(Luận Văn Thạc Sĩ) Nghiên Cứu Khả Năng Tái Sinh In Vitro Ở Một Số Giống Lúa Và Xây Dựng Quy Trình Chuyển Gen Thông Qua Vi Khuẩn Agrobacterium Tumefaciens.pdf

Untitled ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM NGUYỄN VĂN THÀNH NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG TÁI SINH IN VITRO Ở MỘT SỐ GIỐNG LÚA VÀ XÂY DỰNG QUY TRÌNH CHUYỂN GEN THÔNG QUA VI KHUẨN Agrobacterium tumefac[.]

NGUY ỄN VĂN THÀNH

NGHIÊN C ỨU KHẢ NĂNG TÁI SINH IN VITRO Ở

M ỘT SỐ GIỐNG LÚA VÀ XÂY DỰNG QUY TRÌNH

CHUY ỂN GEN THÔNG QUA VI KHUẨN

Agrobacterium tumefaciens

Thái Nguyên - 2020

NGUY ỄN VĂN THÀNH

NGHIÊN C ỨU KHẢ NĂNG TÁI SINH IN VITRO Ở

M ỘT SỐ GIỐNG LÚA VÀ XÂY DỰNG QUY TRÌNH

CHUY ỂN GEN THÔNG QUA VI KHUẨN

Agrobacterium tumefaciens

Ngành: Công ngh ệ sinh học

Mã s ố ngành: 8 42 02 01

Người hướng dẫn khoa học: TS NGUYỄN XUÂN VŨ

Thái Nguyên - 2020

L ỜI CAM ĐOAN

Em xin cam đoan số liệu và kết quả nghiên cứu đề tài “ Nghiên cứu khả năng

tái sinh in vitro ở một số giống lúa và xây dựng quy trình chuyển gen thông qua vi khu ẩn Agrobacterium tumefaciens” là trung thực, được thực hiện tại Khoa Công

nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm – Trường Đại học Nông Lâm- Đại học Thái Nguyên Ngoài ra, trong bài báo cáo có sử dụng một số nguồn tài liệu tham khảo đã được trích dẫn rõ ràng và được phép công bố

Em xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về tính trung thực của các nội dung khác trong đề tài của mình

L ỜI CẢM ƠN

Trong quá trình học tập và hoàn thành luận văn tốt nghiệp, em đã nhận được

sự giúp đỡ về nhiều mặt của các cấp lãnh đạo, các tập thể và các cá nhân

Trước tiên, em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến giáo viên hướng dẫn

T.S Nguyễn Xuân Vũ đã luôn tận tình hướng dẫn, giúp đỡ em trong suốt quá trình

thực hiện và hoàn thành luận văn này

Em xin bày tỏ lời cảm ơn đến Khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm cùng các cán bộ, quý đồng nghiệp đã tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành đề tài nghiên cứu này

Cuối cùng em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất tới gia đình, người thân và bạn bè đã động viên, giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài

Em xin chân thành cảm ơn!

Thái Nguyên, tháng 11 năm 2020

DANH M ỤC TỪ VÀ THUẬT NGỮ VIẾT TẮT

Nghĩa đầy đủ của từ, thuật ngữ

DANH M ỤC BẢNG

Bảng 1.1: Diện tích lúa gieo trồng từ năm 2015 - 2019 9

Bảng 1.2 Sản lượng lúa từ năm 2015 - 2019 9

Bảng 2.1 Danh mục giống nghiên cứu 19

Bảng 3.1 Ảnh hưởng của NaOCl 3% tới hiệu quả khử trùng mẫu (sau 7 ngày nuôi cấy) 29

Bảng 3.2 Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến khả năng ạo mô sẹo

của một số giống lúa 30

Bảng 3.3 Ảnh hưởng của 2,4-D đến tỷ lệ tái sinh mô sẹoở một số giống lúa

(sau 14 ngày) 33

Bảng 3.4 Ảnh hưởng của BAP đến khả năng tái sinh chồi một số giống lúa 34

Bảng 3.5 Ảnh hưởng của kinetin đến khả năng tái sinh ở một số giống lúa 35

Bảng 3.6 Ảnh hưởng của tuổi mô sẹo đến khả năng tiếp nhận gen GUS

của một số giống lúa 37

Bảng 3.7 Ảnh hưởng của chủng vi khuẩn đến hiệu quả chuyển gen ở một số

giống lúa 39

Bảng 3.8 Ảnh hưởng của nồng độ AS đến khả năng tiếp nhận gen GUS

của một số giống lúa 40

Bảng 3.9 Ảnh hưởng của thời gian lây nhiễm đến hiệu quả chuyển gen 42

Bảng 3.10 Ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy đến hiệu quả chuyển gen 43

Bảng 3.11 Ảnh hưởng của nồng độ hygromycin đến hiệu quả chọn lọc mô sẹo

chuyển gen 44

DANH M ỤC HÌNH

Hình 1.1 Tình hình sản xuất và diện tích lúa toàn cầu năm 2018 [16] 6

Hình 1.2 Tỷ trọng sản xuất lúa theo vùng năm 2018 7

Hình 1.3 Vi khuẩn A tumefaciens 10

Hình 1.4 Sơ đồ cấu trúc tế bào vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 10

Hình 1.5 Cấu trúc Ti-plasmid 11

Hình 1.6 Cấu trúc T-DNA 12

Hình 1.7 Cơ chế phân tử của việc chuyển gen thông qua A tumefaciens 13

Hình 2.1 T-DNA của plasmid pCambia3301 mang gen bar và gen gus, mỗi gen

điều kiển bởi CaMV 35S promoter (LB: ranh giới trái, RB: ranh giới phải) 20

Hình 3.1 Mô sẹo tái sinh trên môi trường N6 (A) và MS (B) ở giống lúa Bao thai sau 7 ngày nuôi cấy 31

Hình 3.2 Ảnh hưởng của 2,4D đến khả năng tạo mô sẹo của một số giống lúa

(sau 14 ngày) A- Nếp 87; B- Bao thai; C- Khang dân; D- Đoàn kết 33

Hình 3.3 Ảnh hưởng của BAP đến khả năng tái sinh chồi của một số giống lúa

(sau 28 ngày) A-Đoàn kết; B- Nếp 87 ; C-Khang dân; D- Bao thai 34

Hình 3.4 Ảnh hưởng của kinetin đến khả năng tái sinh chồi của một số giống lúa (sau 28 ngày) A-Nếp 87; B- Đoàn kết; C-Khang dân; D- Bao thai 35

Hình 3.5 Biểu hiện gen GUS ở mô sẹo 3 ngày tuổi của giống Khang dân (A), Bao thai (B), Đoàn kết (C) và Nếp 87 (D) 38

Hình 3.6 Biểu hiện gen GUS ở nồng độ AS 100 µM ở giống Khang dân (A), Bao thai (B), Đoàn kết (C) và Nếp 87 (D) 40

Hình 3.7 Biểu hiện gen GUS sau 3 phút lây nhiễm với vi khuẩn ở giống

Khang dân (A), Bao thai (B), Đoàn kết (C) và Nếp 87 (D) 41

Hình 3.8 Biểu hiện gen GUS sau 3 ngày đồng nuôi cấy ở giống Khang dân (A),

Bao thai (B), Đoàn kết (C) và Nếp 87 (D) 43

Hình 3.9 Chọn lọc tế bào chuyển gen trên môi trường hygromycin10mg/l (A),

15 mg/l (B), 20 mg/l (C) và 25 mg/l (D) 44

M ỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

DANH MỤC TỪ VÀ THUẬT NGỮ VIẾT TẮT iii

DANH MỤC BẢNG iv

DANH MỤC HÌNH v

MỤC LỤC vi

MỞ ĐẦU 1

1 Đặt vấn đề 1

2 Mục đích nghiên cứu 3

3 Đối tượng nghiên cứu 3

4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 3

4.1 Ý nghĩa khoa học 3

4.2 Ý nghĩa thực tiễn 3

Chương 1.TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 Vai trò của cây lúa 4

1.2 Tình hình nghiên cứu và sản xuất lúa trên thế giới 5

1.2.1 Tình hình nghiên cứu chọn tạo giống lúa trên thế giới 5

1.2.2 Tình hình sản xuất lúa trên thế giới 6

1.3 Tình hình nghiên cứu vẩn xuất lúa tại Việt Nam 7

1.3.1 Nghiên cứu chọn tạo giống lúa ở Việt Nam 7

1.3.2 Tình hình sản xuất lúa ở Việt Nam 8

1.4 Vi khuẩn Agrobacterium tumerfaciens và cơ chế chuyển gen vào thực vật 10

1.4.1 Đặc điểm chung về vi khuẩn Agrobacterium tumerfaciens 10

1.4.2 Cấu trúc và chức năng của Ti-plasmid và T-DNA 11

1.4.3 Cơ chế biến nạp gen thông qua vi khuẩn A.tumerfaciens vào thực vật 12

1.5 Hệ thống gen chỉ thị sử dụng để biến nạp vào tế bào thực vật thông qua

vi khuẩn A tumefaciens được sử dụng trong nghiên cứu 14

1.5.1 Gen gusA 14

1.5.2 Gen bar 14

1.6 Một số phương pháp biến nạp gen ở lúa 14

1.6.1 Phương pháp vi tiêm 14

1.6.2 Chuyển gen bằng xung điện 15

1.6.3 Chuyển gen qua ống phấn (pollen tube) 15

1.6.4 Chuyển gen bằng súng bắn gen 15

1.7 Chuyển gen thông qua vi khuẩn A.tumefaciens 16

1.8 Tình hình nghiên cứu tái sinh in vitro cây lúa trên thế giới và Việt Nam 16

1.9 Tình hình nghiên cứu xây dựng quy trình chuyển gen cây lúa trên thế giới

và Việt Nam 17

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19

2.1 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 19

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 19

2.1.2 Vật liệu sử dụng và phạm vi nghiên cứu 19

2.1.3 Thiết bị sử dụng 20

2.2 Địa điểm và thời gian tiến hành 20

2.3 Nội dung và phương pháp nghiên cứu 21

2.3.1 Nội dung 1: Nghiên cứu khả năng tái sinh in vitro của một số giống lúa 21

2.3.2 Nội dung 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố đến khả năng

chuyển gen ở một số giống lúa 23

2.4 Điều kiện bố trí thí nghiệm 26

2.5 Phương pháp theo dõi, đánh giá 26

2.5.1 Các chỉ tiêu theo dõi 26

2.5.2 Các chỉ tiêu đánh giá 26

2.6 Phương pháp xử lý số liệu 27

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 29

3.1 Kết quả nghiên cứu khả năng tái sinh invitro của một số giống lúa 29

3.1.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của NaOCl đến hiệu quả vô trùng mẫu nuôi cấy 29

3.1.2 Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến khả năng tạo mô sẹo 30

3.1.3 Ảnh hưởng của 2,4D đến khả năng tạo mô sẹo ở một số giống lúa 32

3.1.4 Ảnh hưởng của BAP đến khả năng tái sinh chồi ở một số giống lúa 33

3.1.5 Ảnh hưởng của Kinetin đến khả năng tái sinh chồi ở một số giống lúa

Việt Nam 35

3.2 Kết quả nghiên cứu khả năng tiếp nhận gen 36

3.2.1 Ảnh hưởng của tuổi mô sẹo đến hiệu quả biến nạp gen 36

3.2.2 Ảnh hưởng của chủng vi khuẩn đến hiệu quả biến nạp gen 38

3.2.3 Ảnh hưởng của nồng độ AS đến hiệu quả chuyển gen ở một số giống lúa 39

3.2.4 Ảnh hưởng của thời gian lây nhiễm đến hiệu quả chuyển gen 41

3.2.5 Ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy đến hiệu quả chuyển gen 42

3.2.6 Ảnh hưởng của nồng độ hygromycin đến hiệu quả chọn lọc chuyển gen 43

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 45

1 Kết luận 45

2 Kiến nghị 46

TÀI LIỆU THAM KHẢO 47

M Ở ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Lúa (Oryza sativa L.) là một trong ba loại cây lương thực chính quan trọng

hàng đầu của con người, cung cấp từ 60 đến 70% calories [25] Trên thế giới, cây lúa nước được xếp vào vị trí thứ 2 sau cây lúa mì về diện tích và sản lượng.Việt Nam một đất nước đã gắn liền với nền văn minh lúa nước, cây lúa có vai trò đặc biệt quan trọng, trong sản xuất lương thực, đóng góp sản lượng cao nhất (60%) và được canh

mún do sự phát triển của công nghiệp hoá Hiện nay, diện tích đất nông nghiệp bình quân/hộ chỉ vào khoảng 0,46 ha và trung bình được chia thành 2,83 mảnh [7] Trong khi dân số đang không ngừng tăng lên, việc tạo ra bộ giống có năng suất cao, chất lượng tốt là yêu cầu cấp thiết trong giai đoạn hiện nay Các giống lúa đột biến dựa trên việc sử dụng tác nhân đột biến làm biến đổi bộ gen cho kích thước hạt dài, giá trị dinh dưỡng, năng suất cao, đồng thời tạo ra cây lúa kháng thuốc diệt cỏ đồng hợp tử, nhạy cảm với nhiệt độ thấp, đặc biệt là ở giai đoạn non Việc tạo ra các giống lúa có khả năng chống chịu được với điều kiện bất lợi ngoại cảnh đặc biệt là hạn hán có ý nghĩa quan trọng đối với việc duy trì và tăng năng suất lúa gạo, góp phần giữ ổn định

an ninh lương thực quốc gia

trồng, vật nuôi mới phù hợp với mục đích sử dụng Việc chỉnh sửa bộ gen cũng có thể được sử dụng để sửa đổi gen lúa tạo ra các giống lúa an toàn và từ đó tăng giá trị

nhiên phù hợp với phát triển nền nông nghiệp lúa nước, diện tích đồng bằng ven sông lớn như đồng bằng sông Cửu Long 4.081,63 ha và đồng bằng Sông Hồng

mạnh giúp chúng ta phát triển lĩnh vực nông nghiệp Thế nhưng, khi đi sâu vào thực

tế, gạo Việt Nam vẫn còn tồn đọng một số hạn chế nhất định bên cạnh những ưu điểm vang danh bấy lâu

Hiện nay, phương pháp dùng để chuyển gen thông qua vi khuẩn A tumefaciens không được xem là có hiệu quả với cây một lá mầm [19, 30] Tuy nhiên, có nhiều

công trình nghiên cứu báo cáo việc biến nạp gen thành công vào lúa nhờ vi khuẩn A

mặc dù khi đó không thu được cây chuyển gen [9] Đến năm 1993, nhóm nghiên cứu

này đã tạo ra được cây lúa japonica chuyển gen đầu tiên nhờ vi khuẩn A tumefaciens

bằng cách nuôi cấy phôi non Hiện nay, biến nạp gen vào lúa nhờ vi khuẩn A

biến nạp được chèn vào nhiễm sắc thể của tế bào chủ thấp, bền vững [20] Đặc biệt, phương pháp này cho hiệu quả chuyển gen cao, khả năng chuyển được đoạn DNA có kích thước lớn và chi phí thấp

Các nghiên cứu tạo giống truyền thống chủ yếu dựa trên các phương pháp lai tạo nên hiệu quả đạt được không thực sự cao Một số ứng dụng mới trong chọn giống cây trồng nhờ dùng chỉ thị phân tử, gây đột biến tuy đã đạt được một số kết quả nhất định nhưng vẫn có những hạn chế Phương pháp chuyển gen ra đời được ví như

“chìa khóa đa năng” để mở những nút thắt vốn gây rất nhiều khó khăn cho các nhà chọn tạo giống truyền thống nhằm tạo ra một giống cây trồng “hoàn hảo” hơn khi chúng được kết hợp với nhau Với hướng nghiên cứu này, các gen quy định những tính trạng quan tâm được chủ động chuyển vào lúa, từ đó tạo ra cácgiống lúa mang các đặc tính như mong muốn của con người

Những năm gần đây, ngành lúa gạo của Việt Nam gặp nhiều khó khăn cả về điều kiện khí hậu, giá và thị trường xuất khẩu Bên cạnh đó, các thách thức về biến đổi khí hậu, thiếu hụt nguồn nước, thoái hóa đất,…đang ngày càng hiện rõ Duy trì sản lượng lúa gạo lớn là một chính sách đã được áp dụng từ lâu Nghị quyết

lúa 41-42 triệu tấn đáp ứng nhu cầu tiêu dùng trong nước và xuất khẩu khoảng 4

ninh lương thực trong nước và xuất khẩu với một chỉ tiêu cứng nhắc Chính sách khuyến khích sản lượng cao dẫn đến nhiều hệ quả bất lợi cho nông dân trồng lúa Chính vì vậy, hướng tiếp cận nghiên cứu nguồn gen lúa gạo Việt Nam phục vụ cho công tác bảo tồn đa dạng sinh học nguồn gen ngành lúa được lưu giữ trong phòng thí nghiệm cũng như ngoài thực địa dùng làm nguyên liệu ban đầu để tuyển chọn và phát triển thương mại phục vụ nhu cầu tiêu dùng trong nước và xuất khẩu Vì vậy,

các nghiên cứu phải đặt trong hệ thống khép kín, tương tác lẫn nhau từ khâu điều tra, xác định, phân loại, chọn, tạo giống, tới kỹ thuật nuôi trồng và định hướng thị trường tiêu thụ sản phẩm tập trung và bền vững Nhằm tận dụng và phát triển nguồn gen lúa của Việt Nam chưa được khai thác một cách hợp lý và khoa học Việc nghiên cứu khả năng tái sinh in vitro ở một số giống lúa và xây dựng quy trình chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens phục vụ cho công tác tạo giống lúa chuyển gen đáp ứng nhu cầu thực tiễn sản xuất là cần thiết

Xuất phát từ những vấn đề trên tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên c ứu khả năng tái sinh in vitro ở một số giống lúa và xây dựng quy trình chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens”

Nghiên cứu khả năng tái sinh in vitro ở một số giống lúa và xây dựng quy trình chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens phục vụ cho công tác tạo giống lúa chuyển gen đáp ứng nhu cầu thực tiễn sản xuất

3 Đối tượng nghiên cứu

Một số giống lúa : Khang dân, Bao thai, Đoàn kết và Nếp 87

4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

phát triển nguồn gen lúa gạo Việt Nam

tồn đa dạng sinh học nguồn gen được lưu giữ trong phòng thí nghiệm cũng như ngoài thực địa dùng làm nguyên liệu ban đầu để tuyển chọn và phát triển thương mại phục vụ nhu cầu tiêu dùng trong nước và xuất khẩu

Chương 1

Lúa (Oryza sativa L.) là cây lương thực quan trọng được trồng chủ yếu ở Châu

Á, đặc biệt là khu vực Đông Nam Á trong đó có Việt Nam Lúa gạo là nguồn lương thực chủ yếu nuôi sống hàng tỷ người trên thế giới Sản lượng lúa gia tăng trong thời gian qua đã mang lại sự an sinh cho con người, đặc biệt đối với dân nghèo: gạo là nguồn cung cấp thức ăn chủ yếu Các nước nghèo thường dùng gạo là nguồn lương

bằng các loại thức ăn cung cấp nhiều protein và vitamin hơn Ở Việt Nam hiện nay mức tiêu thụ gạo bình quân vẫn còn ở mức cao, khoảng 120 kg/người/năm Tuy

phẩm từ lúa gạo Khoảng 40% dân số trên thế giới lấy lúa gạo làm nguồn lương thực chính Trên thế giới có hơn 110 quốc gia có sản xuất và tiêu thụ gạo với các mức độ khác nhau Lượng lúa được sản xuất ra và mức tiêu thụ gạo cao tập trung ở khu vực Châu Á Năm 1980, chỉ riêng ở Châu Á đã có hơn 1,5 tỷ dân sống nhờ lúa gạo, chiếm trên 2/3 dân số Châu Á Con số này theo ước đoán đã tăng lên gần gấp đôi Lúa là cây trồng thân thiết, lâu đời nhất của nhân dân ta và nhiều dân tộc khác trên thế giới, đặt biệt là các dân tộc ở Châu Á Mặc dù năng suất lúa ở các nước Châu

Á còn thấp nhưng do diện tích sản xuất lớn nên Châu Á vẫn là nguồn đóng góp rất

lượng lúa theo thứ tự là Trung Quốc, Ấn Độ, Indoniesia, Bangladesh, Việt Nam, Thái Lan và Myanmar tất cả đều nằm ở Châu Á Như vậy, có thể nói Châu Á là vựa

thành phần tinh bột và protein hơi thấp hơn, nhưng năng lượng tạo ra cao hơn do chứa nhiều chất béo hơn Ngoài ra, nếu tính trên đơn vị 1 hecta, gạo cung cấp nhiều calo hơn lúa mì do năng suất lúa cao hơn nhiều so với lúa mì Giả sử một người trung bình cần 3200 calo mỗi ngày thì một hecta lúa có thể nuôi 2055 người/ngày hoặc 5,63 người/năm, trong khi lúa mì chỉ nuôi được 3,67 người /năm, bắp 5,3 người/năm Hơn nữa, trong gạo lại có chứa nhiều acid amin, thiết yếu như: Lysine, Threonine, Methionine, Tryptophan… hơn hẳn lúa mì Đối với một số quốc gia như Việt Nam, Thái Lan, Miến Điện (Myanmar), Ai Cập lúa gạo chiếm một vị trí quan

trọng trong nền kinh tế quốc dân, không phải chỉ là nguồn lương thực mà còn là nguồn thu ngoại tệ để đổi lấy thiết bị, vật tư cần thiết cho sự phát triển của đất nước Điều này chỉ rõ vị trí của lúa gạo trong cơ cấu lương thực thế giới và trong đời sống kinh tế quốc tế

Việt Nam là một trong những nước có nghề truyền thống trồng lúa nước cổ xưa nhất thế giới Nông nghiệp trồng lúa vừa đảm bảo an ninh lương thực quốc gia, vừa là cơ sở kinh tế sống còn của đất nước Dân số nước ta đến nay hơn 90 triệu người, trong đó dân số ở nông thôn chiếm gần 80% và lực lượng lao động trong nghề trồng lúa chiếm khoảng 70% lực lượng lao động cả nước Điều đó cho thấy lĩnh vực nông nghiệp trồng lúa thu hút đại bộ phận lực lượng lao động cả nước, đóng vai trò rất lớn trong nền kinh tế quốc dân Bên cạnh đó, ưu thế lớn của nghề trồng lúa còn thể hiện rõ ở diện tích canh tác trong tổng diện tích đất nông nghiệp cũng như tổng diện tích trồng cây lương thực Ngành trồng trọt chiếm 4/5 diện tích đất canh tác trong khi đó lúa giữ vị trí độc tôn, gần 85% diện tích lương thực Theo số liệu sơ bộ của Tổng cục Hải quan, tính chung cả năm 2019 cả nước xuất khẩu 6,37 triệu tấn gạo, tương đương 2,81 tỷ USD, tăng 4,1% về lượng nhưng giảm 8,4% về kim ngạch

so với năm 2018 Giá xuất khẩu đạt 440,7 USD/tấn, giảm 12,1% Kết quả báo cáo tổng kết 7 tháng đầu năm 2020, Việt Nam xuất khẩu khoảng 3,9 triệu tấn gạo, đạt kim ngạch 1,9 tỉ USD, tăng 10,9% về giá trị so với cùng kỳ năm trước Đặc biệt là giá gạo xuất khẩu của Việt Nam tăng cao, vượt Thái Lan, Ấn Độ và Pakistan Đây là lần thứ 2 Việt Nam có thể trở lại vị trí xuất khẩu gạo số 1 thế giới

1.2.1 Tình hình nghiên cứu chọn tạo giống lúa trên thế giới

* Nghiên cứu tái sinh invitro và chuyển gen

Tái sinh cây từ mô sẹo được thông báo lần đầu tiên ở loài cây ngũ cốc bởi Tamaoki và Ullstrup năm 1958 Cho đến nay mô sẹo đã được tạo ra từ các mô lúa khác nhau như lát cắt thân, hoa non, bao phấn, tiểu bào tử, đỉnh rễ, bao lá mầm, trụ dưới lá mầm, hạt trưởng thành Hiện nay, hạt trưởng thành và hạt non (phôi non) được sử dụng làm vật liệu nghiên cứu nhiều nhất vì các vật liệu này cho mô sẹo có tỷ

lệ tái sinh cây cao hơn

Năm 1985, tái sinh cây từ phôi trưởng thành ở các giống lúa Japonica được thông báo bởi Fujimura và cộng sự [17] Tạo mô sẹo và tái sinh cây ở các giống lúa

indica từ phôi non được thông báo bởi Koetije và cộng sự năm 1989 nhiều nghiên cứu cũng chỉ ra rằng các giống lúa Indica có sự khác nhau đáng kể về phản ứng tạo mô sẹo và tái sinh cây Do đó, để cải thiện hiệu quả tạo mô sẹo và tái sinh cây, cần thiết tối ưu hóa môi trường cho các giống lúa indica

Lin và Zhang (2005) đã tối ưu hóa môi trường và các điều kiện nuôi cấy phục vụ biến nạp gen cho hiệu quả cao ở các giống lúa indica [26]

Lin và Zhang đã chỉ ra rằng nguyên nhân chính thu được tỷ lệ biến nạp thành công thấp ở các giống lúa indica (so với các giống lúa japonica) có thể do hiệu quả tái sinh của các giống lúa indica thấp hơn Họ đã tìm ra được hai môi trường mới để cấy chuyển, phân hóa mô sẹo và sử dụng quy trình tái sinh cây để biến nạp cho các giống lúa indica

Hiei và cộng sự (2008) đã tối ưu hóa quy trình biến nạp cho các giống lúa indica bằng Agrobacterium tumerfaciens sử dụng phôi non của hạt non sau thu phấn 8-12 ngày Quy trình đã được áp dụng để biến nạp thành công với hiệu quả cao (trên

7 dòng/phôi) cho các giống lúa indica IR8, IR24, IR26, IR36, IR54, IR64, IR72, Xin Qing Ai 1, Nan Jin 11 và Suewon 258 [20]

1.2.2 Tình hình sản xuất lúa trên thế giới

Theo cơ quan FAO tại Rome, sản xuất lúa thế giới trong 2018 tương đối thuận lợi đạt đến 782 triệu tấn, tăng 1,6% so với năm 2017, mặc dù điều kiện khí hậu bất thường xảy ra tại nhiều nơi, với diện tích trồng toàn cầu khoảng 168 triệu ha

Hình 1.1 Tình hình sản xuất và diện tích lúa toàn cầu năm 2018 [16]

Hình 1.2 Tỷ trọng sản xuất lúa theo vùng năm 2018

giới hay đạt đến 594,7 triệu tấn

Ở Châu Phi, sản xuất 22,6 triệu tấn, hay 3,4% mặc dù gặp hạn hán và ngập lụt

Ở Châu Mỹ, sản xuất lúa đạt đến 33,8 triệu tấn, Brazil là nước sản xuất lúa lơn nhất của vùng, năm 2018 với sản lượng 11,3 triệu tấn

Ở Châu Âu, sản xuất trong 2018 khoảng 3,6 triệu tấn lúa Hai nước trồng lúa lớn của Châu Âu là Ý và Tây Ban Nha

Nguyễn Xuân Dũng và cộng sự (2015) nghiên cứu giống lúa nếp N31 có năng suất, chất lượng tốt và thời gian sinh trưởng ngắn ngày được chọn tạo bằng phương pháp lai hữu tính giữa tổ hợp lai hai giống nếp DT22 và giống nếp N87-2 (N98) [2]

1.3.1.2 C họn tạo giống bằng công nghệ tế bào

* Tình hình nghiên cứu tái sinh in vitro

Phan Thị Hương và cộng sự (2014) đánh giá khả năng tạo mô sẹo và tái sinh của bảy giống lúa bao gồm BM9630, NV1, NV2, NV3, J02 (thuộc nhóm japonica), Hương Cốm và BC15 (thuộc nhóm indica) [4] Tỷ lệ tạo mô sẹo của các giống lúa nghiên cứu trong khoảng 72-98%; trong đó, giống Hương cốm, NV1 và J02 có tỷ lệ tạo mô sẹo trên 90% (tương ứng 97%, 92% và 98%) Môi trường tạo mô sẹo thích hợp đối với giống Hương cốm và các giống japonica là môi trường muối N6 + vitamin B5 + 3 mg/l 2,4-D + 100 mg/l myo-inositol + 500 mg/l L-proline + 500 mg/l L-glutamin + 300 mg/l casein hydrolysate + 30 g/l sucrose

Nguyễn Thị Hồng Châu và cộng sự (2003) đã thực hiện chuyển gen vào giống

lúa C71 thông qua A.tumerfaciens Nhóm tác giả đã sử dụng môi trường MS làm

nền, cho tất cả các giai đoạn nuôi cấy, chuyển gen và tái sinh Gen được chuyển gồm

và gen Xa21 – gen kháng bệnh bạc lá) Vật liệu là giống lúa C71 Kết quả cho thấy tỷ

lệ tạo callus của giống lúa C71 khoảng 92% Tỷ lệ biến nạp gen CryIA(c) đạt 6,6% Tác giả cũng cho rằng khả năng tái sinh của lúa indica là thấp hơn so với japonica Thời gian cho cây chuyển gen mất từ 4,5 đến 5 tháng [1]

Ngoài kết quả tổng hợp ở trên, còn nhiều công trình khác nghiên cứu về công nghệ nuôi cấy mô tế bào lúa và chuyển gen vào lúa thông qua vi khuẩn

1.3.2 Tình hình sản xuất lúa ở Việt Nam

Việt Nam có truyền thống trồng lúa lâu đời, lúa gạo là một lương thực quan trọng và chủ yếu nhất đối với người dân Việt Nam, lúa gạo ngoài dùng làm lương thực cho người, thức ăn cho vật nuôi còn dùng để chế biến các sản phẩm khác… Đặc biệt với một nước dân số đông tới khoảng trên 90 triệu người, việc tự sản xuất lúa là rất quan trọng Việt Nam có điều kiện tự nhiên thích hợp cho cây lúa có 2 vựa lúa chính là đồng bằng sông Hồng và đồng bằng sông Cửu Long Diện tích sản xuất lúa được xếp hạng 5 và xuất khẩu gạo đứng thứ 3 trên thế giới, gạo Việt Nam đã được xuất khẩu sang gần 160 quốc gia và vùng lãnh thổ, chiếm 15% thị phần gạo toàn cầu

và cũng bước đầu thâm nhập được các thị trường có yêu cầu chất lượng cao, như: Nhật Bản, Hàn Quốc, Mỹ, EU,…

- Về gieo trồng:

Diện tích gieo trồng các vụ lúa ở nước ta từ năm 2015 đến năm 2019 có sự thay đổi qua các năm, được thể hiện qua Bảng 1.1

Bảng 1.1: Diện tích lúa gieo trồng từ năm 2015 - 2019

(Nghìn ha)

Diện tích lúa

Hè thu (Nghìn ha)

Diện tích lúa Mùa (Nghìn ha)

Tổng diện tích (Nghìn ha)

Nhìn chung từ năm 2015 đến năm 2019, tổng diện tích gieo trồng ở nước ta có

xu hướng giảm đi, do nhiều nơi người dân chuyển đổi dần từ trồng lúa sang trồng các cây nông nghiệp (điều, cao su, tiêu, ) cho giá trị kinh tế cao hơn; một số địa phương cũng phải ưu tiên dành đất nông nghiệp cho phát triển công nghiệp, kết cấu hạ tầng và đô thị hóa Điều này làm ảnh hưởng rất lớn đến vấn đề an ninh lương thực quốc gia

- Về thu hoạch

Sản lượng lúa thu hoạch thay đổi qua các năm từ 2015 – 2019 và được trình bày tại bảng 1.2:

Bảng 1.2 Sản lượng lúa từ năm 2015 - 2019

(Nghìn tấn)

Sản lượng lúa

Hè Thu (Nghìn tấn)

Sản lượng lúa Mùa

Từ năm 2015 đến năm 2019, sản lượng lúa các mùa vụ sụt giảm qua các năm, chỉ có năm 2018 là sản lượng có tăng so với năm 2017 Nguyên nhân là do diện tích gieo trồng bị thu hẹp dần, người dân dần chuyển sang loại nông sản cho thu nhập cao hơn Điều này đã ảnh hưởng rất lớn đến tình hình xuất khẩu gạo của Việt Nam

1.4 1 Đặc điểm chung về vi khuẩn Agrobacterium tumerfaciens

Hình 1.3 Vi khuẩn A tumefaciens

0,7-0,8µm, dạng đơn bào, không tạo ra bào tử, có vỏ và lông roi, là vi khuẩn hiếu khí, nhuộm màu gram âm (-), khuẩn lạc tròn và rìa nhẵn A.tumefaciens là loài vi khuẩn gây ra bệnh khối u hình chóp ở các vị trí tổn thương của thực vật hai lá mầm Chỉ rất

ít thực vật một lá mầm thuộc họ Liliaceae và Amaryllidaceae là dễ bị bệnh khối u hình chop [1]

Hình 1.4 Sơ đồ cấu trúc tế bào vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens

1.4 2 Cấu trúc và chức năng của Ti-plasmid và T-DNA

- Ti-plasmid

Hình 1.5 Cấu trúc Ti-plasmid

Plasmid là những phân tử DNA có kích thước nhỏ (2-5kb), dạng vòng, nằm độc lập trong tế bào chất Plasmid có khả năng sao chép độc lập, không phụ thuộc vào sự sao chép DNA nhiễm sắc thể của vi khuẩn

Ti-plasmid được tìm thấy trong tất cả các dòng A tumefaciens gây độc, có

kích thước khoảng 200-250 kb Chúng được duy trì ổn định trong Agrobacterium ở

người ta đã xác định được Ti-plasmid có 4 vùng tương đồng Trong đó, vùng T-DNA

(transferred DNA) và vùng gây độc (virulence) liên quan đến sự hình thành khối u

còn hai vùng khác liên quan đến sự tiếp hợp và sự tái bản của plasmid trong

Trong Ti-plasmid có hai vùng quan trọng cần thiết cho quá trình chuyển gen ở thực vật Thứ nhất, vùng T-DNA là vùng được chuyển vào thực vật nhờ quá trình tiếp hợp giữa A tumefaciens và thực vật ở những chỗ có vết thương Hiện nay trong kỹ thuật chuyển gen cây trồng, người ta lợi dụng vùng T-DNA đã mang đoạn gen cần chuyển vào thực vật Thứ hai, vùng vir là vùng gây độc cho thực vật nên không được chuyển vào bộ gen của cây trồng, mà nó đóng vai trò hỗ trợ cho quá trình chuyển T-DNA vào trong tế bào thực vật

- T-DNA

T-DNA là một đoạn DNA có kích thước 25 kb, trong đó chứa gen mã hóa cho sinh tổng hợp auxin, cytokinin, opine và các gen gây khối u Trong Ti-plasmid, vị trí của T-DNA được giới hạn bằng bờ phải (RB- Right Border) và bờ trái (LB-Left Border)

Ở Ti-plasmid dạng nopaline, T-DNA xâm nhập vào genome thực vật ở dạng một đoạn liên tục dài 22 kb Trong khi ở Ti-plasmid dạng octopine, T-DNA là một đoạn gen liên tục dài 13 kb T-DNA mang rất nhiều gen như: (1) Các gen mã hoá những enzyme cần thiết cho quá trình sinh tổng hợp opine; (2) Các gen gây khối u

như tms1, tms2, tmr mã hoá cho các enzyme liên quan đến quá trình sinh tổng hợp

auxin và cytokinine Trong các vùng DNA của Ti-plasmid, ngoài T-DNA vùng được nghiên cứu nhiều hơn cả là vùng DNA phụ trách khả năng lây nhiễm còn gọi là vùng

hiệu như virE2, virB, virD, virD2 [1], [8]

Hình 1.6 Cấu trúc T-DNA 1.4.3 Cơ chế biến nạp gen thông qua vi khuẩn A.tumerfaciens vào thực vật

Các tế bào cây khi bị tổn thương sẽ tiết ra các hợp chất hoá học dẫn dụ vi khuẩn như: acetosyringon (As), alpha hydroxy-acetosyringon Dưới tác dụng của các hợp chất

này, A tumefaciens nhận biết rồi bám vào thành tế bào chủ và chuyển T-DNA vào tế

bào thực vật Quá trình này được sự trợ giúp đặc biệt của các gen vir và RB, LB

Cũng chính các hợp chất này, với vai trò cảm ứng, giúp cho các gen vùng vir hoạt động và tăng cường biểu hiện Sự tiếp xúc của A.tumerfaciens với các hợp chất giải

phóng từ mô thực vật bị tổn thương đã làm cho vùng vir của Ti-plasmid được hoạt hóa và phiên mã [1], [8]

Hình 1.7 Cơ chế phân tử của việc chuyển gen thông qua A tumefaciens

Khi A.tumerfaciens gặp dịch rỉ của các tế bào thực vật bị tổn thương, hoặc As

tinh khiết, sản phẩm của gen virA (có thể liên kết với màng) sẽ nhận diện và tương tác với As và truyền tín hiệu ngoại bào vào trong tế bào này làm hoạt hóa sản phẩm

của gen virG

Sau đó protein virG đã biến đổi hoạt hóa làm cho các gen virB, C, D và E

không hoạt động và làm tăng cường sự phiên mã của gen virG Các sản phẩm của

operon virD mã hóa một loại endonuclease tạo ra vết cắt trên Ti-plasmid tại hai trật tự

biên 25bp Từ đó một mạch đơn T-DNA được giải phóng ra khỏi Ti-plasmid và thay thế vào đó là một mạch đơn mới được tổng hợp theo chiều 5’-3’, bắt đầu từ chỗ đứt của trật tự biên phải Sự hình thành mạch đơn T-DNA được tăng cường nhờ sự tương tác giữa protein VirD2 với một hoặc hai protein do gen VirC mã hóa Còn protein

trình chuyển vào nhân tế bào thực vật Còn gen VirB mã hóa cho các protein hình thành nên một cầu nối cho T-DNA được chuyển sang tế bào thực vật [1], [8]

1.5 H ệ thống gen chỉ thị sử dụng để biến nạp vào tế bào thực vật thông qua vi

1.5.1 Gen gusA

Gen gusA: chỉ thị nhuộm màu mô tế bào thông qua phản ứng oxy hóa cơ

β-Glucuronidase (gus)

Gen gusA lần đầu tiên được phân lập từ E coli -glucuronidase thường được sử

dụng để làm chỉ thị chọn lọc để nhận biết cây chuyển gen bởi ưu điểm dễ nhận biết thông qua nhuộm màu, phản ứng có độ nhạy và độ ổn định cao Hoạt tính gus trong tế bào, dịch chiết, cặn tế bào còn có thể định lượng được thông qua phản ứng xúc tác cơ chất huỳnh quang MUG (4-methylumbelliferyl -D-Glucuronide) và đo bằng RE-Mini

Sigma) ở bước sóng 360 và 460 nm [1]

1.5.2 Gen bar

Gen bar được tạo dòng đầu tiên từ dòng vi khuẩn Streptomyses hygroscopicus,

là tên gọi của gen mã hóa cho enzyme phosphinothricin acetyltransferase (PAT), có tác dụng làm mất độc tính của phosphinothricin (PPT) là hoạt chất chính của thuốc trừ cỏ như Bialaphos, Finale, Buster, Harvest và Basta Glufosinate là hợp chất tự nhiên được phân lập từ 2 loài nấm Streptomyces, ức chế hoạt tính của enzyme tổng hợp glutamin, enzyme cần thiết cho sự tạo thành glutamin và độc tính ammonia Việc sử dụng glufosinate dẫn đến làm giảm hàm lượng glutamin và làm tăng ammonia trong mô thực vật Điều này làm cho quá trình quang hợp ngừng và cây

chết sau này [1]

Ngoài phương pháp biến nạp gen gián tiếp thông qua vi khuẩn A tumefaciens,

các phương pháp biến nạp gen trực tiếp cũng đã được ứng dụng nhiều trong chuyển gen vào lúa, cụ thể:

1.6.1 Phương pháp vi tiêm

Các nhà nghiên cứu sử dụng kim vi tiêm và kính hiển vi để tiêm một lượng nhỏ DNA vào những tế bào nhất định, có thể là tế bào nguyên vẹn Phương pháp này

có ưu điểm là DNA đưa vào tế bào một cách chính xác vị trí đã xác định và có thể quan sát được Phương pháp này cần thiết bị có độ chính xác cao, các thao tác thực hiện cần chính xác và thành thạo

1.6 2 Chuyển gen bằng xung điện

Sử dụng xung điện với thời gian ngắn trong một điện trường cực mạnh Khi đặt các tế bào trần trong điện trường, sự dẫn điện và tính thấm của màng nguyên sinh thay đổi, kéo theo sự mất ổn định tại chỗ và tạm thời của màng dẫn tới sự hình thành lỗ hổng trên màng tế bào Một loạt các lỗ hổng trên màng tế bào được hình thành, DNA sẽ

đi vào tế bào qua các lỗ hổng Một số tế bào thực vật có thể tiếp thụ DNA nhờ xung điện

mà không cần xử lý trước như tế bào ngô, lúa và phôi non lúa mì Zang và cộng sự, (1988) đưa ra cây lúa chuyển gen từ tế bào trần nhờ sử dụng phương pháp xung điện [37] Năm 1989, Shimamoto và cộng sự đưa ra cây lúa chuyển gen hữu thụ đầu tiên

ở lúa Japonica cũng sử dụng phương pháp chuyển gen qua xung điện [34]

1.6.3 Chuyển gen qua ống phấn (pollen tube)

Phương pháp này lần đầu tiên được Z Luo và Ray Wu và các cộng sự ở trường

Đại học Cornell (Mỹ) đề xuất năm 1988 trên cây lúa Khi hạt phấn rơi trên núm nhụy

(quá trình thụ phấn) hạt phấn sẽ này mầm hình thành ống phấn Lúc này tiêm gen mong muốn theo ống phấn mang giao tử đực vào thụ tinh với giao tử cái sẽ hình thành hợp tử có mang gen chuyển vào Phương pháp này khá thành công đặc biệt

trên cây lúa và bông [38]

1.6.4 Chuyển gen bằng súng bắn gen

Kỹ thuật chuyển gen bằng súng bắn gen được phát hiện bởi Christou và cs, (1991) và được cải tiến bởi Cao và cs, (1992); Li và cs, (1992) [8, 12, 25] Sau đó kỹ thuật này đã được áp dụng rộng rãi ở các phòng thí nghiệm chuyển gen lúa Japonica Cheng và cs (1998) đã có những cải tiến rất có ý nghĩa trong việc chuyển nhiều gen vào lúa Japonica sử dụng súng bắn gen khi sử dụng súng bắn gen tạo áp lực đẩy viên đạn được làm bằng kim loại đã được bọc plasmid mang gen thiết kế, có kích thước khoảng 1µm, với vận tốc 130m/s, xuyên qua các lớp tế bào biểu bì, đi vào tế bào bên trong và gen sẽ được biểu hiện ở đó khi hợp nhất với bộ gen của tế bào chủ Hiệu quả chuyển gen lúa thông qua phương pháp này cũng khá cao [10]

1.7 Chuyển gen thông qua vi khuẩn A.tumefaciens

Phạm Thu Hằng và cộng sự đã đã tiến hành thiết kế cấu trúc biểu hiện gen

J02(Oryza sativa L japonica) thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens Sự có

mặt của cấu trúc biểu hiện gen trong cây chuyển gen được kiểm tra bằng PCR với các cặp mồi đặc hiệu Nhóm tác giả đã thu được các dòng lúa chuyển gen T0 có

mang cấu trúc biểu hiện gen OsNAC1 Kết quả thu được là tiền đề cho việc nghiên cứu chức năng gen OsNAC1 ở lúa, từ đó hướng tới tạo ra các giống cây trồng chuyển gen OsNAC1 có khả năng chống chịu tốt với điều kiện hạn của môi trường

Nhóm tác giả Hoàng Thị Giang và cộng sự (2015) [5] tại Viện Di truyền Nông nghiệp Việt Nam đã cải tiến thành công quy trình chuyển gen vào giống lúa Taichung 65 thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens với hiệu suất chuyển gen cao Kết quả thí nghiệm cho thấy sử dụng đĩa petri có gờ cao 15mm và phơi mẫu không chỉ làm tăng tỷ lệ tạo mô sẹo từ phôi mà còn tăng kích thước và chất lượng

mô sẹo dùng cho quá trình chuyển gen Dịch khuẩn với mật độ OD600nm = 0,1 là tối

ưu với tần số biểu hiện gen GUS ở mô sẹo cao (81,25%) và tỷ lệ mẫu nhiễm thấp Ở giai đoạn chọn lọc sau lây nhiễm, mô sẹo phát triển tốt hơn khi tiến hành phơi mẫu

và sử dụng đĩa petri có gờ cao 15mm Phân tích sự có mặt của promoter R4 cho thấy

tỷ lệ cây tái sinh mang cấu trúc gen biến nạp cao (90,24%) Đánh giá sự biểu hiện của gen GUS ở cây lúa chuyển gen đã chứng tỏ sự hoạt động mạnh của promoter R4, điều khiển quá trình phiên mã, dẫn tới tổng hợp enzym GUS Kết quả phân tích cây chuyển gen ở thế hệ T1 đã chứng minh sự di truyền ổn định của gen biến nạp sang thế hệ sau [5]

Trong sự hình thành và phát triển bệnh đạo ôn ở lúa, gen MPG1 đóng vai trò quan trọng, liên quan đến tính gây bệnh được biểu hiện trong suốt quá trình hình thành vòi áp, quá trình phát triển triệu chứng và hình thành bào tử Do vậy, việc ức chế biểu hiện của gen MPG1 có thể khiến nấm đạo ôn không gây được bệnh trên lúa Trên cơ sở đó, Bộ môn CNSH Thực vật - Khoa CNSH - Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã nghiên cứu và thiết kế vector mang miRNA nhân tạo ức chế đặc hiệu sự biểu

hiện của gen MPG1 [6] Việc chuyển thành công cấu trúc miRNA này vào cây lúa sẽ tạo ra giống lúa có khả năng kháng được nhiều chủng nấm đạo ôn Trong quá trình chuyển gen vào cây lúa bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens, phôi lúa trưởng thành thường được sử dụng làm vật liệu chuyển gen do đây là vật liệu sẵn có và dễ thao tác hơn so với các loại vật liệu khác [3, 13, 21, 29, 32, 33] Tuy nhiên khả năng cảm ứng mô sẹo từ và tái sinh cây từ callus lúa không cao và bị ảnh hưởng bởi rất nhiều yếu tố như kiểu gen, thành phần môi trường, phương pháp và điều kiện nuôi

japonica cao hơn so với các giống thuộc loài phụ indica [31] Nghiên cứu này được tiến hành nhằm chọn được các giống lúa có khả năng tạo mô sẹo và tái sinh cây cao

từ vật liệu ban đầu là phôi trưởng thành trong bảy giống lúa khảo sát đang được trồng phổ biến tại Việt Nam nhằm phục vụ chuyển cấu trúc miRNA nhân tạo ức chế

đặc hiệu sự biểu hiện của gen MPG1 giúp kháng nấm đạo ôn do nấm Magnaporthe

Cây lúa (Oryza sativa L.) là một trong những cây lương thực chính của Việt

Nam Hiện nay, trên thế giới việc xác định chức năng gen ở cây lúa rất được chú

ứng dụng Bằng phương pháp nghiên cứu chức năng gen có thể khám phá ra được các gen kiểm soát những đặc điểm nông sinh học quan trọng như năng suất, chất lượng hạt, tính chống chịu strees sinh học và phi sinh học, hiệu quả sử dụng dinh dưỡng Thành công trong kỹ thuật chuyển gen lua mở đường cho các nghiên cứu theo hướng chức năng gen

Trước đây, phương pháp chuyển gen thông qua vi khuẩn A tumefaciens không

được xem là có hiệu quả với cây một lá mầm [18, 30] Nhưng trong những năm gần đây có nhiều công trình nghiên cứu báo cáo việc biến nạp gen thành công vào lúa nhờ vi khuẩn A tumefaciens Chan cs (1992) là những người đầu tiên chuyển gen vào callus lúa mặc dù khi đó không thu được cây chuyển gen Đến năm 1993, nhóm nghiên cứu này đã thu được cây lúa japonica chuyển gen đầu tiên nhờ vi khuẩn A

tumefaciens bằng cách nuôi cấy phôi non [9] Hiện nay, phương pháp biến nạp gen vào lúa nhờ vi khuẩn A tumefaciens là phương pháp được lựa chọn sử dụng hơn cả,

do số bản sao của gen biến nạp được chèn vào nhiễm sắc thể của tế bào chủ thấp, bền vững [20] Đặc biệt, phương pháp này cho hiệu quả chuyển gen cao, khả năng

trình nghiên cứu đánh dấu bước tiến bộ quan trọng trong kỹ thuật chuyển gen lúa sử dụng A tumefaciens là công trình của Hiei cs (1994) [19] Nhóm nghiên cứu này đã

như Tsukinohikari, Asanohikari và Koshihikari Từ đó, kỹ thuật này được áp dụng rộng rãi và cải tiến ở nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới Giống lúa Taichung 65 được xem là giống mô hình đóng vai trò quan trọng trong nghiên cứu về di truyền ở cây lúa Cho đến nay đã có nhiều thể đột biến phục vụ nghiên cứu được phát triển trên nền di truyền của Taichung 65 như: các thể đột biến phôi nhỏ re (Hong cs.,

1995) [21], các thể đột biến phôi lớn ge (Hong cs., 1995), các thể đột biến không có

chồi shl (Satoh cs., 1999) [28]; các thể đột biến không có rễ bên lrt, một số thể đột biến không có rễ bất định crl (Inukai cs., 2005) [23], thể đột biến không có rễ mầm

ral (Enrico cs., 2003) [15], Do các thể đột biến này đều có chung nền di truyền với

giống lúa Taichung 65, nên việc xây dựng một quy trình chuyển gen hiệu quả áp

thể đột biến này, góp phần thúc đẩy quá trình nghiên cứu cơbản và ứng dụng ở lúa Trong nghiên cứu biến nạp gen vào Taichung 65 từ callus phôi hóa, nhóm nghiên

đạt được tỷ lệ chuyển gen là 4,6% Mới đây, Chopita cs (2014) [11] đã công bố nghiên cứu về chức năng của gen OSB2 liên quan đến sự điều hòa sinh tổng hợp anthocyanin ở cây lúa bằng cách gây siêu biểu hiện gen OSB2 trong giống Taichung

65 Nhóm nghiên cứu cũng đã áp dụng phương pháp biến nạp thông qua vi khuẩn A

trường dinh dưỡng có bổ sung hygromycin với lượng tăng từ 15 - 30 mg/l, cho tỷ lệ mẫu callus biểu hiện gen GUS 7,59%

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Vật liệu nghiên cứu là hạt chín của 4 giống lúa thuần được trồng phổ biến ở các tỉnh miền núi phía Bắc

Bảng 2.1 Danh mục giống nghiên cứu

2.1.2 Vật liệu sử dụng và phạm vi nghiên cứu

- Kháng sinh: Rifamycin, spectomycin, cefotaxim, vancomycin, ticarcillin,

- Hóa chất khác: Yeast tract, pepton, NaCl, agarose, sucrose,

Các thiết bị thí nghiệm chính dùng cho nghiên cứu bao gồm: Cân điện tử (Olhous- Vietlabcu) (Mỹ), nồi hấp khử trùng ALP (Nhật Bản), tủ sấy Memmert (Đức), tủ cấy vô trùng cấp II Airtech (Hàn Quốc), máy chuẩn pH Hanna HI2210 (Đức), tủ nuôi lắc LSI (Hàn Quốc), lò vi sóng Sanyo (Nhật Bản), tủ lạnh Sanyo (Nhật bản), micropipette,

Nos ployA LacZ 35S gus

35S bar

Chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens: AGL1, EHA105, GV3101, LBA4404 Vector chuyển gen pCAMBIA3301 mang gen chỉ thị GUS được cung cấp bởi phòng thí nghiệm Sinh học phân tử, Khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ

Hình 2.1 T- DNA của plasmid pCambia3301 mang gen bar và gen gus, mỗi gen điều kiển bởi CaMV 35S promoter (LB: ranh giới trái, RB: ranh giới phải)

Vector pCambia 3301 (hình 3.1) mang gen chọn lọc thực vật là gen bar, gen chọn lọc vi khuẩn là gen kháng kanamycin(r), gen chỉ thị là gen gusA và gen này

được chia thành 2 exon là gus first exon và gusA second exon phân cách nhau bởi

đoạn Intron Catalase, đoạn kết thúc chuỗi là NOS polyA, vị trí đa điểm là

được quy định bởi trình tự CaMV35S polyA

Nghiên cứu tái sinh in vitro và xây dựng quy trình chuyển gen ở một số giống lúa

2.1.3 Thiết bị sử dụng

- Tủ cấy vô trùng, nồi hấp vô trùng, cân phân tích, tủ sấy, máy đo pH và… một

số trang thiết bị khác tại Khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm, trường Đại học Nông Lâm –Đại học Thái Nguyên

- Địa điểm: Thí nghiệm được tiến hành tại phòng thí nghiệm Sinh học phân tử, phòng nuôi cấy mô tế bào thực vật Khoa Công nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm trường Đại học Nông Lâm – Đại học Thái Nguyên

- Thời gian tiến hành: Thí nghiệm được tiến hành từ tháng 1/2019 đến tháng 5/2019

2.3 N ội dung và phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Nội dung 1: Nghiên cứu khả năng tái sinh in vitro của một số giống lúa

 Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian khử trùng NaOCl đến hiệu

quả vô trùng mẫu nuôi cấy

công thức nhắc lại 3 lần và mỗi công thức 100 mẫu

Các chỉ tiêu theo dõi như sau: Tỷ lệ mẫu nhiễm, tỷ lệ mẫu sống, tỷ lệ

 Thí nghiệm 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến khả năng

tạo mô sẹo của một số giống lúa

Hạt sau khi khử trùng bằng NaClo được nuôi cấy tạo mô sẹo trên môi trường bổ sung 2,4-D trên nền môi trường MS và N6 + 30g đường/l + 7g agar/l, pH 5,6 Các thí nghiệm được bố trí theo công thức sau:

Thí nghiệm được bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn, có 2 công thức, mỗi công thức nhắc lại 3 lần, mỗi lần 100 mẫu

Chỉ tiêu theo dõi: tỷ lệ mô sẹo tạo thành, màu sắc mô sẹo và chất lượng mô sẹo

 Thí nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ 2,4-D đến khả năng tạo mô

Để xác định nồng độ 2,4-D thích hợp cho tạo mô sẹo ở lúa, tiến hành thử nghiệm một số nồng độ 2,4-D dựa trên nền môi trường xác định ở Thí nghiệm 2 Các

 Thí nghiệm 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của BAP đến khả năng tái sinh chồi

Sau 28 ngày nuôi cấy mô sẹo có hình thái đồng đều trên môi trường 2,4-D được chuyển sang môi trường tái sinh chồi bổ sung BAP ở các nồng độ khác nhau theo các công thức thí nghiệm như sau: