Trình bày công nghệ sản xuất sinh khối tuyến trùng cơ chế tác động của chế phẩm tuyến trùng trừ sâu

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC VĂN HIẾN BÀI TẬP LỚN CUỐI KÌ HỌC PHẦN CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT THUỐC BVTV SINH HỌC GVHD ThS Huỳnh Đặng Hà Uyên Sinh viên thực hiện Nguyễn Trần Phú MSSV 201A220001 Tp Hồ[.]

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC VĂN HIẾN

-BÀI TẬP LỚN CUỐI KÌ HỌC PHẦN : CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT THUỐC BVTV SINH HỌC

GVHD: ThS Huỳnh Đặng Hà Uyên Sinh viên thực hiện: Nguyễn Trần Phú MSSV: 201A220001

Tp Hồ Chí Minh,ngày 23 tháng 3 năm 2023

Nhận xét và đánh giá của giảng viên

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮTVKCS: Vi khuẩn cộng sinh

IJs: Infective juveniles - ấu trùng xâm nhiễm

BSL: Galleria Mellonella – bướm sáp lớn

VKCS: Vi khuẩn cộng sinh

1. Trình bày công nghệ sản xuất sinh khối tuyến trùng Cơ chế tác động của chế phẩm tuyến trùng trừ sâu (Câu 6)

Trả lời:

Tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng (Entomopathogenic nematodes, viết tắt EPN) đãđược nhiều nước trên thế giới nghiên cứu và phát triển công nghệ để sản xuất chế phẩmsinh học phòng trừ sâu hại cây trồng Tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng EPN thuộc

hai giống Steinernema và Heterohabtidis chúng cộng sinh với vi khuẩn Xenorhadus: Ở

heterorhabtidis chúng cộng sinh với Potorhabdus và chuyên ký sinh côn trùng hại sống

trong đất, hoặc những côn trùng phải qua một phần vòng đời hay một vùng sinh thái trênđất

Hiện nay trên thế giới đã phát triển 2 hệ thống công nghệ nhân nuôi sản

xuất tuyến trùng là nhân nuôi in vivo và nhân nuôi in vitro hai công nghệ này

khác nhau chủ yếu bởi nguồn vật liệu nhân nuôi: vật liệu tự nhiên và vất liệunhân tạo

Sản xuất chế phẩm sinh học EPN dù theo công nghệ in vivo và in vitro cũng bao gồm

5 công đoạn chủ yếu như sau:

- Sản xuất vật liệu ban đầu là nguồn IJS

- Gây nhiễm trùng nhân nuôi

- Nhân ủ để tuyến trùng sinh sôi phát triển

- Thu hoạch tuyến trùng

- xử lý làm sạch tuyến trùng

Ngoài ra tuỳ mục đích kinh doanh sử dụng hay cần bảo quản vận chuyển đi xa mà có thể có 2 công đoạn sau:

- Phối chế tuyến trùng

- Đóng gói bảo quản tuyến trùng

*Công nghệ nhân nuôi in vivo

Công nghệ nhân nuôi in vivo khá đơn giản , không cần đầu tư lớn, vì vậy có áp dụng quy

mô hộ gia đình, các trang trại hoặc các đơn vị sản xuất nhỏ Tuy nhiên công nghệ này cónhược điểm là năng suất thấp, chất lượng không ổn định và đặc biệt là tôn nhiều công laođộng nên giá thành cao

Bước 1: Xâm nhiễm tuyến trùng vào ấu trùng BSL

Tuyến trùng xâm nhiễm IJs thường được bảo quản lạnh từ 12 – 14OC trước khi xâmnhiễm nên để IJs ấm dần lên đến nhiệt độ phòng (20-24OC) kiểm tra tuyến trùng dướikình hiển vi soi nổi Tuyến trùng còn sống tốt sẽ chuyển động Lấy 1ml tuyến trùng vàpha trong một lượng nước xác định sao cho có nồng độ tuyến trùng đạt 200 IJS/ml Đếm

số lượng IJs bằng hợp đếm dưới kính hiển vi soi nổi để biết chính xác mật độ IJs và trên

cơ sở đó điều chỉnh nồng độ tuyến trùng đạt 200 IJS/ml bằng thêm hay bớt một lượngnước hợp lý để đạt được nồng độ trên

Khi có được nồng độ mong muốn thì hút từng ml dung dịch chứa tuyến trùng và cho vàotrên giấy lọc Mỗi hộp cho vào 10 ấu trùng BSL đã qua xử lý nhiệt để không tạo kén.Như vậy nồng độ gây nhiễm là khoảng 200 IJs/BSL Nếu nồng độ gây nhiễm cao thì thìnồng độ tuyến trùng sinh ra sẽ ít do bị cạnh tranh và bị ô nhiễm bởi vi khuẩn bên ngoài.đậy nắp hộp chứa tuyến trùng và vi khuẩn bên ngoài Dán nhãn và để trong túi nilon Đặttrong tối ở nhiệt độ phòng Sau khi gây nhiễm hầu hết BSL đều chết, cẩn thận chuyểnBSL đã chết vào white trap (white 1927)

Thông thường BSL bị nhiễm EPN và chết sẽ không có mùi thúi và có màu sắc khá đặc

trưng BSL bị nhiễm Steinerma sẽ có màu hơi vàng nâu và mềm khi gấp bằng kẹp còn BSL bị nhiễm Herterohabditis sẽ có màu đỏ gạch và cứng hơn môt chút Những con BSL

bị chết do nhiễm nặng hay chết bởi các nguyên nhân khác thường màu hơi đen và có mùithối Tốt nhất là không thu tuyến trùng từ những con này vì số lượng ít và chúng có thểgây ô nhiễm nặng cho cả đợt

Bước 2: Thu hoạch tuyến trùng IJs

Làm bẫy nước (white trap) theo white (1927): Đặt giấy lọc whatman N01- 90mm trênmặt lõm của đĩa đồng hồ trong đĩa petri thuỷ tinh lớn Đặt vào nồi hấp 20 phút ở 121 OC.Cho vào đĩa petri khoảng 70ml nước cất hoặc cho thêm formalin để tạo thành dung dịch0.1% formalin Chú ý: không được để nước nhỏ vào mặt lõm của đĩa đồng hồ Đặt giấylọc lên trên đĩa đồng hồ và gập mép giấp ngược về phía đáy đĩa, sao cho khi đặt vào đĩapetri chứa nước, mép giấy tiếp xúc với bề mặt nước Mỗi đĩa như vậy khoảng 20-30 BSLsát nhau trên giấy lọc ở sát mép đĩa đồng hồ

Ấu trùng BSL

Thông thường sau khi nhiễm từ 10-12 ngày, IJs sẽ bắt đầu phát tán ra khỏi BSL và khichuyển vào nước trong đĩa petri Còn xác BSL còn lại trên đĩa đồng hồ khi tuyến trùngxuất hiện trong đĩa petri nên tiến hành thu chúng hàng ngày tới khi số lượng giảm (3-4ngày) Để thu hoạch, nhấc đĩa có chứa BSL ra, rót nước chứa IJs vào cốc (rữa đĩa petri đểthu huyết trùng) thêm 70ml nước cất hoặc 0.1% formalin và thay đĩa đồng hồ

Với hầu hết tuyến trừng EPN thì ấu trùng thoát ra khỏi vật chủ BSL cũng là IJs thuần

chủng, nhưng với S.glaseri, khi ấu trùng mới thoát ra từ xác chết của côn trùng thì chúng

chỉ là dạng ấu trùng tiền xâm nhiềm và nếu tuyến trùng này di chuyển ngay vào môitrường lỏng chúng sẽ không phát triển hoàn toàn thành dạng IJs được Để cho chúngthành IJs cần thay đĩa đồng hồ và giấy lọc bằng đĩa petri được chuẩn bị đặc biệt Đĩa petrinày chứa lớp mỏng khoảng 2mm plaster, để lớp plaster này khô và làm ẩm không nên ướtsũng Kiểm tra mức độ ẩm trước khi thu hoạch cộng thêm vài giọt nước nếu thầy cầnthiết Vật chủ đã nhiễm được đặt trên giấy plaster ẩm này, sao đó di chuyển trong hai đến

ba ngày vào môi trường nước hoặc 0.1% formalin trong đĩa petri thuỷ tinh lớn hơn.Chúng có thể thu bằng cách thông thường

Bước 3: Chuẩn bị cho bảo quản

Kiểm tra IJs còn hoạt động, mô vật chủ hoặc tuyến trùng không phải IJs phải được loại

bỏ nếu có vấn đề phát sinh hoặc số lớn tuyến trùng không hoạt động cần được xem xét

xử lý hoặc loại bỏ, trong khi tiến hành rửa cuối cùng Tách IJs ra khỏi xác chết vật chủ,môi trường nhân nuôi hoặc tạp chất khác bằng cách cho IJs di chuyển qua rây lọc có kíchthước lỗ thích hợp (60 - 60µm) để giữ lại mô vật chủ và tuyến trùng ở các giai đoạnkhông lây nhiễm Các giai đoạn không xâm nhiễm có thể bị giết khi rửa tuyến trùng bằngdung dịch Hyamine 0.4% trong 15 phút Nếu muốn tất cả các giai đoạn không xâm nhiễm

của hai giai đoạn Steinerma và Herterohabditis đều có thể bị chết ở nhiệt độ phòng trong

một vài ngày Để rửa tuyến trùng, cho chúng vào một cái cốc, để tuyến trùng lắng đọng,gạn phần nước phía trên và cho phần nước sạch vào cho đến khi dung dịch sạch từ 2-4lần Nếu dung dịch bị ô nhiễm nặng chúng có thể rửa một lần bằng dung dịch formalin

Có thể ly tâm ở tốc độ 300 vòng /phút trong 1 phút có thể đẩy nhanh quá trình này Trongthời gian ngắn tuyến trùng có thể được cất giữ qua đêm trong tủ lạnh nhưng nên rửa ítnhất 1 lần trước khi cho vào tủ lạnh Cuối cùng chuyển tuyến trùng cho vào lọ bảo quản

* Công nghệ nhân nuôi in vitro

Phân lập và nuôi sơ cấp.

- Chuyển 10 ấu trùng vào các ẩm 10% vào một đĩa petri cho nhiễm vào khoảng 100 IJstrên mỗi BSL Không nên cho quá nhiều nước đề tránh BSL bị ngập nước mà chết trướckhi nhiễm tuyến trùng

- Sau 24-48 giờ khi ấu trùng BSL Chết chúng sẽ được chuyển vào một cốc thuỷ tinh và rửa bằng cồn trong vòng 5-10 phút

- Mổ xác chết bằng một kéo hoặc bằng kim nhọn sắc đã được khử trùng và lấy một giọt huyết tương lên NBTA sử dụng que cấy platin dạng vòng

Chú ý: khi tác mỗ và lấy mẫu huyết tương và không làm vỡ ruột ấu trùng BSL để tránh nhiễm bẩn

- Ủ đĩa môi trường nhân nuôi ở 25OC trong buồn tối

- Chọn lấy một khuẩn lạc đơn sơ cấp và nhiễm trở lại vào môi trường NBTA agar.

- Nếu đĩa nhân nuôi chất lượng và không bị nhiễm bẩn (có thể phân loại bằng nhân nuôi thứ cấp này), có thể nhân nuôi bằng cách nhân nuôi tiếp theo

- Sau khi san dịch vào các ống túyp, chuyển chúng sang bảo quản ở -80OC

Luu ý: các ống túyp cần được ghi nhãn tên chủng, ngày chuẩn bị mẩu Để chắc chắn cầnthêm mô tả ngắn nguồn giống nhân nuôi trong hồ sơ đông lạnh -80OC, nghĩa là số thứ tựcủa khay và hộp chứa mẩu, số chủng nuôi, đặc tính của chủng ( sơ cấp, thứ cấp)…

Bước 2: Chuẩn bị môi trường nhân nuôi tổ hợp tuyến

trùng Chuẩn bị môi trường chicken offal

Các nội quan như tim gan , ruột,… của gia cầm và gia súc đều có thể sử dụng được trong môi trường nhân nuôi EPN

a Loại bỏ túi mật ( các muối mật có hại cho sự phát triển của tuyến trùng) Không

được làm vỡ túi mật khi lấy nó ra

b Cho vật liệu lòng vào nối áp suất để hấp ở 121 độ C trong 20-25 phút

c Xay nghiến cho nhuyễn vật liệu, trước xay nên dùng kéo cắt ruột thành các đoạn ngắn khoảng 15cm

d Bảo quản lạnh nếu chưa trộn môi trường ngay Tốt nhất là trộn xong sau đó nếu

mới bảo quản để giữ an toàn cho không gian trong tủ bảo quản

e Trộn trong nước và mỡ bò theo các tỷ lệ sau:

Môi trường nhân nuôi các loài Steinernema : 8 Dung dịch offal + 2 phần nước (không mỡ

bò)

Môi trường nhân nuôi các loài Heterorhabditis : 7 Dung dịch offal + 2 phần nước +

1 phần mỡ bò

Bước 3: Chuẩn bị dụng cụ nhân nuôi

Tiến hành cắt xốp thành những miếng nhỏ (kích thước 1cm) sau đó trộn với môi trườngchicken offal đã chuẩn bị sẵn với tỷ lệ môi trường/xốp (tính theo trọng lượng) là 1.25/1.Mỗi bình tam giác cho một lượng 250-300ml (khoảng 100g) môi trường đã trộn với xốp.Lau sạch miệng bình và bịt kín bằng nút bông bọc vải thưa và hấp ở 121 độ C trong 20phút Bình nhân nuôi được làm lạnh một thời gian trước khi sử dụng Trường hợp môitrường có mùi hôi thối do nguyên liệu đã để lâu trước khi chế biến thì có thể sử dụng chấtkhử mùi

Chú ý: Trong suốt quá trình thao tác cần mang găng tay cao su Đây là một yêu cầu quantrọng để tránh nhiễm trùng cho môi trường nhân nuôi

Dùng túi nilon chịu nhiệt thay cho bình tam giác và hộp nhựa để nhân nuôi EPN có thểtiết kiệm chi phí nhân nuôi Ngoài ra, có thể chuyển trực tiếp các túi nhân nuôi ra đồngruộng để phun rải mà không cần qua khâu tách lọc vừa mất nhiều thời gian vừa bị haohụt

Bước 4: Gây nhiễm vi khuẩn

Dịch nhân nuôi vi khuẩn sơ cấp nên được ủ trước một ngày trước khi bình nuôi đượcchuẩn bị Vi khuẩn được cấy chuyền vào các ống nghiệm (tốt nhất nhân nuôi vi khuẩntrong 1 ống tuýp cho một bình nhân nuôi) có chứa 5ml nutrient broth Tốt nhất để các ốngtuýp qua đêm trên máy lắc hoặc ít nhất xoáy nước trong ống trước khi ủ

Khi nhiễm rót một ống dịch vi khuẩn vào mỗi bình nhân nuôi Lắc đều để trộn lẫn dịch vikhuẩn với môi trường trong chất xốp nền Ủ 2-3 ngày ở 25OC để vi khuẩn phát triểnnhanh

Bước 5: Gây nhiễm tuyến trùng và nhân giống tổ hợp (monoxenic)

Sau khi nhân nuôi vi khuẩn xong tiến hành nhiễm tuyến trùng vào các bình đã chuẩn bịsẵn vi khuẩn Một bình tam giác ban đầu có thể chia thành 7 bình mới Dùng pipet hút 1lượng nước chứa tuyến trùng khoảng 3-4ml và phun vào từng bình tại 3- 5 điểm Sau khinhiễm tuyến trùng, tốt nhất là tránh rung lắc mạnh bình đang nhân nuôi tuyến trùng ðểcác bình nhân ủ trong phòng tối ở nhiệt độ 25 - 28OC, ẩm độ 75-80% trong thời gian 10-

14 ngày cho đến khi thấy tuyến trùng sinh sôi và bám đầy trên thành bình có thể thuhoạch

Khi bình nhân nuôi có dấu hiệu không tốt hoặc bị nghi ngờ, IJs đã vô trùng bề mặt cóthể phục vụ như chất gây nhiễm ban đầu Khi chủng IJs không nên cho quá nhiều nướccùng với tuyến trùng (tốt nhất là < 5ml).

Sau 2-3 ngày kiểm tra xem các bình nhân nuôi có thành công không bằng cách lấy mẫu

từ bình nuôi cấy trên MacConkey Agar hoặc NBTA (Nutri agar, bromthymol blue vàtetrazolium choloride) và sau đó kiểm tra màu sắc vi khuẩn phù hợp và hình thái để biết

độ thuần khiết

Bước 6: Thu hoạch IJs

Để tách lọc lấy IJs từ bọt xốp cho xốp vào một ray lọc kích thước lỗ 1-2mm Đặt rây vào

1 chậu và cho nước vừa ngập xốp, để yên tĩnh trong thời gian 2-6 giờ hoặc nếu cần có thể

để lâu đến 12 giờ, nhưng không nên để lâu quá 24 giờ vì thời gian lâu quá sẽ không có lợicho tuyến trùng Không được rót nước lên trên xốp vì sẽ rửa mất một phần chất dinhdưỡng (để nuôi tuyến trùng) Thông thường trong vòng 2 giờ đầu sẽ có khoảng 95% IJs

di chuyền qua đáy rây lọc xuống chậu nước

Làm lắng tuyến trùng và rửa tuyến trùng để loại bỏ các phần khác và IJs không hoạtđộng Có thể dùng rây lọc kích thước lỗ nhỏ 0,5mm để lọc và loại bỏ các phần không cần

thiết Đối với các chủng Steinernema có thể sử dụng dung dịch Hyamine để giết các dạng

không phải IJs trước khi lọc qua rây Cần phải rửa tuyến trùng nhiều lần tới khi nướcsạch Trong trường hợp cần thiết có thể dùng sục khí để phá vỡ những thành phần nhỏcủa dung dịch sau khi rửa IJs

Bước 7: Xử lý sự cố

Để tránh ô nhiễm các bình hoặc hộp nhân nuôi cần hết sức chú ý bất kỳ thao tác nàotrong quá trình thao tác Chỉ cần 1 giọt nước nhỏ trong khi sản xuất cũng có thể gây ônhiễm, hoặc một sự thay đổi đột ngột cũng có thể tạo ra pha thứ cấp của VKCS Thậmchí khi nhiệt độ nhân ủ không thích hợp, ẩm độ không phù hợp vì nhiều nguyên nhân hayyếu tố khác Sự ô nhiễm có thể được nhận biết dễ dàng khi xuất hiện các màu sắc hoặcmùi hôi không bình thường hoặc chất rò rỉ khác lạ từ sinh khối do vi khuẩn và nấm gây

ra Trong bất kỳ trường hợp nào cũng nên được kiểm tra bằng cách gây nhiễm trênNBTA hoặc MacConkey agar Ở thời điểm trước 2 tuần, bình tam giác nuôi cấy chứa tỷ

lệ cao vi khuẩn thứ cấp là bình thường, tuy nhiên một điều rất quan trọng là các bình nàyphải được chủng vi khuẩn sơ cấp lúc ban đầu

Mặc dù nhiệt độ nhân nuôi tối ưu khác nhau ở các loài tuyến trùng, nhưng nhiệt độ 25-28OC

là tốt nhất cho việc sản xuất hầu hết các chủng tuyến trùng Độ ẩm có thể được điều

chỉnh bằng cách thêm vào hay bớt đi một lượng chất lỏng nhất định trong các bước khácnhau của quy trình sản xuất Nếu môi trường là quá lỏng hoặc quá nhiều chất lỏng chovào khi nhiễm, tuyến trùng sẽ bị giữ lại ở chỗ nhiễm và chết Nếu môi trường là quá khô,

sự nhân nuôi sẽ mất độ ẩm dần dần trước khi một số lớn tuyến trùng được sản xuất ra.Duy trì độ ẩm cao ở nơi đặt bình tam giác để nhân ủ là rất tốt

Việc sản suất và bảo quản IJs cần tính toán thời gian phù hợp để không làm giảm khảnăng xâm nhiễm của IJs Sản xuất in vitro chỉ nên được tiến hành 4-6 tháng trước khi sửdụng để tránh làm giảm độc tố và khả năng gây bệnh của tuyến trùng đối với vật chủ của

nó Mặt khác cũng cần quan tâm thích đáng để duy trì các điều kiện thích hợp cho sinhtrưởng, phát triển và bảo quản để làm giảm nguy cơ về vấn đề chất lượng tuyến trùng.Nhìn chung, người sản xuất tuyến trùng cần phải lường trước được các vấn đề có thể xảy

ra Để làm được như vậy người nhân nuôi cần được trang bị kiến thức về hệ thống nhânnuôi để chủ động theo dõi và phản ứng hợp lý đối với các thay đổi mang tính thủ tục.Cùng với một vài hiểu biết về sinh học tuyến trùng, các nguyên nhân và giải pháp khắcphục Thậm chí như vậy sản xuất in vitro cũng không phải là dễ dàng, vì vậy, các thửthách và sự cố sẽ rất cần thiết cho người tập sự để làm hoàn thiện hệ thống sản xuất

Bước 8: Bảo quản IJs

Sau khi thu hoạch và làm sạch, tuyến trùng có thể được chứa trong nước cất với 1 giọtTriton X-100 (Tác nhân làm ẩm và ngăn chặn tuyến trùng dính vào bên trong cốc) hoặc0.1% formalin (chỉ sử dụng khi sự ô nhiễm trở thành một vấn đề quan trọng) Nếu bảoquản trong điều kiện không sục khí thì nồng độ IJs không nên quá 10-20.000 IJs/ml và độsâu của nước nên duy trì ở mức 1cm hoặc ít hơn Các bình tam giác hoặc bình nuôi cấy tếbào là dụng cụ lí tưởng bảo quản tuyến trùng

Trong điều kiện được thông khí (dùng bơm sủi hoặc bất kỳ thiết bị cung cấp khí nào) có

thể bảo quản tuyến trùng ở nồng độ 100.000 IJs/ml Các chủng Steinernema có thể được

bảo quản tốt nhất ở nhiệt độ 4-10OC trong 6-12 tháng mà không mất hoạt tính Các chủng

Heterorhabditis thường không để lâu được như vậy, chỉ từ 2-4 tháng ở 4-10OC Nếu thấy

có hiện tượng tạo búi ở Heterorhabditis cần bổ sung với nồng độ 1gr/50ml nước (hoặc

nhiều hơn ) để làm tan các búi này mà không ảnh hưởng gì đến tuyến trùng

Nhìn chung, các chủng tuyến trùng của việt nam có khả năng bảo quản lâu và có thể bảoquản ở nhiệt độ cao hơn Kết quả thí nghiệm bảo quản IJs trong nước ở nhiệt độ 12OC với

mật độ 20.000 IJs/ml, thì 2 chủng S-TX1 và S-TX4 của loài Sterinerna sangi có thể giữ

được 6-12 tháng và động lực diệt sâu vẫn còn Trong khi đó, với điều kiện bảo quản

tương tự, 2 chủng H-MF11 và H-TN3 của loài Herterohabditis indica có thể sống và giữ

được động lực trong thời gian 4-8 tháng