nghiên cứu áp dụng công nghệ vi sinh hiện đại để sản xuất chế phẩm giàu axit amin và enzym từ nguồn thứ phẩm nông nghiệp và thuỷ hải sản ở qui mô bán công nghiệp

Mục tiêu chung của đề tài là: Triển khai công nghệ mới của công nghệ sinh học trong tận dụng phế phụ phẩm nông nghiệp và thuỷ hải sản nhằm sản xuất các sản phẩm có giá trị kinh tế phục

bộ khoa học và công nghệ viện nông nghiệp và công nghệ sau thu hoạch

báo cáo tổng kết đề tài KHCN cấp nhà nước

nghiên cứu áp dụng công nghệ vi sinh hiện đại để sản xuất chế phẩm axit amin

và enzym từ nguồn thứ phẩm nông nghiệp

và hải sản ở quy mô bán công nghiệp

Danh sách những người tham gia thực hiện đề tài

Chủ nhiệm đề tài: PGS TS Nguyễn Thùy Châu1

1/ Đề tài nhánh: “Sử dụng kỹ thuật hiện đại trong chọn tạo các chủng giống vi sinh vật”

PGS TS Nguyễn Thùy Châu1, chủ nhiệm đề tài nhánh

2/ Đề tài nhánh: “Nghiên cứu công nghệ sản xuất axit amin L-lysin”

PGS TS Nguyễn Thùy Châu1, chủ nhiệm đề tài nhánh

Th.S Vũ Kim Thoa1

KS Trần Văn Tuân

3/ Đề tài nhánh: “Nghiên cứu công nghệ sản xuất axit amin L-methionin”

Th.S Bùi Thị Hương1, chủ nhiệm đề tài nhánh

CN Vũ Thị Hương1

CN Nguyễn Tuấn1

KS Đỗ Minh Trung1

4/ Đề tài nhánh: “Nghiên cứu công nghệ sản xuất enzym phytaza”

NCS Đỗ Thị Ngọc Huyền1, Chủ nhiệm đề tài nhánh

KS Lê Thiên Minh1

CN Đỗ Tất Thủy1

5/ Đề tài nhánh: “Nghiên cứu công nghệ sản xuất enzym pectinaza”

KS Trương Thanh Bình1 , Chủ nhiệm đề tài nhánh

PGS TS Nguyễn Thùy Châu1, đồng chủ nhiệm đề tài nhánh

1

CN Nguyễn Ngọc Linh1

CN Đỗ Thị Thu Hiền1

6/ Đề tài nhánh: “Nghiên cứu công nghệ sản xuất enzym mananaza”

PGS TS Đặng Thị Thu2, Chủ nhiệm đề tài nhánh

NCS Đỗ Biên Cương2

KS Phùng Thị Thủy2

7/Đề tài nhánh: “Nghiên cứu công nghệ sản xuất thịt quả cà phê lên men làm thức ăn gia súc”

CN Nguyễn Thị Hương Trà1, Chủ nhiệm đề tài nhánh

PGS TS Nguyễn Thùy Châu1, đồng chủ nhiệm đề tài nhánh

ThS Nguyễn Giang Phúc3, Chủ nhiệm đề tài nhánh

CN Bùi Thị Thu Huyền3

10/Đề tài nhánh: “Nghiên cứu công nghệ lên men men lactic các phế phụ phẩm của cá bằng vi khuẩn Lactobacillus làm thức ăn chăn nuôi”

KS Lương Văn Chính4, Chủ nhiệm đề tài nhánh

CN Trần Khánh Vân4

KS Lê Văn Huyên4

1 : Viện Cơ điện Nông nghiệp và công nghệ sau thu hoạch

2 : Viện Công nghệ sinh học- Công nghệ Thực phẩm, Trường Đại học Bách khoa Hà nội

3 : Viện Chăn nuôi Quốc Gia

4 : Viện Di truyền Nông nghiệp

5 : Viện Công nghệ Sinh học- Trung tâm Khoa học Tự nhiên và Công nghệ Quốc gia

Phần I: Mở đầu

Từ nhiều năm nay việc tận dụng các phế phụ phẩm nông nghiệp và sử dụng chúng một cách có hiệu quả đa được các nhà khoa học và công nghệ trên thế giới hết sức quan tâm đi sâu nghiên cứu và đã đạt được rất nhiều thành tựu trong vấn đề này Công nghệ sinh học đóng một vai trò hêt sức quan trọng trong việc tận dụng các phế phụ phẩm nông nghiệp để tạo ra các sản phẩm có giá trị kinh tế và giá trị dinh dưỡng cao nhằm sử dụng chúng một cách có hiệu quả, tránh tình trạng lãng phí và gây ô nhiễm môi trường

Trong những năm gần đây, nhờ chính sách đổi mới của Đảng và nhà nước, ngành nông nghiệp nước ta đã có những bước tiến bộ rõ rệt Sản lượng lương thực cũng như các nông sản khác đã tăng một cách đáng kể Sản lượng lúa gạo đạt gần 34 triệu tấn, đường

đạt gần 1 triệu tấn, dừa 500.000 tấn, sản lượng dứa là 50 triệu tấn Cà phê đạt 500.000 tấn Sản lượng các nông sản này tăng kéo theo sản lượng các phế phụ phẩm của chúng cũng tăng theo Cụ thể: sản lượng cám gạo trong năm 1999- 2000 là 1.7 triệu tấn, lượng cám mì

là 150 nghìn tấn, thịt quả cà phê khoảng 1,5 triệu tấn, rỉ đường 450 nghìn tấn, bã dứa 10 triệu tấn, bã dứa sau ép 200000 tấn, phế phụ phẩm thuỷ hải sản khoảng 500 nghìn tấn

Do chưa có biện pháp tận dụng một cách khoa học thịt quả cà phê, bã dứa đã gây ô nhiễm môi trường và trở thành nỗi nhức nhối của người dân vùng chế biến các nông sản này Việc nghiên cứu và triển khai các công nghệ sinh học để tận dụng các phế phụ phẩm này nhằm tạo ra các sản phẩm dinh dưỡng cao và có giá trị kinh tế cao phục vụ chế biến thực phẩm và chăn nuôi là một vấn đề cấp thiết của ngành nông nghiệp cũng như của các cán bộ làm công tác nghiên cứu về công nghệ sinh học Việt Nam

Thực tế cho thấy rỉ đường ở nước ta hiện nay chủ yếu mới chỉ được sử dụng để sản xuất cồn Trong khi đó, có rất nhiều sản phẩm có thể sản xuất được từ rỉ đường để đáp ứng nhu cầu cuộc sống của nhân dân ta song vẫn chưa triển khai được Đặc biệt các axit amin như Lysin, Methionine là những chất có thể sản xuất từ rỉ đường nhưng ta vẫn phải nhập ngoại với số lượng vài trăm tấn/năm trị giá nhiều chục tỉ đồng Vì vậy, việc nghiên cứu công nghệ sản xuất các axit amin lysine, methionine là rất cần thiết để đa dạng hoá các sản phẩm sau đường và phát triển chăn nuôi, dược phẩm

Hiện nay trong thực tế cám gạo, cám mì chủ yếu được làm thức ăn gia súc và hầu như chưa có sản phẩm sinh học nào có giá trị được tạo ra từ nguồn cám gạo và cám mì

Ngành cà phê Việt Nam có tốc độ phát triển nhanh vượt bậc so với 20 năm trước đây, diện tích cà phê đã tăng 25 lần, sản lượng tăng 100 lần, có nghĩa là năng suất đã tăng 4 lần, tỉ lệ

vỏ thịt quả chiếm khoảng 45% trọng lượng quả, trong khi đó công nghệ sau thu hoạch không đáp ứng kịp, gây nên những tổn thất nặng nề và gây ô nhiễm môi trường

Với nguồn phế liệu thuỷ hải sản rất lớn và đa dạng, bao gồm cá kém chất lượng,

đầu và vỏ tôm, các phụ tạng, đầu, xương, vây của cá tạo ra từ các xí nghiệp đánh bắt và chế biến xuất khẩu thuỷ sản Nguồn nguyên liệu này rất dễ dàng và nhanh chóng bị thối hỏng do tác động của khu hệ vi sinh vật đa dạng trong điều kiện khí hậu nước ta Đây thực

sự là một vấn đề không những làm mất đi một nguồn protein lớn mà con gây ô nhiễm môi trường nghiêm trọng

Ở nước ta lượng bã cơm dừa sau ép hàng năm lên tới vài trăm nghìn tấn và hiện nay chỉ được sử dụng làm phân bón, vì vậy hiệu quả sử dụng chưa cao Đặng Thị Thu và các cộng tác viên ở trung tâm công nghệ sinh học- Đại học Bách Khoa Hà Nội đã bước

đầu tập trung nghiên cứu công nghệ sản xuất enzim mananaza để nâng cao giá trị sử dụng bã cơm dừa sau ép Đây là một loại enzim có ý nghĩa kinh tế cao và chưa được tập trung nghiên cứu sâu ở Việt Nam Vì vậy cần đầu tư cho vấn đề này cần đầu tư cho vấn đề này nhằm tìm được công nghệ sản xuất enzim mananaza ở Việt Nam trong thời gian tới

Đề tài “Nghiên cứu áp dụng công nghệ vi sinh hiện đại để sản xuất chế phẩm

giàu axit amin và enzym từ nguồn thứ phẩm nông nghiệp và thuỷ hải sản ở qui mô bán công nghiệp” mã số KC-04-20 thuộc chương trình nghiên cứu khoa học và phát

triển công nghệ sinh học

Mục tiêu chung của đề tài là: Triển khai công nghệ mới của công nghệ sinh học

trong tận dụng phế phụ phẩm nông nghiệp và thuỷ hải sản nhằm sản xuất các sản phẩm

có giá trị kinh tế phục vụ phát triển nông nghiệp

Mục tiêu cụ thể là: áp dụng được các kỹ thuật vi sinh kinh điển và kỹ thuật

sinh học phân tử hiện đại trong công tác chọn tạo các chủng giống vi sinh vật có hoạt tính cao cho công nghệ tận dụng phế phụ phẩm nông nghiệp như rỉ đường, cám gạo, cám mì, bã dứa, thịt quả cà phê, bã dừa sau ép và phế phụ phẩm thuỷ hải sản như cá kém

Xây dựng qui trình công nghệ thích hợp để sản xuất các sản phẩm có giá trị cao như axit amin L- lysin, L-methionine, các enzym phytaza, pectinaza, mannanaza, các thức ăn lên men từ các phế phụ phẩm nông nghiệp và phế phẩm thuỷ hải sản làm thức

ăn chăn nuôi

Xây dựng được mô hình công nghệ thiết bị thích hợp để sản xuất các sản phẩm như axit amin L-lysin, L-methionine, các enzym phytaza, pectinaza, mannanaza, các thức ăn lên men từ phụ phế phẩm nông nghiệp và thuỷ hải sản làm thức ăn chăn nuôi

Đề tài được thực hiện trong 30 tháng từ tháng 9 năm 2002 đến tháng 3 năm 2005 với tổng số kinh phí là 2.700 triệu đồng từ ngân sách SNKH của Nhà nước Dưới đây là

một số thông tin chung về đề tài:

Địa chỉ cơ quan: Viện Cơ điện Công nghiệp và Công nghệ sau thu hoạch Hà Nội

Cơ quan chủ trì đề tài: Viện cơ điện nông nghiệp và Công nghệ sau thu hoạch Hà Nội

Địa chỉ: Số 4 Ngô quyền, Hà Nội

Cơ quan chính phối hợp thực hiện

TT Tên tổ chức Địa chỉ Hoạt động/đóng góp cho đề tài

ăn chăn nuôi từ thịt quả cà phê

nuôi

Thụy Phương- Từ Liêm

Nghiên cứu công nghệ lên men bã

dứa bằng vi khuẩn Lactobacillus

plantarium và Streptococcus lactis

làm thức ăn cho bò sữa

nuôi

Thụy Phương- Từ Liêm

- Nghiên cứu công nghệ lên men lactic các phế phụ phẩm của tôm bằng các chủng vi khuẩn

- Nghiên cứu công nghệ lên men lactic các phế phụ phẩm của cá bằng

1 Nội dung đề tài:

thiên nhiên phục vụ cho đề tài

2 Sử dụng các kỹ thuật hiện đại trong chọn tạo các chủng giống vi sinh vật bao gồm:

+ Sử dụng kỹ thuật đột biến chọn tạo các chủng Corynebacterrium glutamicum

sinh tổng hợp L- lysin và L-methionine cao

+ Sử dụng kỹ thuật sinh học phân tử đề biểu hiện gen mã hóa phytaza đề kháng

nhiệt trong nấm men Pichia pastoris

+ Tách dòng và biểu hiện gen mã hóa bacteriocin từ chủng tự nhiên có tính đề

kháng với vi sinh vật gây bệnh E coli, Salmonella

L-methionine, và các enzym phytaza, pectinaza, mannanaza ở qui mô phòng thí nghiệm và qui mô bán công nghiệp 150l/mẻ và 1500 l/mẻ

phẩm thủy hải sản bằng các vi khuẩn lactic

5 Thử nghiệm và đánh giá các chế phẩm sản xuất được trên đàn gia súc gia cầm

2 Danh mục sản phẩm KHCN của đề tài (hợp đồng giữa Chủ nhiệm chương

trình KC.04 và cơ quan chủ trì đề tài)

TT Tên sản phẩm Số lượng Chỉ tiêu Kinh tế - kỹ

thuật

Ghi chú

1.7 Chế phẩm bã dứa lên men

làm thức ăn cho bò

10 tấn 3 % axit lactic và 105 vi

khuẩn lactic/g chất khô

phế phụ phẩm thuỷ hải sản

làm thức ăn chăn nuôi cho

gia cầm, lợn con

1 tấn 3 % axit lactic và 105 vi

khuẩn lactic/g chất khô

Chế phẩm có khả năng tăng trọng của gia súc

Chủng có hoạt tính methionin đạt từ 30g/l-35g/l

Aspergillus niger sinh

pectinaza

2-3 chủng

Chủng có hoạt tính pectinaza đạt khoảng 10đv/ml

2.3 Các chủng sinh enzym

mannanase

2-3 chủng

Chủng có hoạt tính mannanaza đạt từ 30- 40 đv/ ml

Chủng có hoạt tính phytaza đạt 80-85đv/l

Lượng bacteriocin đạt 50ppm

3 Qui trình công nghệ:

xuất axit amin L-lysin trên

môi trường rỉ đường bằng

công nghệ lên men chìm

sục khí

1 quy trình

Qui mô 1500l/mẻ

xuất axit amin

L-methionin trên môi trường

rỉ đường bằng công nghệ

lên men chìm sục khí

1 qui trình

Qui mô 1500l/mẻ

enzym pectinaza, mananaza,

phytaza trên môi trường thịt

quả cà phê, bã dừa sau ép,

Qui mô 1 tấn thịt quả

cà phê/mẻ

3 Kết quả hoạt động của đề tài

3.1 Tổng quan tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước

3.1.1 Tổng quan về L-lysin

L-lysine bản chất là một axit amin không thay thế, nghĩa là cơ thể người và động vật không tự tổng hợp được axit amin này mà phải trực tiếp thu nhận từ nguồn bổ sung bên ngoài Hoạt tính sinh học chỉ biểu hiện ở dạng đồng phân L- lysine mới có giá trị dinh dưỡng với người và động vật L- lysine được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực như:

Sử dụng bổ sung vào thức ăn gia súc làm tăng chất lượng và sản lượng thịt của động vật nuôi Trong công nghiệp dược phẩm L-lysine được sử dụng như một chất dinh dưỡng, kích thích sự ăn ngon miệng, sử dụng như một chất có nguồn gốc protein bổ sung trong quá trình cắt đứt căn bệnh "stress” và nó cũng có chức năng chống nhiễm trùng máu Trong công nghiệp thực phẩm là chất bổ sung làm giầu thực phẩm, nâng cao chất lượng các loại hạt như lúa mì, ngô, gạo bởi nếu các sản phẩm này thiếu hụt L- lysine thì giá trị dinh dưỡng rất thấp Vì vậy trong thực phẩm của con người như thực phẩm dạng chiên, thực phẩm lỏng, bánh mì thường được bổ sung dạng muối L- lysine Trong công nghiệp, L- lysine được sản sinh trong môi trường dinh dưỡng lên men bởi các chủng vi khuẩn

Corynebacterium glutamicum, Brevibacterium flavum, B lactofermentatum hoặc cũng có

thể thu nhận từ dịch thuỷ phân protein động, thực vật

Trên thế giới việc sản xuất axit amin ở quy mô công nghiệp đã được bắt đầu từ năm

1908 Nhật Bản đã có lịch sử trên 40 năm sản xuất và áp dụng axit amin ở quy mô công nghiệp với sản lượng 90.000 tấn/năm (chủ yếu hai hãng công nghiệp vi sinh khổng lồ là

"Kiowa Hakko" và "Ajinamoto") ở Pháp (hãng "Eurolysine") có sản lượng L-lysine đạt khoảng 20 000 tấn/năm Năm 1983 sản lượng L-lysine trên toàn thế giới là 70 000 tấn/năm nhưng đến năm 2000 đã tăng lên 600 000 tấn/năm Nhiều nhà máy sản xuất L-

lysine còn được xây dựng ở Mỹ, Tây Ban Nha, các nước cộng hoà thuộc Liên Xô (cũ) và Nam Tư (cũ) Việc gia tăng nhanh chóng sản lượng L-lysine trên thế giới đồng nghĩa với nhu cầu rất lớn về sản phẩm này

Hiện nay ở Việt Nam nhu cầu sử dụng lysin cho thực phẩm con người và thức ăn chăn nuôi gia tăng nhanh chóng Hàng năm chúng ta phải nhập khẩu 100% L-lysin với số lượng lớn Trong những năm qua (1980-1985) TS Hồ Sưởng, Viện Công nghiệp Thực phẩm, đã sản xuất lysin từ chủng tự nhiên có tên là VTP 22( không có tên chi và tên loài)

ở qui mô 5000l/mẻ, chủng này cho sản lượng lysin 30-35g/l Chế phẩm lysin ở dạng thô là 80% và ở dạng sệt là 15-20% TS Ngô Tiến Hiển cũng đã nghiên cứu lên men lysin theo phương pháp bề mặt Tuy nhiên theo như lý thuyết thì lên men theo phương pháp bề mặt không cho sản lượng lysin cao so với phương pháp lên men chìm sục khí TS Ngô Thị

Mại và cộng sự cũng đã nghiên cứu về lysin, chủng sản xuất là chủng Corynebacterium

glutamicum tự nhiên lấy từ nguồn ATCC Tuy nhiên thách thức lớn nhất với chúng ta là có

rất ít nghiên cứu hoàn chỉnh về L-lysine và chưa có cơ sở nào triển khai sản xuất L- lysine quy mô công nghiệp chất lượng cao, giá thành hạ

Cho đến nay ở nhiều nước khác nhau hầu như tất cả các chủng có hoạt tính cao và

được ứng dụng để sản xuất axit amin đều là các chủng đột biến Đặc biệt là các vi khuẩn

Corynebacterium, Brevibacterium có khả năng phát triển tốt trong những môi trường chứa

nhiều cacbon và ít nitơ ở đây sự phá vỡ cân bằng giữa trao đổi chất cacbon và sự đồng hoá nitơ là nguyên nhân dẫn đến sự hình thành axit amin với số lượng lớn, vượt quá xa so với nhu cầu nội tại của tế bào và tích luỹ ở tế bào hay thoát ra ngoài môi trường Hiện tượng này được gọi là siêu tổng hợp axit amin của vi sinh vật và thường là do tác động của con

người bằng phương pháp đột biến gây ra để thu được sản phẩm mong muốn

Đặc điểm của chủng vi khuẩn sinh L-lysine

Các chủng vi sinh vật sinh L-lysine được dùng trong sản xuất là các thể đột biến

thuộc các giống vi khuẩn C glutamicum và Brevibacterium Nhiều chủng được tuyển

chọn qua bước làm đột biến và thu được những chủng mới có hoạt lực cao hơn nhiều so với chủng nguyên thuỷ Đặc tính của những chủng này là cần biotin với lượng cao hơn nhiều so với chủng nguyên thuỷ sinh axit glutamic, chịu được ở nồng độ đường lớn tới

20% hoặc cao hơn và đặc biệt là cần một số axit amin cho sinh trưởng, cũng như

cho sinh tổng hợp L-lysine Kinoshita đã thu được những chủng sinh L-lysine theo thứ tự

sau: những chủng cần homoserin (hoặc hỗn hợp threonine + L-methionine) > những

chủng cần threonine > những chủng cần isoleucine > những chủng cần leucine > những

chủng cần hỗn hợp isoleucine + leucine Trong công nghiệp thường dùng những chủng

thuộc các giống Micrococcus glutamicus, Brevibacterium và C glutamicum cần

homoserin Các chủng này có cùng một con đường tổng hợp L-lysine như ở E coli nhưng

phương thức điều hoà lại đơn giản hơn nhiều Một trong những chủng này không có

enzym L-homoleucinedehydrogenaza

L-lysine chỉ điều chỉnh ngược enzym aspactokinaza mà không ức chế ngược enzym

dehydropicolinatsyntetaza

ư Enzym aspactokinaza chịu ức chế ngược của L-lysine và threonine

ư Enzym homoserindehydrogenaza chịu sự ức chế ngược của threonine

Homoserin

Threonin isoleucin Methionin

L-lysin

(1)

Sơ đồ 1: Sản xuất L-lysine nhờ một thể đột biến C glutamicum trợ dưỡng homoserin

Những đường chấm chấm biểu thị sự ức chế bởi sản phẩm cuối cùng ở chủng hoang dại L-lysine và threonine cùng gây ra một sự ức chế phối hợp (E) đối với aspactokinaza (1) Do khuyết homoserin dehydrogenaza (2) mà không có sự tạo thành threonine Dihydropicolinat – synthase (3) không mẫn cảm dị lập thể Hậu quả là sự ức chế bởi sản phẩm cuối cùng (E) bị triệt tiêu và có sự tổng hợp thừa L-lysine

Có ba phương pháp được dùng để loại sự điều chỉnh ngược:

• Sử dụng chủng đột biến trợ dưỡng cần homoserin Chủng này có thể mọc được khi trong môi trường có threonine và L-methionine Với nồng độ axit amin này thấp thì aspactokinaza sẽ không bị ức chế và L-lysine sẽ tạo thành nhiều hơn

• Sử dụng các chủng đột biến mẫn cảm cao với threonine Enzym homoserindehydrogenaza có thể bị ức chế bởi nồng độ threonine rất thấp và aspactokinaza

có thể sẽ không bị ức chế

• Sử dụng các chủng đột biến có khả năng kháng một chất tương đồng của enzym Chúng có enzym aspactokinaza không bị ức chế ngược bởi L-lysine và threonine L-lysine là một axit amin thuộc họ aspactat và được tổng hợp qua một con đường trao đổi chất phân nhánh mà qua đó homoserin, L-methionine, threonine và isoleucine

cũng được tạo thành C glutamicum chỉ có một aspactokinaza bị ức chế dị lập thể bởi

L-lysine và threonine

Một axit amin riêng lẻ trong kiểu điều hoà này không có tác dụng ức chế Bằng cách sử dụng một thể đột biến cần homoserin và khuyết homoserin dehydrogenaza mà threonine không được tạo thành Nhờ vậy sự ức chế bởi sản phẩm cuối cùng bi triệt tiêu và con đường sinh tổng hợp dẫn tới việc sản xuất thừa L-lysine Một điều kiện nữa để có sự tổng hợp L-lysine không ức chế là sự có mặt của gen dihydrodipicolinat-syntetaza không mẫn cảm với sản phẩm cuối cùng Do đó không xuất hiện sự ức chế bởi sản phẩm cuối

cùng ở nhánh L-lysine, như vẫn xảy ra ở các giống khác ở C glutamicum có thể tổng hợp

thừa L-lysine nhờ đột biến theo kiểu này

Mặc dù phần lớn axit amin được sản xuất từ hoá học, tổng hợp bằng hoá học thì quang học không tác động đến dạng hỗn hợp D và L Nhưng trong sinh hoá thì axit amin dạng L là quan trọng nên ngày nay người ta thường sản xuất axit amin bằng con đường sinh tổng hợp Tuy nhiên trong sản xuất công nghiệp axit amin cần phá vỡ cơ chế điều chỉnh để chủng có khả năng siêu sản xuất (Chibata, K Nakayama,K and Esaki 1986 Biotechnology of amino acid production, vol 24, progress in Industrial Microbiology Kodansha)

Một ví dụ về sản xuất L-lysine ở chủng Brevibacterium flavum là điều chỉnh sinh

hoá của enzym aspartokinase, lượng L-lysine dư làm ức chế ngược hoạt động của enzym này và tạo nên dạng L-lysine tương đồng S-aminoethylcysteine (AEC) Tuy nhiên nếu sử

dụng chủng B flavum đột biến để sản xuất thì lượng L-lysine dư không ức chế ngược đến

aspartokinase nữa Đột biến AEC bền sẽ dễ dàng chọn vị trí để sản xuất dạng đột biến của asspartokinase ở điểm biến đổi không phân biệt được AEC hay L-lysine và trong ức chế

ngược lysine bị khử rất nhiều Chủng đột biến B flavum có thể sản xuất hơn 60g/l

L-lysine

Một nhân tố quan trọng khác trong sản xuất axit amin là sự bài tiết Nói chung sinh vật không bài tiết axit amin, do có sự ức chế ngược hay kìm hãm trong đột biến bền thường không xảy ra trong tế bào Việc sản xuất và bài tiết quá mức axit glutamic phụ

thuộc vào tính thấm của tế bào Vi khuẩn C glutamicum dùng sản xuất công nghiệp axit

glutamic cần vitamin biotin (là nhân tố cần thiết trong sinh tổng hợp axit béo) Thiếu hụt biotin dẫn tới tổn thương màng tế bào và dưới điều kiện nội bào axit glutamic được bài tiết Môi trường sử dụng để sản xuất axit glutamic thương mại chứa đầy đủ biotin trong

giai đoạn sinh trưởng, sau đó biotin bị thiếu hụt và bài tiết axit glutamic

Sơ đồ 2,3 : Sản xuất công nghiệp L-lysine ở chủng B flavum

Aspartokinase

(2) con đường sinh hoá từ aspartate biến đổi thành L-lysine nhưng L-lysine có thể

bị ức chế ngược đến hoạt động của enzym aspartokinase dẫn đến dừng sản xuất L-lysine

(3) cấu trúc L-lysine và dạng tương đồng của nó S-aminoethylcystein (AEC) AEC

thường ức chế sinh trưởng, nhưng chủng B flavum đột biến AEC bền ở vị trí biến đổi trên

aspartokinase của chúng được sinh trưởng và sản xuất quá mức L-lysine do ức chế ngược không kéo dài

Hiện nay các nhà khoa học đã sử sụng các kỹ thuật đột biến bằng hoá chất (nitrosoguanidin, raffinate) và kỹ thuật sinh học phân tử (tách dòng và biểu hiện các gen dihydrodipicolinate synthase, aspartate kinase, dihydrodipicolinate reductase) nhằm tăng hoạt lực của các chủng sản xuất (Caroline,United State Patent, 1999), (Hungming,

S-AminoethylcysteineHCNH2

L-methionin công thức phân tử là C5H11N1O2S, khối lượng Mol là 149,21 methionin không hoà tan tốt trong nước

L-Con đường sinh tổng hợp L-methionin:

ở E.coli và các loài họ hàng thì con đường sinh tổng hợp L-methionin được biết từ

sớm Tất cả các bước trao đổi chất diễn ra qua 13 gen met gọi là các đơn vị điều hoà met

ở E.coli gen metA mã hoá homoserine succinyl xúc tác cho việc chuyển hoá homoserin

thành O-acetyl homoserine Còn ở C glutamicum gen metA mã hoá homoserine

acetyltransferase và nó sử dụng acetyl coenzym A như chất cho acyl

Tuỳ thuộc vào mỗi vi sinh vật, mà quá trình chuyển hoá O_acetyl homoserine

thành homocysteine có thể xảy ra theo hai nhánh Brevibacterium flavum chỉ sử dụng

nhánh H2S để sinh homocysteine Các loài khác sử dụng được cả hai con đường Nhưng C

glutamicum thường sử dụng con đường Cystathionine

Aspartate Aspartate phophate

Homoserin acetyltransferase (metA)

Cystathionine gamma - synthase

Sơ đồ 4: Các enzym điều khiển quá trình sinh tổng hợp L-methionin

Vai trò sinh học và ứng dụng L-methionine trong cuộc sống

L-methionin ảnh hưởng lớn đến sinh trưởng, sự làm việc của gan, điều hoà hoạt

động của tuyến giáp, khử độc các chất độc xâm nhập vào cơ thể L-methionin còn có thể thay thế được lượng cystein còn thiếu trong thức ăn gia súc L-methionin ở mức độ đáng

kể có thể thay thế được vitamin cholin là vitamin đóng vai trò quan trọng trong vỗ béo gia cầm và lợn Các axit amin bắt buộc phải có trong thức ăn của tất cả các loài động vật, trừ

động vật nhai lại đã trưởng thành ở các loài nhai lại này, các axit amin không thay thế

được cung cấp do các vi sinh vật tổng hợp ở dạ cỏ Vì vậy, đối với lợn và gia cầm người ta

đã quan tâm nhiều đến cân đối các axit amin, đặc biệt là L-methionin và L-lysin trong thức ăn nuôi dưỡng Việc cân đối L-methionin trong khẩu phần thức ăn có ý nghĩa quan trọng vì L-methionin là một axit amin chứa lưu huỳnh là nguồn nguyên liệu cần thiết cho

sự sinh trưởng Việc nhiễm mỡ ở gan là một trong những triệu chứng điển hình nhất của việc thiếu L-methionin trong khẩu phần thức ăn, bệnh này có thể chữa khỏi khi khẩu phần thức ăn chứa nhiều axit amin này Không đủ L-methionin trong thức ăn thì quá trình đẻ trứng, sắc tố lông ở lợn, gà, vịt sẽ bị cản trở Khi thêm L-methionin thì quá trình này trở lại bình thường Nhiều công trình nghiên cứu cũng đã xác nhận vai trò quyết định của L-methionin trong hàng loạt các công trình sinh lý khác Nó tham gia trong sự trao đổi selen

và cholesterin, trong việc hình thành các hocmon sinh trưởng và hocmon adrenotropic ở phần trước của não thuỳ L-methionin cũng rất cần thiết để duy trì trạng thái bình thường của hệ thần kinh L-methionin chứa nhóm chức lưu huỳnh đặc biệt quan trọng đối với súc vật non trong quá trình tăng trưởng Chính vì vậy mà ở các nước phát triển đã có cơ sở sản xuất L-methionin để bổ sung chúng vào hỗn hợp thức ăn gia súc ứng dụng của L-methionin vào chăn nuôi đã mang lại hiệu quả kinh tế rất cao Hàng loạt các thí nghiệm ở Liên Xô (cũ) và các nước có ngành chăn nuôi phát triển khác chứng minh rằng khẩu phần thức ăn chăn nuôi được bổ sung L-methionin có tác dụng sinh học rất mạnh ở một số nước, để nuôi béo gà con và lợn người ta làm giàu hầu như tất cả các hỗn hợp thức ăn bằng DL-methionin tổng hợp Trọng lượng gà con trong lứa tuổi 70 ngày khi không cho thêm

methionin thì gà mái đạt 1310 gam, gà trồng đạt 1072 gam Chi phí thức ăn cho một đơn

vị tăng trọng giảm 7% đến 9% Trong một thí nghiệm của Enmison và Luis trên cừu cần 2,1gam L-methionin trong một ngày đối với cừu có khối lượng 50kg ở lứa tuổi rất sớm, gia cầm cần một lượng lớn các axit amin chứa lưu huỳnh đặc biệt là L-methionin để mọc lông nhanh, vì lông vũ có chứa tới 10% Cistin Đối với gia cầm còn nhỏ, có lượng lông phủ tương đối lớn hơn trên một đơn vị khối lượng, đòi hỏi nhiều L-methionin và Cistin hơn, nó chiếm 4,5% so với protein, gà mái lấy thịt to cần 4%, gà tây 3,3% Lợi ích của việc sử dụng L-methionin vào chăn nuôi là cao nhất khi thức ăn nghèo protein

Sản xuất L-methionin bằng chủng đột biến

Chủng đột biến Brevibacterium flavum tổng hợp L-methionin, sản phẩm thu được ở

dạng đặc trưng đồng đẳng với L-methionin:

CH2

lai ngược chủng đột biến với chủng hoang dại (lai ngược là lai từng chủng với chủng bố

mẹ tự nhiên của nó)

Sử dụng kỹ thuật sinh học phân tử để tăng sản lượng L-methionin

Mặc dù việc tạo ra các chủng đột biến có khả năng đề kháng với chất đồng đẳng của L-methionin đã khắc phục được cơ chế ức chế ngược, từ đó giúp cho sản xuất L-methionin tăng cao, nhưng quá trình ức chế ngược này vẫn ít nhiều có xu hướng xảy ra,

làm hạn chế sự tăng sản lượng L-methionin Việc tách dòng, biểu hiện gen metA bằng các

promotor mạnh đã giúp khắc phục được hiện tượng nêu trên và làm tăng đáng kể sản lượng L-methionin.[97]

Để tăng sản lượng L-methionin, hiện nay công nghệ gen đã phân tích được yếu tố

làm tăng hoạt động sản sinh L-methionin của chủng C.acetoglutamicum Goyon và cộng

sự 1998 đã tiến hành tách dòng và xác định trình tự gen met2 là gen mã hoá homserin O-

transacetylase, một trong những enzym của con đường sinh tổng hợp L-methionin, đây là phát hiện quan trọng để biết được cấu trúc gen Trong thời gian này đã có nhiều phát hiện thú vị về con đường aspartat qua đó sản xuất L-methionin Tuy nhiên năm 1998, Park

cùng cộng sự đã nghiên cứu metA ở chủng C.acetoglutamicum, gen mã hoá cho homoserin

acetyltransferase enzym đầu tiên của con đường sinh tổng hợp L-methionin từ homserin

Việc biến nạp một plasmid mang gen metA vào chủng C.acetoglutamicum đã làm tăng

hoạt tính enzym và khả năng biểu hiện sản phẩm protein lên 10 lần[26]

Khi sản lượng axit amin thấp, việc khuyếch đại các gen sinh tổng hợp axit amin nhờ phương pháp ADN tái tổ hợp sẽ cho sản phẩm có sản lượng cao hơn và hoàn thiện chủng giống Kỹ thuật này được sử dụng để thiết kế chủng siêu sản xuất

ở nước ta , vấn đề nghiên cứu về L-methionin là rất mới mẻ Vì vậy việc nghiên cứu công nghệ sản xuất L-methionin ở Việt nam là rất cần thiết

3.1.3 Tổng quan về enzym phytaza

Những nghiên cứu về axit phytic:

Axit phytic là một axit hữu cơ trong phân tử có chứa các gốc phosphat Nó có mặt chủ

phytic giữ vai trò nhất định và có những tác động ảnh hưởng đến tính chất dinh dưỡng của các loại hạt trên

Axit phytic có công thức phân tử C6H18O24P6 và phân tử lượng là 660,04 Danh

pháp quốc tế của axit phytic được gọi là myo-inositol 1,2,3,4,5,6 – hexakisdihydrogen

phosphate (IUPAC- IUB, 1977) [94] Thực tế, axit phytic thường tồn tại dưới dạng muối của các kim loại hoá trị I, II (thường là Kali- Magiê- Canxi) Các muối này được gọi là phytat và chúng được xem như là kho dự trữ photpho lớn trong các hạt thực vật

Có nhiều nghiên cứu về mô hình cấu trúc phân tử của axit phytic nhưng các nghiên cứu này lại đưa đến những kết luận rất khác nhau Trong số các nghiên cứu đó có hai nghiên cứu tiêu biểu của hai nhóm chuyên gia khác nhau được biết đến nhiều hơn cả Đó

là nghiên cứu của Johnson và Tate (1969) bằng phương pháp cộng hưởng điện từ hạt nhân

31P (31P- NMR) và nghiên cứu của Blank và cs (1971) bằng phương pháp nhiễu xạ tia X Tuy nhiên hai nhóm nghiên cứu này lại đưa ra hai kết luận trái ngược nhau

Theo Johnson và Tate thì trong cấu trúc của phân tử axit phytic có một gốc phosphat ở vị trí số 2 (gốc phosphat gắn với nguyên tử C số 2) nằm theo hướng trục thẳng

đứng còn các gốc phosphat ở vị trí khác thì có hướng nghiêng một góc so với phương thẳng đứng Ngược lại, kết luận của Blank lại cho rằng các gốc phosphat 1,3,4,5 và 6 nằm theo hướng trục thẳng đứng còn gốc phosphat nằm ở vị trí số 2 lại nghiêng theo góc 1/4

Tuy nhiên, kết luận về cấu trúc phân tử của axit phytic theo phương pháp Johnson

Hình 1 : Mô hình cấu trúc phân tử axit phytic (myo- inositol hexakisphosphate) Các vòng tròn biểu diễn các gốc phosphate, các nguyên tử cácbon được đánh số từ 1

đến 6

Các gốc phosphat trong phân tử axit phytic có thể bị tách ra ở các pH nhất định Bằng phương pháp cộng hưởng điện từ hạt nhân 31P(31P- NMR) và phương pháp định phân

pH, các nhà khoa học đã kết luận rằng số gốc phosphat bị ra tách tuỳ thuộc vào khoảng

pH của môi trường Họ đã xác định được giá trị của hằng số axit pKa khi các gốc phosphat của phân tử axit phytic được tách ra như sau: trong môi trường axit mạnh mà pKa = 1,1- 2,1 toàn bộ 6 gốc phosphat của phân tử axit phytic đều bị tách ra; trong môi trường axit yếu hơn mà pKa = 5,7 thì chỉ có một gốc phosphat bị tách ra; trong môi trường axit yếu

mà pKa = 6,8- 7,6 thì có 2 gốc phosphat bị tách ra; còn khi trong môi trường axit rất yếu, pKa = 10- 12 sẽ có 3 gốc phosphat bị tách ra Điều này cho thấy, axit phytic có nhiều khả năng hình thành hợp chất với các ion dương đa hoá trị và các protein trong cơ thể vì chúng

có rất nhiều khả năng tồn tại ở các dạng phân tử mang điện tích âm trong một dải pH rộng

Chức năng sinh lý của axit phytic:

Axit phytic được tìm thấy nhiều trong các hạt thực vật, đặc biệt là hạt các loại ngũ cốc và hạt các loại đậu đỗ Vì trong thành phần cấu tạo nên phân tử axit phytic có chứa một lượng phospho tương đối lớn nên axit phytic và các muối của chúng trong các hạt thực vật là một nguồn dự trữ phospho khá dồi dào có thể tận dụng nhằm cung cấp khoáng chất cho cơ thể Axit phytic còn là một nguồn dự trữ năng lượng, nguồn myo-inositol (thành phần cấu tạo nền vỏ ngoài của thành tế bào) tương đối lớn

Axit phytic trong các hạt thực vật có những ảnh hưởng nhất định đến đặc tính sinh

lý của hạt Nó tác động đến trạng thái ngủ nghỉ của hạt do nó chống lại sự oxy hoá tự nhiên trong quá trình ngủ nghỉ(chống lại sự hô hấp) của các hạt thực vật, vì vậy làm chậm

sự phát triển và có thể làm mất khả năng nảy mầm của các hạt này

Đối với động vật, axit phytic cũng có những vai trò tích cực nhất định Trong những vai trò đã được biết đến như là nguồn cung cấp phospho và myo- inositol thì nó còn được

axit phytic không tiêu hoá trong đường ruột có thể bảo vệ cơ thể nhờ khả năng chống lại

sự phát triển của các khối u ở trong ruột

Vào cuối thập kỷ 80, đầu thập kỷ 90 người ta đã chứng minh được vai trò gián tiếp của inositol phosphate trong quá trình vận chuyển vật chất trong tế bào, đặc biệt là vai trò của inositol - triphosphate Chúng là dấu hiệu của sự di truyền tính trạng và có liên quan rất lớn đến sự biến đổi chức năng của tế bào đối với cả tế bào động vật và thực vật

Ngoài những tác động sinh lý nêu trên, người ta dự đoán rằng axit phytic còn có thể

có những chức năng chưa biết khác

Hiệu ứng kháng dinh dưỡng của axit phytic

Một đặc tính bất lợi nổi bật nhất của axit phytic đối với cơ thể động vật là hiệu ứng kháng dinh dưỡng Hiệu ứng này tạo nên do nguyên nhân cấu trúc bất thường của axit phytic Khi phân tử axit phytic ở dạng phân ly hoàn toàn, 6 nhóm phosphate của chúng sẽ mang tổng điện tích –12 Vì vậy, chúng có nhiều khả năng kết hợp với các ion dương hoá trị 1, 2, 3 hoặc hỗn hợp của các ion đó, hình thành nên các hợp chất không hoà tan, nên rất khó tiêu hoá Sự hình thành các hợp chất vô cơ không tan trong đường ruột đã ngăn cản sự hấp thụ các khoáng chất của cơ thể động vật Bởi vì axit phytic khi kết hợp với các ion kim loại như Fe3+, Mg2+, Ca2+, Zn+ sẽ ngăn cản khả năng kết hợp của các ion kim loại này với các axit béo không no làm giảm khả năng tiêu hoá thức ăn của động vật Như vậy, yếu tố này đã làm giảm lượng khoáng cần thiết được đưa vào cơ thể động vật qua con đường thức

ăn mà lẽ ra cơ thể động vật có thể hấp thụ được, do đó làm giảm giá trị dinh dưỡng của nguồn thức ăn Vì vậy mà axit phytic được coi là một yếu tố kháng dinh dưỡng ở động vật,

đặc biệt là các động vật có dạ dày đơn ngăn như gia cầm, lợn

Với một số nguyên tố vi lượng, ví dụ như kẽm (Zn) thì giá trị dinh dưỡng của nó chịu ảnh hưởng rất lớn bởi axit phytic Một vài thí nghiệm đã cho thấy việc bổ sung dần dần axit phytic vào trong khẩu phần thức ăn của vật nuôi đã ảnh hưởng âm tính đến sự hấp thụ Zn2+ của cơ thể (cơ thể không hấp thụ được Zn2+) và tốc độ tăng trưởng trọng lượng của động vật thí nghiệm một cách rõ rệt

Axit phytic có khả năng kết hợp với protein tạo thành phức chất phytat- protein trong một khoảng pH rất rộng ở pH rất thấp, axit phytic mang điện tích âm lớn do sự phân ly của toàn bộ các gốc phosphat trong phân tử Trong điều kiện này, axit phytic có thể làm hạn chế khả năng hoà tan của các protein bởi vì có sự liên kết ion giữa các gốc phosphat cơ bản với các gốc tự do của amino axit (L-lysin, histidin, arginin) Trong môi trường có tính axit, axit phytic liên kết chặt chẽ với các protein thực vật do đó điểm đẳng

điện (pI) của các protein thực vật lúc này nằm trong khoảng pH = 4 - 5 ở khoảng pH = 6 -

8, cả axit phytic và protein thực vật đều mang điện tích âm Tuy nhiên, ở điều kiện này vẫn có thể hình thành phức chất giữa axit phytic và các protein Cơ chế xảy ra có thể là sự liên kết trực tiếp của axit phytic với proton ở các nhóm cuối cùng α-NH2 và ε- NH2 của gốc L-lysine tự do hoặc liên kết qua nhân tố trung gian là một cation đa hoá trị Cũng bởi liên kết với protein thực vật nên axit phytic làm giảm khả năng hoà tan và khả năng tiêu hoá của các protein này do đó làm giảm giá trị dinh dưỡng của chúng

Ngoài việc tạo phức chất với các khoáng chất và các protein, axit phytic còn tác

động đến các enzym như trypsin, pepsin, α- amilaza, β- galactosidaza và kết quả là làm giảm hoạt tính của các enzym tiêu hoá quan trọng này

Nguồn gốc và sự phân bố của axit phytic trong tự nhiên

Axit phytic thường tồn tại ở dạng tiền khởi là muối của các ion kim loại có hoá trị một hay nhiều hoặc có thể là hỗn hợp của chúng, chẳng hạn như hỗn hợp muối Kali – Magiê trong gạo, hỗn hợp Canxi – Magiê - Kali trong các hạt có dầu Các muối này thường tập trung ở một số vùng nhất định trong các hạt thực vật Axit phytic được tích luỹ dần trong hạt từ khi hạt non đến khi hạt trưởng thành trong suốt quá trình chín cùng với các chất dự trữ khác trong hạt như tinh bột, lipít Tuy nhiên, mức độ tập trung của axit phytic trong các hạt thực vật khác nhau là không giống nhau Ví dụ như trong các loại ngũ cốc, axit phytic được tích luỹ nhiều trong hạt phấn còn đối với các loại đậu thì axit phytic

được tích luỹ nhiều trong các hạt tinh thể của chúng Nhiều nghiên cứu cho thấy rằng, ở cây một lá mầm như lúa, lúa mì thì trong nội nhũ và nhân của hạt hầu như không chứa phytat mà lượng phytat lại được tìm thấy chủ yếu trong phôi và trong lớp tế bào hạt phấn

Ngược lại, ở cây hai lá mầm thì lượng phytat chủ yếu lại nằm trong thành phần nội nhũ (chiếm 99%) và chỉ có khoảng 1% là ở trong phôi (hay mầm) của hạt

Những nghiên cứu về phytase

Khái niệm về phytase

Phytase là một enzym xúc tác cho phản ứng thuỷ phân axit phytic (myo - inositol hexakisphosphate) thành các myo - inositol phosphate phân tử thấp hơn và các monophosphate vô cơ Trong một số trường hợp, phản ứng thuỷ phân có thể xảy ra hoàn toàn, giải phóng toàn bộ các gốc phosphat trong phân tử axit phytic (hay phytat) và hình thành nên các myo - inositol tự do Phytase có tên gọi đầy đủ, theo quy ước quốc tế là: myo - inositol hexakisphosphat phosphohydrolase Dạng phytat là một phức chất của phospho với các muối khoáng, protein và các enzym trong các hạt thực vật Các dạng chất này được coi là yếu tố phi dinh dưỡng Enzym phytase sẽ giải phóng photpho chứa trong các hạt ngũ cốc, hạt đậu và hạt có dầu bằng cách phá vỡ cấu trúc phytat đồng thời giải phóng các muối khoáng như Ca, Mg, các axit amin kết dính trong phân tử phytat

Hoạt độ phytase của chế phẩm enzym đặc trưng cho khả năng xúc tác phân giải hợp chất phytat (myo- inositol hexakis phosphate) thành các myo- inositol phosphat phân

tử thấp hơn và các gốc phosphat vô cơ Hoạt độ phytase được biểu thị bằng số đơn vị hoạt

độ trong 1ml (hay 1g) chế phẩm

Định nghĩa đơn vị hoạt độ: Một đơn vị hoạt độ phytase là lượng enzym xúc tác

phản ứng thuỷ phân để giải phóng ra 1àmol phosphat vô cơ trong thời gian một phút từ dung dịch natri - phytat ở 37 0 C, pH = 5,5 và trong các điều kiện của phương pháp phân tích

Phân loại phytase

Tổ chức định tên enzym thuộc Hội Hoá sinh Quốc tế đã phân loại phytase thành 2 loại là 3- phytase (EC 3.1.3.8) và 6- phytase (EC 3.1.3.26) Cách định tên này được dựa trên cơ sở xuất phát từ nhóm phosphat đầu tiên được giải phóng ra từ phân tử phytat khi enzym xúc tác phản ứng thuỷ phân Người ta thấy rằng loại 3- phytase (tức enzym xúc tác phản ứng thuỷ phân hợp chất phytat và giải phóng ra gốc phosphat đầu tiên ở vị trí số 3)

thường có ở vi sinh vật còn 6- phytase (là enzym xúc tác phản ứng thuỷ phân hợp chất phytat và giải phóng ra gốc phosphat đầu tiên ở vị trí số 6) có mặt chủ yếu ở trong thực vật

Đặc điểm cấu tạo và tính chất của enzym phytase

Đặc điểm cấu tạo của phytase

Phytase cũng giống như mọi enzym khác có bản chất là protein Chúng là những phân tử có khối lượng từ 20000 đến 1000000 dalton Kích thước phân tử protein của enzym phytase sản sinh từ các nguồn khác nhau thì khác nhau Người ta đã tính toán và tiến hành thí nghiệm xác định khối lượng phân tử của protein phytase thu được từ một số nguồn khác nhau

Các nghiên cứu đã cho thấy rằng hầu hết các phytase thu được từ các chủng vi sinh vật cho đến nay đều là các enzym được cấu tạo chỉ gồm một phân tử Nhưng phytase ở một số động vật và thực vật thì protein của chúng lại được cấu tạo bởi nhiều phần nhỏ, các phần đó được gọi là các tiểu đơn vị Ví dụ như phytase tích luỹ trong các hạt ngô đang nảy mầm là enzym mà phân tử protein của chúng bao gồm 2 tiểu đơn vị có trọng lượng phân

tử bằng nhau là 38 kDa Còn phytase được tách chiết từ ruột của một loài chuột lại được cấu tạo bởi 2 tiểu đơn vị là 2 băng protein có khối lượng được xác định bằng phương pháp

điện di trên gel polyacrylamid (SDS- PAGE) ước tính khoảng 70 và 90 kDa Tuy nhiên người ta đã xác định được rằng chỉ có tiểu đơn vị có kích thước 90 kDa là có khả năng thuỷ phân axit phytic vì hai băng protein này biểu hiện cho hai loại enzym khác nhau tương ứng là phosphataza kiềm tính và phytase.Có một trường hợp đặc biệt là phytase thu

được từ chủng Klebsiella aerogenes lại gồm hai dạng khác nhau Dạng thứ nhất có thể coi

là dạng enzym gốc, có kích thước lớn một cách khác thường (700 kDa) Dạng thứ hai có thể là một mảnh nhỏ của enzym gốc, có khối lượng phân tử rất thấp chỉ khoảng 10- 13 kDa nhưng nó lại mang đầy đủ hoạt tính của một enzym

Tính chất của phytase

Cơ chế thuỷ phân axit phytic của enzym phytase

Khi thuỷ phân axit phytic hay phytat, enzym phytase có tác dụng cắt đứt các liên kết trong phân tử axit phytic, phytat Quá trình cắt đứt này xảy ra nhanh hay chậm và hoàn

toàn hay không hoàn toàn phụ thuộc vào nhiều yếu tố như nhiệt độ phản ứng, pH phản ứng, lượng cơ chất và lượng enzym Ngoài ra, nó còn bị ảnh hưởng bởi các ion kim loại

Sau quá trình thuỷ phân, nó sẽ giải phóng các gốc phosphat, các myo- inositol và các muối khoáng Cơ chế thuỷ phân như Hình 2

Hình 2: Sự thuỷ phân axit phytic bằng enzym phytase

Nhiệt độ tối ưu cho sự hoạt động của phytase:

Nhìn chung, vận tốc phản ứng do enzym xúc tác thường tăng lên theo nhiệt độ nhưng chỉ tăng lên trong một giới hạn xác định mà ở đó, phần tử enzym vẫn còn bền và chưa bị biến tính Nhiệt độ thích hợp cho sự hoạt động của mỗi enzym thường tương đối rộng Đối với phytase, người ta đã nghiên cứu và cho thấy rằng chúng có thể hoạt động trong khoảng 45-750C

Nhưng nhiệt độ mà ứng với hoạt độ enzym cao nhất thường chỉ tồn tại một điểm và nhiệt độ đó gọi là nhiệt độ tối ưu của enzym (topt) Nhiệt độ tối ưu của phytase thu được từ các nguồn khác nhau thì cũng rất khác nhau, dải nhiệt độ này rất rộng, từ 37- 770C Tuy nhiên topt của một enzym thường không cố định mà có thể thay đổi tuỳ theo cơ chất, pH môi trường, thời gian phản ứng Khi nhiệt độ nằm ngoài khoảng thích nghi, enzym có thể

bị vô hoạt tạm thời hoặc vô hoạt hoàn toàn Nhiệt độ mà enzym bị mất hoạt tính xúc tác

hoàn toàn gọi là nhiệt độ tới hạn Nhiệt độ này thường vào khoảng trên 700C ở nhiệt độ tới hạn, enzym bị biến tính, ít có khả năng phục hồi lại hoạt độ Ngược lại, ở nhiệt độ dưới

00C, hoạt độ của enzym tuy bị giảm nhưng lại có thể tăng lên khi đưa về nhiệt độ bình thường

pH tối ưu cho sự hoạt động của phytase:

pH của môi trường ảnh hưởng rõ rệt đến phản ứng enzym vì nó ảnh hưởng đến mức

độ ion hoá cơ chất, enzym và độ bền của protein enzym Đa số các enzym bền trong giới hạn pH giữa 5 đến 9 Độ bền của enzym đối với pH môi trường cũng có thể tăng lên khi

có cơ chất, coenzym và Ca2+ pH tối ưu (pHopt) cho hoạt động của phytase thu được từ các nguồn khác nhau rất khác nhau pH thích hợp cho hoạt động của chúng thường vào khoảng 2,2 đến 8 Hầu hết các phytase từ vi sinh vật thường có pHopt nằm trong khoảng

hẹp 4,5- 5,6 Tuy nhiên phytase từ nấm, đặc biệt là Aspergillus fumigatus lại có khoảng

pH tối ưu rộng Có ít nhất 80% trong loài có hoạt độ cực đại ở pH giữa 4 và 7,3 Thường thì giá trị pHopt cuả một enzym cũng không cố định mà phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác như cơ chất, tính chất dung dịch đệm, nhiệt độ Qua các nghiên cứu cho thấy, trong cùng một điều kiện nhất định thì pHopt của phytase của các chủng được tìm thấy hầu như chỉ ở

một giá trị nhất định, riêng có hai loại phytase từ Aspergillus niger NRRL3135 và

Citrobacter freundii khác với các phytase khác ở điểm là chúng có hai giá trị pHopt khác

nhau Phytase từ một số loài vi khuẩn thuộc chi Bacillus có pHopt vào khoảng pH trung tính (6,5-7,5) Còn phytase thu được từ thực vật như hạt đậu và phấn hoa (hoa Huệ tây) lại

có pHopt cao hơn (thường khoảng 8,0)

Nguồn nguyên liệu để thu phytase

ở động vật, phytase đã được tìm thấy trong ruột và dạ dày của các loài động vật có dạ dày đơn ngăn như lợn và gia cầm Tuy nhiên, các phytase này gần như không có ý nghĩa gì đối với việc phân giải phytate có trong thức ăn được đưa vào dạ dày của động vật Qua kiểm tra, người ta đã thấy rằng nhiều loại inositol polyphosphat phosphatase (MIPP) mang lại hoạt tính phytase đều có trong hệ thống đường ruột của tất cả các con chuột đem làm thí nghiệm nhưng chủ yếu tập trung nhiều ở thận và gan của loài động vật này Các nhà khoa học đã tách dòng và biểu hiện được thành phần inositol polyphosphatate phosphatase mang hoạt tính ở gan của loài chuột trên Một loại enzym giống phytase cũng

đã được tìm thấy ở loài động vật nguyên sinh Paramecium

Phytase từ nguồn vi sinh vật

Chúng ta đã biết rằng enzym nói chung có trong tất cả các cơ quan, mô của động vật, thực vật cũng như trong tế bào vi sinh vật Nguồn vi sinh vật lại vô cùng phong phú và

đa dạng nên phytase cũng như các loại enzym khác có thể được sinh ra từ rất nhiều loài vi sinh vật khác nhau Người ta đã phát hiện và tách được phytase ở rất nhiều loài nấm mốc,

đặc biệt là Aspergillus Cho đến nay đã phân lập được trên 200 loài vi sinh vật từ đất có

khả năng sinh tổng hợp phytase Phần lớn các vi sinh vật này cho sản phẩm phytase nội bào, chỉ có khoảng 30 loài trong số đó là có khả năng sinh tổng hợp phytase ngoại bào Tất cả các vi sinh vật sản sinh phytase ngoại bào thuộc loại nấm mốc, có 28 loài thuộc chủng

Aspergillus, chỉ có một loại từ Penecillium và một loại từ Mucor Trong 28 loài Aspergillus có

khả năng sinh tổng hợp phytase ngoại bào đã phân lập được có 21 loài thuộc nhóm Aspergillus

niger Các nghiên cứu còn khẳng định rằng chủng Aspergillus niger là nguồn thu phytase ngoại

bào tốt nhất Phytase cũng được phát hiện ra ở nhiều loài vi khuẩn khác nhau như Aerobacter

aerogenes, Pseudomonas sp, Bacillus subtilis, Klebsiella sp, Bacillus subtilis natto Vi khuẩn

sinh tổng hợp phytase ngoại bào chỉ có hai loài đó là Bacillus và Enterobacter Một số nấm men như Sacharomyces cerevisiae, Candida tropicalis, Torulopsis candida cũng có khả năng

sinh phytase

Mặc dù phytase rất phong phú trong sinh giới, có thể có nhiều nguồn thu khác nhau song việc tách và thu chúng, nhất là tách với quy mô công nghiệp lợi về kinh tế chỉ có thể tiến hành trong những trường hợp mà vật liệu có chứa một lượng lớn enzym cũng như cho

phép thu được enzym với hiệu suất cao Trong tay con người có ba nguồn nguyên liệu sinh học cơ bản để tách chiết bất kỳ một loại enzym nào nói chung Đó là các mô và cơ quan

động vật, mô và cơ quan thực vật, tế bào vi sinh vật Trong các nguồn nguyên liệu sinh học trên thì chỉ có nguồn nguyên liệu vi sinh vật là dồi dào và đầy hứa hẹn vì việc sử dụng

vi sinh vật làm nguồn nguyên liệu để sản xuất các chế phẩm enzym sẽ khắc phục được mọi khó khăn và hạn chế so với hai nguồn nguyên liệu trên Thực tế đã chứng minh tính

ưu việt và khả năng to lớn của các nguồn nguyên liệu vi sinh vật:

- Thứ nhất, vi sinh vật là nguồn nguyên liệu vô tận để sản xuất enzym nói chung và phytase nói riêng với một lượng lớn và có thể mở rộng để sản xuất tới quy mô cần thiết,

đồng thời việc thu chế phẩm cũng dễ dàng

- Thứ hai, từ vi sinh vật không những chỉ thu được một số lượng lớn các enzym khác nhau, mà từ một số rất lớn các vi sinh vật đã biết luôn luôn có thể tìm được những vi sinh vật có phức hệ enzym thích hợp hơn nhiều với điều kiện của sản xuất Vi sinh vật có thể đồng hoá bất kỳ chất nào trong thiên nhiên trong khi đó có rất nhiều chất mà động vật

và thực vật không thể đồng hoá được Tuy nhiên muốn sử dụng các nguồn chất vô cùng phong phú đó thì tế bào vi sinh vật phải chứa những hệ enzym cần thiết cho các nhu cầu

- Thứ năm, vi sinh vật sinh sản với tốc độ nhanh chóng, lại có kích thước và khối lượng nhỏ nhưng lại có tỷ lệ enzym trong tế bào tương đối lớn nên quá trình sản xuất chế phẩm enzym khá dễ dàng, thao tác thuận tiện, hiệu suất thu hồi cao Trong một thời gian ngắn, với một quy mô nhỏ có thể sản xuất một lượng lớn chế phẩm enzym

- Cuối cùng, thức ăn để nuôi vi sinh vật dễ kiếm, rẻ tiền nên sẽ giảm chi phí trong quá trình sản xuất, đem lại hiệu quả kinh tế lớn

Chính vì những lý do trên mà việc đề xướng và hoàn chỉnh phương pháp sản xuất phytase từ vi sinh vật có một ý nghĩa rất lớn Hiện nay, trên thế giới đã nghiên cứu sản xuất trên quy mô công nghiệp phytase ở dạng đơn chất cũng như chế phẩm kỹ thuật với mức độ tinh khiết khác nhau, thường từ nấm mốc và vi khuẩn.

Bảng 1: Bảng tóm tắt các phytase thu được từ một số nguồn khác nhau

Aspergillus niger NRRL 3135 Ngoại bào

Aspergillus terrus Ngoại bào

Aspergillus carneus Ngoại bào

Aspergillus fumigatus Ngoại bào

Penicillium caseoicolum Ngoại bào Nấm mốc

Rhizopus oligosporus Ngoại bào và nội bào

Saccharomyces cerevisiae Ngoại bào

Schwanniomyces castelii Ngoại bào

Khyveromyces fragilis Ngoại bào

Nấm men

Debaryomyces castelii Ngoại bào

B subtilis (natto) Ngoại bào

B amyloliquefaciens Ngoại bào

Klebsiella aerogenes Nội bào

Vi khuẩn

Citrobacter freundii Nội bào

Mầm ngô Nội bào

Thực Vật

Typha latifolia pootten Nội bào

Động vật

ứng dụng của phytase

Như chúng ta đã biết enzym là những chất xúc tác sinh học có tính đặc hiệu cao đối với cơ chất, do tế bào sống tổng hợp nên, điều khiển vận tốc và sự chuyển hoá của hàng nghìn phản ứng xảy ra trong sinh chất Enzym rất có ích cho con người trong việc nghiên cứu và sử dụng để giải quyết các vấn đề quan trọng của khoa học, công nghiệp và nền kinh tế quốc dân Trong khoảng 20 năm trở lại đây, enzym đã được ứng dụng rộng rãi trong rất nhiều ngành khác nhau như trong hoá học, trong y học, trong công nghiệp nhẹ và

đặc biệt trong công nghiệp thực phẩm Do đó ở nhiều nước trên thế giới, việc sản xuất các chế phẩm enzym đã trở thành một ngành công nghiệp lớn Nền công nghiệp sản xuất chế phẩm enzym đã có những bước tiến lớn với tiến độ phát triển khá mạnh mẽ Càng ngày càng xuất hiện nhiều nhà máy sản xuất các loại chế phẩm enzym khác nhau Enzym phytase được tìm thấy và đã được chứng minh rằng chúng có thể đem lại những lợi ích cực

kỳ to lớn cho nền nông nghiệp nói riêng và cho nền kinh tế nói chung Chính vì vậy mà con người đã không ngừng khai thác nguồn lợi này và đã áp dụng phytase trong nhiều lĩnh vực khác nhau

ứng dụng trong nông nghiệp

Việc sử dụng chế phẩm enzym phytase bổ sung vào thức ăn cho chăn nuôi ngày càng được tăng cường, bởi vì qua các nghiên cứu đã cho thấy rằng việc bổ sung chế phẩm sinh học nói chung và chế phẩm enzym nói riêng vào thức ăn cho gia súc, gia cầm đã đưa sản lượng lên rất cao với giá thành hạ Những năm gần đây, ngành chăn nuôi nước ta đã có nhiều tiến bộ đáng kể Cùng với việc nghiên cứu lai tạo giống và hoàn thiện các quy trình chăm sóc nuôi dưỡng thì khâu chế biến thức ăn cho chúng cũng là một nhân tố quyết định

đến hiệu quả trong chăn nuôi Chính vì vậy, người ta đã sử dụng chế phẩm enzym để bổ sung vào thức ăn chăn nuôi nhằm tăng khả năng chuyển hoá thức ăn của chúng

Rất nhiều nghiên cứu đã chứng minh vai trò tác động của phytase đối với cơ thể

động vật, đặc biệt là động vật có dạ dày đơn ngăn như gia cầm, lợn và cá Năm 1992, phytase bắt đầu được thương mại hoá dưới dạng chế phẩm để bổ sung vào thức ăn của chúng Từ những lợi ích mà phytase có thể mang lại cho con người đã khiến ngày càng có nhiều ứng dụng của loại enzym này trên nhiều lĩnh vực khác nhau Người ta đã không ngừng nghiên cứu nhằm mục đích nâng cao tính chất ưu việt của phytase để những ứng dụng của chúng đạt hiệu quả hơn

Việc sử dụng chế phẩm phytase để bổ sung vào khẩu phần thức ăn cho vật nuôi không những cho phép các vật nuôi đồng hoá tốt thành phần phospho sẵn có trong thức

ăn, tăng sự hấp thu protein và các nguyên tố khoáng mà còn giảm được sự ô nhiễm môi trường do hạn chế được lượng phosphat khó tiêu được thải ra theo phân của động vật Hiệu quả của việc ứng dụng này đã được kiểm định Tại Mỹ, người ta dự tính rằng nếu phytase

được sử dụng trong thức ăn cho tất cả các loài động vật dạ dày đơn ngăn thì sẽ giải phóng

được một lượng phospho tương ứng với giá trị 168 triệu USD và loại trừ được 8,23x104 tấn phosphat thải ra môi trường hàng năm

ứng dụng trong công nghiệp sản xuất giấy

Việc nghiên cứu sự chuyển hoá của axit phytic rất quan trọng trong công nghiệp sản xuất giấy Một loại phytase chịu nhiệt đã được tìm thấy và người ta đã phát hiện rằng chúng có tiềm năng như một tác nhân sinh học mới để làm giảm lượng axit phytic trong sản xuất giấy Sự phân huỷ axit phytic nhờ enzym có điểm lợi là không tạo ra các chất có khả năng gây ung thư và các sản phẩm trung gian có tính độc cao Bởi vậy, việc sử dụng phytase trong quá trình sản xuất giấy rất có lợi cho môi trường và điều này sẽ góp phần

cho sự phát triển của các công nghệ sạch trong tương lai

3.1.4 Tổng quan về sản xuất pectinaza trên thịt quả cà phê

Pectinaza là nhóm enzym xúc tác sự phân cắt các hợp chất pectin thành các hợp phần khác nhau Trong hệ enzym pectinaza phân giải pectin gồm nhiều nhóm enzym khác

nhau, chúng có khối lượng phân tử khản 40,4 kDa Có nhiều các phân loại enzym pectinaza : dựa vào tính đặc hiệu có thể phân ra enzym phân giải pectin và phân giải axit pectinic và axit pectic Dựa và cơ chế tác dụng mà người ta chia enzym ra thành hai loại: enzym phân giảI các liên kết ở trong nội mạch và enzym phân giả các liên kết ỏ đầu mạch Dựa và pH tối ưu có thể chia enzym thành enzym pH axit và pH kiềm

Đặc điểm cấu tạo và tính chất của enzym pectinaza

Pectinesteraza: Tên gọi hệ thống là pectinhydrolaza (mã số EC3.1.1.11), với trọng

Sơ đồ tác dụng của pectinesteraza lên hợp chất pectin

pectinesteraza thu được từ các nguồn khác nhau thì có pH tối ưu khác nhau Pectinesteraza của sinh vật có pH tối ưu từ 4,5-5,5 còn của chế phẩm đã loại bỏ enzym polygalacturonaza có pH tối ưu từ 2,0-6,5 TráI lại pH tối ưu của polyesteraza từ thực vật thượng đẳng cao hơn là 5.0-8,0

Nhiệt độ tối ưu của pectinesteraza từ nấm mốc là : 30-45oC và bị vô hoạt khi ở nhiệt độ 55-62oC, nhiệt độ tối ưu của pectinesteraza từ thực vật thượng đẳng cao hơn từ 55-60oC

Pectinesteraza thường được hoạt hoá bởi các ion Na, K, Ca và Mg Trái lại các

pectinesteraza

Polygalacturonaza

Polygalacturonaza có tên hệ thống là poly-α 1,4 galacturonitglucanohydrolaza (mã

số EC:3.2.1.15) Là các enzym xúc tác sự thuỷ phân liên kết 1-4 glucozit trong phân tử pectin [28]

Polygalacturonaza ít gặp trong cây, Polygalacturonaza chủ yếu có ở các vi sinh vật,

đặc biệt ở nấm mốc và vi khuẩn, thường có trọng lượng phân tử khoảng 65kDa Polygalacturonaza là một phức hệ enzym gồm nhiều cấu tử và thường có tính đặc hiệu đối với cơ chất Các sản phẩm trung gian của quá trình thuỷ phân pectin Polygalacturonaza chủ yếu bền vững ở trong vùng pH từ 4,0-6.0 Nhiệt độ tối ưu của đa số Polygalacturonaza nằm trong khoản 40 –45oC ở trong khoảng nhiệt độ đó chúng thường bền vững, nhưng sẽ

bị vô hoạt khi nhiệt độ là 50 đến khoảng 55-60oC

Dựa vào tính đặc hiệu và cơ chế tác trên cơ chất H.Deuel và E Stutz (1958) đã chia bốn kiểu Polygalacturonaza

Polygalacturonaza

Tên gọi hệ thống polyα 1,4 galacturonic metylesteglucanohydrolaza Polymetyl galacturonaza là enzym tác song lên axit polygalacturonic đã được metoxy hoá (tức pectin) Các enzym này được chia thành 2 nhóm nhỏ tuỳ theo vị trí liên kết glucozit bị cắt

đứt dưới sự xúc tác của enzym ở đầu mạch hay giữa mạch như:

Endo-glucozidaza- polymetyl galacturonaza I

Endo-glucozidaza- polymetyl galacturonaza I còn gọi là enzym polygalacturonaza dịch hoá Đây là enzym xúc tác sự thuỷ phân các liên kết α -1,4 glucozit nội mạch của các phân tử axit polygalactrunic được este hoá ở mức độ cao

Hoạt tính của enzym này bị giảm khi có mặt của enzym pectinesteraza trong môi trường Endo-glucozidaza- polymetyl galacturonaza I rất phổ biến ở trong các vi sinh vật,

đặc biệt là ở nấm mốc A niger, Botrylis cinerea, A awamori

Sơ đồ tác dụng của Endo-glucozidaza- polymetyl galacturonaza I lợp chất pectin

+Exo-glucozidaza- polymetyl galacturonaza III

Exo-glucozidaza- polymetyl galacturonaza III còn là enzym polygalacturonaza

đường hoá Đây là enzym xúc tác sự thuỷ phân các kiên kết α 1,4- glucozit ở đầu mạch để tách dần dần tong gốc axit galacturonic ra khỏi phân tử pectin hay axit pectinic, bắt đàu từ

đầu không khử Exo-glucozidaza- polymetyl galacturonaza III có áI lục với gốc axit galacturonic đã metyl hoá, nghĩa là phân cắt các liên kết α1,4- ở đầu mạch nằm giữa 2 gốc axit galacturonic có nhóm –COOCH3

+ Exo-glucozidaza- polymetyl galacturonaza II

Là enzym polygalacturonaza dịch hoá Exo-glucozidaza- polymetyl galacturonaza

II Thuỷ phân liên kết α1,4-glucozit ở giữa mạch của các phân tử axit pectic hay axit pectinic, các enzym này chỉ tác dụng khi có mặt nhóm –COOH tự do Vị trí đứt mạch của cơ chất được xử lý sơ bộ bằng pectinesteraza Đa số nấm mốc và vi khuẩn là những vi sinh vật tổng hợp được enzym này

Sơ đồ tác dụng của Exo-glucozidaza- polymetyl galacturonaza II lên hợp chất pectin

Enzym này xúc tác sự thuỷ phân các liên kết glucozit ở đầu mạch của phân tử axit pectic hoặc axit pectinic Enzym này có áI lựu với các liên kết glucõit ở đầu mạch gần với nhóm cacboxyl tự do

α1,4-được chuyển đến nguyên tử cacbon thứ 1 của gốc axit galacturonic khác Phải ứng xảy ra

dễ dàng trong môi trường trung tính hoặc kiềm yếu

Transeliminaza tác dụng được trên pectin cũng như trên axit pectic, enzym này có tính đặc hiệu cao Dựa vào cơ chế tác dụng và tính đặc hiệu đó người phân ra thành các Transeliminaza sau:

+ pectin- Transeliminaza: là những enzym tác dụng trên phân tử pectin và axit pectinic Các enzym này có tên hệ thống là poly-α 1,4 galacturonic metyleste glucanoliaza Các enzym có hai loại:

Endo-pectintranseliminaza I

Exo- pectintranseliminaza III

Polyglacturonat- Transeliminaza: là những enzym tác dụng trên axit pectinic và axit pectic Những enzym này có tên hệ thống là poly-α 1,4 D-galacturonic-glucanoliaza Các enzym này có hai loại:

Endo- polyglacturonat- Transeliminaza II

Exo- polyglacturonat- Transeliminaza IV

Transeliminaza từ những nguồn khác nhau thì có cơ chế tác dụng và các thuộc tính khác nhau Transeliminaza từ nấm mốc hoạt động tối ưu ở pH=5,2 Trái lại, Transeliminaza từ vi khuẩn hoạt động tối ưu ở pH từ 7,0-8,5

Nguồn nguyên liệu để thu nhận enzym pectinaza

Pectinaza có thể được sinh tổng hợp từ nấm mốc, vi khuẩn và nấm men Phần lớn các chủng vi sinh vật dùng để sản sản xuất enzym pectinaza đều là vi sinh vật hiếu khí Tuy nhiên người ta cũng đã tìm được những vi sinh vật vốn là yếm khí bắt buộc nhưung lại có khản năng sinh tổng hợp enzym pectinaza

Trong số các vi sinh vật có khả năng tổng hợp enzym pectinaza thì nấm mốc có khả

năng sinh tổng hợp cao nhất Các chủng Aspergillus, đặc biệt là Aspergillus niger, A

awamori đã được ứng dụng nhiều trong sản xuất Pectinaza có thể thu nhận được từ nấm

mốc bằng phương pháp nuôi cấy bề mặt hoặc nuôi cấy chìm sục khí Tuy nhiên dù nuôi cấy trên môi trường lỏng hay đặc thì ngoài các thành phần dinh dưỡng chủ yếu như cacbon, nitơ, phospho thì chất cảm ứng pectin là một thành phần không thể thiếu trong môi trường để nấm mốc tổng hợp định hướng pectinaza với số lượng và hoạt độ lớn

Theo tác giả Antier P và cộng sự đăng trên tạp chí Biotechnol Adv 1993;11(3): 429-40 chúng ta có thể sử dụng nguồn nguyên liệu có độ ẩm thấp như thịt quả cà phê để

lên men sản xuất pectinaza trên hệ thống lên men rắn nhưng phải cải thiện chủng A niger

thích ứng với môi trường lên men để cho hoạt lực cao Tầm quan trọng đặc biệt là dựa trên việc sử dụng 2 hợp chất kháng trao đổi chất: 2- deoxy-glucose (DG) và 2,4-dinitro-phenol kết hợp với ethylen glycol để tuyển chọn chủng khỏe chịu được mức độ xử lý bào tử bằng tia UV Các dạng đột biến nhạy cảm với DG lại làm tăng hàm lượng pectinasa Đây là một nhân tố quan trọng có ý nghĩa trong việc tuyển chọn chủng phù hợp với hệ thồng lên men rắn với nguồn nguyên liệu có độ ẩm thấp như thịt quả cà phê

Tính chất của pectinaza từ Aspergillus niger

Pectinaza được sản xuất từ nấm mốc Apergillus niger là một chế phẩm enzym

thương mại Dịch enzym thô sau khi tách chiết bằng kết tủa (NH4)SO4 và tinh chế bằng

pH tối ưu là 5.0, nhiệt độ tối thích là 36oC, ổn định dưới 35oC, Kết quả phân tích trình tự axit amin cho thấy có 19 loại axit amin trong phân tử enzym endo- polygalacturonaza Trọng lượng phân tử của enzym này khoảng 40,4 kDa Đây là enzym dịch hoá, xúc tác sự thuỷ phân các liên kết α1,4- glucozit nội mạch của các phân tử axit polygalacturonic

Theo tác giả Diaz-Godinez G và cộng sự đăng trên J Ind Microbiol Biotechnol

2001 May;26(5):271-5 việc sản xuất exopectinaza bằng chủng A niger được so sánh trong

hai hệ thồng lên men chìm và rắn Việc thêm sacharoza vào hệ thống lên men chìm thì lại

ức chế quá trình sinh tổng hợp pectinaza Như vậy sản lượng pectinaza là không đáng kể khi lên men chìm có bổ sung sacharoza Trong khi đó ở hệ thống lên men rắn với độ ẩm cao, sản lượng exopectinasa đạt ở mức độ cao khi sử dụng sacharoza điều này tương

đương với việc tạo ra nhiều sinh khối và không có sự ức chế quá trình sinh tổng hợp pectinaza

ứng dụng của enzym pectinaza

Trong hầu hết các chế phẩm pectinaza đều gồm các phức hệ enzym giống nhau Các chế phẩm này chỉ khác nhau ở mức độ hoạt động tỷ lệ các enzym Chính vì điều này

mà người ta sẽ có hướng sử dụng các chế phẩm khác nhau tuỳ theo mục đích công nghệ và tính chất của loại pectin Các enzym có mặt trong chế phẩm pectinaza phụ thuộc vai trò của chúng trong quá trình công nghệ mà được chia thành các nhóm:

- Enzym quyết định hiệu quả tác dụng của chế phẩm

- Enzym có mặt trong chế phẩm cũng tốt nhưng không bắt buộc

- Enzym không cần thiết nhưng có thể cho phép có mặt một lượng không đáng kể trong chế phẩm

Vì vậy đối với mỗi quá trình công nghệ có thể sử dụng các nhóm enzym pectinaza khác nhau

Tác giả Kashyap DR đã có bài viết về ứng dụng của pectinaza trong lĩnh vực thương mại đăng trên tạp chí Bioresour Technol 2001 May;77 (3):215-27 Tác giả đã chỉ

ra những ứng dụng của enzym này trong công nghiệp chế biến nước quả, dệt sợi, sản xuất giấy, lên men thịt quả cà phê, chiết tinh dầu và xử lý nước thải

Theo công bố mới đây trên tạp chí Bioresour Technol 2004 Oct;95 (1):49-52 của tác giả Bai ZH và cộng sự đẫ đề cập đến một ứng dụng rất mới của enzym pectinaza Sử dụng dịch chiết của enzym này trong xử lý nước thải và kháng bệnh ở thực vật cho cây khoai tây non và dưa chuột Củ cải đường được sử dụng như nguồn cacbon và nước thải từ việc sản xuất glutamate được sử dụng làm nguồn N và H2O cho quá trình lên men sinh

tổng hợp pectinaza bằng chủng A niger

ứng dụng pectinaza trong công nghệ sản xuất các chế phẩm từ quả

Pectinaza thường được sử dụng trong các ngành công nghiệp thực phẩm sau:

- Sản xuất rượu vang

- Sản xuất các mặt hàng từ quả: nước quả cô đặc, mứt nhừ, mứt đông

- Sản xuất nước quả và đồ uống không cồn

- Sản xuất nước giải khát

- Sản xuất cà phê và cà phê hoà tan

Trong sản xuất rượu, việc dùng pectinaza không những cho phép tăng hiệu suất thu hồi nước quả, tốc độ lọc Quá trình sản xuất rút ngắn mà rượu thành phẩm còn có mùi thơm hơn, trong và ánh hơn [67]

Với sản xuất nước quả ngâm rượu, nhờ sử dụng pectinaza mà thời gian lắng có thể giảm 10-12 ngày, hiệu suất tăng 10-15%, hao phí rượu giảm từ 7% xuống 2,5%

Ngoài các ngành nói trên, pectinaza còn được dùng trong việc sản xuất các gel

khác nhau từ quả, cà phê đặc hoặc pectin có hàm lượng metoxy thấp

ứng dụng pectinaza trong chăn nuôi

Khẩu phần thức ăn của động vật thường có hàm lượng pectin, xenluloza và hemixenlulaza cao Trong khi đó động vật lại chỉ có khả năng tổng hợp rất hạn chế các enzym cacbonhydrolaza phân giải được tinh bột và disaccarit Trong dịch tiêu hoá động vật cũng không có hemixenlulaza phân giải xilan, pectinaza phân giải pectin, ligninaza phân giảI lignin và các hợp chất phức tạp khác Để giúp cho động vật sử dụng triệt để thức