Fish word Vi sinh vật môi trường

FISH đặc biệt phổ biến trong y học, ngoài mục đích xác định các mầm bệnh có nguồn gốc từ vi khuẩn các bệnh về đường hô hấp, tiêu hóa, các bệnhlây qua đường máu, ung thư… FISH còn được sử

A./ GIỚI THIỆU VỀ KĨ THUẬT FISH.

FISH là một kỹ thuật cho phép hiển thị, nhận dạng, liệt kê và định vị các tế bào vi khuẩn FISH không chỉ cho phép nhận ra các vi sinh vật quen thuộc, đã biết môi trường nuôi cấy đặc hiệu mà còn xác định được các vi sinh vật lạ, chưa biết rõ

về điều kiện và môi trường nuôi cấy, do đó FISH có thể giúp chúng ta biết rõ về hệthống phức tạp của các quần thể vi sinh vật FISH kết hợp sự chính xác của các kỹ thuật di truyền phân tử và sự quan sát trực quan từ kính hiển vi, cho phép hình dung và nhận biết các tế bào vi khuẩn trong môi trường tự nhiên hay trong các mô bệnh Độ nhạy và tốc độ thực hiện là những đặc điểm nổi bật đã giúp FISH trở thành công cụng hiến cứu hữu hiệu nhất

Trên thế giới, FISH được sử dụng trong việc mô tả quần thể vi sinh vật trong môitrường tự nhiên, nổi bật là hệ vi sinh vật ở trầm tích biển Wadden, tại vịnh hẹp ở Na-uy, sinh vật phù du ở sông hoặc biển, tuyết hồ trên núi cao, trong đất và trên bề mặt rễ thực vật FISH đặc biệt phổ biến trong y học, ngoài mục đích xác định các mầm bệnh có nguồn gốc từ vi khuẩn (các bệnh về đường hô hấp, tiêu hóa, các bệnhlây qua đường máu, ung thư…) FISH còn được sử dụng để chẩn đoán thường qui

sự bất thường về cấu trúc và số lượng nhiễm sắc thể (trước sinh và sau sinh) của thai nhi

Ở Việt Nam những nghiên cứu sử dụng FISH còn hạn chế, chủ yếu là ứng dụng trong chẩn đoán các bệnh về di truyền Do đó việc đẩy mạnh phát triển kỹ thuật này ở nước ta trong tương lai sẽ mở ra một bước tiến mới trong việc nghiên cứu và chẩn đoán vi sinh vật so với phương pháp nuôi cấy cổ điển

B PHƯƠNG PHÁP THỰC HIỆN FISH

I QUY TRÌNH THỰC HIỆN.

1.1 Tóm tắt qui trình thí nghiệm FISH

FISH dò tìm và phát hiện ra các trình tự acid nucleic của các loài vi sinh vật mong muốn bằng cách dùng đầu dò được đánh dấu huỳnh quang lai đặc hiệu với các trình tự đích đặc hiệu bổ sung với nó bên trong tế bào nguyên vẹn (không cần phá vỡ tế bào)

Quy trình thực hiện bao gồm các bước cơ bản sau:

- Chuẩn bị mẫu và đầu dò

- Cố định mẫu

- Lai giữa đầu dò và trình tự đích đặc hiệu nằm trong tế bào

- Rửa mẫu để loại bỏ các đầu dò không được lai

- Dò tìm mẫu (bước này có thể bỏ qua nếu sử dụng đầu dò phát huỳnh quangtrực tiếp)

- Quan sát, hiển thị và lưu trữ kết quả

Hình 1: Các bước chính của phương pháp FISH

1.2 Lựa chọn đầu dò đánh dấu huỳnh quang

Lựa chọn đầu dò: Như đã được đề cập từ trước, các trình tự đích được sử dụngphổ biến trong FISH là các rRNA 16S vì chúng ổn định về mặt di truyền, số lượngbản sao nhiều và cấu trúc được bán bảo tồn Các đầu dò oligonucleotide ứng vớimỗi cấp độ phân loại, giữa các loài vi khuẩn nhân thật hay khuẩn cổ, cho đến cácchi và loài cụ thể đều có thể thiết kế được dựa theo kích thước của rRNA đíchVới sự tăng lên nhanh chóng của các đoạn thông tin di truyền trong các cơ

sở dữ liệu chung và thương mại, đoạn gen rRNA 16S giúp cho việc nhận

biết và định danh các loài vi sinh vật trở nên dễ dàng và chính xác Điều này đặcbiệt có ý nghĩa khi tiến hành phân lập hỗn hợp vi khuẩn tạp hay các sinh vật chưatừng nuôi cấy đặc hiệu Số lượng lớn các bản sao rRNA 16S trong mỗi lần saochép và trong các quá trình hoạt động trao đổi chất của tế bào luôn cung cấp đủ sốlượng các trình tự đích để hiển thị được các dòng tế bào cụ thể, ngay cả các

oligonucleotide chỉ gắn một nhãn huỳnh quang trong thí nghiệm FISH Việc lựachọn vị trí trình tự đích và quá trình thiết kế đầu dò phải được tiến hành với sự thậntrọng cao nhất Gần đây, các trình tự đích khác như rRNA 23S, rRNA 18S mà gần đây là mRNA cũng đã được xác định thành công bởi thí nghiệm FISH

Việc lựa chọn đầu dò để sử dụng trong FISH phải xem xét đến tính đặc hiệu, độnhạy và khả năng xâm nhập vào tế bào Một đầu dò oligonucleotide điển hìnhthì có chiều dài khoảng 15 đến 30 bp, được tạo ra bằng một thiết bị tổng hợp tựđộng Các đầu dò ngắn thì dễ dàng tiếp cận được với trình tự đích, nhưng chúng lạimang được ít các trình tự đánh dấu Trong FISH, các trình tự đích thông dụng nhất

là rRNA 16S bởi vì chúng ổn định về mặt di truyền, cấu trúc được bán bảo tồn, và

số lượng các bản sao nhiều Do đó, các đầu dò được lựa chọn thường là các

oligonucleotide rRNA 16S để đảm bảo sự liên kết bổ sung đạt hiệu quả cao nhấttrong quá trình lai Các đầu dò oligonucleotide huỳnh quang ngày nay đã có một sốsản phẩm được thương mại hóa Chúng có thể lưu trữ được ở-20OC trong tối

khoảng vài tháng

Có nhiều cách để đánh dấu đầu dò, đánh dấu trực tiếp chất nhuộm huỳnh quanglên đầu dò là cách thông dụng nhất, nhanh nhất, rẻ nhất và dễ dàng thực hiện nhấtbởi vì chúng không đòi hỏi phải tiến hành các bước dò tìm sau quá trình lai Mộthoặc nhiều phân tử thuốc nhuộm huỳnh quang được liên kết trực tiếp với

oligonucleotide trong suốt quá trình tổng hợp thông qua liên kết amino ở đầu 5’của đầu dò, hoặc sử dụng enzyme Terminal transferase để gắn các

nucleotide có đánh dấu huỳnh quang vào đầu 3’ của đầu dò Ngoài ra, một số thuốc nhuộm như Flourescein-Isothiocyanate (FITC) nếu được gắn vào

oligonucleotide theo một dải đệm 18 carbon thì có thể làm tăng cường độ tín hiệu

so với các đầu dò được đánh dấu trực tiếp Sự tăng lên về tín hiệu huỳnh

quang cũng được biểu hiện trên những đầu dò được gắn nhãn chất huỳnh quangtrên cả hai đầu, một phân tử ở đầu 3’ và 4 phân tử ở đầu 5’ được sử dụng nhưnhững miếng đệm thích hợp để ngăn chặn sự che khuất lẫn nhau của các tín hiệuhuỳnh quang

Trong một số trường hợp, việc dò tìm theo cách gián tiếp thì có hiệu quả hơn Người ta thấy rằng, có thể tăng độ nhạy của thí nghiệm FISH lên bằng cách kết hợp các đầu dò với những chất chỉ thị như Digoxygenin (DIG), sau đó chúng sẽ được dò tìm thông qua một chất phản huỳnh quang Độ nhạy của FISH còn có thểđược tăng lên đáng kể khi sử dụng enzyme nhằm khuếch đại tín hiệu

Phương pháp này được phát triển bởi Kagiyama và cộng sự (1993) khi nghiên cứu

về di truyền học tế bào, sau đó được Yamaguchi và cộng sự thay đổi để áp dụngvào định danh vi khuẩn (1996) Ban đầu, mỗi oligonucleotide vẫn sẽ được đánhdấu bằng digoxygenin như trên, sau đó được dò tìm bằng một thể kháng

digoxygenin, kháng thể này tiếp tục được liên kết với enzyme phosphatase kiềm.Enzyme này chuyển hóa HNPP (2-hydroxy-3-naphtoic acid-2’-phenylanilide

phosphate) thành dạng Dephosphoryl, thểnày tạo ra màu huỳnh quang đỏ sáng khikết hợp với Fast Red TR Tín hiệu huỳnh quang thu được theo cách thực hiện này

có cường độ mạnh hơn 8 lần so với tín hiệu của các oligonucleotide chỉ gắn nhãnhuỳnh quang duy nhất Phương pháp khuếch đại tín hiệu bằng enzym ngày càngđược cải tiến tốt hơn nhờ vào một kỹ thuật được gọi là “hệ thống khuếch đại tínhiệu Tyramide” (TSA) Hệ thống TSA làm tăng cường độ tín hiệu lên

khoảng 10 – 20 lần Tuy nhiên, số lượng các tế bào được lai thành công đã giảm đimột cách rõ ràng so với việc sử dụng đầu dò thông thường được đánh dấu duy nhấtmột chất huỳnh quang Điều này xảy ra là do quá trình xâm nhập của các chất caophân tử bào trong tế bào vi khuẩn bị hạn chế hơn những chất nhuộm thông thường Mặc dù enzyme lysozyme đã giúp cải thiện tính thấm của các đầu dò vào trong tếbào, dẫn tới cường độ tín hiệu được nâng cao, nhưng phương pháp này dường nhưkhông áp dụng được với một số loài vi khuẩn Gram dương, do đó phương pháp này chủ yếu được dùng để phân tích các quần thể vi khuẩn tạp

Hình 2: Đánh dấu trực tiếp (a) và (b); đánh dấu gián tiếp sử dụng DIG (c), TSA (d) hay đầu dò polyribonucleotide (e)(Moter et al., 2000)

Có lẽ phương pháp hiệu quả nhất là kết hợp việc sử dụng các đầu dò

polyribonucleotide, được đánh dấu với digoxygenin, đồng thời sử dụng hệ thốngkhuyếch đại tín hiệu tyramide (TSA) Kỹ thuật này đã được ứng dụng thành côngkhi dò tìm và phát hiện trực quan các độc tố trong Listeria(Hình 2e)

Lựa chọn thuốc nhuộm huỳnh quang: Các loại thuốc nhuộm huỳnh quang

đều có các mức năng lượng kích thích và phát xạ tối đa khác nhau nên cho phépphát hiện đồng thời hai hoặc nhiều vi sinh vật khi chỉlai một lần duy nhất Cùngvới việc quan sát trực quan bằng kính hiển vi đa màu FISH, các bộ lọc màng nhiềudải cũng có thể được sử dụng Các chất huỳnh quang tổng hợp có những điểm phát

xạ sắc nét khác nhau nên sẽ loại bỏ được hiện tượng các phổ huỳnh quang chồnglên nhau giữa các đầu dò, đồng thời hạn chế các vấn đề về màu nền và sự dây,

nhem màu Chất màu huỳnh quang có màu sáng nhất và bền quang học nhất nên sửdụng để dò tìm các trình tự đích mà lượng mẫu rất ít

Bảng 1: Một số thuốc nhuộm được sử dụng để dò tìm vi sinh vật bằng phương pháp FISH

Bước sóng có thể thay đổi ít nhiều tùy thuộc vào nhà sản xuất Quang phổ phát

xạ có thể thay đổi trong các dung môi khác nhau hoặc đặc tính của mẫu

*FITC : Fluorescein–isothiocyanate

**FluoXE : 5-(-6-)carboxyfluorescein–N-hydroxysuccimideester

***TRITC : Tetramethyl–rhodamine–isothiocyanate

1.3 Chuẩn bị mẫu và xử lý sơ bộ

Trước khi tiến hành lai, mẫu chứa vi sinh vật và các đầu dò phải được ngâm

trong các hợp chất tạo tủa như ethanol hoặc methanol, hợp chất tạo được liên kết

ngang như aldehyde hoặc hỗn hợp các chất trên để các đầu dò huỳnh quang có thểthấm vào bên trong tế bào và bảo vệ các rRNA không bị biến tính bởi các RNAsenội bào Các điều kiện và phương pháp cố định mẫu có thể khác nhau tùy thuộcvào vi sinh vật đích và loại mẫu Quá trình cố định mẫu tối ưu sẽ đưa được sốlượng lớn các đầu dò thấm được vào tế bào, giữ lại tối đa số lượng các trình tự đíchRNA, đồng thời bảo quản toàn vẹn cấu trúc tế bào và hình thái của chúng Cố địnhđầu dò vào mẫu hiệu quả sẽ ảnh hưởng rất tích cực đến kết quả của FISH, nhưngviệc cố định rất khó để có thể tối ưu hóa Thông thường một lượng dung dịch

formaldehyde hoặc paraformaldehyde 3-4% (v/v) thì phù hợp cho hầu hết các loại

vi khuẩn Gram âm Đối với các vi khuẩn Gram dương, sử dụng ethanol (50%), hỗnhợp ethanol/formalin (tỉlệ9:1 v/v) hoặc xử lý nhiệt là những biện pháp thông dụngnhất; ngoài ra có thể bổ sung thêm bước xử lý sơ bộ để tăng tính thấm của đầu dò Khi áp dụng phương pháp FISH trên mẫu chứa nhiều đoạn mô khác nhau, cácquá trình tiền xử lý bắt buộc phải được áp dụng để tăng khả năng tiếp cận của cácđầu dò đối với các trình tự đích tương ứng, đồng thời hạn chế được các liên kếtkhông đặc hiệu Gần đây, FISH đã được áp dụng trên các mẫu mô tế bào đượcngâm trong dung dịch keo lạnh Trong các chất dẻo này, sự hiển thị của vi

khuẩn và sự bảo vệ cấu trúc của mô của các tế bào rất hoàn chỉnh mà không hề cóbất cứ quá trình tiền xử lý nào

1.4 Lai giữa đầu dò và trình tự đích đặc hiệu

Trước khi tiến hành lai, các tế bào sau giai đoạn xử lý kể trên được cố định vàomột mặt kính Để quá trình gắn mẫu vào mặt kính được tốt hơn, người ta khuyênnên xử lý bề mặt kính trước bằng cách phủ lên mặt kính một lớp chất tráng kính

ngoài Các hóa chất được sử dụng cho hiệu quả tốt là gelatin , poly-L-lysine hay các hợp chất tạo muối.

Quá trình lai phải được thực hiện trong những điều kiện hết sức nghiêm ngặtnhằm kết hợp chính xác các đầu dò đánh dấu huỳnh quang với trình tự đích bổsung với chúng Đối với thao tác quan trọng nhất trong thí nghiệm FISH, quá trìnhlàm nóng sơ bộ các phân tử lai phải được thực hiện để các đầu dò huỳnh quang kếthợp bổ sung với các trình tự RNA đích tương ứng Sự chính xác khi bắt cặp bổsung có thể được điều khiển bằng cách thay đổi nồng độ formamide hay nhiệt độcủa quá trình Formamide sẽ làm giảm nhiệt độ nóng chảy của phân tử bằng cáchlàm suy yếu liên kết hydro, từ đó cho phép tiến hành quá trình nhuộm ở nhiệt độthấp những vẫn đảm bảo độ chính xác cao

Quá trình lai xảy ra trong môi trường tối ẩm, nhiệt độ vào khoảng 37 đến 50oC.Thời gian lai có thể kéo dài từ 30 phút đến vài giờ Sau đó, rửa mẫu bằng nước cất

để loại bỏ các đầu dò không liên kết được với trình tự đích Cuối cùng, rửa lại vớinước một lần nữa, sấy và cố định các phân tử lai, có thể bổ sung thêm các chấtchống phai màu

1.5 Quan sát và xử lý tín hiệu

Để có thể quan sát được các tín hiệu huỳnh quang đa sắc trong thí nghiệm

FISH, kính hiển vi thông thường sẽ được trang bị thêm một bộ lọc dải hẹp nhiềutần Ngoài ra, để thu nhận và phân tích được các hình ảnh đó cần phải sử dụng mộtmáy ảnh CCD (charged coupled device) kết hợp với phần mềm phân tích xử lý ảnh

kỹ thuật số Đây là hệ thống cảm biến chính xác nhất hiện nay và nó rất hữu dụngkhi quan sát những mẫu vi sinh vật quan trọng, những nơi có cường độ tín hiệu

thấp Hệ thống này cũng đã được sử dụng để kiểm tra số lượng các tế bào vi sinhvật và xác định hoạt tính các dòng tế bào đơn trong màng sinh học thông quaviệc xác định hàm lượng rRNA Gần đây, phương pháp phân tích sự phân bốkhông gian của vi khuẩn đã được cải tiến hơn nữa khi sử dụng kính hiển vi quansát huỳnh quang dải rộng Một loại kính hiển vi khác được sử dụng cho thí

nghiệm FISH là kính hiển vi quét laze đồng tiêu (CLSM) Thông qua việc hạn chế

hệ thống tín hiệu trong những khoảng hẹp của đối tượng nghiên cứu, các tín hiệuhuỳnh quang bị lệch tiêu sẽ bị loại bỏ, tạo ra những hình ảnh rõ nét Điều này rấthữu dụng cho mẫu có độ phân bố dày đặc, như các lớp bùn, màng sinh học hayđoạn mô

Hình 4 Kính hiển vi quét laze đồng tiêu

II NHỮNG TRỞ NGẠI ĐỐI VỚI KỸ THUẬT FISH

2.1 Kết quả không chính xác

2.1.1 Các chất tự phát huỳnh quang

Khi gặp phải những chất có khả năng tự phát huỳnh quang, phương pháp FISH

sẽ có nhiều hạn chế Vấn đề khó khăn nhất chính là khả năng tự phát huỳnh quangcủa bản thân vi sinh vật Những trở ngại này đều đã được kiểm chứng trên nhiềuloài nấm mốc hay nấm men khác nhau , trên một số loại vi khuẩn: Pseudomonas , Legionella , Rhodospirillum centenum, vi khuẩn lam và gần đây nhất là sự thí nghiệm trên các loại vi khuẩn cổ như methanogenes đều thể hiện những phức tạp của FISH khi phân tích môi trường vi sinh vật

Hình 4: Sự tự phát huỳnh quang của Paraformaldehyde trong các tế bào Candidaalbicans(Moter et al., 2000)

2.1.2 Đầu dò thiếu tính đặc hiệu

Độ chính xác và độ tin cậy của FISH phụ thuộc nhiều vào tính đặc hiệu của cácđầu dò oligonucleotide Thiết kế cẩn thận và đánh giá giới hạn của các đầu dò mới

là điều thiết yếu Điều quan trọng cần lưu ý rằng mỗi một oligonucleotide chỉ phùhợp với duy nhất một dữ liệu thông tin mà nó có chung nguồn gốc Do sự báo cáothiếu chính xác thông tin của các trình tự và sự mở rộng nhanh chóng của cơ sở dữliệu, nên các trình tự đầu dò cần được kiểm tra một cách thường xuyên để cậpnhật các thông tin mới nhất Khi phân lập các vi sinh vật khó nuôi cấy hoặc chưabiết môi trường đặc hiệu, việc cập nhật thông tin các trình tự tỏ ra rất hữu ích đểkiểm tra tính đặc hiệu trước khi lai thử nghiệm như các phương pháp lai dot-blot

2.2 Kết quả âm tính

2.2.1 Số lượng đầu dò quá ít

Cường độ tín hiệu thấp có thể do sự thâm nhập không đủ của đầu dò vào bêntrong tế bào vi khuẩn Các đầu dò polyribonucleotide khi thấm vào tế bào vi sinhvật gram âm thường không gặp phải bất cứ vấn đề nhỏ nào Đối với vi sinh vậtgram dương, đặc biệt là những đầu dò có trình tự dài hoặc trung bình thì sử dụngcác acid mycolic kết hợp với cố định đặc hiệu và tiền xử lý có thể rất cần thiết

2.2.2 Những cấu trúc phức tạp của đầu dò hay trình tự đích

Do cấu trúc ba chiều của rRNA nên không phải tất cả các chuỗi trình tự đíchđều tiếp cận được với các đầu dò tương ứng Cấu trúc vòng hoặc kẹp tóc cũng như

sự tương tác giữa rRNA và protein cản trở dẫn đến sự cảm biến khác nhau của cácđầu dò oligonucleotide Điều này giải thích tại sao các đầu dò sử dụng tốt trong cácphương pháp lai thông thường có giai đoạn biến tính RNA hoặc DNA đã không

cho kết quả khả quan trong FISH Một hệ thống nghiên cứu nhằm giải quyết

vấn đề này đã được công bố bởi Fuchs và cộng sự (1998) Các nhà nghiên cứu đãtạo ra hơn 200 đầu dò oligonucleotide, xác định cụ thể những vị trí khác nhau trên16S rRNA của E.coli, rồi sử dụng phương pháp flow cytometry đo cường độ tínhiệu của chúng bằng thí nghiệm FISH Dựa trên đầu dò phát sáng nhất, các

oligonucleotide được phân thành 6 mức độ sáng khác nhau và dựng sẵn một biểu

đồ thể hiện khả năng tiếp cận của 16S rRNA E.coli Kể từ khi rRNA 16S được bảoquản tốt hơn, biểu đồ này có thể đơn giản việc thiết kế đầu dò hợp lý không chỉ đốivới E.coli, mà còn cho tất cả các vi sinh vật khác Tuy nhiên, theo một số nhànghiên cứu khác, đây là điều bắt buộc để đánh giá và tối ưu hóa thiết kế tất cả cácđầu dò tương ứng với các vi sinh vật và thích nghi với những ảnh hưởng tiêu cựctrước khi được áp dụng trên các mẫu hỗn tạp và chưa xác định được thành phần

2.2.3 Hàm lượng rRNA thấp

Mặc dù thông thường rất phong phú, nhưng hàm lượng rRNA của các tếbào vikhuẩn khác nhau rất đáng kể không chỉ giữa các loài, mà còn có sự khác nhau giữacác tế bào của cùng một chủng tùy theo các đặc điểm sinh lý liên quan trực tiếp đến tốc độ tăng trưởng của chúng

2.2.4 Ảnh chụp bị mất màu

Nhiều chất nhuộm huỳnh quang bị phai màu nhanh chóng theo sự kích thíchcủa bước sóng ánh sáng, dẫn đến không thể phục hồi những chỗ hư hỏng Nhữnglần phơi sáng chỉ từ vài giây đến vài phút nhưng có ảnh hưởng rất quan trọng, đặcbiệt với ảnh chụp qua kính hiển vi Để khắc phục những khó khăn này, việc sửdụng bộ lọc dải hẹp, thuốc nhuộm cyanine bền quang học và các công cụ chống

III./ Biện pháp khắc phục

Sử dụng đầu dò vi khuẩn : Cách kiểm soát tốt nhất cho những kết quả bị âmtính về khía cạnh phương pháp là sử dụng một đầu dò vi khuẩn Nếu tiến hành laivới một đầu dò phổ biến cho được kết quả khả quan trong FISH, thì việc cố định,

sự thẩm thấu và hàm lượng rRNA của vi khuẩn không còn là chỉ số hạn chế

EUB338 là đầu dò thường được sử dụng cho mục đích này Tuy nhiên, các

phân tích gần đây đã chỉ ra rằng một số ngành vi khuẩn bao gồm Planctomycetales

và Verhowrucomicrobia vẫn còn bị thiếu đầu dò này Vì vậy, sử dụng một tậphợp nhiều đầu dò vi khuẩn là điều rất cần thiết có một cái nhìn toàn diện hơn khiphân tích các quần thểvi khuẩn phức tạp Để kiểm soát những liên kết không đặchiệu giữa các đầu dò của vi khuẩn nhân thật với 16S rRNA đích hay với các thànhphần khác của tế bào so với acid nucleic, việc bổ sung đầu dò có tên là NON338

có thể được sử dụng và nó không phải đưa ra bất cứ tín hiệu nào trong FISH

C ỨNG DỤNG CỦA KĨ THUẬT FISH

1 Hệ vi sinh vật trong nước thải

Ardern và Lockett (1914) đã phát triển hệ thống hoạt hóa bùn đầu tiên để thanhlọc nước thải tại Manchester Tuy nhiên, vai trò của quần thể vi sinh vật trong quátrình này vẫn chưa được hiểu hết Bởi vì những kỹ thuật nuôi cấy thông thường đãđược thực hiện là quá chọn lọc cung cấp một bức tranh toàn diện và đáng tin cậycủa toàn bộ mạng lưới vi khuẩn , phân tích tập hợp các phân tử rRNA đã

tìm thấy nhiều ứng dụng rộng rãi cho kỹ thuật phân tích của một số môi trường:bình phản ứng sinh học hay nhà máy xử lý chất thải Các chuỗi trình tự được tạo rabằng những kỹ thuật phân tích phân tử như kỹ thuật PCR đã được sử dụng tạo ra

các đầu dò oligonucleotide mới cho FISH để nghiên cứu các quần thể vi khuẩn,như trong bùn hoạt tính Gần đây, vào năm 1999 Bond và cộng sự đã

tiến hành xác định các nhóm vi khuẩn trong bùn với sự tăng cường loại bỏ photphosinh học Một số nhóm nhà nghiên cứu khác thì tập trung vào Actinomycetes cóchứa acid mycolic được cho là có chứa nhiều sợi nhỏ tạo bọt trong nhà máy xử lýnước thải Ngoài các cá thể của nhóm khuẩn cổ, đặc biệt là

methanogen (một loại khuẩn cổ kị khí có khả năng tạo khí methal), đã được tìmthấy bằng phương pháp FISH trong quá trình phân hủy kị khí và trong hạt bùn nhỏ,mặc dù khả năng tự phát huỳnh quang của chúng rất mạnh Gần đây, sự

kết hợp giữa FISH và bộ vi cảm biến cho phép phân tích đồng thời quần thể vikhuẩn và các hoạt động trao đổi chất, qua đó phát hiện ra các vi khuẩn kị khí nằmtrong các khe nhỏ thiếu oxy trong môi trường hiếu khí

2 Vi khuẩn cộng sinh

Hầu hết các vi sinh vật cộng sinh bắt buộc đều chưa tiến hành nuôi cấy được

Sử dụng rRNA 16S, chúng có thể được định danh và phân cấp phát sinh loài Việckhoanh vùng vi sinh vật trong những bộ phận khác nhau của vật chủ bằng FISH cóthể chứng minh được tính chất cộng sinh của chúng, như Amann và cộng sự (1991)

đã làm, người đã xác định được vi khuẩn nội cộng sinh chưa nuôi cấy thuộc chiHolosporatrên lông của Paramecium caudatum Từ khi loài Holospora được tìmthấy trong nhân của các vi sinh vật có lông mịn, nó có thể được nhận biết rõ ràng

vi khuẩn tiêu hóa hiện diện trong các túi thức ăn Tương tự, FISH cũng được sửdụng để chứng minh Paramecium caudatum cũng chứa Caedibacter caryophila,một “kẻ” tiêu diệt vi sinh vật nội cộng sinh mà sự phát triển có liên quan đến loài