2021

Học viên

Lê Tr ọng Nghĩa

DANH M ỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Cấu trúc chung của carrageenan 12

Hình 1.2 Cấu trúc của các dạng carrageenan 13

Hình 1.3 Rong đỏ B gelatinus 27

Hình 1.4 Vòng đời B gelatinus 29

Hình 2.1 Rong đỏ B gelatinus thu tại Ninh Thuận, Việt Nam 33

Hình 2.2 Bản đồ khu vị trí thu mẫu rong (tỉ lệ 1: 25.000) 38

Hình 2.3 Sơ đồ thu và phân tích mẫu nước 38

Hình 2.4 Sơ đồ quy trình chiết carrageenan tự nhiên 40

Hình 2.5 Sơ đồ quy trình chiết lectin 41

Hình 2.6 Sơ đồ xác định tỉ lệ rong tươi/bột rong khô và chuẩn bị mẫu rong chiết carrageenan 42

Hình 3.1 Bột rong khô từ rong đỏ B gelatinus 52

Hình 3.2 Carrageenan chiết tự nhiên 58

Hình 3.3 Phổ hồng ngoại của mẫu carrageenan chiết tự nhiên từ rong B gelatinus thu tháng 3/2021 56

Hình 3.4 Phổ hồng ngoại của mẫu carrageenan chiết tự nhiên từ rong B gelatinus thu tháng 5/2021 56 Hình 3.5 Cấu trúc của beta- và kappa-carrageenan từ rong đỏ B gelatinus 60

DANH M ỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1 Các thiết bị chính được sử dụng trong nghiên cứu 34

Bảng 2.2 Các hóa chất chính được sử dụng trong nghiên cứu 35

Bảng 3.1 Tỉ lệ rong tươi/bột rong khô 51

Bảng 3.2 Hàm lượng carrageenan chiết tự nhiên từ rong B gelatinus thu từ

Bảng 3.12 Mối quan hệ giữa các yếu tố môi trường với hàm lượng protein và

hoạt tính của lectin từ rong đỏ B gelatinus thu tháng 3 đến tháng 5/2021 68

M ỤC LỤC

L ỜI CAM ĐOAN

L ỜI CẢM ƠN

DANH M ỤC CÁC HÌNH

DANH M ỤC CÁC BẢNG

M ỤC LỤC 1

M Ở ĐẦU 6

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 9

1.1 TỔNG QUAN VỀ TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU CARRAGEENAN TỪ RONG BIỂN TRÊN THẾ GIỚI 9

1.1.1 Lịch sử nghiên cứu carrageenan 9

1.1.2 Nguồn rong đỏ để sản xuất carrageenan 10

1.1.3 Cấu trúc và tính chất hóa lý của carrageenan 12

1.1.4 Các phương pháp chiết carrageenan 18

1.1.5 Các phương pháp xác định tính chất hóa-lý để đánh giá chất lượng carrageenan 19

1.1.6 Các phương pháp cơ bản phân tích cấu trúc carrageenan 20

1.2 TỔNG QUAN VỀ TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU LECTIN TỪ RONG BIỂN TRÊN THẾ GIỚI 21

1.2.1 Giới thiệu chung về tính chất của lectin từ rong biển 21

1.2.2 Khả năng ứng dụng của lectin 22

1.3 TỔNG QUAN VỀ TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU CARRAGEENAN VÀ LECTIN TỪ RONG BIỂN TRONG NƯỚC 23

1.3.1 Tổng quan về tình hình nghiên cứu carrageenan từ rong biển trong

nước 23

1.3.2 Tổng quan về tình hình nghiên cứu lectin từ rong biển trong nước 24

1.4 TỔNG QUAN CÁC YẾU TỐ MÔI TRƯỜNG ẢNH HƯỞNG ĐẾN TỐC ĐỘ TĂNG TRƯỞNG, HÀM LƯỢNG, CHẤT LƯỢNG CARRAGEENAN VÀ HOẠT TÍNH CỦA LECTIN TỪ RONG ĐỎ CARRAGEENOPHYTE 25

1.4.1 Yếu tố nhiệt độ nước biển 25

1.4.2 Yếu tố nitơ tổng của nước biển 25

1.4.3 Yếu tố phosphate của nước biển 26

1.4.4 Yếu tố độ mặn của nước biển 26

1.5 TỔNG QUAN VỀ TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU RONG ĐỎ B GELATINUS TRÊN THẾ GIỚI VÀ TRONG NƯỚC 26

1.5.1 Vị trí phân loại rong đỏ B gelatinus 26

1.5.2 Phân bố rong đỏ B gelatinus 27

1.5.3 Đặc điểm sinh trưởng 28

1.5.4 Đặc điểm sinh sản 28

1.5.5 Mô tả carrageenan và lectin từ rong đỏ B gelatinus 29

1.5.6 Khả năng sử dụng carrageenan và lectin từ rong đỏ B gelatinus 30

1.5.7 Lý do và mục đích chọn nghiên cứu đối tượng rong đỏ B gelatinus 31

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 33

2.1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 33

2.1.1 Vật liệu nghiên cứu 33

2.1.2 Thiết bị và hóa chất 34

2.2 PHƯƠNG PHÁP THU MẪU 37

2.2.1 Thu mẫu rong 37

2.2.2 Thu mẫu nước 38

2.3 PHƯƠNG PHÁP CHIẾT 39

2.3.1 Phương pháp chiết carrageenan tự nhiên 39

2.3.2 Phương pháp chiết lectin 40

2.4 CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH, XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG VÀ CHẤT LƯỢNG CARRAGEENAN 42

2.4.1 Xác định tỉ lệ rong tươi/bột rong khô 42

2.4.2 Xác định hàm lượng carrageenan 43

2.4.3 Xác định hàm lượng carbohydrate trong carrageenan 43

2.4.4 Xác định hàm lượng 3,6-anhydrogalactose trong carrageenan 43

2.4.5 Xác định hàm lượng sulfate trong carrageenan 44

2.4.6 Xác định các nhóm chức của carrageenan bằng phổ hồng ngoại 45

2.5 PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG PROTEIN VÀ HOẠT TÍNH CỦA DỊCH CHIẾT LECTIN 46

2.5.1 Xác định hàm lượng protein 46

2.5.2 Xác định hoạt tính ngưng kết hồng cầu 47

2.6 CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH YẾU TỐ MÔI TRƯỜNG 48

2.6.1 Phương pháp xác định nitơ tổng 48

2.6.2 Phương pháp xác định phosphate 49

2.6.3 Phương pháp xác định độ mặn và pH của nước biển 49

2.7 CÁC PHƯƠNG PHÁP THỐNG KÊ VÀ ĐÁNH GIÁ MỐI TƯƠNG QUAN 49

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 51

3.1 TỈ LỆ RONG TƯƠI/BỘT RONG KHÔ TỪ RONG ĐỎ B

GELATINUS 51

3.2 HÀM LƯỢNG VÀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CARRAGEENAN CHIẾT TỰ NHIÊN TỪ RONG ĐỎ B GELATINUS 52

3.2.1 Hàm lượng của carrageenan chiết tự nhiên 52

3.2.2 Hàm lượng carbohydrate, 3,6-anhydrogalactose và sulfate của carrageenan chiết tự nhiên 54

3.4 CÁC NHÓM CHỨC ĐẶC TRƯNG TỪ RONG ĐỎ B GELATINUS 56 3.4.1 So sánh các nhóm chức đặc trưng của carrageenan chiết tự nhiên (mẫu thu tháng 3 và tháng 5/2021) 56

3.4.2 Đánh giá sơ bộ cấu trúc của hỗn hợp carrageenan từ rong đỏ B gelatinus 60

3.5 HÀM LƯỢNG PROTEIN VÀ HOẠT TÍNH NGƯNG KẾT HỒNG CẦU CỦA DỊCH CHIẾT LECTIN TỪ RONG ĐỎ B GELATINUS 61

3.5.1 Hàm lượng protein của dịch chiết lectin 61

3.5.2 Hoạt tính ngưng kết hồng cầu của dịch chiết lectin 62

3.6 CÁC YẾU TỐ MÔI TRƯỜNG Ở VỊ TRÍ THU MẪU 63

3.6.1 Hàm lượng nitơ tổng 63

3.6.2 Hàm lượng phosphate 64

3.6.3 Nhiệt độ 65

3.6.4 Độ mặn và pH 66

3.7 ĐÁNH GIÁ MỐI QUAN HỆ GIỮA CÁC YẾU TỐ MÔI TRƯỜNG ĐẶC TRƯNG ẢNH HƯỞNG ĐẾN HÀM LƯỢNG, CHẤT LƯỢNG CỦA CARRAGEENAN CHIẾT TỰ NHIÊN VÀ HÀM LƯỢNG PROTEIN, HOẠT TÍNH NGƯNG KẾT HỒNG CẦU CỦA DỊCH CHIẾT LECTIN TỪ RONG ĐỎ B GELATINUS 67

3.7.1 Đánh giá mối quan hệ của nitơ và nhiệt độ ảnh hưởng đến hàm

lượng và chất lượng của carrageenan chiết tự nhiên 67

3.7.2 Đánh giá mối quan hệ của nitơ và nhiệt độ ảnh hưởng đến hàm lượng protein và hoạt tính ngưng kết hồng cầu của dịch chiết lectin 68

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 69

4.1 KẾT LUẬN 69

4.2 KIẾN NGHỊ 69

TÀI LI ỆU THAM KHẢO 70

PH Ụ LỤC

M Ở ĐẦU

1 LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI

Rong đỏ, carrageenophyte, là những loài rong thực phẩm quan trọng về

mặt kinh tế và được trồng rộng rãi hoặc thu hoạch tự nhiên ở Việt Nam, được

biết đến là nguồn để thu nhận carrageenan và các chất có hoạt tính sinh học như lectin Hàm lượng và chất lượng của carrageenan và lectin ở rong đỏ cũng thay đổi theo mùa, do ảnh hưởng của các yếu tố môi trường tác động đến quá trình phát triển của rong, vì vậy việc nghiên cứu sự thay đổi của hàm lượng, chất lượng carrageenan và hoạt tính lectin theo mùa ở rong đỏ là cần thiết để đề ra kế hoạch nuôi trồng và khai thác hợp lý

Rong đỏ Betaphycus gelatinus là loài rong có giá trị cao, được thị

trường trong nước ưa chuộng, là nguồn nguyên liệu phong phú để nghiên cứu carrageenan và các hợp chất mới từ rong này cho định hướng sử dụng Ở Việt Nam, loài rong này chỉ được khai thác tự nhiên, vùng phân bố của chúng ngày càng thu hẹp và đứng trước nguy cơ tuyệt chủng do tình trạng khai thác quá

mức

Tại tỉnh Ninh Thuận, Việt Nam, rong đỏ B gelatinus được khai thác tự

nhiên từ tháng 3 đến tháng 5 hàng năm theo kinh nghiệm của người dân để làm nguyên liệu cho ngành thực phẩm Tuy nhiên hiện tại chưa có nhiều thông tin đánh giá về hàm lượng, chất lượng carrageenan và hoạt tính lectin

của loài rong B gelatinus thu hoạch trong giai đoạn này như thế nào để làm

cơ sở khoa học cho thu hoạch Trên cơ sở đó, tôi tiến hành nghiên cứu sự thay

đổi của hàm lượng, chất lượng carrageenan và hoạt tính lectin từ rong đỏ B

gelatinus thu hoạch từ tháng 3 đến tháng 5/2021 ở tỉnh Ninh Thuận để làm cơ

sở khoa học định hướng cho quá trình thu hoạch loài rong kinh tế này

3 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU

3.1 Đối tượng nghiên cứu

Hàm lượng, chất lượng carrageenan và hoạt tính của lectin từ rong đỏ

4 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

- Xác định hàm lượng carrageenan, hàm lượng 3,6-anhydrogalactose và

hàm lượng sulfate của carrageenan từ rong đỏ B gelatinus thu hoạch theo

tháng

- Xác định sự có mặt và hoạt tính lectin từ dịch chiết rong đỏ B

gelatinus thu hoạch theo tháng

- Xác định các yếu tố môi trường nhiệt độ, độ mặn, hàm lượng nitơ

tổng và phosphate của mẫu nước thu theo tháng ở vị trí thu mẫu rong B

gelatinus

5 Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI

5.1 Ý nghĩa khoa học

Các kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ cung cấp bổ sung số liệu khoa

học về sự thay đổi hàm lượng, chất lượng carrageenan và hoạt tính lectin từ

rong đỏ B gelatinus thu hoạch tự nhiên từ tháng 3 đến tháng 5 ở Việt Nam

5.2 Tính th ực tiễn của đề tài

Các kết quả đạt được từ đề tài không chỉ đánh giá hàm lượng và chất

lượng carrageenan từ rong đỏ B gelatinus thu hoạch tự nhiên từ tháng 3 đến

tháng 5 nhằm hướng đến khuyến khích người dân thu hoạch rong ở giai đoạn

nào để đạt được hàm lượng và chất lượng cao, mà còn tạo cơ sở khoa học cho việc nuôi trồng và phát triển loài rong này cho các mục đích sử dụng khác

nhau trong thực phẩm hoặc y học

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 TỔNG QUAN VỀ TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU CARRAGEENAN TỪ RONG BIỂN TRÊN THẾ GIỚI

1.1.1 Lịch sử nghiên cứu carrageenan

Carrageenan là tên chung cho một nhóm các polysaccharide sulfate thu được bằng cách chiết rong đỏ, carrageenophyte Cấu trúc của carrageenan bao gồm các dimer D-galactose và 3,6-anhydrogalactose tham gia vào một polymer mạch thẳng với liên kết luân phiên của β-D-Galactosepyranose qua liên kết 1-3 và α-D-Galactosepyranose qua liên kết 1-4 [1] Carrageenan được

sử dụng như một chất keo, chất ổn định và cũng là chất thay thế chất béo trong ngành công nghiệp thực phẩm, đặc biệt là trong các sản phẩm sữa

Các loài rong biển khác nhau chiết xuất ra các loại carrageenan khác nhau Các loài rong có chứa carrageenam xuất hiện hầu hết các vùng biển, những vùng biển nhiệt đới thường được chọn để nuôi trồng các loài rong có carrageenan vì chúng sinh sản nhanh nhất ở các vùng biển ấm như ở Philippines, Indonesia, Ấn Độ, Brazil, nam Trung Quốc và các nước nhiệt đới, cận nhiệt đới khác

Từ những năm 1930, quá trình tách chiết carrageenan nguyên chất đã được tiến hành ở Mỹ Sau thế chiến thứ hai, sự phát triển của ngành công nghiệp thực phẩm dẫn đến nên nhu cầu về carrageenan trên thế giới ngày càng tăng lên Vào những năm 1950, những nghiên cứu về carrageenan đã cho thấy rằng sự khác nhau về các phân đoạn của carrageenan là kết quả của nhiều loại carrageenan khác nhau và cũng trong thời gian này người ta đã xác định được cấu trúc phân tử của carrageenan

Đến ngày nay thì người ta đã biết thêm nhiều loại rong có khả năng sản xuất carrageenan Những nghiên cứu chi tiết về các loài rong này đã cho phép chúng có thể trồng trên quy mô lớn và nhờ đó đáp ứng đươc nhu cầu nguyên liệu cho ngành công nghiệp sản xuất carrageenan

Ngành công nghiệp carrageenan đóng một vai trò quan trọng cho kinh

tế của nhiều hộ gia đình trên toàn thế giới Trồng rong biển để sản xuất các sản phẩm như carrageenan đã trở thành sinh kế ưa thích của nhiều nông dân, đặc biệt là ở vùng khí hậu nhiệt đới vì trồng rong biển cần ít vốn và thiết bị, mất ít thời gian hơn các sản phẩm khác Nông dân có thể duy trì nguồn rong biển của riêng họ, một mặt hàng có lợi nhuận ổn định ở các cộng đồng ven biển ở các nước đang phát triển

1.1.2 Nguồn rong đỏ để sản xuất carrageenan

Các loài rong đỏ Kappaphycus alvarezii, Kappaphycus striatus và

Eucheuma denticulatum là nguồn nguyên liệu chính cho công nghiệp sản xuất carrageenan hiện nay Chúng chỉ được nuôi trồng thành công từ những năm

1970, trước đó người ta sử dụng loài Chondrus crispus là nguyên liệu chính

để sản xuất carrageenan, tuy nhiên sản lượng loài này bị giới hạn do thu

hoạch ngoài tự nhiên đến cạn kiệt mà việc nuôi trồng trong bể lại quá đắt đỏ Việc nuôi trồng 2 loài rong đỏ K alvarezii và K striatus ở vùng nước ấm bắt nguồn từ Philippines, hiện nay đã mở rộng sang các nước vùng Đông Nam Á khác bao gồm Indonesia, Malaysia, Việt Nam và vùng lân cận Ấn Độ, Châu Phi, các đảo Thái Bình Dương Riêng ở Việt Nam, năm 1993, Phân viện Vật

liệu Nha Trang (nay là Viện Nghiên cứu và Ứng dụng công Nghệ Nha Trang)

đã hợp tác di nhập giống rong sụn K alvarezii, tiến hành nghiên cứu nhân

giống và thử nghiệm nuôi trồng ở vùng biển Khánh Hòa, Ninh Thuận Từ đó đến nay nghề nuôi trồng rong sụn phát triển mạnh ở các tỉnh Khánh Hòa, Phú Yên, Ninh Thuận, Bình Định, Kiên Giang, trở thành một nghề mới, góp phần

tạo công ăn việc làm cho hàng ngàn lao động [2]

Rong đỏ tươi thường có màu đỏ hoặc màu xanh đỏ nâu do trong rong

có hai loại sắc tố là phycobilin (bao gồm phycocyanine có màu xanh tím, phycocythine có màu đỏ) và chlorophyll Rong carrageenophyte thuộc loài

đơn trụ chia thành 2 phần gồm phần lõi và phần da:

- Phần lõi: gồm một tế bào trung trụ chạy dọc thân từ gốc đến ngọn Xung quanh có từ 3 – 4 hàng tế bào vây trụ có kích thước lớn, hình tròn hay hình đa giác, trong suốt, vách mỏng chứa các chất dinh dưỡng (carrageenan)

- Phần da: gồm nhiều tế bào nhỏ sắp xếp khít nhau, hình tròn hay hình bầu dục, không trong suốt, chứa đầy sắc tố Ngoài cùng là lớp vỏ keo chứa cellulose, chiếm khoảng 4 % trọng lượng rong khô, đóng vai trò bảo vệ các lớp bên trong [3]

Ngày nay, sản xuất công nghiệp carrageenan không còn giới hạn vào chiết tách từ C crispus, mà rất nhiều loài rong đỏ thuộc ngành Rhodophyta đã

được sử dụng Những loài này gọi chung là carrageenophyte

Qua nhiều nghiên cứu, đã có hàng chục loài rong biển được khai thác

tự nhiên hay nuôi trồng để sản xuất carrageenan Tóm lại, carrageenan là một

sản phẩm tự nhiên được chiết xuất từ nguyên liệu là rong đỏ thuộc họ

Rhodophyceae, chủ yếu thuộc chi Chondrus, Eucheuma, Gigartina và

Iridaea

Mặc dù carrageenan được giới thiệu ở quy mô công nghiệp vào những năm 1930, nhưng chúng lần đầu tiên được sử dụng ở Trung Quốc vào khoảng

năm 600 trước Công nguyên (nơi Gigartina được sử dụng) và ở Ireland vào

khoảng năm 400 sau Công nguyên [4, 5] Tính đến năm 2019, doanh số toàn cầu của carrageenan ước tính khoảng 741,9 triệu đô la [6] Trong đó, các sản

phẩm từ kappa-carrageenan chiếm đến khoảng 70% [6]

Các nguồn rong được sử dụng phổ biến nhất là Eucheuma cottonii (K

alvarezii , K striatus) và Eucheuma spinosum (E denticulatum) đã cung cấp khoảng ba phần tư sản lượng rong chế biến carrageenan thế giới Chúng phát triển từ mặt biển đến độ sâu khoảng 2 m Rong đỏ thường được trồng trên các dây nylon căng giữa phao tre, và nó được thu hoạch sau ba tháng hoặc lâu hơn, khi mỗi cây nặng khoảng 1 kg

Giống E cottonii đã được phân loại lại thành K cottonii bởi Maxwell Doty (1988), qua đó giới thiệu chi Kappaphycus, trên cơ sở các loại

phycocolloids được sản xuất (cụ thể là kappa-carrageenan)

1.1.3 C ấu trúc và tính chất hóa lý của carrageenan

1.1.3.1 C ấu trúc hóa học chung của carrageenan

Carrageenan có cấu trúc chung gồm D-galactose và anhydrogalactose tham gia vào một polymer mạch thẳng với liên kết luân phiên của β-D-Galactosepyranose qua liên kết 1-3 và α-D-Galactosepyranose qua liên kết 1-4 (Hình 1.1)

3,6-Hình 1.1 Cấu trúc chung của carrageenan [7]

Carrageenan có thể phân thành các loại như sau: mu, kappa, nu, iota, lambda, theta, beta và xi Các loại carrageenan này chỉ khác nhau ở mức độ sulfate hoá, vị trí sulfate hoá, mức độ dehydrate hoá của chuỗi polysaccharide, các loại carrageenan được mô tả trong Hình 1.2

Hình 1.2 Cấu trúc của các dạng carrageenan [8]

Carrageenan chiết tự nhiên từ các loài rong khác nhau có thể là hỗn hợp khác nhau của các loại carrageenan đã nêu ở trên Người ta phân chia carrageenan ra hai nhóm chính: nhóm 1 chứa các loại mu, nu, kappa, iota, beta và các dẫn xuất của chúng Các carrageenan thuộc nhóm này tạo gel với ion K+ hoặc có thể xử lý kiềm để có tính chất tạo gel, chúng có đặc điểm là gốc đường có liên kết 1,3 hoặc không có nhóm sulfate hoá ở vị trí C4 Nhóm thứ 2 là lambda, xi, theta và các dẫn xuất của chúng Các carrageenan ở nhóm này không có khả năng tạo gel ngay cả trước và sau khi xử lý kiềm Đặc trưng của cấu trúc ở nhóm này là cả hai loại gốc đường liên kết 1,4 và 1,3 đều có nhóm sulfate ở ví trí C2 Ngoài ra, thành phần của carrageenan gồm có HOSO3-, Ca2+ và 3,6-anhydro D-Galactose Dạng tồn tại của carrageenan trong rong đỏ gắn với Ca2+, K+, Na+ như: R=(OSO3)2Ca hoặc R-OSO3Na, ROSO3K (R là gốc polysaccharide) Hàm lượng sulfate cũng ảnh hưởng đến sức đông của carrageenan [9]

Hiện nay carrageenan có 3 loại phổ biến là: kappa-carrageenan, lambda-carrageenan, iota-carrageenan, trong đó kappa-carrageenan chiếm thị phần lớn nhất (70 %) Sự khác nhau của các loại carrageenan trên ở vị trí và

số lượng nhóm ester sulfate đính vào chuỗi polysaccharide, do đó mỗi loại có tính chất vật lý và hoá học đặc trưng khác nhau [9]

Hai thành phần hóa học ảnh hưởng lớn đến chất lượng của carrageenan

là hàm lượng 3,6-anhydrogalactose và hàm lượng sulfate:

- Hàm lượng 3,6-anhydrogalactose trong thành phần carrageenan ảnh hưởng đến độ bền gel, hàm lượng 3,6-anhydrogalactose càng cao thì độ bền gel càng lớn và ngược lại

- Hàm lượng sulfate ảnh hưởng đến độ nhớt của carrageenan, hàm lượng sulfate càng cao thì độ nhớt càng lớn và ngược lại

Trong công nghiệp, người ta thiết kế quy trình chiết xuất nhằm đạt được carrageenan có hàm lượng 3,6-anhydrogalactose và hàm lượng sulfate theo nhu cầu về độ bền gel và độ nhớt tương ứng

1.1.3.2 Tính chất của carrageenan

- Ảnh hưởng của môi trường kiềm

Môi trường kiềm có ảnh hưởng lớn đến trạng thái cấu tạo hoá học của carrageenan, cụ thể trong môi trường kiềm, nhóm (OSO3-) bị khử tách dần khỏi cấu trúc của carrageenan Tùy thuộc vào mức độ tách nhóm (OSO3-) từ carrageenan ban đầu sẽ hình thành nên cấu trúc của một loại carrageenan khác với ban đầu [9, 10, 11]

- Mang điện tích âm

Carrageenan là một polymer mang điện tích âm nên bị ngưng kết khi

có mặt của các đại phân tử mang điện tích dương như: methylen xanh, safranine, phẩm màu azo thiazo khác, tính chất này giống như một vài alkaloid và protein Mặt khác, carrageenan còn có khả năng kết tủa khi có mặt của ethanol nồng độ cao (ethanol đóng vai trò là tác nhân dehydrate hoá) Do vậy, người ta có thể sử dụng ethanol nồng độ cao để kết tủa thu carrageenan [9, 10, 11]

- Tính tan

Carrageenan là hợp chất cao phân tử (polysaccharide) có cực nên hydrate hóa và hòa tan tốt trong môi trường có cực, chẳng hạn như nước Khi carrageenan hút nước sẽ xảy ra hiện tượng hydrate hóa và dẫn tới sự hòa tan Khi hòa tan trong nước, carrageenan tạo thành dung dịch lỏng, sánh Do vậy, người ta sử dụng đặc tính này để làm tăng khả năng ổn định của các hỗn hợp thực phẩm lỏng hay dung dịch thực phẩm hoặc làm tăng khả năng hydrate hóa của các loại thuốc [12]

Carrageenan tan trong anhydrous hydrazine (N2H4), ít tan trong formamide (CH3NO) và methyl sulfoxide ((CH3)2SO), không tan trong dầu và dung môi hữu cơ

- S ự tạo gel (gelation)

Khả năng keo hoá của carrageenan nằm trung gian giữa agar và gelatin, gần giống gelatin hơn Sự hình thành gel của dung dịch carrageenan là một

quá trình nhiệt thuận nghịch Khi nhiệt độ cao hơn giá trị nhiệt độ tạo gel thì gel sẽ tan (cân bằng bị phá vỡ) Khả năng hình thành gel của carrageenan phụ thuộc vào nhiệt độ và nồng độ dung dịch, loại và số lượng muối có mặt trong dung dịch Ngoài ra, tính chất tạo gel còn phụ thuộc vào loài rong, công nghệ sản xuất, hàm lượng 3,6-anhydrogalactose và hàm lượng sulfate

- Tính bền acid

Trong môi trường có pH thấp cùng với sự tác dụng của nhiệt độ cao thì

sự thuỷ phân carrageenan xảy ra nhanh hơn Vì vậy, nên tránh chế biến dung

dịch carrageenan ở pH thấp và nhiệt độ cao trong thời gian dài

- Các nhóm ch ức trong carrageenan

Dung dịch carrageenan là một chất hữu cơ, nên có khả năng tạo các đỉnh hấp thụ trong phổ hồng ngoại ở các bước sóng nhất định, phụ thuộc vào loại và thành phần carrageenan Dựa vào tính chất này, người ta có thể biết được carrageenan thuộc loại kappa-, iota-, lambda-, beta-carrageenan…

- Tính thu ỷ phân và sự methyl hoá xác định công thức cấu tạo của

carrageenan

Dung dịch carrageenan ít bị thủy phân ở môi trường pH từ 7 - 9 Carrageenan, đặc biệt kappa-carrageenan dễ bị thuỷ phân bởi enzyme kappa carrageenase hay kappa-carovora Khi carrageenan (kappa-, lambda-) bị thuỷ phân bởi enzyme để tạo thành các oligo kappa-carrageenan thì độ nhớt của dung dịch giảm rất nhiều và làm tăng khả năng khử, tạo các sản phẩm thuộc dãy đồng đẳng của oligosaccharide sulfate, 3-6-(3,6-anhydrose-D-galactosepyranose)–D–galactose–4–6-sulfate-(neocarrabiose–4–O-sulfate)

Carrageenan bị methyl hoá tạo ra các dẫn xuất methyl như methyl-D (L)-galactose hoặc 2,4,6-tri-methyl-D (L)-galactose và dựa vào đặc tính này người ta đã xác định thành phần cấu trúc của nó

2,3,4,6-tetra Độ nhớt

Độ nhớt của dung dịch carrageenan phụ thuộc rất lớn vào loại carrageenan, hàm lượng sulfate, khối lượng phân tử, nồng độ carrageenan,

nhiệt độ dung dịch và các yếu tố ảnh hưởng khác như sự có mặt của các muối trong dung dịch Độ nhớt dung dịch tỷ lệ thuận với nồng độ dung dịch và tỷ lệ nghịch với nhiệt độ Sử dụng khả năng tạo độ nhớt của carrageenan, trong thực phẩm, dược phẩm carrageenan được sử dụng như chất ổn định để làm tăng độ nhớt của pha liên tục, từ đó chúng đảm bảo chất béo không bị phân riêng trong dung dịch [13]

1.1.3.3 Sử dụng carrageenan

- Trong th ực phẩm

Carrageenan đóng vai trò là chất phụ gia trong thực phẩm để tạo đông

tụ, tạo tính mềm dẻo, tính đồng nhất cho sản phẩm Carrageenan được dùng trong các món ăn trong thực phẩm: các món thạch, hạnh nhân, nước uống…

Carrageenan còn được sử dụng là một chất để điều chỉnh độ chắc, trạng thái, tính chất cảm quan… của thực phẩm Chức năng của nó là tạo nhũ tương, keo tụ và tính kết nối

- Trong y dược và dược phẩm

Carrageenan được dùng để sản xuất các loại dược phẩm quan trọng, carrageenan là chất nhũ hóa trong ngành dược phẩm để sản xuất các loại sản

phẩm như: các loại thuốc dạng nhờn, nhũ tương để thoa lên các vết thương làm vết thương mau lành, làm màng bao cho thuốc

- Trong các ngành khác

Giữ cố định enzyme và tế bào: carrageenan là môi trường cố định enzyme, là chất xúc tác trong công nghiệp tổng hợp và chuyển hóa các chất khác

Hỗn hợp iota-carrageenan và kappa-carrageenan và các chất tạo nhũ tương được bổ sung vào dung dịch sơn nước để tạo độ đồng nhất, khả năng nhũ hóa tốt hơn cho sơn

Bổ sung vào kem đánh răng để chống lại sự tách lỏng, sự bào mòn trạng thái, tạo các đặc tính tốt cho sản phẩm

1.1.4 Các phương pháp chiết carrageenan

1.1.4.1 Chiết carrageenan tự nhiên

Chiết carrageenan tự nhiên theo phương pháp của Hellebust và Craige (1978) [14] Bột rong khô được chiết với dung dịch NaHCO3ở 90 °C trong 2

giờ với sự khuấy trộn thường xuyên Hỗn hợp được lọc thô qua túi vải và lọc tinh bằng lọc hút chân không với chất trợ lọc diatomite Dịch lọc được kết tủa

với cetyltrimethylammonium bromide (Cetavlon) Ly tâm thu tủa và rửa tủa

với dung dịch CH3COONa bão hòa để loại bỏ Cetavlon, và rửa tủa với ethanol 95 % để loại bỏ CH3COONa Thu hồi carrageenan và làm khô

Chiết carrageenan tự nhiên chủ yếu được thực hiện trong phòng thí nghiệm, nhằm khảo sát hàm lượng và chất lượng carrageenan trong mẫu rong

để cung cấp cơ sở khoa học phục vụ cho công tác nghiên cứu hoặc sản xuất công nghiệp

1.1.4.2 Chiết carrageenan bằng phương pháp xử lý kiềm

Theo phương pháp của Renn (1993) [15] Rong được xử lý với dung dịch kiềm nóng thường là KOH ở nồng độ từ 6 – 20 % với mục đích loại bỏ tinh bột, các chất hòa tan trong dung dịch kiềm và đặc biệt là nâng cao hàm lượng 3,6-anhydrogalactose trong rong Sau khi xử lý rong được rửa sạch kiềm về pH gần trung tính và được chiết với nước nóng [16]

Chiết carrageenan bằng phương pháp xử lý kiềm là phương pháp chính trong quá trình sản xuất carrageenan ở quy mô công nghiệp Nồng độ kiềm có thể thay đổi nhằm thu được carrageenan có chất lượng phù hợp với nhu cầu

sử dụng

1.1.5 Các phương pháp xác định tính chất hóa-lý để đánh giá chất lượng carrageenan

1.1.5.1 Các phương pháp xác định tính chất hóa học

- Xác định hàm lượng carbohydrate trong carrageenan:

Theo phương pháp của Dubois (1956) [17], dùng D-galactose làm chuẩn Lấy dung dịch chuẩn ở các nồng độ galactose từ khác nhau cho vào

mỗi ống nghiệm, trộn đều với dung dịch mẫu Thêm vào mỗi ống nghiệm dung dịch phenol, lắc đều các ống nghiệm và giữ trong 10 phút ở nhiệt độ phòng Thêm dung dịch H2SO4 đậm đặc, lắc đều các ống nghiệm và giữ các ống nghiệm trong chậu nước lạnh trong 20 phút và đo độ hấp thụ ở bước sóng

490 nm

- Xác định hàm lượng 3,6-anhydrogalactose trong carrageenan:

Theo phương pháp của Yaphe, Arsenault (1965) [18], dùng D-fructose làm chuẩn Lấy dung dịch chuẩn, nước cất và dung dịch mẫu cho vào ống nghiệm Làm lạnh các ống nghiệm trong đá, sau đó thêm thuốc thử resorcinol-acetal lạnh vào mỗi ống nghiệm Trộn đều các ống nghiệm và đun

ở 80 oC trong 10 phút Làm lạnh ống nghiệm trong chậu đá và đo độ hấp thụ ở bước sóng 555 nm

Hàm lượng của 3,6-anhydrogalactose được xác định với chuẩn fructose và theo hệ số giữa 3,6-anhydrogalactose/D-fructose

D Xác định hàm lượng sulfate trong carrageenan:

Theo phương pháp của Terho, Hartiala (1971) [19], dùng Na2SO4 làm chuẩn

Lấy dung dịch chuẩn, dung dịch mẫu và nước cất cho vào các ống nghiệm, thêm ethanol 96 % vào các ống nghiệm, trộn đều Sau đó, thêm dung

dịch đệm BaCl2 và dung dịch rhodizonate sodium, trộn đều Giữ các ống nghiệm trong tối ở nhiệt độ phòng trong 10 phút và đo độ hấp thụ ở bước sóng 520 nm

1.1.5.2 Xác định tính chất vật lý của carrageenan

Xác định nhiệt độ đông và nhiệt độ tan và độ bền gel của carrageenan theo phương pháp của Hellebust, Craige (1978) [15]

- Xác định nhiệt độ đông của carrageenan:

Cho vào mỗi ống nghiệm dung dịch carrageenan 1,5 % và giữ các ống nghiệm trong bể điều nhiệt Hạ nhiệt độ của bể điều nhiệt cho đến khi đặt các viên bi thuỷ tinh rơi xuống giữa ống nghiệm và dừng lại, ghi nhận nhiệt độ đông

- Xác định nhiệt độ tan của carrageenan:

Cho vào mỗi ống nghiệm dung dịch carrageenan 1,5 % và giữ các ống nghiệm ở nhiệt độ phòng để tạo gel hoàn toàn Đặt lại các ống nghiệm trong

bể điều nhiệt, đặt các viên bi thuỷ tinh trên bề mặt gel và tiến hành nâng nhiệt

độ bể điều nhiệt cho đến khi nào viên bi rơi xuống đáy ống nghiệm, ghi nhận nhiệt độ tan

- Xác định độ bền gel của carrageenan:

Đổ dung dịch carrageenan 1,5 % vào đĩa petri để tạo gel Sau khi mẫu gel đông ở nhiệt độ phòng, mẫu được đặt vào máy đo sức đông với đầu dò có

diện tích tiếp xúc 1 cm2 Các quả cân có khối lượng khác nhau được đặt lên máy cho đến khi đầu dò phá vỡ bề mặt gel

1.1.6 Các phương pháp cơ bản phân tích cấu trúc carrageenan

1.1.6.1 Phương pháp phổ hồng ngoại xác định cấu trúc của carrageenan

Đây là một phương pháp đơn giản, thuận tiện được sử dụng để nghiên cứu cấu trúc của carrageenan Phép đo này chỉ đòi hỏi một vài milligam mẫu khô được sấy, nghiền và trộn với bột KBr theo tỷ lệ 1:10 Tiến hành đo mẫu, các đặc trưng nhóm chức của một loại carrageenan cho trước được đánh giá tại các số sóng đặc trưng S=O của ester sulfate tại 1240cm-1, CO của 3,6-anhydro-D-galactose tại 930 – 940 cm-1 C-O-S của sulfate axial thứ hai ở C-4

của galactose tại 845cm-1 C-O-S của sulfate equatorial thứ hai ở C-2 của galactose tại 830cm-1 C-O-S của sulfate equatorial thứ nhất ở C-6 của galactose tại 820cm-1 C-O-S của sulfate axial thứ hai ở C-2 của 3,6 anhydro-D- galactose tại 805cm-1 [20]

Dải hấp thụ tại 895-900 cm-1 cũng xuất hiện trên phổ IR của carrageenan Dải này thường không xuất hiện trên phổ của các carrageenan không được desulfate hoá [21] Đây chính là điểm phân biệt giữa carrageenan

κ-và các agar Các peak đặc trưng chính đã có thể đo được trong rong khô ban đầu (carrageenan chiếm 50 – 70%) hoặc sau các phân đoạn chiết carrageenan Các thành phần ít, ở nồng độ 5 - 7% trọng lượng cũng có thể xác định bằng cách sử dụng kĩ thuật này

1.6.1.2 Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân xác định cấu trúc của carrageenan

Phổ 1H-NMR của polysaccharide có thể khẳng định độ tinh khiết của mẫu (không có mặt của các tín hiệu các oligonucleotide, protein hay lipid) [22] Phổ cũng có thể cho biết số monosaccharide thực từ số các cộng hưởng proton anomer thông qua các tín hiệu trong khoảng 4,4 đến 5,8 ppm Như vậy, dựa vào tỷ lệ tích phân tương đối của các cộng hưởng anome cũng có thể đánh giá tỷ lệ phân tử của các monosaccharide Về mặt này kết quả phân tích hoá học có thể phù hợp với kết quả phân tích 1H NMR Nhìn chung, kết quả tính tích phân NMR là chính xác so với kết quả phân tích hoá học

1.2 TỔNG QUAN VỀ TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU LECTIN TỪ RONG BIỂN TRÊN THẾ GIỚI

1.2.1 Giới thiệu chung về tính chất của lectin từ rong biển

Lectin là các protein hoặc glycoprotein có khả năng liên kết thuận nghịch với carbohydrate nhưng không làm thay đổi cấu trúc cộng hóa trị của carbohydrate [8] Liên kết giữa lectin và carbohydrate bao gồm các liên kết như tương tác kỵ nước, liên kết hydro và liên kết Val der Waal [23] Lectin còn có khả năng ngưng kết các dạng hồng cầu của người và các loài động vật

khác [24], đặc tính ngưng kết hồng cầu của lectin là yếu tố đặc trưng để phân biệt lectin với các protein khác

Trong tự nhiên, lectin có mặt trong nhiều loại các sinh vật như động

vật, thực vật bậc cao, tảo, nấm, động vật nguyên sinh, nấm men, nấm, san hô [25] Do có khả năng liên kết đặc hiệu với các cấu trúc carbohydrate khác nhau trên bề mặt tế bào ung thư hoặc trên lớp vỏ vi khuẩn và virus, lectin không chỉ được dùng như thuốc thử trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu mà còn

hứa hẹn trong các liệu pháp chữa bệnh ung thư và kháng virus [26]

Trong vài thập niên qua, đã có nhiều công bố về kết quả sàng lọc lectin

từ rong biển ở các khu vực khác nhau trên thế giới như ở Anh [27, 28], Nhật

bản [29], Tây Ban Nha [30], Hoa Kỳ [31], Brazil [32, 33, 34], Pakistan [35], Trung Quốc [36], Việt Nam [37, 38], Ấn độ [39], Nam cực [40] và hơn 800

mẫu rong biển đã được sàng lọc hoạt tính ngưng kết hồng cầu, trong số đó khoảng 60 % mẫu được thông báo có chứa lectin, tuy nhiên số lượng lectin được tinh chế vẫn còn ít so với lectin từ thực vật bậc cao Các nghiên cứu về đặc tính cho thấy rằng lectin từ rong biển khác với lectin từ thực vật bậc cao trong các tính chất hóa-lý và hóa sinh Hầu hết lectin từ rong biển có một số đặc tính chung như tồn tại ở dạng monomer, có khối lượng phân tử nhỏ hơn lectin từ các nguồn khác, bền nhiệt và hoạt tính không bị ảnh hưởng bởi các kim loại hóa trị 2, có ái lực cao với các glycoprotein nhưng không với các monosaccharide [41, 42] Do có khối lượng phân tử thấp, vì vậy khi sử dụng lectin từ rong biển trong y học ít tạo ra kháng nguyên so với lectin từ các nguồn khác [43]

1.2.2 Khả năng ứng dụng của lectin

Lectin từ rong biển đã được chứng minh sở hữu một số hoạt tính sinh

học như: lectin GRFT từ rong đỏ Griffithsia sp., đã chứng minh có hoạt tính

mạnh kháng virus HIV với các giá trị ức chế trong phạm vi picomole [44]

hoặc lectin từ rong Eucheuma serra (ESA-2) và K alvarezii (KAA-2) cũng

đã cho thấy hoạt tính mạnh kháng virus HIV ở giá trị IC50 từ 7,3 đến 12,9 nM [45, 46] kháng virus cúm với EC50 ở mức độ nano [45], kháng ung thư như

lectin ESA gây chết tế bào ung thư ruột kết ở người (Colo201) và ung thư cổ

tử cung ở người (tế bào HeLa) [47], lectin từ rong Sagittaria filiformis đặc

hiệu đối với oligosacaride dạng high-mannose đã ức chế sự phát triển của tế bào ung thư vú MCF-7 với giá trị IC50 = 125 µg/ml [48] Các kết quả chỉ ra

rằng lectin từ rong biển hứa hẹn trở thành thuốc kháng virus trong tương lai

Hàm lượng protein trong rong biển đã được chứng minh có sự thay đổi theo các tháng trong năm, thường có hàm lượng cao hơn vào các tháng mùa

đông và thấp hơn vào các tháng mùa hè như Gracilaria gracilis ở Ý [49],

Grateloupia turuturu ở Pháp [50, 51], Agarophyton vermiculophyllum ờ Bồ Đào Nha [52], K alvarezii và K striatus ở Việt Nam [53, 54]

1.3 TỔNG QUAN VỀ TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU CARRAGEENAN VÀ LECTIN TỪ RONG BIỂN TRONG NƯỚC

1.3.1 Tổng quan về tình hình nghiên cứu carrageenan từ rong biển trong nước

Tại vùng biển Việt Nam có hơn 800 loài rong biển thuộc tất cả các bộ

của các ngành rong đã được công bố trên thế giới, trong đó có gần 40 loài

rong đỏ chứa carrageenan với hàm lượng cao Rong đỏ, K striatus, K

alvarezii và E denticulatum là các loài rong kinh tế, đang được nuôi trồng

rộng rãi ở nước ta cho mục đích sử dụng làm thực phẩm hoặc làm nguồn nguyên liệu để sản xuất carrageenan Nước ta là một nước nhiệt đới, có bờ

biển dài với khí hậu thuận lợi cho việc nuôi trồng và phát triển nhiều loại rong

có giá trị kinh tế cao Kể từ khi du nhập vào nước ta từ năm 1993 cây rong

sụn (K alvarezii Maxwell Doty, 1972) tỏ ra thích hợp với khí hậu Việt Nam,

đặc biệt là ở các tỉnh miền trung

Hiện nay, nguồn nguyên liệu carrageenan tại Việt Nam chủ yếu từ các loài rong sụn đã được nuôi trồng rộng rãi như K alvarezii, K striatus, E

denticulatum Các loài rong này được nuôi trồng tại các tỉnh ven biển Việt Nam từ Đà Nẵng đến Kiên Giang Tại Khánh Hòa rong được nuôi trồng nhiều

ở Cam Ranh, vịnh Vân Phong, Ninh Hòa và xung quanh đảo Trường Sa Rong sụn thường được trồng theo mô hình kết hợp với nuôi các loài thủy sản

khác, đây là dạng mô hình nuôi trồng kết hợp đang được quan tâm phát triển

ở nước ta hiện nay [55]

Các nghiên cứu về biến động của hàm lượng và chất lượng carrageenan

của các loài rong được nuôi trồng phổ biến ở Việt Nam đã chỉ rõ hàm lượng carrageenan biến động từ 45,6 – 49,8 % ở rong K alvarezii [53], hàm lượng

carrageenan biến động từ 25,1 – 28,7 % và độ bền gel từ 555 – 935 g.cm⁻² trong nghiên cứu từ tháng 11/2014 đến tháng 9/2015 ở rong K striatus [54]

Tuy nhiên chưa có nghiên cứu nào về sự thay đổi hàm lượng và chất lượng carrageenan từ loài rong B gelatinus được thu hoạch tự nhiên

1.3.2 Tổng quan về tình hình nghiên cứu lectin từ rong biển trong nước

Với toàn bộ lãnh thổ nằm trong vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới và có đường bờ biển dài khoảng 3.260 km, Việt Nam sở hữu sự đa dạng rất lớn của các loài sinh vật biển Sự đa dạng này là tiềm năng khai thác các hợp chất hoạt tính sinh học từ các loài sinh vật biển, bao gồm lectin Tuy nhiên cho đến nay các công bố về lectin từ sinh vật biển ở nước ta vẫn còn hạn chế, chỉ có

một vài công bố của Viện Nghiên cứu và Ứng dụng công nghệ Nha Trang dựa trên kết quả sàng lọc hemagglutinin từ rong biển Việt Nam và động vật thân

mềm biển [37, 29, 56], tinh chế và mô tả đặc tính của lectin từ rong đỏ K

alvarezii , K striatus, E denticulatum, G salicornia, H eucheumatoides và từ

bọt biển Stylissa flexibilis [57, 58, 59, 60, 61, 62], các dòng cDNA mã hóa

lectin từ rong K striatus và E denticulatum [58, 63, 64]

Về sự biến động qua các tháng trong năm của hàm lượng protein và

hoạt tính ngưng kết hồng cầu của dịch chiết lectin từ các loài rong ở Việt Nam, chỉ có nghiên cứu từ các rong đỏ đang nuôi trồng K alvarezii và K

striatus, chỉ ra sự khác biệt đáng kể giữa các mùa, thường có hàm lượng và

hoạt tính cao hơn vào các tháng mùa lạnh từ tháng 8 đến tháng 3 năm sau và

hàm lượng thấp hơn từ tháng 4 đến tháng 9 [53, 54]

Nhờ sự phong phú, đa dạng các loài rong biển, cùng với các hợp chất

có hoạt tính sinh học chiết xuất từ chúng, rong biển Việt Nam đang là nguồn

tiềm năng để khai thác các hợp chất có hoạt tính sinh học bao gồm lectin để

sử dụng trong các lĩnh vực thực phẩm, y sinh, hóa sinh và nuôi trồng thủy sản Chính vì vậy, các nghiên cứu về sự thay đổi của hàm lượng protein và hoạt tính lectin ở một số loài rong đỏ là cần thiết để làm cơ sở khoa học cho các nghiên cứu sâu hơn về khả năng khai thác, nuôi trồng rong biển và ứng dụng

của lectin chiết xuất từ chúng

1.4 TỔNG QUAN CÁC YẾU TỐ MÔI TRƯỜNG ẢNH HƯỞNG ĐẾN TỐC ĐỘ SINH TRƯỞNG, HÀM LƯỢNG, CHẤT LƯỢNG CARRAGEENAN VÀ HOẠT TÍNH CỦA LECTIN TỪ RONG ĐỎ CARRAGEENOPHYTE

Các yếu tố môi trường như nhiệt độ, độ mặn, cường độ ánh sáng, pH, hàm lượng các muối dinh dưỡng được biết đến là các yếu tố ảnh hưởng lớn

tới quá trình sinh trưởng của rong biển, qua đó ảnh hưởng đến hàm lượng cũng như chất lượng các hoạt chất sinh học chiết xuất từ chúng Dưới đây là một số nghiên cứu về các yếu tố môi trường ảnh hưởng đến sinh trưởng của các loài rong thuộc chi Kappaphycus và Eucheuma nuôi trồng tại chỗ và B

gelatinus nuôi trồng trong phòng thí nghiệm

1.4.1 Yếu tố nhiệt độ nước biển

Nhiệt độ nước biển có ảnh hưởng lớn đến sự phát triển của rong nuôi trồng, carageenophyte, K alvarezii, K striatus và E denticulatum đã được công bố nằm trong khoảng từ 24,6 – 28,8o C [53, 54, 65, 66] Trong nghiên

cứu về rong K alvarezii và K striatus tại Việt Nam [53, 54], nhiệt độ nước

biển được xác định là yếu tố có ảnh hưởng lớn đến tốc độ sinh trưởng của

rong, hàm lượng protein và hoạt tính lectin Ở rong B gelatinus nuôi trồng

trong điều kiện phòng thí nghiệm, chúng phát triển tốt ở nhiệt độ khoảng 24 –

28 oC [67, 68, 69]

1.4.2 Yếu tố nitơ tổng của nước biển

Hàm lượng nitơ tổng đã được thông báo cho nuôi trồng rong K

alvarezii và rong K striatus ở vùng biển vịnh Cam Ranh và vịnh Vân Phong, Khánh Hòa, Việt Nam, từ 29,4 – 93,8 µgN/L [53, 54, 70] Trong nghiên cứu

về rong K alvarezii và K striatus tại Việt Nam [53, 54], hàm lượng nitơ tổng

là yếu tố có ảnh hưởng lớn đến tốc độ sinh trưởng của rong, hàm lượng protein và hoạt tính lectin

1.4.3 Yếu tố phosphate của nước biển

Hàm lượng phosphate đã được thông báo cho nuôi trồng rong K

alvarezii và rong K striatus ở vùng biển vịnh Cam Ranh và vịnh Vân Phong, Khánh Hòa, Việt Nam từ 7 – 41 µgP/L [53, 54, 70] Hàm lượng phosphate trong nước biển không ảnh hưởng nhiều đến tốc độ sinh trưởng, hàm lượng protein và hoạt tính lectin ở rong K alvarezii nuôi trồng tại Việt Nam [53]

1.4.4 Yếu tố độ mặn của nước biển

Phạm vi độ mặn độ để rong eucheumatoid phát triển là từ 29,3 – 34,3

‰ và từ pH [53, 54, 65, 70, 71, 72] Ở nghiên cứu nuôi trồng rong B

gelatinus trong điều kiện phòng thí nghiệm, độ mặn trung bình để rong phát triển tốt nhất là 30 – 35 ‰ [67, 68, 69] Độ mặn cũng là một yếu tố quyết định đến tốc độ sinh trưởng của rong biển, tuy nhiên ở vùng biển xa các cửa sông và không bị bao bọc trong các vịnh, đầm, phá, độ mặn ít thay đổi qua các tháng trong năm và ảnh hưởng không lớn đến quá trình phát triển của rong

1.5 TỔNG QUAN VỀ TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU RONG ĐỎ B

1.5.1 Vị trí phân loại rong đỏ B gelatinus

Loài: Betaphycus gelatinus

Tên Việt Nam: Rong hồng vân

Hình 1.3 Rong đỏ B gelatinus

Rong đỏ B gelatinus (Esper) Doty trước đây có tên Eucheuma

gelatinae (Esper) J.Agardh 1847, được phân loại vào chi Betaphycus vào năm

1996 do trong thành phần có chứa beta-carrageenan [73]

1.5.2 Phân bố rong đỏ B gelatinus

B gelatinus sống ở nơi có sóng gió mạnh, độ sâu 1 – 3m tùy thủy triều, nơi nền đáy san hô phong phú, có nhiều loài rong đỏ, rong lục phân bố đa

dạng, môi trường ít thiên địch như rùa, cá

B gelatinus phân bố ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới như: miền đông Indonesia, Philippines, Việt Nam, miền nam Trung Quốc, miền nam

1.5.3 Đặc điểm sinh trưởng

Rong biển hấp thụ các nguồn dinh dưỡng nitơ, phospho trong môi

trường nước để chuyển hóa thành chất hữu cơ cho cơ thể rong Rong B

gelatinus phát triển tốt ở những thủy vực nước trồi, nơi thường có hàm lượng dinh dưỡng cao

Một số nghiên cứu về B gelatinus trong phòng thí nghiệm đã chỉ ra

rằng chúng phát triển tốt ở nhiệt độ khoảng 24 – 28 oC, độ mặn trung bình 30 – 35 ‰, độ trong cao, cường độ ánh sáng 100 μmol photon m-2.s-1) [67, 68, 69], Rong đỏ B gelatinus sinh trưởng tốt ở môi trường ít thiên địch như cầu

gai, rùa biển, cá

Rong đỏ B gelatinus là rong sống nhiều năm, phát triển tốt nhất từ

tháng 3 đến tháng 6 [74] Tuy nhiên thời gian phát triển của rong còn tùy thuộc vào điều kiện môi trường của từng năm [55, 75, 76]

1.5.4 Đặc điểm sinh sản

Vòng đời và sinh sản của B gelatinus nói riêng và một số loài rong đỏ

nói chung bao gồm sự luân phiên của ba thể (Hình 1.4): tứ bào tử (tetrasporophyte), giao tử (gametophyte) đực và cái, bào tử quả (carposporophyte hay cystocarp) Cây tứ bào tử (thể 2N) và cây giao tử quả (thể đơn bội 1N) có kích thước lớn và đồng hình (chúng giống nhau về hình dạng tản) Bào tử quả (thể 2N) có kích thước rất nhỏ và sinh trên cây giao tử cái

Hình 1.4 Vòng đời của B gelatinus [77]

Trong tự nhiên, B gelatinus sinh sản theo các hình thức sau: sinh sản

sinh dưỡng (vegetive reproduction) bằng các đoạn thân nhánh của cây rong, sinh sản đơn tính (asexual reproduction) bằng sự kết hợp giữa tinh tử của cây giao tử đực với trứng của cây giao tử cái Các hình thức sinh sản này luân phiên xảy ra trong điều kiện tự nhiên và các dạng của cây rong cũng đồng

thời tồn tại và phát triển, dạng sinh sản dinh dưỡng chiếm ưu thế hơn dạng sinh sản bằng bào tử [74]

1.5.5 Mô tả carrageenan và lectin từ rong đỏ B gelatinus

Hiện tại có rất ít các tài liệu nghiên cứu về carrageenan và lectin chiết

xuất từ rong đỏ B gelatinus Theo Renn và cs (1993), hàm lượng carrageenan trong rong E gelatinae là 38 % [15], theo Greer và Yaphe (1984) hàm lượng carrageenan trong rong E gelatinae là 57 % [78], theo Trần Văn Huynh

(2019), hàm lượng carrageenan từ rong đỏ B gelatinus nuôi trồng trong

phòng thí nghiệm là 70 – 78 % [69] Carrageenan trong rong đỏ B gelatinus

được xác định là có thành phần beta-carrageenan theo Renn và cs [15] Chưa

có bất kỳ tài liệu nào công bố về loại carrageenan có trong rong đỏ B

gelatinus tại Việt Nam

Beta-carrageenan đã được xác định có mặt trong rong đỏ B gelatinus ở

mẫu rong thu được tại Trung Quốc [15], tuy nhiên chưa có bất kỳ công bố nào

về loại carrageenan và cấu trúc của carrageenan từ rong B gelatinus thu

hoạch tại Việt Nam Việc xác định cấu trúc carrageenan có trong rong cũng được xem như là một tiêu chí đánh giá chất lượng carrageenan, góp phần thiết

kế quy trình chế biến hợp lý loài rong này

Chưa có nghiên cứu nào trên thế giới về sự thay đổi hàm lượng, chất

lượng carrageenan thay đổi theo mùa trong năm ở loài rong đỏ B gelatinus

ngoài tự nhiên, trong khi ở các loài rong thuộc chi Kappaphycus được nuôi

trồng phổ biến có khá nhiều các nghiên cứu về vấn đề này như ở Việt Nam [53, 54], Philippines [72], Brazil [79], Indonesia [80]

Lectin là loại protein đặc trưng có mặt ở nhiều loài rong đỏ, trong đó có

B gelatinus [81] Các đặc tính của lectin đã được nghiên cứu nhiều trên thế

giới, sự thay đổi hàm lượng protein và hoạt tính lectin theo mùa trong rong đỏ

cũng đã có một số nghiên cứu như ở rong K alvarezii [53] và K striatus [54]

nuôi trồng tại Việt Nam Tuy nhiên, hiện tại có rất ít tài liệu tham khảo về lectin từ rong B gelatinus

1.5.6 Khả năng sử dụng carrageenan và lectin từ rong đỏ B

gelatinus

Carrageenan từ rong đỏ B gelatinus hiện nay chủ yếu sủ dụng trong

chế biến thực phẩm ở quy mô nhỏ lẻ Người dân địa phương thu hoạch loài rong này, chiết xuất carrageenan thủ công và chế biến thành các món ăn như mứt, kẹo, nước uống… phục vụ khách du lịch và cung cấp cho các địa phương khác Các loại thực phẩm chế biến từ loài rong này rất được ưa chuộng, tuy nhiên chưa có nghiên cứu nào tại Việt Nam về chất lượng, hàm

lượng carrageenan trong rong đỏ B gelatinus lý giải cơ sở khoa học cho điều

này

Loài rong đỏ B gelatinus có giá trị cao dẫn đến việc khai thác tràn lan

làm thu hẹp vùng phân bố của loải rong này Do sản lượng khai thác hạn chế

nên hiện tại chưa có thông tin nào về chiết xuất carrageenan từ rong đỏ B

gelatinus ở quy mô công nghiệp Nếu có thể nghiên cứu nuôi trồng thành công, loài rong này có tiềm năng trở thành nguồn chiết xuất carrageenan chất lượng cao và trở thành kế sinh nhai ổn định cho nhiều hộ gia đình

Lectin từ rong biển có hoạt tính mạnh kháng virus HIV từ rong E serra

và K alvarezii mạnh kháng virus HIV [45, 46], kháng virus cúm [45], kháng ung thư như gây chết tế bào ung thư ruột kết ở người và ung thư cổ tử cung ở

người [47], lectin từ rong Sagittaria filiformis ức chế sự phát triển của tế bào

ung thư vú [48] Tuy nhiên chưa có nhiều nghiên cứu về ứng dụng lectin chiết

xuất từ rong đỏ B gelatinus, dù vậy lectin từ loài rong này hứa hẹn sẽ có nhiều ứng dụng trong ngành dược phẩm và nhiều ngành công nghiệp khác

1.5.7 Lý do và mục đích chọn nghiên cứu đối tượng rong đỏ B

gelatinus

Rong đỏ B gelatinus là loài rong có giá trị cao, được thị trường ưa

chuộng, thường được khai thác tự nhiên Riêng ở Trung Quốc, B gelatinus

được nuôi trồng bằng cách như sau: thu rong giống từ môi trường tự nhiên, rong được cắt thành từng mẩu nhỏ (1 kg được chia thành 40 nhánh nhỏ) Các

mẩu rong này được buộc vào các mảnh san hô chết bằng dây thun hoặc dây nilon và rải xuống vùng nền đáy có san hô chết, sau đó người dân lặn xuống

và sắp xếp lại, mật độ thả là khoảng 75.000 mảnh/ha Năm 1981, 250 ha mặt biển được quy hoạch tại vùng biển đảo Hải Nam dành riêng cho việc nuôi

trồng rong đỏ B gelatinus, thu được 300 - 400 tấn rong khô, ước tính thu về

450.000 USD Việc trồng rong bị giới hạn bởi lượng san hô chết ở vùng biển này [82]

Ở Việt Nam chưa phát triển nuôi trồng loài rong này, chỉ thu hoạch tự nhiên khoảng vài tấn rong khô/năm Hiện nay tại Việt Nam chỉ có vùng biển Ninh Thuận tiến hành khai thác rong B gelatinus nhưng chưa có khu quy

hoạch bảo vệ nguồn lợi, do đó loài rong này đang đứng trước nguy cơ thu hẹp

diện tích phân bố cũng như có nguy cơ tuyệt chủng do tình trạng khai thác quá mức

Tại tỉnh Ninh Thuận, Việt Nam, rong đỏ B gelatinus được khai thác tự

nhiên từ tháng 3 đến tháng 5 hàng năm theo kinh nghiệm của người dân để làm nguyên liệu cho ngành thực phẩm, tuy nhiên thời vụ thu hoạch rong còn tùy thuộc vào điều kiện môi trường của từng năm [55, 75, 76] Hiện tại chưa

có nhiều thông tin đánh giá về hàm lượng, chất lượng carrageenan và hoạt tính lectin của loài rong B gelatinus thu hoạch trong giai đoạn này như thế

nào để làm cơ sở khoa học cho thu hoạch Trên cơ sở đó, nghiên cứu về sự thay đổi của hàm lượng, chất lượng carrageenan và hoạt tính lectin từ rong đỏ

B gelatinus thu hoạch từ tháng 3 đến tháng 5/2021 ở tỉnh Ninh Thuận để làm

cơ sở khoa học định hướng cho quá trình thu hoạch loài rong kinh tế này là rất

cần thiết

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU

2.1.1 V ật liệu nghiên cứu

Rong đỏ B gelatinus được thu ở vùng biển Thôn Thái An, Tỉnh Ninh

Thuận trong các tháng 3, 4, 5/2021, đây là giai đoạn nằm trong khoảng thời gian người dân địa phương thu hoạch rong hàng năm theo kinh nghiệm dân gian (từ tháng 3 đến tháng 5) [55, 74, 75, 76]

Hình 2.1 Rong đỏ B gelatinus thu tại tỉnh Ninh Thuận, Việt Nam

Rong B gelatinus là rong sống nhiều năm, phát triển tốt nhất từ tháng 3 đến tháng 6, dạng sinh sản dinh dưỡng chiếm ưu thế hơn dạng sinh sản bằng bào tử [74] Người dân ven biển Ninh Thuận thường thu hoạch từ tháng 3 đến tháng 5 hàng năm, tuy nhiên thời gian phát triển tốt nhất của rong và thời vụ thu hoạch rong còn tùy thuộc vào điều kiện môi trường của từng năm [55, 75,

76]

2.1.2 Thi ết bị và hóa chất

2.1.2.1 Thi ết bị

Một số thiết bị chính sử dụng trong nghiên cứu được trình bày trong

Bảng 2.1

Bảng 2.1 Các thiết bị chính được sử dụng trong thí nghiệm

6 Máy đo quang

7

Các loại Micropipet