1 MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Việt Nam có một hệ thực vật rất phong phú và đa dạng, trong đó có khoảng 20% số loài là đặc hữu Các nhà khoa học dự đoán Việt Nam có khoảng 15 000 loài thực vật, trong đó trên 10 0[.]
Trang 1MỞ ĐẦU Đặt vấn đề
Việt Nam có một hệ thực vật rất phong phú và đa dạng, trong đó có khoảng 20% số loài là đặc hữu Các nhà khoa học dự đoán Việt Nam có khoảng 15.000 loài thực vật, trong đó trên 10.000 đã được nhận biết Tuy nhiên, do nhiều nguyên nh n như chiến tranh kéo dài, khai thác lạm dụng, du canh du cư, chuyển đổi mục đích sử dụng đất đã làm diện tích và chất lượng rừng của nước ta bị suy giảm Các hệ sinh thái rừng cũng bị suy thoái nghiêm trọng Nhiều loài thực vật rừng quý hiếm đang bị khai thác, chặt hạ trái phép nên đang đứng trước nguy cơ bị đe doạ tuyệt chủng
Các loài cây họ Dầu là những loài c y rừng chiếm ưu thế và đóng một vai trò sinh thái và kinh tế quan trọng Hiện nay, có hơn 45 loài được biết đến thuộc 6 chi ở Việt Nam, chủ yếu là bản địa và đặc hữu Bởi vì giá trị thương mại và nhu cầu gỗ địa phương, các loài cây họ Dầu đang bị khai thác mạnh Hơn nữa, trong nhiều năm, áp lực tăng trưởng kinh tế đã dẫn đến một sự giảm lớn trong khu vực rừng và tăng mức độ ph n mảnh rừng còn sống sót Những
xu hướng này có ảnh hưởng bất lợi đến môi trường sống của c y họ Dầu Hiện nay, 33 loài c y họ Dầu đang bị đe dọa ở mức độ toàn cầu Loài c y Dầu
song nàng (Dipterocarpus dyeri) có th n thẳng, gỗ tốt được sử dụng nhiều
trong sơn kỹ nghệ hay đóng tàu Ngoài ra, chúng còn được sử dụng như một ngu n tinh dầu có giá trị
C y Dầu song nàng ph n bố trong các khu rừng nhiệt đới vùng đất thấp Ở Việt Nam, do sự giảm của môi trường sống và khai thác quá mức dẫn đến loài câynày đã được liệt kê là bị đe dọa Theo sách đỏ Việt Nam năm
2007 Dầu song nàng được xếp vào bậc VU A1c,d + 2c, d; vì vậy rất cần những nghiên cứu bảo t n phát triển loài c y này Vì vậy đề tài này nghiên cứu tập trung đánh giá hiện trạng quần thể, mức độ đa dạng di truyền của ba
Trang 2quần thể Dầu song nàng tại rừng nhiệt đới Đông Nam Bộ bằng kỹ thuật SSR góp phần cho các nhà quản lý đƣa ra các giải pháp bảo t n, phục h i và phát triển bền vững
Mục tiêu, nội dung, ý nghĩa khoa học và thực tiễn đề tài
- Mục tiêu đề tài:
Xác định đƣợc sự đa dạng di truyền và thụ phấn chéo của loài Dầu song
nàng (Dipterocarpus dyeri) ở rừng nhiệt đới Đông Nam Bộ
- Nội dung nghiên cứu:
Ph n tích đa dạng di truyền loài Dầu song nàng trên cơ sở ph n tích
9 cặp m i Microsatellite (SSR)
Xác định các thông số thụ phấn chéo loài Dầu song nàng ở rừng nhiệt đới Mã Đà (Đông Nam Bộ)
- Ý nghĩa khoa học và thực tiễn:
Kết quả nghiên cứu là dẫn liệu khoa học đa dạng di truyền loài Dầu song nàng phục vụ cho công tác bảo t n và phục h i loài hữu hiệu ở Việt Nam
Trang 3Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan cây họ Dầu (Dipterocarpaceace)
Họ Dầu còn được gọi là Họ Hai cánh có danh pháp khoa học
là Dipterocarpaceae g m có 17 chi và khoảng 580 – 680 loài cây thân gỗ chủ yếu ở các rừng mưa nhiệt đới vùng đất thấp với quả hai cánh Tên gọi khoa
học của họ xuất phát từ chi điển hình là Dipterocarpus, có ngu n gốc từ tiếng
Hy Lạp (di là hai, pteron là cánh và karpos là quả, nghĩa là quả có hai cánh)
Các chi lớn nhất là Shorea (196 – 360 loài), Hopea (105 loài), Dipterocarpus (70 loài) và Vatica (60 – 65 loài) Nhiều loài chiếm ưu
thế trong các hệ sinh thái rừng, thông thường có thể cây cao tới 40–70 m, đôi
khi trên 80 m (Dryobalanops, Hopea và Shorea) Họ Dầu (Dipterocarpaceae)
g m 3 phân họ Monotoideae g m có 3 chi và 30 loài phân bố ở Châu Phi, đảo Madagascar và vùng Amazon thuộc Colombia Pakaraimoideae g m có 1
loài duy nhất là Pakaraimaea roraimae, ph n bố ở vùng cao nguyên Guiana
(Nam Mỹ) Dipterocarpoideae là ph n họ lớn nhất g m có 13 chi và 470 - 650 loài Khu vực ph n bố bao g m Seychelles, Sri Lanka, Ấn Độ, Đông Nam
Á, New Guinea, nhưng chủ yếu ở miền t y Malesia, tại đ y chúng tạo thành quần thể thống lĩnh trong các cánh rừng vùng đất thấp [1,2,18]
Ở Việt Nam theo danh lục các loài thực vật ở Việt Nam, họ Dầu (Dipterocarpaceae) g m 6 chi, 42 loài và 3 phân loài, trong đó: chi Vên vên
(Anisoptera) có 2 loài; chi Dầu (Dipterocarpus) có 11 loài và 2 phân loài; chi Kiền kiền (Hopea) có 11 loài; chi Chò chỉ (Parashorea) có 2 loài; chi Sến mủ (Shorea) có 8 loài; chi Táu (Vatica) có 8 loài và 1 phân loài Theo Nguyễn
Hoàng Nghĩa (2005), Việt Nam có 42 loài và 1 phân loài thuộc họ Dầu
(Dipterocarpaceae), trong đó: chi Vên vên (Anisoptera) có 1 loài Hai loài
Vên vên trong danh lục thực vật Việt Nam gộp lại thành 1 loài là Vên vên
Trang 4(A costata); chi Dầu (Dipterocarpus) có 12 loài, bổ sung loài Dầu cát (D condorensis) so với Danh lục thực vật Việt Nam; chi Kiền kiền (Hopea) có
11 loài trong đó không nhắc đến loài Sao xanh (H helferi) như trong Danh
lục thực vật Việt Nam và bổ sung thêm một loài chưa định danh chính xác
là Sao đá (Hopea sp.); chi Chò chỉ (Parashorea) có 2 loài; chi Sến mủ (Shorea) có 8 loài và chi Táu (Vatica) có 8 loài với 1 phân loài Theo tác giả, các loài Sao đá (Hopea sp.), Dầu cát (D condorensis) được ghi nhận thực sự t n tại ở Việt Nam trong khi các loài khác là Sao xanh (H helferi), Kiền kiền nhẵn (A scaphula) không chắc chắn t n tại ở Việt Nam [1,2]
Về thực trạng của họ Dầu, có 23 loài được ghi nhận mức bị đe dọa theo IUCN (2001), trong đó 2 loài rất nguy cấp (CR) có 3 loài nguy cấp (EN) và 18 loài đang bị đe dọa (VU) Theo Sách đỏ Việt Nam (2007), có
11 loài được xếp hạng đe dọa, trong đó có 1 loài rất nguy cấp (CR), 5 loài nguy cấp (EN) và 5 loài đang bị đe dọa (VU) [1,2,3]
Về sự phân bố, theo Nguyễn Hoàng Nghĩa (2005), các loài họ Dầu (Dipterocarpaceae) phân bố trong các sinh cảnh rừng khô cây họ Dầu, rừng mưa mùa thường xanh hoặc nửa rụng lá, rừng kín mưa mùa thường xanh
ẩm [6]
Các loài họ Dầu (Diptercarpaceae) là những loài cây gỗ có giá trị kinh
tế cao bởi thân thẳng, gỗ tốt và chiếm lĩnh các sinh cảnh tốt Khoảng giữa những năm 80 của thế kỷ trước, chúng chiếm đến 25% thị phần thương mại
gỗ cứng của thế giới, trong đó hơn 80% là Shorea Bên cạnh đó, nhựa và các
hợp chất của câu họ Dầu cũng có giá trị cao như resin, oleoresin, lac hoặc chiết xuất các chất béo có bơ từ quả [14]
Theo Viện Điều tra quy hoạch rừng (1995), năm 1959 diện tích các loại rừng có cây họ Dầu ở Đông Nam Bộ là 1146 275 ha (chiếm 49% diện tích toàn vùng) Đến năm 1968 giảm xuống còn 834 050 ha (chiếm 36% diện tích
Trang 5khu vực), năm 1982 giảm còn 416 900 ha (bằng 18% diện tích) và năm 1992 chỉ còn 183 081 ha (8%) Rõ ràng là việc bảo t n các loài cây họ Dầu ở nước
ta đã trở nên cấp thiết hơn bao giờ hết, nó góp phần vào việc bảo t n ngu n gen cây rừng đang có nguy cơ tuyệt chủng ở nước ta
1.2 Cây Dầu song nàng
Dầu song nàng (Dipterocarpus dyeri Pierre) là cây thuộc họ Dầu có
kích thước lớn nhất, phân bố ở các tỉnh phía Nam Gỗ cứng, khá nặng (tỷ trọng 0.8) có giác lõi phân biệt; lõi màu đỏ n u, được dùng để đóng tài hoặc chế tạo đ gỗ C y cũng cho loại nhựa như Dầu rái, dùng trong kỹ nghệ sơn hay đóng tàu Hiện nay, nơi cư trú của c y đang bị tàn phá và thu hẹp, cây bị khai thác mạnh, có xu hướng bị tiêu diệt ở từng vùng lớn, được phân loại vào nhóm VU A1c,d + 2c,d Vì vậy, việc nghiên cứu và bảo t n ngu n gen của loài này rất cần thiết [2]
Trong tự nhiên, hạt Dầu song nàng chỉ nảy mầm khi đất đủ ẩm nhờ có mưa lớn Nếu không gặp mưa, chúng sẽ mất sức nảy mầm nhanh chóng sau 1 – 2 tuần kể từ khi rụng xuống đất Hạt Dầu song nàng chỉ nảy mầm trong bóng râm, không nảy mầm trên nền đất trống có nhiều ánh sáng và khô hạn Ngoài ra, Dầu song nàng có khả năng sinh sản mạnh bằng ch i gốc, nhưng chỉ bắt gặp ở những gốc chặt có D0 < 20 cm, sinh sản tốt nhất trên những gốc chặt có đường kính từ 3 – 7 cm và chiều cao dưới 20 cm Gốc chặt có khả năng sinh ch i nhiều lần Điều kiện đất ẩm mát dưới tán rừng có độ tàn che 0,5 – 0,6 hoặc môi trường trong các lỗ trống là tối ưu cho tái sinh ch i của dầu song nàng Cây ch i thường hình thành dưới tán rừng sau khi khai thác hoặc dưới tán cây mẹ bị đổ gẫy do gió hay chết tự nhiên
Ngoài ra, theo Lê Văn Long (2016) nghiên cứu về đặc điểm sinh học cũng như ưu hợp của Dầu song nàng trên 6 ô tiêu chuẩn, số loài cây gỗ bắt gặp trong những ưu hợp Dầu song nàng trên đất xám (43 loài) thấp hơn so với
Trang 6ưu hợp Dầu song nàng trên đất n u đỏ (49 loài) Những loài cây gỗ ưu thế và
đ ng ưu thế đối với ưu hợp Dầu song nàng trên đất xám và đất n u đỏ biến động động từ 6 – 9 loài Mật độ của ưu hợp Dầu song nàng trên đất n u đỏ (660 cây/ha) còn ở đất xám (616 cây/ha) Những ưu hợp Dầu song nàng có khả năng tái sinh tự nhiên khá tốt dưới tán rừng, quá trình tái sinh diễn ra liên tục theo thời gian, phần lớn cây tái sinh có ngu n gốc hạt và có chất lượng tốt Cây tái sinh Dầu song nàng phân bố trên mặt đất theo dạng phân bố cụm [16]
1.3 Đánh giá đa dạng di truyền bằng sinh học phân tử
1.3.1 Quần thể và tính đa dạng di truyền của quần thể
Quần thể là tập hợp một nhóm cá thể của một loài, sống trong cùng một không gian nhất định, có khả năng sinh sản để tạo ra cơ thể mới hữu thụ Quần thể là đơn vị tiến hóa của loài trong tự nhiên Các quần thể khác nhau của cùng một loài được đặc trưng bởi mật độ cá thể, kiểu ph n bố và đặc biệt
là kích thước của quần thể
Kích thước quần thể là số lượng cá thể của quần thể Trong đó, kích thước tối thiểu là số lượng cá thể ít nhất mà quần thể cần có để duy trì và phát triển, kích thước tối đa là giới hạn cuối cùng mà quần thể có thể đạt được để phù hợp với khả năng cung cấp ngu n sống của môi trường Kích thước của quần thể phụ thuộc vào mức sinh sản, mức tử vong và sự phát tán của cá thể trong quần thể Trong tự nhiên, quần thể của các loài luôn có xu hướng tự điều chỉnh số lượng cá thể để duy trì trạng thái ổn định và phù hợp với môi trường
Tác động của con người đến môi trường sống thường dẫn đến sự phá
vỡ cấu trúc quần thể và thiết lập những quần thể có kích thước nhỏ, cô lập Nếu trạng thái này t n tại trong khoảng thời gian dài có thể ảnh hửng đến sự sinh trưởng và sinh sản của quần thể, cuối cùng làm suy giảm khả năng thích nghi của quần thể với môi trường sống của chúng
Đa dạng sinh học là thuật ngữ thể hiện tính đa dạng của các thể sống,
Trang 7loài và quần thể, tính biến động di truyền giữa chúng và tất cả sự tập hợp phức tạp của chúng thành các quần xã và hệ sinh thái Đa dạng sinh học là kết quả của quá trình tiến hoá tự nhiên trải qua hàng triệu năm, bao g m cả 3 mức
độ hệ sinh thái, loài và di truyền
Đa dạng di truyền thể hiện đa dạng về ngu n gen và genotype của mỗi loài Đa dạng di truyền cho phép cá thể và loài thích nghi được với những biến đổi bất lợi của môi trường sống và có khả năng tự phục h i trong môi trường sống của chúng Như vậy, đa dạng di truyền được đề cập đến như là mức độ đa hình di truyền của mỗi cá thể trong suốt thời gian sống của nó, hoặc được phản ánh bởi số alen của quần thể tại một địa điểm và thời gian cụ thể hoặc số allele của một loài trong một phạm vi ph n bố địa lý và lịch sử t n tại của nó
Nơi sống của mỗi loài được thiết lập trong quá trình hình thành loài
Ph n cắt xảy ra khi nơi sống bị chia nhỏ và bị cô lập với nhau bằng ma trận các cảnh quan khác không giống ban đầu và không phù hợp cho sự t n tại của loài Như vậy, ph n cắt tạo nên sự phá vỡ nơi sống Tác nh n g y ra ph n cắt bao g m mở rộng đất nông nghiệp, khai thác không hợp lý tài nguyên sinh vật, x y dựng khu d n cư và khai thác khoáng sản Ph n cắt đe doạ đến tính thống nhất sinh thái đã được hình thành trong lịch sử phát triển loài và là một trong những nguyên nh n g y ra sự tuyệt chủng
Suy giảm diện tích nơi sống ảnh hưởng đến kích thước quần thể và
ph n bố lại các mảnh nơi sống còn lại sẽ ảnh hưởng đến sự phát tán của loài Hậu quả của quá trình ph n cắt thường làm suy giảm chức năng hệ sinh thái
và cuối cùng mất nơi sống Các quần thể nhỏ và bị cô lập trong các mảnh nơi sống còn lại dễ bị tổn thương và ít có khả năng thích nghi khi điều kiện môi trường sống của chúng bị thay đổi Tất nhiên, hậu quả sẽ dẫn đến mất tính đa dạng di truyền ở cả 2 mức độ quần thể và loài và cuối cùng nhiều loài bị đe
Trang 8dọa tuyệt chủng
Một trong những hậu quả của quần thể nhỏ và cô lập là xuất hiện mối quan hệ cận noãn giữa các cá thể trong quần thể Ảnh hưởng này có thể làm mất tính đa dạng di truyền nếu tần số và cường độ quan hệ cận noãn cao và cuối cùng giảm khả năng thích nghi của quần thể trong điều kiện môi trường biến đổi và tăng khả năng nhạy cảm đối với dịch bệnh
1.3.2 Một số kỹ thuật trong nghiên cứu đa dạng di truyền và tiến hóa phân tử
Bảo t n và quản lý của một loài đòi hỏi thông tin về sự đặc điểm sinh thái và đa dạng di truyền trong và giữa các quần thể Để có được thông tin đó, đặc biệt là một sự hiểu biết tốt hơn về các quá trình di truyền, kỹ thuật sinh học được yêu cầu Tiềm năng tiến hóa của loài phụ thuộc vào mức độ khác nhau di truyền của nó Hiểu biết về đa dạng di truyền sẽ cung cấp những thông tin hữu ích để xây dựng chiến lược bảo t n và sử dụng loài một cách bền vững Đối với loài thực vật, thụ phấn chéo duy trì tiềm năng lớn cho quá trình trao đổi di truyền sẽ duy trì mức độ cao của đa dạng di truyền trong quần thể và loài [28],[29]
Trong vài thập kỷ qua, các kỹ thuật sinh học phân tử đã có sự phát triển mạnh mẽ, tạo ra công cụ hữu hiệu cho con người nghiên cứu sự sống ở cấp độ phân tử, các kỹ thuật sinh học phân tử cũng nhanh chóng được ứng dụng trong nghiên cứu và bảo t n đa dạng sinh học, tạo ra lĩnh vực khoa học mới như tiến hóa phân tử, di truyền bảo t n Để nghiên cứu đa dạng di truyền quẩn thể và loài thực vật, ngoài kỹ thuật isozym, còn có kỹ thuật ADN với các phương pháp như RAPD, SSR, ISSR, AFLP, RFLP,
Kỹ thuật RAPD
RAPD (Random Amplified Polymorphism DNA – đa hình các đoạn
ADN được khuếch đại ngẫu nhiên) do William phát minh năm 1990, Welsh
và cộng sự hoàn thiện năm 1991 (Watson và Barker, 2004) Phương pháp này
Trang 9sử dụng cùng một số m i ngẫu nhiên (m i ngẫu nhiên là các đoạn oligo nucleotide g m khoảng 8 đến 20 Nucleotide) để thực hiện phản ứng PCR nhằm nh n các đoạn ADN đặc trưng của các mẫu nghiên cứu Nếu các mẫu nghiên cứu có bộ gen giống nhau hoàn toàn, sản phẩm PCR thu được g m các đoạn ADN hoàn toàn giống nhau về kích thước và cấu trúc Khi bộ gen của các mẫu nghiên cứu có sự khác biệt nhau, kết quả PCR sẽ nh n được các đoạn khác biệt nhau [5,18,28]
*Ưu điểm của kỹ thuật RAPD
Về mặt kỹ thuật, kỹ thuật RAPD dễ thực hiện và dễ thành công do không cần biết trước trình tự bộ gen của đối tượng cần nghiên cứu, thao tác đơn giản, chất lượng ADN khuôn không cần độ tinh sạch quá cao, thời gian thực hiện nhanh, khả năng nh n bản cao
Về mặt kinh tế, chi phí thực hiện cho kỹ thuật này thấp Trong nghiên cứu, kỹ thuật RAPD thường được sử dụng kết hợp với những kỹ thuật cao cấp khác để đánh giá đa dạng di truyền và nhận diện chỉ thị ph n tử có độ tin cậy cao [4]
* Những hạn chế của kỹ thuật RAPD
Kỹ thuật RAPD có độ chính xác không cao, không ổn định (thể hiện ở mức độ lặp lại giống nhau thấp) Khả năng nh n bản trong phản ứng PCR cao nhưng khả năng xuất hiện đa hình thấp và độ tin cậy không cao
Kỹ thuật RFLP
RFLP (Restriction fragment length Polymorphism – đa hình chiều dài
các đoạn ADN cắt bởi các enzyme giới hạn) Kỹ thuật này dựa trên đặc điểm của các enzyme giới hạn khác nhau, tạo nên các đoạn cắt ADN khác nhau phân biệt được bằng điện di đ , các đoạn cắt còn được gọi là các “dấu vân
Trang 10tay” đặc trưng cho từng phân tử ADN Bản đ di truyền kết quả RFLP có tính chính xác cao, thường được sử dụng trong nghiên cứu sự khác biệt trong cấu trúc bộ gene của các cá thể, các loài sinh vật, nhằm so sánh sự khác biệt giữa các mẫu nghiên cứu, xác định ngu n gốc hoặc mức độ tiến hóa giữa của các loài sinh vật [5,18]
Kỹ thuật này được dùng phổ biến từ đầu thập niên 80 đến nay Kỹ thuật RFLP được sử dụng để kiểm tra sự phân ly di truyền của một số tính trạng theo qui luật Mendel, hoặc ứng dụng trong chọn giống động vật, chọn giống thực vật hoặc so sánh sự khác nhau giữa các cá thể, các loài sinh vật Kỹ thuật RFLP được thực hiện trên nguyên lý cắt enzyme giới hạn DNA của mẫu nghiên cứu sau khi được tách chiết và tinh sạch sẽ được cắt với cùng 1 số loại enzyme giới hạn Mỗi enzyme giới hạn sẽ nhận biết và cắt đặc hiệu DNA
ở những vị trí xác định, do đó các bộ gen có cấu trúc khác nhau sẽ cho ra số lượng và kích thước các đoạn cắt ADN khác nhau, những bộ gen giống nhau thì sẽ cho ra số lượng, kích thước các đoạn cắt giống nhau, kích thước vá số lượng các đoạn cắt này sẽ quan sát được trên điện di đ
Kỹ thuật SSR
Chỉ thị SSR (simple sequence repeat) hay còn gọi là vi vệ tinh
(Microsatellite), là những đoạn trình tự DNA đơn giản lặp lại nối tiếp và chỉ
g m 1 – 6bp Hiện tượng các SSR trong cơ thể sinh vật nh n chuẩn là khá phổ biến ở động vật và thực vật Tuy nhiên, tùy từng loài mà số lượng các nucleotide trong mỗi đơn vị lặp lại có thể thay đổi từ một đến hàng chục và số lượng đơn vị lặp lại có thể biến động từ hai đến hàng chục lần hoặc nhiều
hơn Thông thường có các kiểu lặp lại:
- Lặp lại hoàn toàn: các đơn vị lặp lại sắp xếp nối tiếp nhau
- Lặp lại không hoàn toàn: xen kẽ vào các đơn vị lặp lại là một hoặc một số nucleotide khác
Trang 11- Lặp lại phức tạp: xen kẽ giữa các đơn vị lặp lại khác nhau
Thông thường, các SSR có mặt chủ yếu ở các vùng dị nhiễm sắc của nhiễm sắc thể như vùng t m động hoặc các đầu mút, chúng giữ vai trò quan trọng trong việc điều hòa phiên mã đối với các gen hoạt động ở vùng nguyên nhiễm sắc, góp phần làm tăng tính ổn định cơ học của nhiễm sắc thể trong các quá trình ph n bào và có thể chứa đựng những thông tin di truyền liên quan đến sự xác định giới tính ở cả động vật và thực vật
Phương pháp xác định đa hình SSR là nhờ sự nh n bội từ DNA tổng số của hệ gen nhờ sử dụng hai đoạn m i bổ trợ với trình tự gần kề hai đầu của vùng lặp lại Sự khác nhau về độ dài ở locus SSR được phát hiện bởi sự nh n đoạn DNA nhờ phản ứng PCR Kích thước sản phẩm PCR được xác định một cách chính xác bằng điện di trên gel agarose hoặc gel polyacrylamide với sự khác nhau về độ dài có thể rất nhỏ (2bp) Chỉ thị SSR dùng để đánh giá đa dạng di truyền, xác định mối quan hệ di truyền của c y tr ng, chọn lọc tính kháng bệnh, một số tính trạng có quan hệ chặt chẽ đến năng suất, lập bản đ , nghiên cứu locus tính trạng số lượng
Thuận lợi to lớn của ph n tích SSR là phương pháp này biểu hiện số lượng lớn sự đa hình Hơn nữa, khả năng ph n biệt các cá thể khi có sự kết hợp các locus được kiểm tra làm cho phương pháp này rất hữu dụng trong các thí nghiệm ph n tích mối quan hệ di truyền SSR là marker đ ng trội, do đó,
dị hợp tử có thể dễ dàng được xác định trong quá trình thực nghiệm tính đ ng trội của SSR sẽ gia tăng sự hiệu quả và độ chính xác của những phép toán di truyền quần thể dựa trên những marker này so với những marker khác như RAPD và AFLP Hơn nữa, việc xác định dị hợp tử ở thế hệ F1 sẽ làm cho những ph n tích phả hệ, sự lai giống, dòng gen trở nên dễ dàng hơn Hạn chế của chỉ thị này là quá trình thiết kế primer chi phí cao liên quan đến trình tự
m i chính xác cho loài quan t m không hề có sẵn
Trang 121.4 Các nghiên cứu đa dạng di truyền họ Dầu
1.4.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới
Để bảo t n và quản lý các loài cây Dầu, các thông tin về đặc điểm sinh thái và đa dạng di truyền ở cả 2 mức độ quần thể và loài là cần thiết, và đóng vai trò quan trọng góp phần đưa ra các giải pháp bảo t n một cách phù hợp Nghiên cứu ảnh hưởng của khai thác chọn dẫn đến mật độ thấp trong tự nhiên
đã làm tăng khả năng thụ phấn cận noãn của nhiều loài cây Dầu như Shorea megistophylla ở Sri Lanka (Murawski et al., 1994), Drybalanops aromatica (Lee, 2000), Shorea curtisii và Dryobalanops aromatica (Wickneswari et al., 2004), Neobalanocarpus heimii (Naito et al., 2005; 2008), Shorea leprosula (Fukue et al., 2007) và S curtisii (Obayashi et al., 2002) ở rừng nhiệt đới Malaysia Số lượng quả của loài S siamensis được sản sinh ở nơi sống bị tác động mạnh thấp hơn ở nơi ít bị tác động (Ghazhoul et al., 1998) Kitamura et
al (1994) đã đề cập đến mức độ thụ phấn chéo là cao (82%) của loài Dryobalanops aromatica ở Brunei Năm 2006, Lee và cộng sự đã nghiên cứu
và phối hợp thống kê các thông số hệ thống trong rừng rậm nhiệt đới của loài
Shorea leprosula Miq (Dipterocarpaceae) từ rừng nhiệt đới thấp Malaysia Cung cấp các đặc điểm sinh học đặc trưng của loài Shorea leprosula Miq
(Dipterocarpaceae) tại rừng nhiệt đới Malaysia
Cui-Ping Cao và cộng sự năm 2009 đã nghiên cứu biến đổi di truyền
trong chín loài Shorea (Dipterocarpaceae) ở Indonesia bằng chỉ thị AFLP
Công trình nghiên cứu 274 cây với 84 locus AFLP đa hình tại 2 địa điểm khác nhau Từ kết quả nghiên cứu độ đa dạng di truyền cho thấy sự khác biệt tần số cao giữa cac loài và giữa các vùng trong các loài Thông tin trình tự của các dấu hiệu này có khả năng sử dụng để phát triển các dấu hiệu phản ứng chuỗi polymerase cụ thể để xác định danh tính loài [37]
Yoshihiko Tsumura và cộng sự năm 2011 đã nghiên cứu cơ sở dữ liệu
Trang 13phân tử để phân loại các loài Shorea (Dipterocarpaceae) và các kỹ thuật kiểm
tra danh tính hợp pháp của các loài gỗ Từ đó hình thành cơ sở dữ liệu DNA
lục lạp và hình thái giải phẫu để phân loại loài Shorea (Dipterocarpaceae) ở
trong cac khu rừng ở Đông Nam Á Tuy nhiên phương pháp ph n tích DNA
từ gỗ vẫn cần được nghiên cứu để hoàn thiện hơn đặc biệt đối với các mẫu gỗ dán [38]
Sự phân cắt nơi sống ảnh hưởng đến khả năng thụ phấn của một số loài
cây Dầu đã được phân tích cho loài Vateriopsis seychellarum (Finger etal., 2012), Shorea javanica ở Sumatra (Rachmat et al., 2012) và Vateria indica ở
Ấn Độ (Ismail et al., 2014)
Cùng năm 2016, Cheng choon Ang và cộng sự đã tiến hành đánh giá đa
dạng di truyền của 02 loài Shorea leprosula và Parashorea malaanonansau
khi khai thác và phục h i tại Borneo Các mẫu được lấy từ mô lá non và sử dụng các Marker microsatellite Từ đó đánh giá mức độ đa dạng di truyền giữa các cây giống họ Dầu được sử dụng để làm giàu cho các khu rừng được khai thác chọn lọc ở Sabah, Malaysia và so sánh nó với sự đa dạng trong cây tái
sinh tự nhiên.Cây giống được tr ng của P malaanonan thể hiện mức độ đa dạng di truyền tương tự như c y con tái sinh tự nhiên trong khi những cây S leprosula có sự đa dạng di truyền thấp hơn đáng kể so với cây con tự nhiên [39]
Các tác giả đã chỉ ra rằng suy giảm tính đa dạng di truyền xảy ra liên quan đến số lượng cá thể thấp trong quần thể tại thời gian nơi sống bị suy giảm Hệ số thụ phấn cận noãn cao cũng là yếu tố làm suy giảm tính đa dạng
di truyền Suy giảm (phân cắt nơi sống và số lượng cá thể thấp) có thể hạn chế mức độ trao đổi di truyền giữa các quần thể bị cô lập và làm tăng mức độ di truyền khác nhau giữa chúng [33]
Trang 141.4.2 Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam
Đinh Xu n Lý (1993) đã nghiên cứu các biện pháp kỹ thuật tạo cây con
Dầu rái (Dipterocarpus alatus Roxb) phục vụ tr ng rừng gỗ lớn, gỗ lạng ở
các tỉnh phía Nam Trong nghiên cứu này tác giả đã chỉ ra khả năng tái sinh trong tự nhiên thấp cũng nhƣ các đặc tính sinh học của cây Dầu rái (hình thái, sinh lý); cũng nhƣ đƣa ra kết quả sự tái sinh của loài cây này trên các nguyên liệu ruột bầu khác nhau [17]
Các công trình khác nghiên cứu về giá trị của các loài c y gỗ của Trần Hợp và Nguyễn Bội Quỳnh (1993) đề cập đến giá trị của các loài c y gỗ và các loài c y trong họ Dầu ở Việt Nam Trong nghiên cứu này, các tác giả mô
tả đặc điểm hình thái các loài c y trong các chi thuộc họ Sao - Dầu, khu ph n
bố và công dụng của chúng, đ ng thời kết luận ở Việt Nam họ Dầu có sáu chi
bao g m: Chi Vên vên (Anisoptera) có 1 loài; chi Dầu (Dipterocarpus) có khoảng 12 loài; chi Sao (Hopea) có khoảng 9 loài; chi Chò chỉ (Parashorea)
có 2 loài; chi Sến (Shorea) có khoảng 8 loài; chi Táu (Vatica) có 8 loài [9]
Năm 2005, Nguyễn Thúy Hạnh và cộng sự nghiên cứu mẫu lá của 12
loài thuộc chi Dipterocarpus bao g m: D alatus Roxb.- Dầu rái, D baudii Korth - Dầu bao, D chartaceus Sym - Dầu cát, D costatus Gaertn - Dầu mít,
D dyeri Pierre - Dầu song nàng, D gandiflorus Blco - Dầu đọt tím, D intricatus Dyer- Dầu lông, D obtusifolius Teysm - Dầu trà beng, D tuberculatus Roxb.ssp grandifolius Craib - Dầu đ ng, D turbinatus Gaertn.- Dầu lá bóng, D hasseltii Bl - Dầu Haselt, D tonkinensis Chev.- Chò n u sử
dụng chỉ thị RAPD để ph n tích đa dạng di truyền Kết quả cho thấy xét về đa
hình các loài c y thuộc chi Dipterocarpus cho thấy: tất cảcác loài đều cho tỷ
lệ đa hình lớn hơn 64%, trong đó loài Dầu cát cho tỷ lệ băng đa hình cao nhất (83.33%), và loài Dầu đọt tím cho tỷ lệ băng đa hình thấp nhất (64,29%) Những số liệu nhận đƣợc chứng tỏcác loài c y nghiên cứu này rất khác nhau
Trang 15về mặt di truyền Trên cơ sở các hệ số tương đ ng di truyền giữa 12 loài nghiên cứu cho thấy: hai loài Dầu đọt tím và Dầu rái có quan hệ di truyền xa
so với 10 loài còn lại và có hệ số tương đ ng di truyền tương ứng là 0,18 và 0,21 10 loài còn lại này ph n thành hai nhóm: nhóm 1 g m 3 loài: Dầu mít, Dầu Haselt, Dầu song nàng có mức tương đ ng di truyền là 0,26 Nhóm 2
g m 7 loài: Dầu bao, Chò n u, Dầu cát, Dầu trà beng, Dầu lông, Dầu đ ng, Dầu lá bóng có mức tương đ ng di truyền là 0,27 Ngoài ra các loài trong hai nhóm trên đều có mức độ tương đ ng di truyền rất khác nhau và ở mức độ thấp, chỉ riêng hai loài Dầu trà beng và Dầu cát có mức độ tương đ ng di truyền cao hơn cả, tuy nhiên vẫn ở mức thấp (0,41) Những kết quả trên cho thấy 12 loài nghiên cứu có quan hệ di truyền rất xa nhau Điều này chứng tỏ
sự đa dạng di truyền cao của 12 loài thuộc chi Dipterocarpus ở Việt Nam
[12] Thành và cộng sự (2007) đã điều tra mức độ đa hình di truyền của 17 loài Dầu ở Việt Nam bằng 7 chỉ thị RAPD và 4 cặp m i lục lạp (trnD-trnT, trnH-trnK, psbC-psbS và trnM-rbcL), và chỉ ra rằng hệ số đa dạng di truyền dao động từ 0,18 đến 0,58 Thành và cộng sự (2009) đã điều tra đa dạng di
truyền của loài Sao mạng (Hopea reticulata Tardicu) bằng chỉ thị RAPD và
một số gen lục lạp và chỉ ra mức độ đa dạng di truyền thấp [8]
Quách Thị Liên và cộng sự (2009) sử dụng 5 cặp mối cpSSR và 6 cặp
m i SSR để ph n tích đa dạng di truyền 30 mẫu lá của loài Dầu nước thu được từ các xuất xứ khác nhau Kết quả thu được với 5 cặp m i cpSSR cho 7 alen đa hình trong tổng số 10 alen nhận được Với 6 cặp m i SSR cho 9 alen
đa hình trên tổng số 12 alen Một số mẫu thu được ở khác khu vực có tính đa dạng di truyền cao, một số mẫu cùng khu vực có tính đa dạng thấp [15]
Cùng năm 2010, Nguyễn Văn Hường đã nghiên cứu đặc tính sinh thái
của cây tái sinh Vên vên (Anisoptera cochinchinensis Pierre) trong kiểu rừng
thườngxanh và nửa rụng lá ẩm nhiệt đới ở Đ ng Nai Từ đó cho thấy độ
Trang 16phong phú của tái sinh Vên vên ở 2 cấp tuổi đều phụ thuộc vào trạng thái rừng, độ ẩm đất và độ tàn che tán rừng Độ ẩm đất thích hợp cho cấp tuổi 1 từ 61,8 - 82,3%, tối ưu là 73,0%; ở cấp tuổi 2 tương ứng là 62,8 - 83,9% và 73,0% Độ tàn che tán rừng thích hợp cho cấp tuổi 1 là 0,65 – 0,85, tối ưu 0,75; ở cấp tuổi 2 từ 0,63 - 0,88, tối ưu là 0,75 Độ phong phú của tái sinh Vên vên thay đổi tùy thuộc vào sự thay đổi của 2 yếu tố độ ẩm đất và độ tàn che tán rừng [13]
Nguyễn Hoàng Nghĩa (2012) đã điều tra sinh thái 4 loài cây họ Dầu là
Dầu cát (Dipterocarpus chartaceus), Sến cát (Shorea roxburghii), Chai lá cong (Shorea falcata) và Sao lá hình tim (Hopea cordata) trên vùng đất cát
ven biển Nghiên cứu này cung cấp các thông tin lâm sinh cần thiết cho công tác bảo t n do 4 loài cây họ Dầu đang rất khó phục h i trên đất sau tàn phá này [19]
Nguyễn Thị Hải H ng và cộng sự (2010) Nghiên cứu nhân giống bằng
hom Dầu rái (Dipterocarpus alatus) Loài c y này được xác định khó ra rễ đối
với những hom thu hái từ cây mẹ trưởng thành Trong nghiên cứu này với công thức xử lý 2,4D n ng độ 500ppm và IAA 100ppm (38,33% - 48,33%); hom từ cây mẹ 1 năm tuổi cho tỷ lệ rễ rất cao 82,5% và giảm đi đáng kể đối với cây mẹ từ 2 năm tuổi trở lên Thời điểm thu hái hom vào tháng 4 cho kết quả ra rễ cao nhất đ ng thời chất lượng rễ có xu hướng tỷ lệ thuận với tỷ lệ ra
rễ [10]
Trần Hữu Biển và Phan Văn Huống (2011) nghiên cứu một số đặc điểm
sinh thái và gây tr ng loài Lò Bo ( Brownlowia tablaris Pierre), Xoan Mộc (Toona surenii (Blume) Merr) và Dầu cát( Dipterocarpus condorensisAshton) Nghiên cứu về một số đặc điểm sinh thái của 3 loài cây từ
đó cho thấy phân bố lâm phần của chúng theo quy luật phân bố giảm, chứng tỏ rừng đang trong giai đoạn sinh trưởng và phát triển tốt Ngoài ra đánh giá rừng
Trang 17tr ng cho thấy khả năng sinh trưởng kém và tỷ lệ sống thấp của cây tr ng bản địa khi chúng bị tách ra khỏi trạng thái tự nhiên (Xoan mộc, s u đục ngọn ) [3]
Năm 2012 Nguyễn Thị Hải H ng và cộng sự đã tiến hành đánh giá đa
dạng di truyền dựa trên 41 mẫu lá Dầu rái (Dipterocarpus alatus Roxb.) thu
thập từ 10 tỉnh thuộc 3 vùng sinh thái l m nghiệp tại Việt Nam bằng chỉ thị RAPD với 18 m i ngẫu nhiên Kết quả cho thấy các mẫu Dầu rái có đa dạng
di truyền khá cao Hệ số tương đ ng dao động trong khoảng 43 - 100% [11]
Trần Quốc Hoàn và cộng sự (2013) nghiên cứu xác định chỉ số sinh
trưởng của c y Dầu rái (Dipterocarpus alatus) trên một số dạng lập địa ở tỉnh
Bình Phước Từ đó tính được chỉ số sinh trưởng chiều cao, đường kính của
c y Dầu rái trên các điều kiện lập địa; các mô hình (phương trình) h i quy nhiều lớp phản ánh mối liên hệ giữa chỉ số sinh trưởng của c y tr ng với các yếu tố lập địa [12]
Tô Bá Thanh và cộng sự (2014) nghiên cứu về chất lượng c y trong mô
hình rừng tr ng Sao đen (Hopea odorata) và Dầu rái (Dipterocarpus alatus)
tại khu bảo t n thiên nhiên văn hóa Đ ng Nai Kết quả nghiên cứu cho thấy: Phương pháp tr ng đã ảnh hưởng rõ rệt tới tỷ lệ sống, nhìn chung tỉ lệ sống của loài Sao đen thấp hơn loài Dầu rái nhưng sai lệch không có giá trị trong thống kê; Tỷ lệ sống của những loài này có quan hệ chặt chẽ với tuổi c y, phương thức và quy cách tr ng khác nhau thì tỷ lệ c y có phẩm chất tốt vẫn luôn nhiều hơn đáng kể so với c y trung bình và c y xấu [22]
Tam và cộng sự (2014) và Duy và cộng sự (2013) đã đánh giá mức độ
đa dạng di truyền của loài Dầu rái (Dipterocarpus alatus) ở một số tỉnh Đông
Nam Bộ trên cơ sở sử dụng 9 cặp m i microsatellite và chỉ ra mức độ đa dạng
di truyền bị ảnh hưởng bởi quá trình ph n cắt nơi sống và mật độ cá thể trong mỗi quần thể Sự trao đổi di truyền giữa các quần thể cao (>1) thường xuất hiện giữa các quần thể có khoảng cách địa lý trong cùng một khu vực (tỉnh),
Trang 18chẳng hạn giữa các quần thể ở vườn Quốc gia Cát Tiên, Mã Đà và rừng đặc dụng T n Phú thuộc tỉnh Đ ng Nai, có hệ số trao đổi di truyền lớn hơn 1; trong khi đó giữa các quần thể ở Mã Đà (Đ ng Nai), Lò Gò-Xa Mát (Tây Ninh) và Bù Gia Mập (Bình Phước), có hệ số trao đổi di truyền < 1 Kết quả
nghiên cứu về đa dạng di truyền giữa các quần thể của loài Sao đen (Hopea odorata) cũng cho kết quả tương tự (Trang et al., 2014) Nghiên cứu mối quan hệ di truyền của 11 loài Dầu thuộc chi Dầu (Dipterocarpus) sử dụng gen
lục lạp (matK) đã chỉ ra các loài trong cùng một chi có quan hệ mật thiết với nhau (Đức và cộng sự 2013) Trang và cộng sự (2014) cũng đã ph n tích đa
dạng di truyền của 3 loài dầu sao, Sao hòn gai (Hopea chinensis), Sao hải nam (H hainanensis) và Sao mặt quỷ (H mollissima) dùng 3 vùng gen rcbL, psbA-trnH và matK và chỉ ra sự khác biệt di truyền giữa 3 loài Sao là rất thấp,
từ 0,2 đến 0,6 [6,34]
Trang 19Chương 2 ĐỐI TƯỢNG, ĐỊA ĐIỂM VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Đối tượng và vật liệu nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu là loài Dầu song nàng (Dipterocarpus dyeri
Pierre) ở ba khu rừng bảo t n thuộc rừng nhiệt đới núi thấp Đông Nam Bộ, Rừng Phòng hộ T n Phú (huyện Định Quán, tỉnh Đ ng Nai), Khu Bảo t n Thiên nhiên và Văn hóa Đ ng Nai (huyện Vĩnh Cửu, Đ ng Nai) và Vườn Quốc gia Lò Gò – Xa Mát (huyện T n Biên, tỉnh T y Ninh) rừng nhiệt đới Đông Nam Bộ
Để ph n tích đa dạng di truyền loài D dyeri ở rừng nhiệt đới Đông
Nam Bộ, 73 mẫu vỏ th n của c y trưởng thành đã được thu thập Mẫu được thu thập ngẫu nhiên tại mỗi địa điểm nghiên cứu (Bảng 2.1)
Bảng 2.1 Địa điểm thu thập mẫu cho phân tích đa dạng di truyền
Trang 20Công ty mía đường La Ngà, phía Nam giáp sông La Ngà (huyện Xu n Lộc), phía Đông giáp sông La Ngà (Tỉnh Bình Thuận) và phía T y giáp Công ty mía đường La Ngà Về mặt địa hình, rừng phòng hộ T n Phú bao g m đ i núi thấp dưới 300 m, độ dốc không quá 10o Lượng mưa hằng năm khoảng 1500
mm, tập trung chủ yếu vào mùa mưa từ tháng 4 đến tháng 11, nhiệt độ trung bình năm 27,3oC với độ ẩm 78% Về thổ nhưỡng g m 5 loại đất chính như đất bazan trên vùng đ i thấp, đất bazan trên đ i núi trung bình, đất phù sa cổ trên đ i thấp đất phù sa cổ trên vùng bán bình nguyên và đất hình thành trên
sa thạch, phiến thạch vùng đ i trung bình Thảm thực vật đặt trưng bởi rừng kín thường xanh và nửa rụng lá ẩm nhiệt đới với các họ đặc trưng như họ Dầu (Dipterocarpaceae), họ Đậu (Fabaceae), họ Thầu dầu (Euphorbiaceae), họ Cơm nguội (Myrtaceae), họ Côm (Elaeocarpaceae), họ Cà phê (Rubiaceae) và
họ Dẻ (Fagaceae) Rừng phòng hộ T n Phú g m có khoảng 200 loài thực vật với 45 họ (Tài liệu của Ban quản lý rừng phòng hộ T n Phú năm 2011) Các loài c y họ Dầu (Dipterocarpaceae) thường ở tầng vượt tán bao g m Vên vên
(Anisoptera costata), Dầu rái (Dipterocarpus alatus), Dầu mít (D costatus), Sao đen (Hopea odorata), Sến mủ (Shorea roxburghii), Dầu lông (D intricatus), Dầu lá bóng (D turbinatus), Dầu song nàng (D dyeri), Táu trắng (Vatica odorata) Một số loài khác cũng có mặt ở khu vực này, như Chiêu liêu nước (Terminalia calamansanai), Sang đen (Diospyroslancaefolia), Côm
đ ng nai (Elaecarpus tectorius) Rừng này thuộc rừng phục h i sau khai thác
chọn vào những năm 1980 và 1990
Tầng vượt tán: Là tầng hình thành bởi những c y gỗ cao trên 30 m,
g m các loài c y thuộc họ Dầu (Dipterocarpaceae) như Dầu rái
(Dipterocarpus alatus), Dầu song nàng (D.dyeri), Dầu mít (D costatus), Vên vên (Anisoptera costata), Sến mủ (Shorearoxburghii), Sao đen (Hopea odorata), Táu trắng (Vatica odorata), một số loài khác như Huỳnh (Heritiera
Trang 21cochinchinensis) họ Trôm (Sterculiaceae), Vấp (Mesua ferrea) họ Bứa (Clusiaceae), Bằng lăng nước (Lagerstroemia speciosa) họ Tử vi (Lythraceae), Cẩm lai (Dalbergia bariensis), Căm xe (Xylia xylocarpa) họ
Đậu (Fabaceae) Tầng này có những c y thường xanh nhưng cũng có những
c y rụng lá trong mùa khô, là tầng không liên tục
Tầng ưu thế sinh thái: Là tầng c y gỗ cao trung bình từ 20 - 30 m thân
thẳng, tán liên tục hoặc gián đoạn phụ thuộc vào mức độ khai thác, g m nhiều
c y của nhiều họ khác nhau, đa số là các c y thường xanh như Bông gạo
(Ceiba pentandra) họ Gạo (Bombaceae), Trám lá đỏ (Canarium subulatum),
Gỗ đỏ (Afzelia xylocarpa) họ Đậu (Fabaceae), Thành ngạnh (Cratoxylon formosum) họ Bứa (Clusiaceae), Mẫn kinh (Vitex quinata) họ Cỏ roi ngựa (Verbenaceae), Chiêu liêu nghệ (Terminalia triptera) họ Bàng (Combretaceae), Côm đ ng nai (Elaeocarpus tectorius) họ Côm (Elaeocarpaceae), Kơ nia (Irvingia malayana) họ Kơ nia (Ixononthaceae), Bằng lăng (Lagerstroemia duppereana) họ Tử vi (Lythraceae), Mít nài (Artocarpus rigida) họ D u tằm (Moraceae), Vối rừng (Syzygium cumini), Trâm (Syzygium sp.) họ Cơm nguội (Myrtaceae), Sưa (Dalbergia cochinchinensis) họ Đậu (Fabaceae), Săng mã (Carallia brachata) họ Đước
(Rhizophoraceae) Tầng ưu thế sinh thái tuy không có c y gỗ to và cao như tầng vượt tán nhưng số lượng c y khá tập trung và có nhiều c y thuộc lớp kế cận cho tầng trên tham gia vào trữ lượng ổn định l u dài và liên tục của rừng
Tầng dưới tán: g m những c y mọc rải rác dưới tán rừng, có chiều cao
trên dưới 15 m, đường kính nhỏ hơn, tạo thành lớp tán không liên tục và mỏng Tổ thành loài c y trong tầng này g m những loài thuộc các họ thực vật
có giá trị kinh tế thấp như: Lành ngạnh nam (Cratoxylon cochinchinensis), Bứa (Garciniacochinchinensis) họ Bứa (Clusiaceae), Máu chó Pierre (Knema pierrei), Máu chó kính (K lenta) họ Máu chó (Myristicaceae), Trường chua
Trang 22(Pavieasia annamensis) họ B hòn (Sapindaceae), San (Aporusa tetrapleura), Giâu gia ta (Baccaurearamiflora), Sóc thon (Glochidion lanceolarium) Thầu dầu (Euphorbiaceae), Thị lá rộng (Diospyros latisepala) họ Thị (Ebenaceae),
Cò ke (Grewia paniculata) họ Đay (Tiliaceae), Xương cá (Canthium dicoccum) họ Cà phê (Rubiaceae), Săng ớt (Xanthophyllum excelsum) họ
Săng ớt (Xanthophyllaceae)
Tầng thảm cỏ cây bụi: g m những c y mọc rải rác thấp nhỏ, cao từ 2 -
8 m, thuộc các loài như Tà hay (Aidia cochinchinensis), Dành dành (Gardeniaannamensis), Găng trắng (Randia dasycarpa)họ Cà phê (Rubiaceae), Chòi mòi tía (Antidesma bunius), Chòi mòi (A ghaesembilla), Sòi tía (Sapium discolor) họ Thầu dầu (Euphorbiaceae), Bôm bà (Scolopia macrophylla) họ Mùng qu n (Flacourtiaceae), Bời lời đắng (Litsea umbrellata) họ Long não (Lauraceae), Củ rối (Leea rubra) họ Gối gạc (Leeaceae), Cọ tàu (Livistonia chinensis) họ Cau dừa (Arecaceae), B an (Colona auriculata) họ Đay (Tiliaceae) và đôi khi có Tre l ô (Schizostachyum zollongeri) họ Hòa thảo (Poaceae) mọc xen kẽ rải rác Thấp nhất g m những loài thực vật như cỏ tranh (Imperata cylindrical), cỏ may (Chrysopogon acticulatus) họ Hòa thảo (Poaceae), Sẹ (Alpinia globosa) họ Gừng (Zingiberaceae), Dương xỉ (Christella parasitica), cao không quá 2 m,
thường làm c y chỉ thị cho hoàn cảnh môi trường rừng Trong rừng còn có nhiều d y leo họ D y gối (Selastraceae) và Cơm nguội (Myrsinaceae) cùng với một số c y phụ sinh thuộc họ Phong lan (Orchidaceae), họ Đỗ quyên (Ericcaceae) và Hymenophyllaceae
2.2 Khu Bảo tồn Thiên nhiên và Văn hóa Đồng Nai
Khu Bảo t n nằm trên địa bàn xã Mã Đà (huyện Vĩnh Cửu, Đ ng Nai), nằm ở vị trí 106o54’ đến 107o13’ kinh độ Đông và 11o03’ đến 11o30’ vĩ độ Bắc Đ y là khu rừng đặc dụng có diện tích tự nhiên lớn nhất nước ta, với hệ
Trang 23sinh thái đặc trưng Đông Nam Bộ Khu rừng này được thiết lập năm 2003 với diện tích 53822 ha, trực thuộc Ủy ban nh n d n tỉnh Đ ng Nai Khu vực này
có 3 di tích lịch sử như c n cứ Trung ương cục Đông Nam bộ, căn cứ Khu ủy miền Đông Nam bộ và địa đạo Suối Linh Về thảm thực vật khu rừng này
g m các kiểu rừng kín nửa rụng lá ẩm nhiệt đới, rừng kín rụng lá hơi ẩm nhiệt đới với các loài c y họ Dầu như Dầu nước, dầu mít, dầu song nàng, dầu lông, sao đen và một số loài khác như B hòn, họ Sim và kiểu rừng kín thường xanh mưa nhiệt đới
Cấu trúc phân tầng ở Khu Bảo tồn với đặc trưng là rừng c y họ Dầu
(Dipterocarpaceae) có diện tích lớn Các loài c y họ Dầu chiếm tỷ lệ cao hoặc
có ưu thế tuyệt đối trong tổ thành loài c y như Dầu song nàng, Dầu con rái, Sao đen, Chai, Vên vên thường mọc thành cụm hoặc không liên tục, chiếm
ưu thế ở tầng vượt tán, đôi khi mọc tập trung thuần loại thường được gọi là
“lán dầu”
Bên cạnh loài cây họ Dầu còn có nhiều loài cây gỗ mọc hỗn giao đa số thuộc loài cây họ Đậu (Fabaceae) như Gõ đỏ, Gõ mật, Cẩm lai, Giáng hương và các loài c y gỗ thuộc các họ khác như họ Xoài (Anacardiaceae),
họ Dâu tằm (Moraceae), họ B hòn (Sapindaceae), họ Tử vi (Lythraceae) tạo thành rừng nhiều tầng tán, độ đa dạng thực vật khá cao, cây phụ sinh phong phú, độ tàn che 0,7 là kiểu rừng có cảnh sắc đa dạng phức tạp, tiêu biểu của kiểu rừng thường xanh ẩm nhiệt đới
Cấu trúc phức tạp nhiều tầng được phân biệt thành 5 tầng, trong đó có 3 tầng cây gỗ lớn, 1 tầng cây bụi thấp, 1 tầng thảm tươi
Tầng vượt tán: Là tầng hình thành bởi những cây gỗ cao trên 40 m,
g m các loài cây thuộc họ Dầu (Dipterocarpaceae), họ Dâu tằm (Moraceae),
họ Đậu (Fabaceae) Tầng này có những c y thường xanh nhưng cũng có những cây rụng lá trong mùa khô, là 1 tầng không liên tục
Trang 24Tầng ưu thế sinh thái: Là tầng cây gỗ cao trung bình từ 20 - 30 m thân thẳng, tán liên tục g m nhiều cây của nhiều họ khác nhau, đa số là các cây
thường xanh như Tr m (Syzygium sp.), Trường (Pometia sp.), Re (Cinnamomum sp.), Kơ nia (Irvingia malayana), Cám (Parinarium annamensis), Bình linh (Vitex glabra), Gáo vàng (Sarcocephalus coadunata) Tầng ưu thế sinh thái tuy không có cây gỗ to và cao như tầng
vượt tán nhưng số lượng cây khá tập trung và có nhiều cây thuộc lớp kế cận cho tầng trên tham gia vào trữ lượng ổn định lâu dài và liên tục của rừng
Tầng dưới tán: g m những cây mọc rải rác dưới tán rừng, có chiều cao trên dưới 15 m, đường kính nhỏ hơn, tạo thành lớp tán không liên tục và mỏng Tổ thành loài cây trong tầng này g m những loài thuộc các họ thực vật
có giá trị kinh tế thấp như: Bứa (Clusiaceae), Máu chó (Myristicaceae), Thầu dầu (Euphorbiaceae), Thị (Ebenaceae)
Tầng cây bụi: g m những cây mọc rải rác thấp nhỏ, cao từ 2 - 8 m, thuộc các họ Cà phê (Rubiaceae), Trúc đào (Apocynaceae) và một số loài cây thuộc họ Cau dừa (Arecaceae) như Cau rừng, Lá nón, Song m y và đôi khi
có Tre l ô (họ Hòa thảo-Poaceae) mọc xen rải rác
Tầng thảm tươi: là tầng cuối cùng thấp nhất, g m những loài thực vật như cỏ Quyết, Sẹ, Sa nh n, Dương xỉ cao không quá 2m, thường làm cây chỉ thị cho hoàn cảnh môi trường rừng
Trong rừng còn có nhiều dây leo thuộc họ Đậu (Fabaceae) họ Na (Annonaceae) cùng với một số cây phụ sinh như Quyết tổ diều, Phong lan
Kiểu rừng này có một số ưu hợp chính như:
Ưu hợp Dầu song nàng (Dipterocarpus dyeri): trên vùng đất feralit
vàng và vàng đỏ, gần đ y còn thấy ở rừng Mã Đà, Hiếu Liêm và phía Bắc sông Đ ng Nai
Ưu hợp Dầu rái (Dipterocarpus alatus) trên nền đất phù sa cổ, trước
Trang 25đ y có ở một số vùng, nhưng nay chỉ còn những đám nhỏ
Ưu hợp Sao đen (Hopea odorata) Theo tài liệu điều tra thảm thực vật
cũng như đối chiếu tài liệu của Maurand (1943), ở Đ ng Nai có những ưu hợp Sao đen tự nhiên mọc hầu như thuần loại trên đất feralit vàng đỏ nhưng nay gần như không còn
Ưu hợp Vên vên (Anisoptera glabra) - Sao đen (Hopea odorata) - Sến
mủ (Shorea roxburghii) là ưu hợp khá phổ biến ở nhiều nơi trên một số loại
đất khác nhau ở Đ ng Nai
Vườn Quốc gia Lò Gò-Xa Mát (T n Biên, T y Ninh): Được thành lập
năm 2001 của Ủy ban nhân dân tỉnh Tây Ninh Về vị trí địa lý, phía Bắc giáp với biên giới Việt Nam – căm Pu Chia Đông giáp đường ranh giới Lâm nông trường Tân Lập, Tân Bình và phía Nam giáp với L m nông trường Hòa Hiệp
và Tây giáp với sông Vằm cỏ Đông Tạo độ địa lý là 105o57’ đến 106o04’ kinh độ Đông và 11o02’ đến 11o47’ vĩ độ Bắc, độ cao trung bình 13 m so với mặt biển và độ dốc dưới 5o Khu vực này có nhiều chỗ ngập nước vào mùa mưa Vườn Quốc gia có diện tích khoảng 800 ha chủ yếu là rừng phục h i sau khai thác gỗ, có trữ lượng gỗ thấp Về cấu trúc thảm thực vật, rừng nhiều tầng Tầng tán g m các cây gỗ cao trên 25 m như các loài thuộc họ Dầu như
đ u nước, dầu mít, Sao đen, Sến mủ, vên vên và một số loài thuộc họ đậu như giàng hương Nhìn chung, khu rừng Lò Gò- Xa Mát vừa có các kiểu rừng lá rộng thường xanh, rừng nửa rụng lá, rừng khộp, vừa có trảng cỏ ngập nước theo mùa Rừng nửa rụng lá và rừng rụng lá là những kiểu rừng đặc trưng trên đất xám phù sa cổ khô vào mùa khô với ưu thể các loài cây họ Dầu Dầu rái ở
Lò Gò - Xa mát là rừng khô rụng lá ưu thế họ Dầu ở T y Ninh, đặc trưng nhất
ở Lò Gò-Xa Mát có đặc điểm chung là đất bằng phẳng, gợn sóng, dạng đất cát hay laterit, thoát nước, xói mòn, có 2 mùa mưa và mùa khô, mùa khô thường xuyên có lửa rừng, cấu trúc tầng chỉ có 2 tầng: tầng cây gỗ và tầng cây bụi
Trang 26Thành phần loài đa phần là loài rụng lá trong mùa khô Kiểu rừng này thường xuất hiện trên nền đất xám điển hình thoát nước kém có khi mang nhiều sét, hạn chế sự xâm nhập của hệ thống rễ Về cấu trúc thảm thực vật thuộc kiểu rừng này tương đối giống với hầu hết các nước chung quanh trong khu vực do cùng ngu n gốc Cấu trúc tán rừng thường mở hay thưa với tầng cây bụi rải rác và thảm cỏ nghèo về loài Cấu trúc phân tầng rừng như sau:
Tầng tán: Chiều cao các loài cây trong tầng cao nhất có thể đạt trung bình đến 20-25 m bao g m các loài như Kơ nia (Irvingia malayana), Trám Canarium sp., các loài da sung Ficus spp (Moraceae), Dầu Dipterocarpus
spp (Dipterocarpaceae) Trên tầng đất feralit nông và mỏng, Dầu trà beng
(Dipterocarpus obtusifolius) hình thành như một tầng tán thưa
Tầng cây bụi: g m các loài cây thấp hơn bao g m các loài có chiều cao trung bình hay cây bụi như cơm nguội Ardisia sp (Myrsinaceae), Quả dẹt (Hymenocardia punctata)(Euphorbiaceae), Bằng lăng Lagerstroemia sp (Lythraceae), Memecylon sp (Melastomataceae), Bưởi bung (Acronychia pedunculata)(Rutaceae) và một số c y như nhỏ đùng đình Caryota sp., kè Livistona sp (Arecaceae) Dây leo trong khu vực này nhìn chung không đa
dạng, tầng cây bụi nhiều nơi vắng hay thưa thớt, các loài phụ sinh hiếm, gần
như không gặp và đa phần là các loài dương xỉ (Drynaria, Platycerium, Polypodium), họ Thiên lý (Asclepiadaceae: Dischidia, Hoya), rất ít đại diện của họ Lan (Orchidaceae) (nếu có thì là Dendrobium, Oberonia, Otochilus) Tầng thảm cỏ đa niên bao g m các loài thuộc họ Poaceae, Fabaceae, và Asteraceae, chúng có chiều cao trung bình 1-1,5m Trên đất ngập nước còn tìm thấy loài Pseudopogonantherum, mọc xen kẽ với Cỏ tranh (Imperata cylindrica), Heteropogon contortus, Themeda triandra và Alloteropsis semialata
Gần như các loài c y gỗ trong kiểu rừng ở Lò Gò-Xa Mát là loài rụng
lá, quá trình rụng lá chủ yếu do thiếu nước trong mùa khô hơn là do quang
Trang 27chu kỳ (photoperiod), tùy theo loài, quá trình rụng lá có khác nhau nếu loài
Shorea roxbughii rụng lá vào khoảng tháng 12 trong đầu mùa khô và sau đó
lá non sẽ hình thành vào tháng giêng sau đó Nhưng loài Dầu trà beng
(Dipterocarpus obtusifolius) lại thay lá dần dần trong suốt mùa khô và rất ít
khi bị trơ cành Trong khi các c y con loài này lại không rụng lá như các c y
bố mẹ Hoa Dầu trà beng xuất hiện tương đối sớm thường vào cuối mùa khô Một đặc điểm khá phổ biến cho các loài họ Sao Dầu trong kiểu rừng này là lớp vỏ cây dày dễ bong ra và khả năng tái sinh bằng ch i do khả năng thích ứng với lửa rừng thường xuyên xảy ra tại kiểu rừng này
Một số loài họ Dầu thường gặp trong kiểu rừng này là: Dầu trà beng
(Dipterocarpus obtusifolius), Dầu rái (D alatus), Dầu mít (D costatus), Dầu lông (D intricatus), Sến mật (Shorea roxburghii), Cẩm liên (Shorea siamensis), và các loài cây gỗ phổ biến khác: Vừng (Careya arborea), Chiêu liêu xanh (Terminalia chebula), Chiêu liêu ổi (Terminalia corticosa) Trong
đó Dầu rái có thành phần không lớn, mọc hỗn giao với các loài cây họ Dầu và một số loài cây gỗ khác Dầu mít mới chỉ gặp một vài cá thể
Sinh cảnh điển hình của kiểu này là: đất bằng phẳng, có gợn sóng, dạng đất cát hay laterit, thoát nước, xói mòn, có 2 mùa mưa và mùa khô, với mùa khô khắc nghiệt, thường xuyên có lửa rừng, chỉ có 2 tầng: tầng cây gỗ và tầng cây bụi Thành phần loài đa phần hay phần lớn là loài rụng lá trong mùa khô
2.3 Phương pháp nghiên cứu
2.3.1 Các bước nghiên cứu
- Khảo sát thực địa quần thể loài Dầu song nàng ở rừng nhiệt đới Đông Nam Bộ
- Thu thập mẫu để ph n tích
- Tách chiết, kiểm tra và tinh sạch DNA tổng số từ 73 mẫu Dầu song nàng
- Sử dụng phương pháp PCR với các cặp m i SSR
Trang 28- Điện di sản phẩm PCR bằng phương pháp điện di gel Polyacrylamide
- Ph n tích kết quả nghiên cứu
2.3.2 Khảo sát ngoài thực địa
Chúng tôi tiến hành thu mẫu theo tuyến Mẫu g m các cá thể trưởng thành Do số lượng cá thể trong mỗi khu vực nghiên cứu khá lớn, mẫu được thu ngẫu nhiên Tổng số 73 mẫu đã được thu thập tại 3 khu bảo t n, rừng phòng hộ Tân Phú, khu Bảo t n Thiên nhiên và Văn hóa Đ ng Nai, và vườn Quốc gia Lò Gò – Xa Mát
2.3.3 Phương pháp tách chiết DNA tổng số
DNA tổng số được tách từ các mẫu lá theo phương pháp của Doyle JJ
và Doyle JL, 1987 có cải tiến cho phù hợp với việc tách chiết DNA tổng số của các mẫu
a Dung dịch đệm dùng trong nghiên cứu
Bảng 2.2 Công thức pha đệm rửa (washing buffer) 10ml:
việc
Lượng pha
Bảng 2.3 Công thức pha đệm tách chiết (CTAB) 10ml:
Trang 29b Quy trình thực hiện
Bước 1: C n 200mg mẫu Nghiền mẫu với nitơ lỏng bằng cối chày sứ
vô trùng thành dạng bột mịn và chuyển ngay vào ống eppendorf 2ml Mỗi ống eppendorf chứa khoảng 10mg bột nghiền
Bước 2: Bổ sung 800µl đệm rửa (bảng 1) vào ống eppendorf 2ml, votex
tạo thành dịch đ ng nhất Ly t m 13.000 v/p trong 5 phút Loại bỏ dịch nổi (lặp lại bước này 1-3 lần)
Bước 3: Bổ sung 600µl đệm tách chiết (bảng 2), đảo nhẹ tạo thành hỗn
hợp đ ng nhất, ủ 1 giờ ở 65oC (thỉnh thoảng đảo đều)
Bước 4: Để nguội 5 phút ở nhiệt độ phòng
Bước 5: Bổ sung 600µl phenol: chloroform: isoamylalcohol (25:24:1),
đảo đều để tạo thành dịch Ly t m 13.000 v/p trong 10 phút, hút dịch nổi cho vào ống eppendorf 1,5ml mới
Bước 6: Bổ sung 600µl chloroform: isoamylalcohol (24:1), đảo đều để
tạo thành dịch Ly t m 13.000 v/p trong 10 phút, hút dịch nổi cho vào ống eppendorf 1,5ml mới
Bước 7: Bổ sung Isopropanol lạnh vào mẫu theo tỷ lệ (Vmẫu : Visopropanol
= 1:1) đảo nhẹ để ở tủ -20oC trong 1 giờ
Bước 8: Sau đó lấy trong tủ m ra và ly tâm ngay, ly tâm 13.000 v/p
trong 15 phút ở 40C, loại bỏ dịch nổi, thu tủa
Bước 9: Bổ sung 800µl c n 70% Ly t m 13.000v/p trong 15 phút ở
4oC, loại c n thu tủa
Bước 10: Làm khô DNA ở nhiệt độ phòng Hoà tan DNA trong 100µl
HOH deion
Bước 11: Bổ sung 2µl RNase (10mg/ml), ủ ở 37oC trong 1 giờ
Bước 12: Điện di kiểm tra kết quả trên gel Agarose 1%
Bước 13: Cất mẫu vào tủ lạnh ở -20o
Trang 30Bảng 2.4 Trình tự nucleotide các cặp mồi SSR dùng trong nghiên cứu
TT Locus Số lần lặp lại Trình tự mồi SSR Kích thước sản phẩm(bp) Nhiệt độ bắt cặp
[27] (CT)8CA(CT)5CACCC(CTCA)3CT(CA)10
F-5’-ATGTC CATGT TTGAG TG-3’
Trang 312.3.5 Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction)
Tiến hành
Tính toán và pha n ng độ DNA tổng số của mẫu tương đương nhau trong khoảng từ 10-20ng để khi đưa vào mỗi ống phản ứng thể tích DNA khuôn là xấp xỉ nhau trong tổng thể tích 40µl/phản ứng
Chu trình nhiệt được thực hiên trên máy PCR system 9700 Phản ứng PCR được tiến hành trong thể tích là 40µl trong đó chứa các thành phần và
n ng độ của các chất tham gia phản ứng như sau:
5 Hoàn tất kéo dài chuỗi 72 10 phút
Trang 322.3.6 Phương pháp điện di
2.3.6.1 Điện di trên gel agarose
Điện di DNA là phương pháp được sử dụng trong cả ph n tích định tính và định lượng mẫu DNA DNA là đại ph n tử sinh học mang điện tích
m, khi đặt trong môi trường có điện trường các ph n tử DNA có kích thước khác nhau sẽ di chuyển từ cực m sang cực dương với tốc độ khác nhau tùy thuộc vào kích thước
Gel agarose là loại gel thông dụng và phổ biến nhất, thao tác đơn giản, thường được sử dụng để ph n tích những đoạn DNA có kích thước khỏang 0,5 – 20 kb Gel được đổ trên một giá thể nằm ngang [7]
Chúng tôi thực hiện điện di kiểm tra DNA tổng số và sản phẩm PCR bằng điện di trên gel Agarose 1%, sử dụng đệm TAE 1X, nhuộm gel bằng GelRedTM Nucleic Acid gel Stain, thực hiện trên thiết bị điện di của hãng Biorab
2.3.6.2 Điện di gel Polyacrylamide
Điện di sản phẩm PCR trên gel Polyacrylamide 5% trong 40 ml dung dịch đệm 1xTAE, nhuộm bằng GelRedTM Nucleic Acid gel Stain và chụp ảnh trên máy soi gel của hãng CLEARVER
Các bước tiến hành pha nông độ gel polyacrylamide như sau:
- Chuẩn bị dung dịch: 30% acrylamide (g m bis-acrylamide), 1x TBE, 10% ammonium persulphate
- Lau sạch hai tấm kính dùng làm khuôn gel và miếng đêm bằng KOH/methanol hoặc ethanol Xử lý bề mặt của hai tấm kính bằng dung dịch silicon để ngăn gel dính chặt vào hai tấm kính gây rách gel lúc lấy nó ra khỏi khuôn sau khi điện di xong
- Tính toán thể tích của các dung dịch dùng để tạo polyacrylamide gel trên cơ sở kích thước tấm kính, độ dày của miếng đệm
