Luận Án Tiến Sĩ Nghiên Cứu Chế Tạo Bộ Kít Phát Hiện Nhanh Nọc Rắn Hổ Mang Naja Atra Bằng Kỹ Thuật Sắc Ký Miễn Dịch.pdf

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ QUỐC PHÒNG HỌC VIỆN QUÂN Y NGUYỄN NGỌC TUẤN NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO BỘ KÍT PHÁT HIỆN NHANH NỌC RẮN HỔ MANG NAJA ATRA BẰNG KỸ THUẬT SẮC KÝ MIỄN DỊCH LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC NĂM 2017[.]

NGUYỄN NGỌC TUẤN

NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO BỘ KÍT PHÁT HIỆN NHANH

NỌC RẮN HỔ MANG NAJA ATRA BẰNG KỸ THUẬT

SẮC KÝ MIỄN DỊCH

LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC

NĂM 2017

NGUYỄN NGỌC TUẤN

NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO BỘ KÍT PHÁT HIỆN NHANH

NỌC RẮN HỔ MANG NAJA ATRA BẰNG KỸ THUẬT

NĂM 2017

Tôi xin cam đoan luận án này là của riêng tôi và có một phần số liệu trong đề tài (Nghị định thư) có tên: “Hợp tác nghiên cứu chế tạo test chẩn đoán rắn hổ mang cắn” Kết quả đề tài này là thành quả nghiên cứu của tập thể mà tôi là một thành viên chính Tôi đã được chủ nhiệm đề tài và toàn bộ các thành viên trong nhóm nghiên cứu đồng ý cho phép sử dụng số liệu đề tài này vào trong luận án để bảo vệ lấy bằng tiến sĩ Các số liệu, kết quả nêu trong luận án là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất cứ công trình nào khác

Tác giả luận án

Nguyễn Ngọc Tuấn

Trang phụ bìa

Lời cam đoan

Mục lục

Danh mục các chữ viết tắt

Danh mục các bảng

Danh mục các biểu đồ

Danh mục các sơ đồ

Danh mục các hình

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 3

1.1 Tai nạn rắn cắn và chẩn đoán rắn độc cắn ở Việt nam 3

1.1.1 Tai nạn rắn cắn ở Việt nam 3

1.1.2 Chẩn đoán rắn độc cắn ở Việt Nam 5

1.2 Rắn hổ mang Naja atra 6

1.2.1 Đặc điểm sinh học và nọc độc 6

1.2.2 Tai nạn do rắn hổ mang Naja atra cắn 9

1.3 Một số kỹ thuật miễn dịch phát hiện nọc rắn và kháng thể kháng

nọc rắn 12

1.3.1 Điện di miễn dịch 13

1.3.2 Ngưng kết hồng cầu 13

1.3.3 Ngưng kết miễn dịch 14

1.3.4 Miễn dịch phóng xạ 15

1.3.5 Miễn dịch huỳnh quang 16

1.3.6 Miễn dịch quang 16

1.3.7 Miễn dịch gắn enzym 17

1.3.8 Kít phát hiện nhanh 18

1.4.2 Nguyên lý hoạt động 21

1.4.3 Chế tạo và tối ưu que thử 23

1.5 Kháng thể kháng nọc rắn 26

1.5.1 Công nghệ chế tạo kháng thể IgG kháng nọc rắn 26

1.5.2 Công nghệ chế tạo kháng thể IgY kháng nọc rắn 30

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 33

2.1 Đối tượng và vật liệu nghiên cứu 33

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 33

2.1.2 Vật liệu nghiên cứu 34

2.2 Phương pháp nghiên cứu 35

2.2.1 Thu thập và kiểm định chất lượng nọc rắn 36

2.2.2 Chuẩn bị kháng nguyên và gây miễn dịch 37

2.2.3 Phát hiện kháng thể kháng nọc rắn trong huyết thanh 39

2.2.4 Tách chiết và tinh sạch kháng thể 40

2.2.5 Kiểm tra độ đặc hiệu của các kháng thể với các kháng nguyên

nọc rắn 45

2.2.6 Hấp phụ miễn dịch 45

2.2.7 Thử nghiệm lựa chọn cặp kháng thể 46

2.2.8 Tối ưu hóa phản ứng cộng hợp 49

2.2.9 Tối ưu hóa bộ xét nghiệm nhanh 50

2.2.10 Xác định thông số kỹ thuật của xét nghiệm 55

2.2.11 Thử nghiệm bộ kít phát hiện nhanh nọc rắn trên các mẫu

bệnh phẩm 55

2.3 Xử lý số liệu 56

2.4 Đạo đức nghiên cứu 56

3.1 Kết quả nghiên cứu chế tạo kháng thể kháng nọc rắn hổ mang Naja atra

từ thỏ và gà 57

3.1.1 Kết quả kiểm định chất lượng nọc rắn hổ mang Naja atra 57

3.1.2 Biến động hiệu giá kháng thể trong quá trình gây miễn dịch 58

3.1.3 Kết quả xác định hiệu giá kháng thể của các huyết thanh kháng

nọc rắn 60

3.1.4 Phản ứng chéo giữa kháng thể kháng nọc rắn với kháng nguyên nọc rắn của các loài khác 61

3.2 Kết quả tách chiết và tinh sạch kháng thể IgG và IgY từ huyết thanh và trứng gà 62

3.2.1 Sắc ký đồ tinh sạch kháng thể 62

3.2.2 Kết quả điện di kháng thể IgG và IgY sau tách chiết và tinh sạch 63

3.2.3 Hoạt tính kháng thể IgG và IgY sau tách chiết và tinh sạch 64

3.3 Phản ứng đặc hiệu và phản ứng chéo của kháng thể với các kháng nguyên nọc rắn hổ mang Naja atra, hổ đất và hổ chúa 65

3.3.1 Kiểm tra phản ứng đặc hiệu và phản ứng chéo của các kháng thể bằng kỹ thuật Western blot 65

3.3.2 Hoạt tính và phản ứng đặc hiệu của các kháng thể với kháng nguyên nọc rắn hổ mang Naja atra sau hấp phụ miễn dịch 66

3.4 Kết quả lựa chọn cặp kháng thể 68

3.4.1 Kết quả lựa chọn cặp kháng thể bằng phương pháp ELISA 68

3.4.2 Kết quả lựa chọn cặp kháng thể bằng phương pháp nhúng

trực tiếp 69

3.5 Kết quả cộng hợp kháng thể với hạt nano vàng 70

3.5.1 Tối ưu hóa nồng độ kháng thể và pH dung dịch hạt nano vàng 70

3.6 Kết quả tối ưu xét nghiệm phát hiện nhanh nọc rắn hổ mang Naja atra 72

3.6.1 Hệ đệm 72

3.6.2 Nồng độ kháng thể ở vạch phát hiện 73

3.6.3 Nồng độ kháng thể ở vạch chứng 74

3.6.4 Nồng độ kháng thể cộng hợp 74

3.7 Kết quả xác định các thông số kỹ thuật của xét nghiệm phát hiện

nhanh 75

3.7.1 Giới hạn phát hiện 75

3.7.2 Phản ứng chéo 76

3.7.3 Độ ổn định của bộ kít xét nghiệm phát hiện nhanh 76

3.7.4 Bộ kít xét nghiệm phát hiện nhanh nọc rắn hổ mang 77

3.8 Đánh giá khả năng phát hiện nọc rắn hổ mang của bộ kít trên

lâm sàng 77

3.8.1 Đặc điểm đối tượng nghiên cứu 77

3.8.2 Kết quả định lượng và phát hiện nọc rắn hổ mang trên lâm sàng 78

CHƯƠNG 4 BÀN LUẬN 85

4.1 Nghiên cứu chế tạo kháng thể kháng nọc rắn hổ mang Naja atra từ

thỏ và gà 85

4.1.1 Kiểm định chất lượng nọc rắn hổ mang Naja atra 85

4.1.2 Lựa chọn loài gây miễn dịch 86

4.1.3 Tạo kháng nguyên và quy trình gây miễn dịch 87

4.1.4 Phản ứng đặc hiệu và phản ứng chéo của kháng thể với các kháng nguyên nọc rắn 88

4.1.5 Tách chiết và tinh sạch kháng thể IgG và IgY từ huyết thanh và

trứng gà 89

4.3 Tối ưu hóa bộ kít phát hiện nhanh nọc rắn hổ mang Naja atra 93

4.3.1 Lựa chọn nguyên liệu cho bộ kít 93

4.3.2 Tối ưu hóa quy trình cộng hợp 94

4.3.3 Tối ưu hóa hệ đệm và các hóa chất xử lý màng 96

4.3.4 Tối ưu hóa nồng độ kháng thể 97

4.4 Thử nghiệm bộ kít phát hiện nhanh nọc rắn hổ mang Naja atra trên

in vitro 99

4.5 Đánh giá khả năng phát hiện nọc rắn hổ mang trên lâm sàng 102

4.5.1 Đặc điểm đối tượng nghiên cứu 102

4.5.2 Thử nghiệm khả năng phát hiện nọc rắn hổ mang trên mẫu

lâm sàng 103

KẾT LUẬN 109

KIẾN NGHỊ 110

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CỦA LUẬN ÁN 111

TÀI LIỆU THAM KHẢO 112

PHỤ LỤC 126

TT Phần viết tắt Phần viết đầy đủ

1 BSA Bovine Serum Albumin (Albumine huyết thanh bò)

2 CFA Completed Freund's Adjuvant (Tá chất Freund hoàn chỉnh)

3 CNBr Cyanogen Bromide

4 ECVAM European Centre for the Validation of Alternative Methods

5 EDC 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide

6 ECL Enhanced chemiluminescence

7 ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay (Thử nghiệm miễn

dịch hấp phụ gắn enzym)

8 HRP Horseradish Peroxidase

9 HTKNR Huyết thanh kháng nọc rắn

10 ICA Immunochromatographic assay (Sắc ký miễn dịch)

11 IFA Incompleted Freund's Adjuvant (Tá chất Freund không

hoàn chỉnh)

12 IgG Immunoglobulin G (Kháng thể lớp IgG)

13 IgY Yolk Immunoglobulin (Kháng thể IgY)

16 KTKNR Kháng thể kháng nọc rắn

19 NC Nitrocellulose (Màng Nitrocellulose)

20 OIA Optical immunoassay (Miễn dịch quang)

21 OPD O – phenylene diamine (Cơ chất)

22 PBS Phosphat Buffer Salin (Dung dịch đệm phosphat)

23 PEG Polyethylene Glycol

24 PVA Polyvinyl Alcohol

Bảng Tên bảng Trang

1.1 Ưu và nhược điểm của các vật liệu sử dụng làm màng cộng hợp 25 2.1 Liều kháng nguyên sử dụng gây miễn dịch cho thỏ và gà 37 3.1 LD0 và LD100 của nọc rắn hổ mang Naja atra 57 3.2 Tỷ lệ tử vong của chuột sau 24 giờ tiêm nọc rắn hổ mang Naja

3.3 Tính kết quả LD50 theo phương pháp Karber-Behrens 57 3.4 Kết quả thử nghiệm với kháng nguyên nọc rắn hổ mang Naja atra 68

3.6 Kết quả xác định khả năng phát hiện nọc rắn của bộ kít xét nghiệm

3.7 Phản ứng chéo của bộ kít xét nghiệm với nọc của một số loài rắn độc

3.9 Kết quả phát hiện nọc rắn trong các mẫu bệnh phẩm theo thời gian

3.10 Kết quả xét nghiệm của bộ kít so với xét nghiệm VDK của Đài loan

3.12 Kết quả xét nghiệm của bộ kít so với xét nghiệm VDK của Đài loan

3.13 Kết quả xét nghiệm của bộ kít và chỉ định sử dụng HTKNR 84 3.14 Kết quả xét nghiệm của bộ kít so với xét nghiệm ELISA 84

Biểu đồ Tên biểu đồ Trang

3.1 Biến động hiệu giá kháng thể đặc hiệu của các lô thỏ trong quá

3.7 Hoạt tính của các kháng thể với nọc rắn hổ mang Naja atra sau

3.8 Phổ hấp phụ của phức hợp kháng thể - hạt nano vàng 71 3.9 Thời gian nhập viện của nhóm BN nghiên cứu sau khi bị rắn cắn 80 3.10 Phân bố bệnh nhân được lựa chọn lấy mẫu theo chẩn đoán 78 3.11 Nồng độ nọc rắn trong huyết thanh của bệnh nhân lúc nhập viện 79

Sơ đồ Tên Sơ đồ Trang

Hình Tên hình Trang

1.1 Số ca nhiễm độc nọc rắn mỗi năm theo khu vực 4

1.4 Biến chứng hoại tử tổ chức do rắn hổ mang Naja atra cắn và

1.8 Nguyên lý hoạt động theo cơ chế cạnh tranh 23 1.9 Sự khác nhau về màu sắc giữa các kích thước của hạt nano vàng 24 1.10 Mối liên quan giữa đặc tính màng mao dẫn và hiệu suất của que

2.1 Chế tạo kháng nguyên và gây miễn dịch trên thỏ và gà 38

2.3 Thử nghiệm lựa chọn cặp kháng thể bằng kỹ thuật ELISA 46 2.4 Thử nghiệm lựa chọn cặp kháng thể trực tiếp trên que thử 48 2.5 Thiết kế xét nghiệm nhanh theo nguyên lý sắc ký miễn dịch 50

3.1 Kết quả điện di nọc rắn hổ mang Naja atra 58 3.2 Các kháng thể sau quá trình tách chiết và tinh sạch 63

3.4 Kiểm tra phản ứng đặc hiệu của các kháng thể bằng kỹ thuật

3.5 Kết quả lựa chọn cặp kháng thể bằng phương pháp nhúng trực

3.7 Kết quả tối ưu pH dung dịch hạt nano vàng 70 3.8 Hoạt tính kháng thể sau khi cộng hợp hạt nano vàng bằng kỹ

3.9 Khả năng thấm màng cộng hợp trước và sau khi xử lý 72

ĐẶT VẤN ĐỀ

Rắn độc cắn là một cấp cứu ngộ độc thường gặp Theo các chuyên gia ước tính, ở nước ta hàng năm có khoảng 30000 trường hợp bị rắn cắn [71] Thủ phạm gây ra các vết cắn có độc chủ yếu thuộc hai họ rắn hổ và rắn lục [12], [13] Theo số liệu thống kê của Trung tâm chống độc Bệnh viện Bạch mai năm 2015, số bệnh nhân nhập viện do bị rắn hổ cắn chiếm 7,12% tổng số trường hợp ngộ độc nói chung, trong đó có 29% được chẩn đoán xác định do rắn hổ mang cắn [3]

Một trong những loài rắn hổ mang thường gặp và hay gây ra tai nạn rắn

cắn ở Miền bắc là rắn hổ mang Naja atra, hay còn được gọi là rắn hổ mang bành Tai nạn do rắn hổ mang Naja atra cắn có thể dẫn tới nhiễm độc nọc rắn,

nếu không được điều trị kịp thời có thể dẫn đến tử vong hoặc để lại di chứng nặng nề, ảnh hưởng lớn đến chất lượng cuộc sống của nạn nhân sau khi sống sót [4] Theo Tổ chức Y tế Thế giới, thuốc điều trị hiệu quả nhất cho bệnh nhân bị nhiễm độc nọc rắn là Huyết thanh kháng nọc rắn, chế tạo từ huyết thanh động vật được gây miễn dịch [124] Thế nhưng, điều kiện tiên quyết cho sử dụng Huyết thanh kháng nọc rắn là phải xác định loài rắn độc đã gây

ra tai nạn rắn cắn Tuy nhiên cho đến nay, ở nước ta việc chẩn đoán loài rắn độc đã gây ra tai nạn rắn cắn để lựa chọn Huyết thanh kháng nọc rắn chủ yếu dựa vào kinh nghiệm lâm sàng, do đó thường bị hạn chế và chỉ được thực hiện ở các bệnh viện tuyến cuối nơi có các chuyên gia nhiều kinh nghiệm Hơn thế nữa, ngay cả tại các bệnh viện tuyến cuối, việc xác định loài rắn và lựa chọn Huyết thanh kháng nọc rắn thường cũng chỉ thực hiện được khi các biểu hiện lâm sàng đã rõ, điều này dẫn đến sử dụng Huyết thanh kháng nọc rắn muộn, chủ yếu để cứu tính mạng nạn nhân chứ chưa hạn chế được những

di chứng tổn thương do nọc độc gây ra Chính vì vậy, việc xác định chính xác nọc độc của của loài rắn gây tai nạn trong cơ thể nạn nhân rắn cắn có ý nghĩa thực tiễn rất quan trọng, vừa giúp sơ cấp cứu đúng cách vừa định hướng lựa

chọn đúng loại Huyết thanh kháng nọc rắn để sử dụng, đem lại hiệu quả điều trị cao và an toàn hơn cho nạn nhân

Do thành phần chính của nọc rắn độc đa phần là các độc tố có bản chất

là protein [1], [2], [14], [16] Trong đó đa số đều có tính kháng nguyên cao [42], [49] Nên các xét nghiệm phát hiện nọc rắn độc thường dùng là xét nghiệm miễn dịch dựa vào tương tác đặc hiệu giữa kháng nguyên nọc rắn với các kháng thể đặc hiệu có trong thành phần của bộ xét nghiệm Ở Việt nam,

Hà Thị Hải và cộng sự đã nghiên cứu thành công bộ xét nghiệm ELISA định

lượng nọc rắn hổ mang Naja atra [7] Tuy nhiên, ở khía cạnh giúp phát hiện

nhanh nọc rắn bộ xét nghiệm khó có thể được coi như một xét nghiệm cấp cứu do có thời gian tiến hành tương đối dài Bên cạnh kỹ thuật ELISA đã được nhiều tác giả trong nước và trên thế giới lựa chọn để phát triển các xét nghiệm phát hiện nọc rắn [5], [29], [107] Xét nghiệm dựa trên nguyên lý sắc

ký miễn dịch là kỹ thuật có nhiều ưu điểm như có độ nhạy cao trong khi thời gian tiến hành nhanh, kỹ thuật này cũng dễ triển khai và có thể sử dụng trên thực địa [123] Ở Đài loan, Hung D.Z và cộng sự cũng đã áp dụng nguyên lý này để phát triển bộ xét nghiệm nhanh phát hiện nọc rắn hổ mang và đã có những thành công nhất định [59] Qua đó có thể thấy việc nghiên cứu chế tạo

bộ kít chẩn đoán nhanh rắn hổ mang Naja atra cắn với nguyên lý sắc ký miễn

dịch là thích hợp với điều kiện thực tế ở Việt nam, nơi mà tai nạn rắn độc cắn thường xuyên xảy ra ở các khu vực nông thôn và miền núi, những nơi xa các trung tâm y tế

Từ những cơ sở lý luận và thực tiễn trên, chúng tôi tiến hành đề tài

“Nghiên cứu chế tạo bộ kít phát hiện nhanh nọc rắn hổ mang Naja atra

bằng kỹ thuật sắc ký miễn dịch” nhằm hai mục tiêu:

1 Chế tạo bộ kít phát hiện nhanh nọc rắn hổ mang Naja atra theo

nguyên lý sắc ký miễn dịch

2 Đánh giá khả năng phát hiện nọc rắn Naja atra của bộ xét nghiệm

trên thực nghiệm và lâm sàng

CHƯƠNG 1

TỔNG QUAN

1.1 Tai nạn rắn cắn và chẩn đoán rắn độc cắn ở Việt nam

1.1.1 Tai nạn rắn cắn ở Việt nam

Nước ta nằm trong vùng nhiệt đới với địa hình và khí hậu khác nhau giữa các miền Bắc, Trung, Nam Từ đặc điểm tự nhiên đó đã tạo nên sự đa dạng sinh học ở nước ta, trong đó có rắn độc Theo các tác giả Trần Kiên và Nguyễn Quốc Thắng, Việt Nam có hơn một trăm loài rắn, trong đó có hàng chục loài rắn độc phân bố cả trên cạn và dưới nước [11]

Theo cách phân loại của Tổ chức Y tế thế giới (WHO) [124] và dựa trên các nghiên cứu đáng tin cậy trong nước có thể phân loại rắn độc ở nước

ta thành 2 nhóm [6], [10], [12], [13], [17]:

- Nhóm 1: bao gồm các loài rắn có độc tính cao, thường gặp hoặc phân

bố rộng rãi và gây nên tỷ lệ bị nhiễm độc, tử vong và tàn phế cao Thuộc

nhóm này có rắn hổ mang ở miền Bắc (Naja atra) và miền Nam (Naja

kaouthia), rắn cạp nia ở miền Bắc (Bungarus multicinctus) và miền Nam

(Bungarus candidus), rắn chàm quạp (Calloselasma rhodostoma, ở miền Nam), rắn lục tre (Cryptelytrops alborabris) trên cả nước và rắn lục mũi hếch (Deinagkistrodon acutus)

- Nhóm 2: bao gồm các loài rắn có độc tính cao và có thể gây tỷ lệ ngộ độc, tử vong và tàn phế nhưng:

▪ Thiếu các số liệu lâm sàng hoặc dịch tễ và/hoặc

▪ Ít cắn người hơn (do chu kỳ hoạt động, hành vi, nơi cư trú mà rắn ưa thích hoặc chỉ ở các vùng ít dân cư Thuộc nhóm này có rắn cạp nia đầu

đỏ (ở Đồng Nai, Bungarus flaviceps), Cryptelytrops macrops, rắn hổ mèo (Naja siamensis, miền Nam), rắn khô mộc (Protobothrops

mucrosquamatus, miền Bắc), rắn hổ chúa (Ophiophagus hanah, cả

nước), rắn lục xanh (Viridovipera stejnegeri, miền Bắc và Trung) và rắn cạp nong (Bungarus fasciatus)

Cho đến nay, chưa có số liệu nào thống kê chính xác nào về số ca nhiễm độc và tử vong do rắn cắn Mặc dù vây, bằng nhiều cách tiếp cận khác nhau, các chuyên gia ước tính mỗi năm nước ta có đến 30.000 trường hợp bị

rắn cắn, thủ phạm chủ yếu do hai họ rắn hổ (Elapidae) và họ rắn lục (Viperidae) gây ra [12], [13], [17], [71]

Hình 1.1 Số ca nhiễm độc nọc rắn mỗi năm theo khu vực

*Nguồn: theo Kasturiratne A và cộng sự (2008) [71]

Tại Trung tâm chống độc Bệnh viện Bạch mai, năm 2015, chỉ tính số trường hợp bị rắn hổ cắn đã là 216 trường hợp (chiếm 7,12% so với tổng số

bệnh nhân ngộ độc nói chung) [3] Số liệu trên đây chỉ là “phần nổi của tảng

băng” vì rất nhiều trường hợp tử vong không được thống kê Một nguyên

nhân quan trọng là phần lớn người bị rắn cắn thường lựa chọn điều trị theo

phương pháp cổ truyền, nên có thể tử vong tại nhà mà không đưa đến bệnh viện

1.1.2 Chẩn đoán rắn độc cắn ở Việt Nam

Cho đến nay, ở nước ta việc chẩn đoán loài rắn độc đã gây ra tai nạn rắn cắn để lựa chọn Huyết thanh kháng nọc rắn (HTKNR) chủ yếu dựa vào kinh nghiệm lâm sàng và nhận biết loài rắn [4], [13] Chẩn đoán lâm sàng thường dựa vào:

• Mô tả của bệnh nhân hoặc người đi cùng về tình huống bị cắn và đặc điểm con rắn gây tai nạn do họ nhìn thấy hoặc bắt được mang theo đến

bệnh viện;

• Dấu vết móc độc để lại tại vết thương rắn cắn;

• Biểu hiện nhiễm độc tại chỗ quanh vết cắn như chảy máu, đau buốt,

lại ở định hướng chẩn đoán họ rắn cắn (ví dụ “rắn lục cắn”, “rắn hổ cắn”), hoặc tiến bộ thêm một bước nữa là chẩn đoán giống rắn độc cắn (ví dụ “rắn

hổ mang cắn”, “rắn cạp nong, cạp nia cắn”) [3], [13] Việc chẩn đoán vẫn chưa thể tiến tới mức độ xác định cụ thể loài rắn độc cắn (ví dụ “rắn hổ mang

Naja atra cắn”, “rắn cạp nia Candidus multicinstus cắn” ), ngoại trừ những

trường hợp bắt được rắn gây tai nạn mang đến Một trong những nhược điểm khác nữa là phải dựa trên các biểu hiện và mức độ nhiễm độc của bệnh nhân, những biểu hiện này chỉ có khi nọc rắn đã gây hại cho cơ thể bệnh nhân một cách rõ ràng, tức là ở giai đoạn muộn của bệnh Trong nhiều trường hợp, các bác sỹ phải mất cả quá trình theo dõi diễn biến các biểu hiện nhiễm độc để đưa ra kết luận cuối cùng về loài rắn độc cắn Khi đã hội đủ các triệu chứng lâm sàng, xét nghiệm cần thiết thì đồng nghĩa với việc nọc rắn đã gây tổn thương tối đa cho cơ thể Song song với quá trình theo dõi đó, các bác sỹ còn phải áp dụng tất cả các biện pháp có thể (thậm chí điều trị thử bằng HTKNR đặc hiệu) Ngoài ra, việc chẩn đoán loài rắn độc gây tai nạn cũng có thể dựa

vào phân bố địa lý của các loài rắn (ví dụ chủng rắn hổ mang Naja atra thường gặp và gây nhiễm độc nhiều nhất ở miền Bắc, chủng Naja kaouthia

thường gặp ở miền Nam) [4], [13] Nhưng do sự phát triển của các hoạt động mua bán rắn giữa các vùng miền dẫn tới thay đổi về phân bố rắn độc và các bệnh nhân bị rắn cắn Thay đổi này là một khó khăn với việc chẩn đoán loài rắn cắn dựa trên các biểu hiện nhiễm độc

1.2 Rắn hổ mang Naja atra

1.2.1 Đặc điểm sinh học và nọc độc

Rắn hổ mang Naja atra hay còn gọi là Taiwan cobra, Chinese cobra, là loài thuộc họ Elapidae [4], [13], [65], [116]

Hình 1.2 Rắn hổ mang Naja atra

*Nguồn: theo Breuer H và cộng sự (2009) [28]

Rắn hổ mang N.atra được mô tả lần đầu tiên bởi một bác sỹ, nhà động

vật học người Đan mạch là Theodore Edward Cantor vào năm 1842 [105]

Rắn hổ mang N.atra trưởng thành có kích thước hơn 1m Lưng rắn thường

màu đen hoặc xám, vẩy ở lưng mịn và bóng Rắn có thân hình hơi dẹt, đuôi ngắn Đầu hình tam giác, không có vảy má và có khả năng bạnh cổ khi bị kích thích Khi bạnh cổ sẽ xuất hiện một vòng cung gọi là mắt kính và vệt giống gọng kính ở hai bên màu vàng hoặc trắng (hình 1.2) Giống các loài rắn hổ khác, răng nanh của rắn là vĩnh viễn và có tuyến nọc ở bên trong, vị trí của răng nanh ở phía trước hàm trên Rắn có khả năng phun nọc độc, đây là một trong những đặc điểm độc đáo của loài rắn hổ [11], [69]

Môi trường sống của rắn hổ mang N.atra thường là rừng, cánh đồng,

thậm chí cả khu vực đông dân cư Rắn thường ẩn dưới lá cây, gậy, đá Rắn hoạt động săn mồi cả ngày và đêm, đặc biệt vào thời điểm từ tháng 3 đến tháng 10 [11], [13]

Nọc của rắn có độc tính cao, thành phần chính là các neurotoxin gây độc thần kinh, cardiotoxin, haematoxin và Phospholipase A2… [1], [2], [16], [117] Cardiotoxin (I, II, III và IV) chiếm đến 54% trọng lượng khô của nọc (Wang JD, 1981) [117] Giá trị LD50 trên chuột 0,62 mg/kg khi tiêm dưới da [78]

Rắn hổ mang N.atra được tìm thấy ở miền đông nam Trung Quốc (bao

gồm các tỉnh Tứ Xuyên, Phúc Kiến, Quảng Đông, Quảng Tây, Quý Châu, Hồ Nam, Hồ Bắc, Chiết Giang và đảo Hải Nam), Hồng Kông, Bắc Lào, Bắc Việt Nam và Đài Loan (hình 1.4) [65], [116]

Hình 1.3 Phân bố của rắn hổ mang Naja atra

*Nguồn: theo Ji X và cộng sự (2014) [65]

Hoàng Ngọc Anh và cộng sự (2006), nghiên cứu tách các độc tố thần

kinh từ nọc rắn hổ mang N.atra (trại rắn Vĩnh Sơn, Vĩnh Tường) thấy trọng

lượng phân tử của các độc tố này không giống với các độc tố của nọc rắn hổ mang Đài Loan Khi khảo sát các chất có hoạt tính sinh học có trong nọc rắn

hổ mang, tác giả đưa ra một số kết luận: hàm lượng các neurotoxin có trong nọc phụ thuộc vào thời gian hoạt động sinh lý của rắn, cao nhất trong thời gian rắn ngủ đông Kết quả điện di những phân đoạn có hoạt tính độc cho

thấy các protein và enzym có trong thành phần nọc rắn hổ mang N.atra có

trọng lượng phân tử lần lượt là 6, 25, 35, 45, 66 và lớn hơn 116 kDa [2]

Nọc độc của rắn hổ mang có chứa nhiều các peptid chịu nhiệt tốt Mặc

dù độc tính bị mất đi ở nhiệt độ 60°C trong 100 phút nhưng hoạt tính sinh học của một số hoạt chất vẫn còn ngay cả khi được làm nóng trong thời gian 300 phút Ngoài ra, trong thử nghiệm formalin ở chuột, nọc độc sau khi được làm nóng ở 60°C trong 300 phút cho hiệu quả giảm đau tốt hơn so với lidocain [27]

1.2.2 Tai nạn do rắn hổ mang Naja atra cắn

1.2.2.1 Dịch tễ

Tai nạn do rắn hổ mang N.atra cắn thường gặp ở các khu vực nông

nghiệp ở các nước Châu Á, các tai nạn thường xảy ra vào mùa hè hoặc đầu

thu Tại Đài loan, rắn hổ mang N.atra là một trong 6 loài có ý nghĩa dịch tễ

quan trọng [69] Trong nghiên cứu của Wang JD và cộng sự (2009), trong thời gian từ năm 1994 đến năm 2007, có đến 38% số trẻ em bị rắn độc cắn

được xác định là do rắn hổ mang N.atra [117] Ở Việt nam, trong nghiên cứu

của Nguyễn Kim Sơn (2008), có đến 163/384 bệnh nhân bị rắn hổ mang cắn

nhập viện được xác định là do rắn hổ mang N.atra (chiếm 42%) [13] Tai nạn

do rắn hổ mang N.atra cắn theo các tác giả thường xảy ra vào mùa hè cho đến

mùa thu [60], [122]

1.2.2.2 Biểu hiện lâm sàng

Khi bị rắn hổ mang cắn ngoài dấu vết của răng độc, đau đớn thường xảy ra trong vòng 10 phút tại vị trí vết cắn Các triệu chứng đau, đỏ da, sưng

nề, chảy máu thậm chí có bọng nước dần nặng lên Các vết thương tổ chức tại chỗ tương đối rõ ràng, nguyên nhân chính là do tác dụng của cardiotoxin và phospholipase A2 Hình ảnh mô bệnh học nghiên cứu trên vết cắn của N.atra

trên cơ thể người cho thấy trung tâm hoại tử của lớp biểu bì với cục máu đông với lắng đọng fibrin ở lớp bề mặt và mạch máu lớp sâu ở trung bì Sự phá hủy

tổ chức lan rộng của nọc rắn hổ mang được cho là kết quả của tác động gây độc tế bào với thiếu máu thứ phát của các mạch máu trung bì và hậu quả của nhiễm khuẩn [97], [122] Theo Nguyễn Kim Sơn, dấu hiệu phù nề + hoại tử sớm gặp ở 100% trường hợp [13] Do vị trí cắn thường là các chi, hoại tử lan rộng dẫn đến làm tăng gánh nặng cho những bệnh nhân còn sống sót (hình 1.4)

Hình 1.4 Biến chứng hoại tử tổ chức do rắn hổ mang Naja atra cắn và hình

ảnh mẫu vật do bệnh nhân đem đến

(A1-A3: hoại tử tổ chức lan rộng khắp mu bàn chân trái sau khi bị rắn hổ mang cắn gần mắt cá chân trái, A4: sau ghép da B1-B2: da hoại tử lan rộng sau khi bị rắn cắn ở ngón chân thứ 5, B3-B4: mở ổ hoại tử ghép da C1-C2: mẫu vật chết)

*Nguồn: theo Wong O.F và cộng sự (2010) [122]

Hội chứng nhiễm độc thần kinh do tác dụng của các độc tố thần kinh có trong nọc rắn hổ mang gây liệt các dây thần kinh sọ não, liệt cơ hô hấp cũng như liệt mềm ngoại vi Độc tố thần kinh tác động lên tất cả hệ thống cơ vân trong đó có cơ hô hấp gây suy hô hấp ở mức độ khác nhau, nặng có thể gây ngừng thở dẫn đến tử vong nếu không điều trị kịp thời Kèm theo dấu hiệu liệt các cơ ở mặt và các cơ vận động bởi các dây thần kinh sọ não, bệnh nhân không nói được, khó nuốt và khó khạc đờm, sụp mí mắt, trùng cơ mắt Có

biểu hiện tinh thần từ lơ mơ đến hôn mê do hậu quả của thiếu oxy [13], [122]

Triệu chứng về tim mạch cũng có thể gặp do hoạt tính của các cardiotoxin gây ra các rối loạn chức năng nút xoang, block nhánh… Ngoài ra còn do tác động gián tiếp của phospholipase A2 làm cho cơ tim mất khả năng đáp ứng mọi kích thích do làm tăng thời gian khử cực và gây co cơ kéo dài Tuy nhiên, sự xuất hiện của các triệu chứng tim mạch này cũng phụ thuộc nhiều vào bệnh tim mạch kèm theo [13], [122]

Ngoài các triệu chứng trên, nọc độc khi tiếp xúc với mắt có thể gây kích thích mạnh kết mạc và giác mạc [46], nếu không được điều trị ngay có thể dẫn đến loét giác mạc và mù vĩnh viễn [69]

Chưa có trường hợp nào được ghi nhận có triệu chứng rối loạn đông

máu do ảnh hưởng trực tiếp của nọc rắn hổ mang N.atra, đa số những biểu

hiện rối loạn đông máu là tổn thương thứ phát do nhiễm khuẩn vết thương [122]

1.2.2.3 Chẩn đoán và điều trị

Cũng tương tự như chẩn đoán các loài rắn độc khác, chẩn đoán rắn hổ

mang N.atra cắn chủ yếu dựa vào kinh nghiệm lâm sàng thông qua việc thăm

khám tỉ mỉ các dấu hiệu tại chỗ và dấu hiệu toàn thân [4], [13] Ngoại trừ các trường hợp bắt được rắn mang đến, đa số các chẩn đoán chỉ dừng lại ở chẩn đoán họ hoặc giống rắn hổ mang chứ chưa chẩn đoán chính xác loài rắn gây

tai nạn là do N.atra [3]

Hà Thị Hải và cộng sự (2015), đã phát triển thành công bộ kít ELISA

định lượng nọc rắn hổ mang N.atra Bộ kít có thể giúp định lượng nọc rắn hổ mang N.atra trong máu của nạn nhân với ngưỡng phát hiện là 0,1 ng/ml Tuy

nhiên, do thời gian tiến hành tương đối dài nên mục tiêu hướng tới của xét nghiệm là định lượng chứ không phải định tính [7]

Về điều trị, khi bị rắn hổ mang N.atra cắn bệnh nhân cần được sơ cứu

thích hợp, vận chuyển nhanh chóng và an toàn tới các cơ sở y tế có khả năng cấp cứu hồi sức hoặc có HTKNR Các biện pháp sơ cứu như: băng ép, bất động, hô hấp nhân tạo… được đánh giá là rất quan trọng do đa phần các trường hợp bị rắn cắn ở những khu vực cách xa trung tâm y tế Các biện pháp điều trị không đặc hiệu khác bao gồm: các biện pháp cấp cứu, hồi sức, điều trị triệu chứng, điều trị hỗ trợ bệnh nhân cũng đóng vai trò rất quan trọng Các biện pháp này thường áp dụng khi không có HTKNR hoặc kết hợp với dùng

HTKNR Hiện nay, ở Việt nam vẫn chưa có HTKNR đặc hiệu để điều trị cho

bệnh nhân bị rắn hổ mang N.atra cắn Tại Trung tâm chống độc Bệnh viện Bạch mai, các trường hợp bị rắn hổ mang N.atra cắn do chưa có HTKNR đặc

hiệu nên được chỉ định dùng HTKNR hổ đất Thực tế lâm sàng cho thấy, sử dụng HTKNR hổ đất trên những bệnh nhân này cũng có những kết quả khả quan nhất định [13]

Việc sử dụng HTKNR đặc hiệu cần phải được tiến hành càng sớm càng tốt mới có tác dụng ngăn ngừa các hoại tử do các tổn thương hoại tử có thể xuất hiện sớm từ 4 – 6 giờ sau khi bị rắn hổ mang cắn [60] Theo Wong O.F (2010) HTKNR cần được sử dụng sớm trong vòng 12 giờ, liều HTKNR dao động từ 1 đến 21 lọ (mỗi lọ chứa 1000 IU), liều khuyến cáo đối với nạn nhân

bị rắn hổ mang N.atra cắn là 2000 IU Sau 24 giờ, HTKNR hầu như không

còn tác dụng ngăn ngừa hoại tử [122]

1.3 Một số kỹ thuật miễn dịch phát hiện nọc rắn và kháng thể kháng nọc rắn

Nọc rắn độc có hoạt tính sinh học cao nên trước đây người ta đã sử dụng các thử nghiệm sinh học dựa trên các hoạt tính sinh học của nọc độc như tan huyết hoặc nhiễm độc thần kinh để phát hiện nọc rắn Tuy nhiên kỹ thuật này có nhược điểm là giá thành đắt, đòi hỏi phải có động vật thí nghiệm, mất nhiều thời gian và không có tính đặc hiệu - do nhiều loại nọc độc có thể có cùng hoạt tính như nhau [95], [106]

Do thành phần chính của nọc rắn độc đa phần là các độc tố có bản chất

là protein [1], [2], [14], [16] Trong đó đa số đều có tính kháng nguyên cao [42], [49] nên các xét nghiệm phát hiện nọc rắn độc thường dùng là xét nghiệm miễn dịch dựa vào tính đặc hiệu của phản ứng kết hợp Kháng nguyên

- Kháng thể [95] Dưới đây là một số kỹ thuật miễn dịch đã và đang được ứng dụng phát hiện nọc rắn trong mẫu bệnh phẩm của nạn nhân bị rắn độc cắn

1.3.1 Điện di miễn dịch

Kỹ thuật này sử dụng gel điện di agar để phân tách các phân tử Kháng nguyên (KN) hoặc Kháng thể (KT), sau khi các phân tử KN hoặc KT chạy qua vạch KT hoặc KN có trong bản gel, những KN hoặc KT đặc hiệu sẽ bị bắt giữ bởi KT hoặc KN tương ứng và được nhận biết thông qua một vạch ở vị trí

có phức hợp KN – KT Đây là kỹ thuật nhằm tìm ra KN đặc hiệu trong hỗn hợp protein dựa vào điện di KT đặc hiệu đã biết hoặc tìm ra phân tử KT đặc hiệu trong huyết thanh dựa vào điện di KN đặc hiệu sẵn có [82], [90], [114]

Năm 1974, Greenwood và cộng sự đã sử dụng thành công kỹ thuật này

phát hiện nọc độc của 4 loài rắn phổ biến ở Nigeria là B.arietans, C

maculatus, E carinatus (E ocellatus) và N nigricollis trong các mẫu bệnh

phẩm là dịch vết cắn, huyết thanh và nước tiểu của 101 bệnh nhân rắn cắn Trong số 44 mẫu cho kết quả dương tính bằng kỹ thuật khuyếch tán miễn dịch thì có đến 40 mẫu cũng cho kết quả tương tự khi sử dụng kỹ thuật điện di miễn dịch Kỹ thuật này có ưu điểm là nhanh hơn so với khuyếch tán miễn dịch, chỉ mất khoảng 30 phút cho việc xác định nọc độc ở những nạn nhân bị

rắn N nigricollis cắn Tuy nhiên, nhược điểm của kỹ thuật này là độ nhạy

thấp do đòi hỏi nồng độ KN cao nên cũng ít được sử dụng [95], [114]

1.3.2 Ngưng kết hồng cầu

KT kháng nọc độc được gắn lên bề mặt hồng cầu cừu Khi có mặt của nọc độc, các phân tử nọc độc (hay KN nọc độc) sẽ đóng vai trò là cầu nối gắn các tế bào hồng cầu phủ KT vào với nhau tạo ra hình ảnh ngưng kết hồng cầu

có thể quan sát thấy bằng mắt Năm 1993, Kittigul và Ratanabanagkoon sử

dụng kỹ thuật ngưng kết hồng cầu thụ động đảo ngược để phân biệt 6 loài rắn phổ biến ở Thái Lan Độ nhạy của xét nghiệm phát hiện nọc rắn này dao động trong khoảng từ 2 – 635 ng/ml và tổng thời gian yêu cầu xét nghiệm từ 60 –

120 phút [75] Tuy nhiên, kỹ thuật này chỉ nhận được sự chú ý nhất định trong

những trường hợp nhiễm độc nọc rắn Ưu điểm của kỹ thuật này là nhanh, đơn giản, rẻ tiền, thích hợp với các cơ sở y tế địa phương ở các nước đang phát triển Nhược điểm lớn nhất của kỹ thuật này là tính bất ổn định của tế bào hồng cầu cừu, làm cho xét nghiệm không thể bảo quản được lâu và đôi

khi cho kết quả không đồng nhất nên hiện nay cũng ít được sử dụng [63]

1.3.3 Ngưng kết miễn dịch

Để khắc phục tính bất ổn định của tế bào hồng cầu, người ta đã dùng những hạt nhựa latex để thay thế cho hồng cầu cừu Kỹ thuật dùng các hạt latex này được gọi là kỹ thuật ngưng kết, kỹ thuật này lần đầu tiên được Singer và Plotz phát triển vào năm 1956 [100] Chinonavanig và cộng sự (1991) đã phát triển và sử dụng kỹ thuật này để phát hiện nọc độc của 6 loại

rắn thường gặp ở Thái Lan là N kaouthia, B fasciatus, O hannah, D

russelli, C rhodostoma và T albolabris Độ nhạy của kỹ thuật này có thể đạt

được từ 0,16-1,2 mg/ml nọc thô pha loãng trong nước muối có chứa đệm

glycine Các hạt latex được gắn với các phân tử KT có thể bảo quản ở nhiệt

độ 4°C hơn một năm Nếu bảo quản dưới dạng đông khô thì ngay cả khi để ở nhiệt độ phòng cũng có thời gian ổn định dài hơn [34] Năm 1997, Amuy và cộng sự đã cải tiến và áp dụng kỹ thuật ngưng kết latex thụ động đảo ngược (RPLA) bằng cách gắn các hạt latex với KT được tinh chế bằng sắc ký ái lực

để phát hiện nọc rắn Micrurus nigrocinctus trong các dịch sinh học với độ

nhạy là 0,3 µg/ml [21] Khow và cộng sự (1999), cũng đã phát triển kỹ thuật

RPLA để phát hiện nọc rắn Naja kouthia, kỹ thuật đạt độ nhạy từ 25-50 ng/ml

[73], tốt hơn nhiều lần kỹ thuật do Chinonavanig tiến hành năm 1991 Tuy nhiên, kỹ thuật ngưng kết miễn dịch nhận được không nhiều sự chú ý và ít được lựa chọn trong chẩn đoán nhiễm độc nọc rắn do độ nhạy thấp và kỹ thuật gắn kháng thể vào các hạt latex rất phức tạp [95]

miễn dịch phóng xạ kiểu cạnh tranh (competitive radioimmunoassay) hoặc kỹ

thuật miễn dịch phóng xạ kiểu sandwich (sandwich radioimmunoassay) Kỹ

thuật miễn dịch phóng xạ (RIA) phát hiện nọc rắn được phát triển tại Úc trong những năm đầu thập niên 1970 Ban đầu kỹ thuật này được sử dụng để phát

hiện và định lượng nọc độc của rắn N scutatus và rắn P textilis trên lâm sàng

và thực nghiệm Trên động vật thí nghiệm, kỹ thuật này có khả năng phát hiện

15 ng/ml nọc N scutatus trong thời gian 10 phút sau khi tiêm dưới da với liều

gây chết (Coulter và cộng sự, năm 1974) [38] Kỹ thuật này sau đó được cải thiện và đạt độ nhạy là 0,4 ng/ml, được sử dụng nhiều trong những trường hợp nghi ngờ rắn cắn nhưng chủ yếu vẫn là trong điều tra pháp y [102], [103]

Kỹ thuật RIA cũng được xây dựng để phát hiện nọc rắn Russell (Daboia

russelli) trong các mẫu bệnh phẩm của nạn nhân bị rắn cắn (Pukrittayakamee

và cộng sự, 1987) với độ nhạy là 4 ng/ml trong nước tiểu và 5µg/ml trong

huyết thanh [88]

Kỹ thuật RIA có ưu điểm là đáng tin cậy và có độ nhậy cao Tuy nhiên, nhược điểm của kỹ thuật này là quá phức tạp, chi phí cao, thời gian bảo quản ngắn do các đồng vị phóng xạ bị phân rã và tiềm ẩn các mối nguy hiểm liên quan đến xử lý, bảo quản chất đồng vị phóng xạ nên không phù hợp cho việc

sử dụng trên thực địa [102], [103]

1.3.5 Miễn dịch huỳnh quang

Kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang được sử dụng từ năm1944 Những người đầu tiên thực hiện kỹ thuật này là Coons, Creech và Jones [37] Kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang bao gồm: Miễn dịch huỳnh quang trực tiếp và miễn dịch huỳnh quang gián tiếp Kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang phát hiện nọc rắn được Tiru-Chelvam sử dụng vào năm 1972 có độ nhạy cao, cho phép quan sát bằng mắt vùng có nọc độc [108] Tuy vậy, hạn chế của kỹ thuật này

là khá đắt tiền, đòi hỏi trang thiết bị hiện đại và chỉ tiến hành được trên động vật do phải đưa được thuốc nhuộm vào trong cơ thể và không có tác dụng trên

mô chết Gần đây Gao và cộng sự (2008) phát triển xét nghiệm miễn dịch huỳnh quang dựa trên thử nghiệm huỳnh quang với các vi hạt nhựa và KT

huỳnh quang cho phép phát hiện nọc độc in vitro [48]

1.3.6 Miễn dịch quang

Kỹ thuật miễn dịch quang (optical immunoassay – OIA) là kỹ thuật dựa

trên sự thay đổi của ánh sáng phản chiếu khi xuất hiện phản ứng KN-KT trên

bề mặt của một vật liệu mỏng không cho ánh sáng từ nguồn sáng truyền qua

(optical layer) và có thể quan sát được sự thay đổi đó bằng mắt thường [83]

Lê Văn Đông và cộng sự (2004) đã sử dụng kỹ thuật miễn dịch quang

để phát hiện nọc rắn Vật liệu được sử dụng là một chíp silicon có bề mặt phản quang (silicon - optical layer) và các KT đặc hiệu nọc rắn được gắn trên

bề mặt lớp silicon phản quang, KT phát hiện gắn Biotin và sử dụng cơ chất TMB Phương pháp này đã phát hiện được nọc rắn độc của 4 loại rắn là rắn lục xanh, rắn chàm quạp, rắn hổ chúa và rắn hổ đất trong các mẫu máu, huyết tương, nước tiểu, dịch vết cắn và dịch nốt phỏng Phương pháp này có thể phát hiện nọc rắn độc ở nồng độ 0,4 ng/ml; trong khi ELISA là 0,8 ng/ml [43]

Tuy nhiên, nhược điểm của phương pháp OIA là giá thành xét nghiệm đắt, đòi hỏi phải có trang thiết bị hiện đại do đó khó áp dụng triển khai trên thực địa, nhất là trong điều kiện các nước đang phát triển như Việt Nam

1.3.7 Miễn dịch gắn enzym

Kỹ thuật miễn dịch phóng xạ như chúng ta đã biết có ưu điểm là độ nhạy cao, đáng tin cậy nhưng các chất phóng xạ lại tiềm ẩn mối nguy hiểm vì vậy người ta nghĩ đến một phương pháp mới trong đó tín hiệu được nhận biết không phải nhờ phóng xạ Khi đó người ta đã biết rằng một số loại enzyme

như các peroxidase phản ứng với một số cơ chất nhất định làm thay đổi màu

sắc dung dịch Màu sinh ra từ các phản ứng này có thể được sử dụng làm tín

hiệu nhận biết (tín hiệu chỉ thị) Tuy nhiên, để tín hiệu này được sử dụng như

chất phóng xạ trong kỹ thuật miễn dịch phóng xạ, sự có mặt của tín hiệu màu phải đồng nghĩa với sự có mặt của KT hay KN Chính vì vậy, giải pháp được đưa ra là enzyme sẽ được gắn với KN hay KT Kỹ thuật gắn kết enzyme với

KN hay KT được phát triển bởi Avrameas [25] Tiếp sau đó, vào năm 1966, Wide và Porath phát triển phương pháp gắn KN và KT trên bề mặt rắn nhờ đó

mà KN hay KT không được gắn kết sẽ dễ dàng được rửa trôi [121] Perlmann

và Engvall (Thụy Điển) cùng với nhóm Schuurs và Weemen (Hà Lan) công

bố phương pháp được đặt tên ELISA (EIA) dựa trên tất cả những bước phát triển nói trên [44], [110] Phương pháp chính thức ra đời vào năm 1971 Phương pháp này mang lại lợi thế đáng kể, bao gồm cả việc thay thế các đồng

vị phóng xạ bằng các enzyme, thời gian phản ứng nhanh hơn, đặc hiệu cao, và còn thời gian sử dụng lâu hơn so với RIA

Theakston và cộng sự (1977) là những người đầu tiên sử dụng ELISA

để phát hiện nọc rắn và KT chống nọc rắn trên động vật và các mẫu bệnh phẩm của người [107] Khi đó phương pháp ELISA được thực hiện trên những phiến nhựa loại nhỏ hoặc trên những giếng của một phiến nhựa lớn Các bệnh phẩm là máu, huyết thanh, nước tiểu, dịch vết thương hoặc những tổ

chức có chứa nọc độc Chúng được ủ ở nhiệt độ 37°C khi lên màu được đo bằng máy phân tích quang phổ Cường độ màu phụ thuộc vào sự có mặt của

KT hay nồng độ nọc độc trong mẫu thí nghiệm Thử nghiệm này có thể phát hiện được từ 1 đến 5 ng/ml nọc độc [87] Từ đó ELISA ngày càng được cải tiến để ứng dụng trong việc phát hiện nọc độc trên khắp thế giới ELISA được xem là công cụ hữu ích để nghiên cứu động học sự phân bố của nọc rắn trong máu, mức độ nhiễm độc và liệu pháp huyết thanh kháng nọc độc Ở Việt Nam, Đỗ Khắc Đại và cộng sự (2013) đã nghiên cứu chế tạo bộ xét nghiệm ELISA phát hiện và phân biệt nọc của một số loài rắn độc thường gặp ở Việt Nam, ngưỡng phát hiện của xét nghiệm là 0,4 – 3,2 ng/ml [5] Mặc dù có rất nhiều ưu điểm nhưng phương pháp ELISA vẫn tồn tại một nhược điểm đó là thời gian tiến hành tương đối lâu, tối thiểu từ 1 đến 2 giờ

1.3.8 Kít phát hiện nhanh

Năm 1991, bộ xét nghiệm miễn dịch enzym trong ống mao quản được

phát triển ở Astralia, bộ kít được chứng minh là hữu ích trong chăm sóc nạn nhân bị rắn cắn [102] Tuy nhiên, bộ xét nghiệm này lại không phù hợp cho việc phát hiện nọc rắn độc ở các khu vực khác trên thế giới vì có sự khác nhau

về phân bố các loại rắn giữa các khu vực

Năm 2010, Hung D.Z và cộng sự đã lần đầu tiên phát triển thành công

bộ kít dạng que thử dựa trên nguyên lý sắc ký miễn dịch giúp chẩn đoán nhanh rắn hổ mang cắn ở Đài Loan, bộ kít sử dụng hai loại KT kháng nọc rắn

từ thỏ và vịt Ngưỡng phát hiện của bộ kít là 5 ng/ml và có thể đánh giá kết quả trong thời gian 20 phút So với kỹ thuật ELISA, bộ kít có độ nhạy là 88,9% và độ đặc hiệu là 100% [59] Có thể nói, phương pháp sắc ký miễn dịch đã mở ra một hướng nghiên cứu mới trong phát triển các bộ kít chẩn đoán nhanh nọc rắn độc

1.4 Kỹ thuật sắc ký miễn dịch

1.4.1 Lịch sử hình thành và phát triển

Sự phát triển của các kít chẩn đoán nhanh dựa trên nguyên lý sắc ký

miễn dịch (Immunochromatographic assay), hay còn được gọi là xét nghiệm sắc ký miễn dịch (Lateral flow immunoassay: LFIA), đó là kết quả của một

loạt các nghiên cứu từ những năm 1950 Cơ sở của kỹ thuật sắc ký miễn dịch được bắt nguồn từ kỹ thuật ngưng kết hạt latex được Plotz và Singer phát triển vào năm 1956 [100] Cũng trong thời gian này, kỹ thuật miễn dịch trên các vi phiến hay đĩa cũng được nghiên cứu phát triển, đầu tiên là kỹ thuật miễn dịch phóng xạ được phát minh bởi Yalow và Berson vào những năm

1960 [125] Tiếp theo đó là kỹ thuật miễn dịch gắn enzym vào những năm của thập niên 60, với nhiều lợi thế bằng việc thay các đồng vị phóng xạ bằng các enzym, có tính đặc hiệu cao và thời gian phản ứng nhanh hơn Những ứng dụng quan trọng thúc đẩy sự phát triển liên quan đến pha rắn, đặc biệt là phương pháp thử thai được thực hiện bởi Vaitukaitis và cộng sự (1972), một kết quả của những cải tiến trong công nghệ KT và sự hiểu biết về sinh học Tuy nhiên, để phát triển một cách đầy đủ các nền tảng cho kỹ thuật sắc ký miễn dịch cần có sự phát triển của một loạt các công nghệ khác liên quan đến hóa chất, thiết bị… Các nguyên lý của kỹ thuật sắc ký miễn dịch tiếp tục được nghiên cứu và khẳng định vào những năm 1980 và những năm cuối của thập

kỷ đó với việc các công ty như Becton Dickinson, Unilever và Carter Wallace nộp một số lượng lớn các bằng sáng chế về công nghệ này Kể từ đó đến nay

đã có ít nhất 500 bằng sáng chế đã được nộp vào các thời điểm khác nhau về các khía cạnh của công nghệ sắc ký miễn dịch [123]

Hình 1.5 Hệ thống sản xuất que thử điển hình

*Nguồn: theo Market F.C (2013) [80]

Trong 20 năm gần đây, với việc sử dụng các thế hệ KT, đặc biệt là ứng dụng công nghệ KT đơn dòng (monoclonal antibody) và cải tiến nguyên liệu thành phần trong đó có việc sử dụng hạt nano kim loại thay thế các hạt latex

làm thành phần cộng hợp (ví dụ: hạt vàng-Au), sử dụng màng mao dẫn đảm

bảo quá trình mao dẫn, cũng như kỹ thuật gia công gần như tự động hóa hoàn toàn, ICA được phát triển để xây dựng bộ sinh phẩm chẩn đoán ứng dụng rộng rãi trong rất nhiều lĩnh vực: chẩn đoán lâm sàng, phát hiện các mầm bệnh [18], [55], [77], phát hiện độc tố [50], độc chất, hóa chất tồn dư trong đất và nước, thực phẩm… thậm chí cả những vấn đề hình sự [30], [33], [47], [57], [72]

1.4.2 Nguyên lý hoạt động

1.4.2.1 Cấu tạo

Cấu tạo của bộ kít phát hiện nhanh với các thành phần: que thử + cassette bằng nhựa Cassette bằng nhựa được cấu tạo với 3 cửa sổ: cửa sổ tra mẫu, cửa sổ kiểm tra kết quả vạch phát hiện và vạch chứng

Hình 1.6 Cấu tạo bộ kít phát hiện nhanh

*Nguồn: theo Millipore Corporation (2002) [84]

1.4.2.2 Nguyên lý hoạt động

- Cơ chế sandwich: sử dụng KT đặc hiệu để gắn cộng hợp với một chất đánh dấu (thông thường là hạt nano vàng) Nếu trong mẫu thử có sự xuất hiện của KN cần phát hiện, KT gắn cộng hợp sẽ gắn với KN tạo thành phức hợp

KN – KT, phức hợp này sau đó chuyển dịch trên màng bởi tác dụng mao dẫn,

để rồi được tóm bắt bằng một KT đặc hiệu khác đã bố trí sẵn tại vạch phát hiện Sự xuất hiện của vạch phát hiện đồng nghĩa với phản ứng dương tính Cũng có thể sử dụng KN gắn cộng hợp để phát hiện KT với cơ chế như trên

Hình 1.7 Nguyên lý hoạt động theo cơ chế sandwich

*Nguồn: theo Wong R.C và cộng sự (2009) [123]

- Cơ chế cạnh tranh: sử dụng KN có bản chất giống với KN cần phát hiện để gắn cộng hợp với một chất đánh dấu (thông thường là hạt nano vàng) Cộng hợp này chuyển dịch trên màng bởi tác dụng mao dẫn, để rồi được tóm bắt bằng KT đặc hiệu đã bố trí sẵn tại vạch phát hiện Sự xuất hiện của vạch phát hiện đồng nghĩa với phản ứng âm tính Nếu trong mẫu thử có sự xuất hiện của KN cần phát hiện Các KN này sẽ ngay lập tức cạnh tranh vị trí gắn với các KN được gắn cộng hợp dẫn đến vạch phát hiện không xuất hiện đồng nghĩa với phản ứng dương tính Dựa trên cơ chế này, ta có thể sử dụng KT để gắn cộng hợp với chất đánh dấu để phát hiện KN

Hình 1.8 Nguyên lý hoạt động theo cơ chế cạnh tranh

*Nguồn: theo Wong R.C và cộng sự (2009) [123]

1.4.3 Chế tạo và tối ưu que thử

- Thiết kế định dạng que thử: phụ thuộc vào mục đích phát hiện kháng nguyên hay kháng thể, nguyên vật liệu sẵn có và chất lượng của các nguyên vật liệu đó Que thử có thể theo định dạng theo cơ chế sandwich hoặc cạnh tranh [92], [123], thông thường để phát hiện kháng nguyên cơ chế sandwich được nhiều tác giả lựa chọn [18], [55], [59], [77], [104] Các kháng thể sử dụng là các kháng thể kháng lại các epitop khác nhau hoặc từ các loài khác nhau

- Lựa chọn vật liệu:

+ Chỉ thị màu (nhãn): có nhiều loại hạt nano như hạt nano vàng, nano bạc, hạt từ, latex, phân tử huỳnh quang, enzym… được sử dụng để làm chỉ thị

màu trong nguyên lý sắc ký miễn dịch [19], [36], [70], [85], [113] Trong số

đó hạt nano vàng là thông dụng nhất do chúng có ái lực cao với các protein và phân tử sinh học lại có thể dễ dàng chức năng hóa bề mặt và kích thước có thể điều chỉnh bằng cách sử dụng các chất hóa học phù hợp Trường hợp cần định lượng các chất trong mẫu phân tích thì các phân tử huỳnh quang lại được sử dụng rộng rãi [113], [123]

Hình 1.9 Sự khác nhau về màu sắc giữa các kích thước của hạt nano vàng

*Nguồn: theo Nobbmann U (2013)[86]

Về màu sắc của các hạt sử dụng cho các xét nghiệm dạng sắc ký theo Bangs Laboratories, Inc Màu tối ưu phụ thuộc vào bản chất của mẫu cần phân tích Với mẫu là máu toàn phần thì các hạt có màu đen hoặc xanh đậm được ưu tiên, các hạt màu đỏ hoặc xanh nước biển lại phù hợp với các mẫu là huyết thanh, nước tiểu thì có nhiều sự lựa chọn hơn bao gồm xanh, đỏ hoặc đen Trong khi đó nước bọt và dịch tủy sống lại phù hợp với các hạt có màu tối [29] Về kích thước, có nhiều kích thước hạt nano vàng được các nhà nghiên cứu lựa chọn [15], [18], [59], [72], [79], thường dao động từ 10 – 60

nm Các kích thước này thường cho màu sắc rõ khi quan sát bằng mắt thường, cũng không quá lớn nên phù hợp khi sử dụng cho các xét nghiệm miễn dịch dòng chảy

+ Màng: lựa chọn màng membrane (có thể gọi là “màng mao dẫn”) và các loại màng khác (màng cộng hợp, màng hút mẫu ) Các thông số lựa chọn